2. Material und Methoden

▼ 33 (fortgesetzt)

2.1  Chemikalien

▼ 34 

AnnexinV-Fluoreszein-5-Isothiozyanat, ApoptestTM-FITC kit (FITC-AnV)

AnnexinV-AlexaTM-594 (Alexa-AnV),

AnnexinV-Biotin, ApoptestTM-Biotin (Biotin-AnV)

VPS Diagnostics

(Hoeven, Holland)

Arachis hypogaea (peanut) Agglutinin-FITC (FITC-PNA),

Rinderserumalbumin (BSA),

CaCl2(*2H2O), Kalziumionophor A-23187,

Dithionit (Na2S2O4), Dimethylsulfoxide (DMSO),

Ethanol, Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Glucose

Heparin (H3149, 170 USP units/mg), HEPES,

Kanamycin, KCl, Merocyanin 540 (M540), MgCl2, MgSO4

Na-Citrat, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, Na-Laktat-Sirup,

Pisum Sativum Agglutinin-FITC (FITC-PSA),

Protease Inhibitor Cocktail (P8340), Rhodamin 123 (R123)

Tris(hydroxymetyl)aminomethan (TRIS)

Sigma-Aldrich

(Taufkirchen, Deutschland)

Na-Pyruvat, Percoll

Biochrom

(Berlin, Deutschland)

Arachis hypogaea (peanut) Agglutinin-Alexa Fluor 594 (Alexa-PNA), Propidiumjodid (PI)

MoBiTec

(Göttingen, Deutschland)

1-acyl-2-[6-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]caproyl]-sn-glycero-3-phosphatidylserin (C6-NBD-C16-PS, NBD-PS),

1-acyl-2-[6-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]caproyl]-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (C6-NBD-C16-PC, NBD-PC)

Avanti Polar Lipids

(Alabaster, USA)

Anti-Biotin-Antikörper (810.088 EM, Ziege, 10nm Gold)

BIOTREND

(Cologne, Deutschland)

Paraformaldehyd, Glutaraldehyd, LR-White

AGAR Scientific

(Stansted, England)

Bleicitrat, EPON 812

Osmiumtetroxid, Uranylacetat

SERVA

(Heidelberg, Deutschland)

2.2 Lösungen

Zur Flüssigkonservierung von Eberspermien wurde eine modifizierte Beltsvill-Thawing-Lösung (BTS) genutzt. Tabelle 3 zeigt im Überblick die Zusammensetzung dieser wie auch der im weiteren Text beschriebenen Lösungen.

Die In-vitro-Kapazitation der Eberspermien erfolgte in einem modifizierten Tyrodemedium (TALP). Eine sehr ähnliche Zusammensetzung weist Hank‘s gepuffertes Tyrodemedium (HBT) auf. Es wurde in einigen Versuchen alternativ zum TALP eingesetzt. Beide Kapazitationsmedien wurden in einem Zellkulturschrank mit 5% CO2 gesättigt, um das Bikarbonatgleichgewicht und somit den pH-Wert einzustellen.

▼ 35 

In einigen Versuche erfolgte die AnnexinV-Markierung der Spermien, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers, in einem Bindungspuffer. Entscheidend für die Bindung des AnnexinV an endogenes PS ist die Anwesenheit von mindestens 1,8 mM CaCl2 im Medium.

Tab. 3: Zusammensetzung der eingesetzten Lösungen: BTS - modifizierte Beltsville-Thawing-Lösung, TALP – modifiziertes Tyrodemedium, HBT – Hank’s gepuffertes Tyrodemedium; BP – Bindungspuffer; alle in Aqua bidest; pH 7,4; 300mOsmol.

BTS [mM]

TALP [mM]

HBT [mM]

BP [mM]

NaCl

-

100,0

105,0

150,0

NaHCO2

15,0

20,0

15,0

-

NaH2PO4

-

0,4

0,3

-

(Na-)Laktat

-

20,0

21,7

-

Na-Zitrat

23,0

-

-

-

KCl

10,0

2,7

3,1

5,0

MgCl2

-

0,5

-

1,0

MgSO4

-

-

0,4

-

HEPES

-

10,0

20,0

10,0

Glukose

205,0

6,0

5,0

-

(Na-)Pyruvat

-

1,0

1,0

-

CaCl2

-

2,0

2,0

1,8

EDTA

3,7

-

-

-

BSA

-

6mg/ml

3mg/ml

-

Gentamycin

300µg/ml

-

-

-

Kanamycin

-

-

100µg/ml

-

2.3 Eberspermien

Für die Versuche standen flüssigkonservierte Spermien von Ebern der Rasse Piétrain, vereinzelt auch der Rassen Duroc, Deutsches Edelschwein, Deutsche Landrasse und Leicoma zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Ejakulate erfolgte ganzjährig in Besamungseberstationen nach standardisierten Protokollen. Die Ejakulate wurden in BTS auf ca. 2-3,5*107 Spermien/ml verdünnt und in geschlossenen Plastiktuben (ca. 90 ml) bei 17°C gelagert. Unter diesen Bedingungen bleiben Eberspermien mehrere Tage befruchtungsfähig.

▼ 36 

Vor jedem Versuchstag wurden die verwendeten Eberspermien hinsichtlich ihrer Motilität und Morphologie mikroskopisch beurteilt. Diese Untersuchungen erfolgten im spermatologischen Labor des Instituts für Fortpflanzung landwirtschaftlicher Nutztiere Schönow e.V. (IFN). Als Mindestanforderung für den Praxiseinsatz bei der künstlichen Besamung gelten bei flüssigkonservierten Eberspermien 65% motile und 75% morphologisch intakte Spermien. Weitere Untersuchungen zur Einschätzung der Spermienqualität, wie z.B. ein Thermoresistenztest (Inkubation der in BTS flüssigkonservierten Spermien bei 38,5°C bis zu 5 h) oder ein Kapazitationstest (Auslösbarkeit der Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors) erfolgten für ausgewählte Proben ebenfalls im IFN.

2.3.1  Kapazitation

Um Spermien in vitro zu kapazitieren, wurden spezielle Medien entwickelt, die in etwa dem natürlichen Ionenmilieu einer In-vivo-Kapazitation im Eileiter des weiblichen Tieres entsprechen. Die flüssigkonservierten Eberspermien müssen zunächst in dieses Medium überführt werden. Dabei wird auch das in den flüssigkonservierten Proben enthaltene Seminalplasma entfernt. Für eine erfolgreiche Kapazitation von Eberspermien ist des weiteren eine Temperatur von 38-39°C erforderlich.

Protokoll - Kapazitation IFN

▼ 37 

Die Versuche wurden nach einem Standardprotokoll (IFN) zur Kapazitation von Eberspermien durchgeführt. Abweichend von diesem Standardprotokoll wurden Kontrollexperimente durchgeführt, in denen einzelne Komponenten des Kapazitationsmediums variiert wurden (BSA, Heparin, CaCl2). Eine Inkubation im Zellkulturschrank mit 5% CO2 wurde getestet und die Inkubationszeit variiert. Diese Abweichungen vom Protokoll „Kapazitation IFN“ sind im Ergebnisteil ausgewiesen.

Für einige Versuche wurde das flüssigkonservierte Ebersperma über einen Percoll-Dichtegradienten nach dem Protokoll von Harrison et al. aufbereitet Harrison, et al. (1993). Diese Methode bietet die Möglichkeit, motile Spermien anzureichern und sehr effektiv von Zytoplasmatropfen, Seminalplasma und anderen Verunreinigungen zu trennen.

▼ 38 

Protokoll - Kapazitation Harrison

Wie bereits bei der „Kapazitation IFN“ beschrieben, wurden auch bei dieser Methode verschiedene Faktoren variiert, wie im Ergebnisteil angegeben.

▼ 39 

Versuche, bei denen eine Markierung der Plasmamembran mit fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga vorgenommen wurde, erfolgten in BSA-freiem TALP. Die Kapazitation erfolgte im Zellkulturschrank mit 5% CO2. Nach Harrison et al. ist eine Kapazitation von Eberspermien allein in Gegenwart von Bikarbonat möglich Harrison, et al. (1993).

Als sichtbares Indiz der Kapazitation von Eberspermien gilt unter anderem die zunehmende Agglutination der Spermien. Dies ist bereits makroskopisch im Reagenzglas bzw. im Zellkulturschälchen zu erkennen. Ein weiteres gut sichtbares Zeichen ist die Änderung der Bewegungsform der Spermien, die mikroskopisch beurteilt werden kann. Es kommt zur Hyperflagellation, die durch größere Amplitude und Frequenz der Kopfauslenkung gekennzeichnet ist. Diese beiden Kapazitationsmerkmale wurden bei allen Inkubationen in unterschiedlichem Ausmaß beobachtet. Der klassische Nachweis einer erfolgreichen Kapazitation ist die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion.

2.3.2 Akrosomreaktion

Die Akrosomreaktion kann bei kapazitierten Eberspermien durch Zugabe eines Kalziumionophors (z.B. A-23187) ausgelöst werden. Die Versuche wurden nach einem Standardprotokoll zur Induktion der Akrosomreaktion von Eberspermien IFN durchgeführt.

▼ 40 

Protokoll - Akrosomreaktion

1 ml Spermiensuspension + 15 µl A-23187 (200 µM Stammlösung in TALP/DMSO) in einem Eppendorfgefäß gut mischen ( = 3 µM)

▼ 41 

Das Ausmaß der Akrosomreaktion vor (frühzeitig) und nach (induziert) Zugabe des Ionophors dient als Maß für die Kapazitation der Spermien. Diese Auswertung kann sowohl mikroskopisch als auch, nach geeigneter Färbung, durchflusszytometrisch erfolgen. Man unterscheidet dabei vier Subpopulationen der Spermien:

  1. lebend und morphologisch intaktes Akrosom

  1. leb./NAR

  1. lebend und defekte oder abgelöste Kopfkappe

  1. leb./akrosomreagiert

  1. tot und morphologisch intaktes Akrosom

  1. tot/NAR

  1. tot und defekte oder abgelöste Kopfkappe

  1. tot/akrosomreagiert

▼ 42 

Dieser „Kapazitationstest“ wurde nicht für alle in dieser Arbeit genutzten Spermienproben durchgeführt. Zur Kontrolle und zum Vergleich verschiedener Inkubationsbedingungen wurden einzelne Proben hinsichtlich ihres Akrosomstatus nach Kapazitation und Akrosomreaktion beurteilt.

2.3.3 Zona-pellucida-Bindungsassay

Um die Bindungsfähigkeit der Spermien zu charakterisieren, wurde ein Zona-pellucida-Bindungsassay als „Qualitätstest“ für Eizellen und Säugerspermien entwickelt. Dabei werden kapazitierte Spermienzellen zusammen mit isolierten Zonae inkubiert. Nach dem Waschen der Zonae kann man die fest assoziierten Spermien mikroskopisch beurteilen.

Der an der Tierärztlichen Hochschule Hannover für Eberspermien etablierte Hemizona-Assay und die Arbeiten von Fazeli et al. dienten als Grundlage und wurde an die Fragestellung angepasst Fazeli, et al. (1997) ;Ferreira (1998). Als Ausgangsmaterial wurden Schlachtovarien vom Schwein nach ihrer Entnahme bei -70°C gelagert und am Versuchstag in TALP bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut.

▼ 43 

Protokoll – Zona-pellucida-Assay

Die an den Zonae assoziierten Eberspermien wurden sofort fluoreszenzmikroskopisch untersucht.

2.3.4 Kavitation

▼ 44 

Die Kavitation von Zellen wird seit vielen Jahren zur selektiven Isolierung von Plasmamembranvesikeln genutzt. Dabei werden die Zellen für kurze Zeit einem hohen Gasdruck ausgesetzt. Das Gas, in der Regel Stickstoff, löst sich im Medium und im Zytoplasma der Zellen. Wird schließlich der Druck reduziert, bilden sich kleine Gasblasen, die Löcher in die Zellmembran reißen oder diese völlig ablösen. Gillis et al. isolierten mit dieser Methode erstmals Plasmamembranvesikel von Eberspermien. In den folgenden Jahren wurden die Produkte der Kavitation von Spermien mikroskopisch und biochemisch charakterisiert Gillis, et al. (1978). Bei geeigneter Wahl der Kavitationsbedingungen wird lediglich die Plasmamembran im Bereich über der Kopfkappe abgelöst, während die äußere Akrosommembran intakt bleibt Althouse, et al. (1995). In Anlehnung an die von Peterson et al. beschriebene Methode erfolgte die Kavitation der Eberspermien nach folgendem Protokoll Peterson, et al. (1980).

Protokoll - Kavitation

▼ 45 

Die Spermien wurden unmittelbar nach der Kavitation markiert und fluoreszenz-mikroskopisch untersucht.

2.3.5 Markierungen

Um Aussagen über die Membranstrukturen der Eberspermien zu erhalten, wurden diese mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und anschließend analysiert. Die verwendeten Marker bauen sich in definierte Zellkompartimente ein oder binden an bestimmte Zellstrukturen und ermöglichen somit eine detaillierte Aussage über die Integrität oder Organisation dieser Zellbestandteile. Tabelle 4 und Abbildung 4 zeigen die verwendeten Marker und ihre Eigenschaften im Überblick.

Kapazitierte Eberspermien reagieren äußerst empfindlich auf jeglichen „Stress“, wie z.B. Temperaturänderung oder Wechsel des Mediums. Deshalb erfolgten alle Manipulationen an den kapazitierten oder akrosomreagierten Spermien ohne Fixierung bei 38,5°C im vorgewärmten TALP (wenn nicht anders beschrieben). Überschüssiger Farbstoff bzw. ungebundener Marker wurden nur ausgewaschen wenn unbedingt nötig. In der Regel reichte die ohnehin nötige Verdünnung der Proben für die Durchflusszytometrie als "Waschschritt“ aus.

▼ 46 

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Marker und Label: Molekulargewicht (MW) in Dalton (d), Absorbtionsmaxima (λabs), Emmisionsmaxima (λem), Extinxtionskoeffizient (ε); Desoxyribonukleinsäure (DNS), Plasmamembran (PM), äußere Akrosommembran (äAM).

Marker / Label

Bindung / Einbau

MW [d]

λabs [nm]

λem [nm]

{ε×10-3}

Propidiumjodid

DNS

668

535

617

Aarts and Tymianski (2003)

Rhodamin 123

Mitochondrien

381

507

529

Chen and Wang)

NBD-PS, -PC

PM

860

465

535

Adams and Cory)

AnnexinV

PS (+Ca2+)

36x103

-

-

-

PSA

akrosomaler Inhalt

49x103

-

-

-

PNA

äAM

110x103

-

-

-

FITC

AnnexinV, PNA, PSA

389

494

518

)

Alexa Fluor® 594

AnnexinV, PNA

k.A.

590

617

k.A.

Abb. 4: Strukturformeln verwendeter Fluoreszenzmarker: nach Molecular Probes bzw. Avanti Polar Lipids.

2.3.5.1  Lebend-Tot-Färbung mit Propidiumjodid

Der Farbstoff Propidiumjodid (PI) wird in der Regel von lebenden Zellen ausgeschlossen. Zellen, deren Plasmamembranintegrität gestört ist, erscheinen intensiv rot, da die Fluoreszenzintensität des PI nach Bindung an die Desoxyribonukleinsäure (DNS) auf das 20-30fache steigt. PI baut sich durch Interkalation zwischen den Basenpaaren der DNS im Verhältnis 1 Molekül PI pro 4-5 Basenpaare ein. Für eine konstante Färbung muss PI im Überschuss vorhanden sein, darf aber im Untersuchungszeitraum nicht zytotoxisch wirken.

▼ 47 

Protokoll – PI-Färbung

Aliquot der PI-Stammlösung 1-15 min (Standard: 5 min) vor der Messung direkt in die Messküvette mit 2 ml Spermiensuspension (105-106 Zellen; = 0,75-1,88 µM) geben und im Dunkeln weiter inkubieren
oder

Aliquot der PI-Stammlösung die letzten 1-15 min (Standard: 5 min) der Inkubationszeit zu 250 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension (105-106 Zellen; = 1,5-15,0 µM) hinzufügen und im Dunkeln weiter inkubieren

▼ 48 

Die Konzentration der Spermien und des PI sowie die Inkubationszeit der Spermien mit dem PI variierten in den einzelnen Versuchen und sind im Ergebnisteil ausgewiesen. Es wurde eine 1,5mM Stammlösung von PI in physiologischer Kochsalzlösung (pNaCl) angesetzt, portioniert und bei 4°C aufbewahrt.

2.3.5.2 Färbung der Mitochondrien mit Rhodamin 123 (R123)

R123 ist ein lipophiles Kation, das in Abhängigkeit vom Mitochondrienmembranpotential in diesem akkumuliert wird. Bricht das Membranpotential der Mitochondrien zusammen, kann der Farbstoff ausgewaschen werden. Für Krebszellen wurde eine carriervermittelte Aufnahme von R123 gezeigt Cho, et al. (2000). Motile Spermien erscheinen bei dieser Färbung intensiv markiert, während Spermien, deren Mitochondrienmembranpotential Störungen aufweist, eine schwache oder keine Markierung zeigen. Die Färbung der Eberspermien mit R123 erfolgte nach folgender Vorschrift.

Protokoll – Rhodamin-Färbung

▼ 49 

- 1 µl einer 0,13 mM (0,05 mg/ml) Stammlösung in Aqua bidest. zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension geben (105-106 Zellen; = 0,52 µM)

- Probe für 5-20 min im Dunkeln weiter inkubieren

2.3.5.3 Bindung von Lektinen an akrosomale Zuckerstrukturen

Peanut Agglutinin (PNA) ist ein Lektin, das spezifisch an ß-D-Galaktose-Reste bindet. Für Säugerspermien wurde gezeigt, das es vor allem an der äAM bindet. Pisum sativum Agglutinin (PSA) bindet hingegen spezifisch an α-Methyl-Mannose-Reste, die bei Säugerspermien vor allem an Komponenten des akrosomalen Inhalts (Akrosin) gefunden wurden. Beide Lektine binden nicht an Eberspermien mit intakter Plasmamembran. Eine Markierung mit PNA detektiert man an Spermien deren Integrität der Plasmamembran zerstört ist, deren äußere Akrosommembran aber noch nicht abgelöst ist. Eine PSA-Markierung charakterisiert hingegen ein akrosomreagiertes Spermium. Die Markierung der Eberspermien wurde wie folgt durchgeführt.

▼ 50 

Protokoll – Lektinbindung

1 µl einer 0,5 mg/ml Stammlösung in pNaCl zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension geben (105-106 Zellen; = 2 µg/ml)

2.3.5.4 AnnexinV-Bindung an endogenes Phosphatidylserin

▼ 51 

AnnexinV (AnV) ist ein phospholipidbindendes Protein, das in Anwesenheit von Kalzium mit hoher Affinität an PS bindet. Es wurde in Kombination mit einem Lebend-Tot-Farbstoff als Marker der transversalen Asymmetrie der Phospholipide in der Zellmembran der Eberspermien genutzt. Des weiteren wurde die Verteilung des endogenen PS in der äußere Akrosommembran nach Ablösung der Plasmamembran untersucht. Die Markierung der Spermien erfolgte entsprechend nachstehendem Protokoll.

Protokoll – AnnexinV-Bindung

1 µl einer 250 µg/ml FITC-AnV (Alexa-AnV) Stammlösung zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension dazu geben (105-106 Zellen; = 1 µg/ml)

▼ 52 

Sowohl die Temperatur (4°C; RT; 38,5°C) als auch die Dauer der Markierung (1-30 min) mit AnV variierten in den einzelnen Versuchen und sind im Ergebnisteil angegeben.

2.3.5.5 Einbau und Translokation von fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga in die Zellmembran der Spermien

Als zweiten Versuchsansatz zur Untersuchung der transversalen Asymmetrie der Phospholipide in der Plasmamembran von Eberspermien nutzten wir den spontanen Einbau von fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga (NBD-PL), deren Fluoreszenz im äußeren Monolayer selektiv gelöscht werden kann. Die zunächst in Methanol/Chloroform (1:1) gelösten NBD-PL wurden im Reagenzglas mit Stickstoff abgedampft und durch Vortexen in Pufferlösung resuspendiert. Die verwendeten NBD-PL sind partiell wasserlöslich und liegen im Monomer-Mizell-Gleichgewicht vor. Nach Zugabe der Spermiensuspension bauen sich die Labelmonomere spontan in die Zellmembran ein. Der Einbau von NBD-PL in die Plasmamembran von Eberspermien wurde zunächst am Fluoreszenzspektrometer verfolgt.

▼ 53 

Protokoll – Einbau NBD-PL / Spektrometer

Die Eigenfluoreszenz der Spermien war in den verwendeten Konzentrationen und Messeinstellungen vernachlässigbar. Der Einbau der NBD-PL wurde nur an in TALP gewaschen Spermien bei Raumtemperatur untersucht. Vergleichende Untersuchungen an gewaschenen und kapazitierten Eberspermien erfolgten am Durchflusszytometer, um zwischen membranintakten und -defekten Zellen unterscheiden zu können.

▼ 54 

NBD-Lipidderivate fluoreszieren mit hoher Quantenausbeute. Die Zugabe von Dithionit führt zur Reduktion der Nitrogruppe am C4 des konjugierten Ringsystems und somit zum Erlöschen der Fluoreszenz. McIntyre und Sleight etablierten diesen Assay zur Bestimmung der transversalen Lipidverteilung in Membranen McIntyre and Sleight (1991). Unter der Voraussetzung, dass die Dithionitionen nicht die Plasmamembran durchdringen, werden nur die NBD-Gruppen der Analoga in der äußeren Lamelle reduziert. Da die Reduktion um Größenordnungen schneller ist als die transversale Bewegung der NBD-PL über die Membran, kann mit diesem Assay die transversale Phospholipidverteilung in der Plasmamembran von Zellen bestimmt werden Pomorski, et al. (1994). Zu beachten ist dabei jedoch, dass sowohl der Abbau der Label durch Phospholipasen als auch der innerzelluläre Lipidtransport (z.B. Endozytose) die Ergebnisse verfälschen können. Um die Kapazitation der Eberspermien nicht zu blockieren - die Hydrolyse von Phospholipiden ist hierbei wahrscheinlich ein wesentlicher Bestandteil - wurde auf die Zugabe von Hemmstoffen (z.B. DFP oder PMSF) verzichtet.

Das molare Verhältnis des Labels zu endogenen Membranphospholipiden wurde so gewählt, dass ein Labelanteil von 2% (mol/mol) nicht überschritten wurde. Dabei wurde für die Eberspermien ein Gesamtphospholipidgehalt von 2 µmol/109 Zellen angenommen (eigene Messungen und Werte für Bullenspermien aus Parks, et al. (1987)). Nach Abschätzungen aus Membranpräparationen von Forellen- und Bullenspermien entfallen 1/3 bis 1/5 auf die Plasmamembranphospholipide. Die Versuche wurden in Anlehnung an bereits beschriebene Protokolle zur Markierung von Spermien mit NBD-PL durchgeführt Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1999).

Protokoll – Einbau und Einwärtstranslokation NBD-PL / Durchflusszytometrie

▼ 55 

für die 2. Messung (Fluoreszenz Innen) 20 µl Dithionit (1 M in 1 M Tris, pH 9, = 10 mM) in die Messküvette pipetieren, gut mischen und 1 min im Dunkeln inkubieren

▼ 56 

Die Zentrifugation und die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Die jeweilige Inkubationstemperatur und -zeit ist im Ergebnisteil ausgewiesen. Um die sehr schnelle Translokation des NBD-PS auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran zeitlich besser auflösen zu können, wurde bei einigen Versuchen auf ein Auswaschen der nicht eingebauten Label verzichtet und die Dauer der PI-Färbung auf 2 min reduziert. Genaue Erläuterungen zur Auswertung der einzelnen Messungen und zu den durchgeführten Berechnungen sind im Ergebnisteil dargestellt.

Um die Translokation der NBD-PL von der zytoplasmatischen zur exoplasmatischen Seite zu analysieren, wurde die Fluoreszenz der NBD-PL im äußeren Monolayer mit Dithionit gelöscht, die Spermien in BSA-haltigem Medium gewaschen und weiter inkubiert.

Protokoll – Auswärtstranslokation NBD-PL / Durchflusszytometrie

▼ 57 

Auch für diese Versuche sind die genauen Erläuterungen zur Auswertung der einzelnen Messungen und zu den durchgeführten Berechnungen im Ergebnisteil dargestellt.

2.3.6 Fluoreszenzspektroskopie

Die Fluoreszenzspektren der verwendeten Label und die Kinetiken des Einbaus der NBD-PL wurden an einem Shimadzu RF 5001 PC Spektrometer aufgenommen. Mit Hilfe eines kleinen Magnetrührers wurden die Spermien und die Fluoreszenzmarker zu einer homogenen Suspension vermischt. Die Messdaten wurden exportiert und mit SigmaPlot bearbeitet.

▼ 58 

Die gemessenen Einbaukinetiken wurden nach den Messungen normiert. Unter der Annäherung, dass die Quantenausbeute der NBD-PL in der Spermienmembran vergleichbar ist mit der in Tritonvesikeln, erfolgte die Normierung wie folgt:

Dabei entspricht der Nullwert der gemittelten Fluoreszenzintensität der NBD-PL im Puffer und der Maximalwert der gemittelten Fluoreszenzintensität der NBD-PL in Triton.

▼ 59 

Die jeweils verwendeten Geräteeinstellungen für die Anregung und Emission (Wellenlänge, Spaltbreite) sind im Ergebnisteil angegeben.

2.3.7 Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ermöglicht es in kurzer Zeit die Fluoreszenzeigenschaften von mehreren tausend markierten Einzelzellen aufzuzeichnen und zu analysieren. Somit können auch kleine Subpopulationen, die durch eine bestimmte Eigenschaft gekennzeichnet sind, erkannt werden. Die zu untersuchenden Zellen müssen in einer relativ hohen Verdünnung in Suspension vorliegen. Die Einzelzelluntersuchungen gefärbter Eberspermien erfolgten an einem Durchflusszytometer (Particle Analysing System - PAS) der Firma Partec GmbH (Münster, Deutschland). Dieses Gerät ist mit einem Argon-Ionen-Laser (200 mW, 488 nm) ausgestattet und ermöglicht die Analyse des Fluoreszenz- (FL1, FL3) und Streulichts (FSC, SCC) der gemessenen Partikel in folgenden Kanälen.

FL1 (grün): TK500, EM 515-560 // FL3 (rot): TK610, RG630 // FSC: Ex488 // SCC: Ex488

▼ 60 

Ein Aliquot der zu untersuchenden Spermiensuspension wurde in 2ml gefiltertem Messpuffer (in der Regel TALP) gleichmäßig suspendiert und zügig vermessen. Bei einer Messgeschwindigkeit von 100-150 Zellen pro Sekunde wurden in 2 Minuten 15.000 Zellen erfasst.

Die Auswertung erfolgte mit der Software von Partec. Nachdem anhand des Streulichtes die Spermien identifiziert wurden, konnten die Fluoreszenzeigenschaften dieser Zellen in den 1-Parameter-Histogrammen der Einzelkanäle analysiert werden. Es wurden Intensitätsbereiche festgelegt, in denen die Spermien nicht (Ø), schwach (+) oder stark (++) fluoreszierten. Eine Peakanalyse der Histogramme lieferte die arithmetischen Mittelwerte der Intensitätspeaks und die Prozentsätze der im jeweiligen Bereich gemessenen Zellen. Des weiteren wurden bei allen Doppelfärbungen die Fluoreszenzen der gemessenen Spermienzellen gegeneinander in einem 2-Parameter-Diagramm aufgetragen. Dies ermöglichte die Einteilung in Quadranten oder Regionen unterschiedlicher Fluoreszenzeigenschaften (z. B. unmarkiert / nur grün / nur rot / grün und rot).

Für einige Messungen war eine sogenannte Farbkompensierung nötig. Das Emissionsspektrum von R123 und NBD reichte aufgrund ihrer hohen Quantenausbeuten in den Bereich der roten Wellenlängen. Anhand einer Einzelfärbung von Eberspermien mit diesen Markern wurde die jeweilige Kompensierung festgelegt und für die entsprechende Doppelfärbung mit PI (oder Alexa-PNA) übernommen.

2.3.8 Mikroskopie

▼ 61 

Vor jedem Versuchstag erfolgte eine Einschätzung der flüssigkonservierten Eberspermien im Phasenkontrast (Jenaval, Carl Zeiss Jena). Für die Motilitätsbeurteilung der Spermien (250fache Vergrößerung) werden drei Bewegungsformen (vorwärtsbeweglich, ortsbeweglich, unbeweglich) unterschieden. Bei der morphologischen Differenzierung der Eberspermien (800fache Vergrößerung) werden verschiedene Veränderungen des Kopfes, der Kopfkappe, des Halses und des Spermienschwanzes unterschieden. Zwei wesentliche Subpopulationen wurden für alle in den Versuchen eingesetzten Ejakulate erfasst: Der Anteil morphologisch intakter Zellen, die durch einen sich deutlich abzeichnenden „normalen akrosomalen Rand“ (NAR) und eine unveränderte Schwanzform gekennzeichnet sind, und der Anteil an Spermien, mit denen Zytoplasmatropfen assoziiert waren. Die Spermienkonzentration wurde, wenn erforderlich, mit Hilfe einer Zählkammer (Bürker-Thürk) bestimmt und entsprechend eingestellt. Dazu wurde die Motilität der Eberspermien in einer hypertonen Kochsalzlösung blockiert. Die Beurteilung der Hyperaktivierung, Agglutination und des Akrosomstatus nach Kapazitation und Akrosomreaktion erfolgte für ausgewählte Proben ebenfalls an einem Lichtmikroskop unter Phasenkontrast-Optik (Jenaval, Carl Zeiss Jena).

2.3.8.1  Fluoreszenzmikroskopie

Die mikroskopische Beurteilung fluoreszenzmarkierter Eberspermien erfolgte entweder an einem Fluoreszenzmikroskop der Firma Zeiss (Axiovert 100) oder an einem Olympus-IX81. Dazu wurde eine Aliquot der markierten Spermien unverdünnt auf einen vorgewärmten Objektträger gebracht und mit einem warmen Deckgläschen (20×30) abgedeckt. Beide Mikroskope sind mit einem Wärmetisch ausgestattet, so dass die Proben (wenn nicht anders angegeben) bei 38,5°C untersucht werden konnten. Die Morphologie der Spermien wurde unter Phasenkontrast-Optik (Zeiss) oder im differentiellen Interferenzkontrast (Olympus) beurteilt. Für die Aufnahme von monochromatischen Bildern sind beide Mikroskope mit einer Digitalkamera ausgerüstet.

▼ 62 

Die Bildauswertung erfolgte mit der Software MetaVue der Firma Universal Imaging Corp. (Las Vegas, USA), die eine Überlagerung einzelner Fluoreszenzbilder ermöglicht.

2.3.8.2 Elektronenmikroskopie

Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgten am Institut für Zoo- und Wildtierforschung (IZW) in Berlin. Die fixierten Proben wurden entsprechend der unten aufgeführten Protokolle, für die Elektronenmikroskopie aufgearbeitet. Die Ultradünnschnitte wurden mit einem Ultracut Ultramikrotom der Firma Reichert-Jung (Iowa City, USA) angefertigt und die fertigen Präparate an einem Elektronenmikroskop TEM Zeiss 902A der Firma Carl Zeiss (Oberkochen, Deutschland) untersucht. Proben kapazitierter und kavitierter Eberspermien wurden elektronenmikroskopisch zunächst bezüglich ihrer Membranstruktur untersucht (Protokoll I).

Protokoll – Elektronenmikroskopie I

▼ 63 

Weitere Versuche zur Analyse von an Spermien gebundenem AnV mit Hilfe eines goldmarkierten Antikörpers erfolgten in Anlehnung an bestehende elektronenmikroskopische Arbeiten nach Protokoll II Nagae, et al. (1986) ;Pellicciari, et al. (1997) ;Szöllösi and Hunter (1978) ;Töpfer-Petersen, et al. (1983).

Die Fixierung der kapazitierten Spermien erfolgte die ersten 30 min bei 38,5°C mit anschließender Abkühlung der Proben auf Raumtemperatur. Bei den Proben kavitierter Spermien erfolgte die Markierung mit Biotin-AnV und die Fixierung auf Eis.

▼ 64 

Protokoll – Elektronenmikroskopie II

Markierung der Eberspermien mit Biotin-gelabeltem AnV:

50 µl AnV-Biotin zu 5 ml der zu untersuchenden Spermiensuspension (~108 Zellen, = 1 µg/ml) dazugeben und für 10 min weiter inkubieren

▼ 65 

Fixierung der Spermien:

Einbettung, Ultradünnschnitte und Kontrastierung:

▼ 66 

Bei allen Versuchsansätzen wurde je ein Aliquot der Spermiensuspension ohne Biotin-AnV präpariert, um unspezifische Bindung des Anti-Biotin-Antikörpers analysieren zu können.

2.4 Forellenspermien

Forellenspermien dienten als Untersuchungsobjekt für die laterale Phasenseparation von Lipiden und Proteinen, da sie einen einfacheren Zellaufbau als Eberspermien aufweisen. Reife Forellenspermien besitzen kein Akrosom und nur ein einzelnes ringförmiges Mitochondrium.

▼ 67 

Die Versuche an Forellenspermien wurden im Rahmen eines PROCOPE-Austauschprogrammes in Zusammenarbeit mit dem „Laboratoire de Ichtyodiversite et Cryoconservation“, Rennes, Frankreich (C. Labbé) durchgeführt. Für alle Versuche wurden ausgewachsene Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) aus Aquakulturen genutzt. Die Spermien wurden innerhalb der Fortpflanzungssaison nach Anästhesie der Forelle mit Phenoxy-2-ethanol gewonnen. Dazu wurden die Flanken der Tiere ausgestrichen und die Spermien in einem Falcon-Röhrchen mit 10 ml Pufferlösung aufgefangen. Als Wasch- und Inkubationsmedium wurde SFMM (Seminal fluid mineral medium, Billard (1983)) verwendet (110 mM NaCl; 28,3 mM KCl; 1,1 mM MgSO4; 1,8 mM CaCl2; 20 mM TRIS, pH 9). In diesem Medium bleiben die Forellenspermien im immobilen Zustand und können bei 4°C unter Sauerstoffbegasung gelagert werden. Die Motilität der Spermien wurde am Mikroskop eingeschätzt. Dazu wurden 20 µl eines Aktivierungsmediums (enthält kein KCl) mit 2 µl der Forellenspermien direkt auf einem Objektträger vermischt. Dies bewirkt einen Kaliumstrom aus der Zelle und daran gekoppelt einen Kalziumeinstrom in das Spermium Tanimoto and Morisawa (1988). Über mehrere Zwischenschritte erfolgt sehr schnell die Aktivierung der Forellenspermien, verbunden mit einer sehr intensiven Bewegung, die jedoch innerhalb 1 min wieder erlischt. Zur weiteren Versuchsführung wurden die Spermien zunächst bei 250xg für 25 min bei 10°C zentrifugiert und das Spermienpellet 1:1 (vol/vol) in frischem SFMM resuspendiert (~ 1x1010Spermien/ml). Die gewaschenen Forellenspermien wurden in einem verschlossenen, liegenden, abgedunkeltem Falcon-Röhrchen auf Eis gelagert, um eine möglichste große Oberfläche dem Luftsauerstoff zugänglich zu machen.

2.4.1  Isolation von Triton-unlöslichen Membranfraktionen

Protokoll – Raft-Isolierung

▼ 68 

Die Versuche wurden in Anlehnung an ein Protokoll zur Isolierung Triton-unlöslicher Membranfraktionen aus Krebszellen durchgeführt Yamamura, et al. (1997). Abweichungen von diesem Protokoll werden im Ergebnisteil gesondert ausgewiesen. Variiert wurden die Triton- und Kalziumkonzentrationen des Lysepuffers, die Inkubationsdauer der Spermien im Lysepuffer und die Ultrazentrifugationsdauer. In Abbildung 5 sind die Präparationsschritte gekennzeichnet an denen Proben zur Lipid- und Proteinbestimmung entnommen wurden.

Abb. 5: Raftpräparation aus Spermienzellen: Isolierung von in Triton unlöslichen Membranfraktionen, die sich durch eine geringere Dichte auszeichnen und somit im Dichtegradienten aufsteigen. Kursiv geschriebene Angaben wurden variiert und sind im Ergebnisteil angegeben.

2.4.2 Lipid- und Proteinanalysen

Die zu analysierenden Proben wurden bei –70°C gelagert. Für alle selektierten Banden sowie für das Ausgangslysat, den Überstand der Membranvesikel, der dem Gradienten unterschichtet wurde, und das jeweils verbleibende Pellet wurde eine quantitative Bestimmung des CHO-, PL- und Proteingehaltes durchgeführt.

2.4.2.1  Lipidextraktion

▼ 69 

Die Extraktion der Lipide erfolgte nach einer 2-Schritt-Methode Bligh and Dyer (1959). Prinzipiell werden die Lipide von den Proteinen und der DNS durch Phasenseparation (Chloroform / Methanol+Wasser) getrennt. Ein Teil der Glykolipide und der geladenen Phospholipide (z.B. PS) verbleibt dabei jedoch in der wässrigen Phase und geht für die Lipidbestimmung verloren. Eine Zugabe von Essigsäure würde aber die in Spermienzellen zahlreich vertretenen Plasmalogene angreifen und eventuell zerstören.

2.4.2.2 Phosphatbestimmung

Der Anteil an Phospholipiden in den Proben wird aus der Menge an Phosphat in einem Aliquot der extrahierten Lipide bestimmt. Dazu wird das vorhandene Phosphat mit Perchlorsäure hydrolysiert. Die freien Phosphationen zeigen nach Zugabe von Heptaammoniummolybdat und Ascorbinsäure eine konzentrationsabhängige Farbreaktion, die mit Hilfe eines Phosphatstandards kolorimetrisch quantifiziert werden kann.

2.4.2.3 Cholesterolbestimmung

Der Cholesterolanteil wurde mit einem KIT (Boehringer Mannheim Nr.: 1442341) in einem Aliquot der extrahierten Lipide bestimmt. Der Assay beruht auf einer enzymatischen Reaktionskette, in der das Cholesterol stöchiometrisch umgesetzt und die Reaktionsprodukte kolorimetrisch analysiert werden.

2.4.2.4 Proteinbestimmung

▼ 70 

Der Proteingehalt in den Proben wurde mit einem BCA Protein Essay (Biuret-Reaktion) von Pierce (Nr.: 23225) bestimmt. Das Reaktionsprinzip beruht auf der charakteristischen Reduktion von Kupferionen (Cu2+♢ Cu1+) durch die Peptidbindungen der Proteine im alkalischen Milieu. Die entstehenden Cu1+-Ionen werden kolorimetrisch analysiert.

Die kolorimetrischen Analysen erfolgten jeweils mit Hilfe eines ELISA-Platten-Lesegerätes. Für jeden Versuchsansatz wurden Standardkonzentrationsreihen zur Eichung des Gerätes mitgefahren.

2.5 Berechnungen und Statistik

Alle Berechnungen und statistischen Analysen erfolgten entweder in Exel oder in SigmaPlot. Es sind entweder die Ergebnisse von Einzelversuchen angegeben oder Mittelwert und Standardabweichung einer Versuchsgruppe. Die Berechnung von Signifikanzen erfolgte mittels t-Test oder, bei gepaarten Versuchen, mit Hilfe des gepaarten t-Tests.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
17.08.2007