3. Ergebnisse

▼ 70 (fortgesetzt)

3.1  Vorbereitende Versuche zur Markierung von Eberspermien mit Fluoreszenzlabeln

3.1.1  Lebend-Tot-Färbung mit Propidiumjodid

▼ 71 

Eine Suspension von Spermienzellen enthält immer einen gewissen Anteil toter Zellen, der im Laufe der Inkubation z.T. erheblich ansteigen kann. Um Membranänderungen an intakten Zellen analysieren zu können, ist eine Lebend-Tot-Färbung unerlässlich. PI fluoresziert im Bereich roter Wellenlängen (617nm) und wird häufig zur Identifizierung toter Zellen genutzt, da es eine Gegenfärbung mit zahlreichen Fluoreszenzmarkern (NBD, R123, FITC) ermöglicht. Der geringe Extinktionskoefizient des PI machte eine hohe Verstärkung der roten Fluoreszenzsignale nötig. Messungen PI-gefärbter Eberspermien am Durchflusszytometer ergaben drei Populationen (PI Ø, PI+, PI++) zunehmender Fluoreszenzintensität.

Abb. 6: Durchflusszytometrische Erfassung von kapazitierten Eberspermien nach Markierung mit PI und R123. Das Histogramm zeigt das Ergebnisse der Einzelfärbungen mit PI, das 2-Parameter-Diagramm die Auswertung der Doppelfärbung (1µl R123 20min bei RT inkubiert und ausgewaschen, 2,5µl PI in Küvette 5min vor Messung).

Um entscheiden zu können, ob die mittlere Population (PI+) Zellen kennzeichnet, deren Membranintegrität gestört war oder ob es sich um eine unspezifische Wechselwirkung des PI mit den Spermien handelte, erfolgte eine Gegenfärbung mit R123, einem Mitochondrien-Farbstoff. Die Motilität der Spermien muss bis zur Befruchtung erhalten bleiben und ist unmittelbar von der Mitochondrienfunktion abhängig. Doppelfärbungen der Eberspermien mit R123 und PI zeigten deutlich (Abb. 6), dass nur die stark PI-gefärbten Zellen (PI++) toten, nicht motilen (R123Ø) Spermien entsprachen. Die Bedeutung der schwach gefärbten PI-Populationen blieb unklar. Wurde R123 nach der Färbung nicht ausgewaschen, sondern nur durch Überführen der markierten Spermiensuspension in die Messküvette verdünnt, erschienen alle defekten Zellen schwach R123 gefärbt.

▼ 72 

3.1.1.1  Optimierung der PI-Färbung für kapazitierte Spermien

Die Konzentration des PI wurde so niedrig gewählt, dass (i) keine Fixierung der Spermien nötig war und (ii) PI im Untersuchungszeitraum nicht zytotoxisch wirkte. Andererseits musste die PI-Konzentration hoch genug sein, um (iii) eine Trennung der Subpopulationen im Durchflusszytometer auch bei Messungen in großer Verdünnung sicher zu ermöglichen und (iv) eine Sättigung der Bindung zu erreichen (1PI-Molekül pro 4-5bp).

Da die Versuche zur Lipidorganisation vor allem an kapazitierten Eberspermien durchgeführt werden sollten, wurde zunächst die PI-Färbung für kapazitierte Spermien optimiert. Dazu wurde eine Spermienprobe kapazitiert und Aliquots zur PI-Färbung entnommen.

▼ 73 

Abb. 7: PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien: Aufspaltung der vom Durchflusszytometer aufgezeichneten Fluoreszenzpeaks in Abhängigkeit von der eingesetzten PI-Konzentration. Die Markierung der Spermien erfolgte direkt in der Messküvette für 5min bei 38,5°C. Die jeweilige PI-Konzentration und molare PI-Menge pro Zelle ist in Tabelle 1 angegeben.

Abbildung 7 zeigt an einem Beispiel die Verschiebung der Fluoreszenzpeaks in Abhängigkeit von der eingesetzten PI-Konzentration. Beim Färben der Eberspermien in der Messküvette war eine Abgrenzung der toten Zellen erst ab einer Konzentration von 0,75µM PI (1µl PI/2ml Puffer) möglich. Eine bessere Trennung der PI-Peaks erhält man mit 1,88µM PI (2,5µl/2ml Puffer), wobei dann der Anteil „toter“ Spermien bereits zunimmt.

In Tabelle 5 sind die verwendeten PI-Konzentrationen während der Markierungen und Messungen im Überblick dargestellt. Bei einem angenommenen mittleren DNS-Gehalt von 3µg/106 Eberspermien Anand, et al. (1967) und einem mittlerem Molekulargewicht von 600 g/mol und Basenpaare ergibt sich ein Gehalt von ca. 5 nmol Basenpaare/106 Spermienzellen. Eine Sättigung der gesamten DNS mit PI erfordert somit ca. 1nmol PI / 106 Zellen.

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Alternativ zur Markierung in der Messküvette erfolgte die PI-Färbung im Eppendorfgefäß. Die molare PI-Menge pro Spermium entsprach den Werten der Markierung in der Messküvette (Tab. 5). Lediglich das Volumen und somit die Konzentration der Spermien und des PI während der Färbung waren im Vergleich zur Messküvette erhöht.

Tab. 5: PI-Färbung von Eberspermien: Überblick über die zur Lebend-Tot-Färbung von Eberspermien getesteten PI-Konzentrationen. Die Zellzahl pro Färbungsansatz betrug ca. 1*106 Zellen.

Volumen der zugesetzten 1,5mM PI-Stammlösung [µl]

PI-Konzentration [µM] bei Markierung im Eppendorfgefäß à 250µl

PI-Konzentration [µM] bei Markierung/Messung in Küvette à 2ml

PI-Konzentration /

Anzahl der Zellen

[nmol PI / 106Spermien]

0,3

1,8

0,23

0,45

0,5

3,0

0,38

0,75

1,0

6,0

0,75

1,50

2,5

15,0

1,88

3,75

Abbildung 8 zeigt den Einfluss der Konzentrationsverhältnisse sowie den Einfluss der Abkühlung der Probe (38,5°C ♢ RT) während der PI-Färbung.

▼ 75 

Abb. 8: PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien: Einfluss der Inkubationsbedingungen (Konzentration und Temperatur) während der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien auf den Anteil (PI++)-gefärbter Zellen und auf die Fluoreszenzintensität des (PI++)-Peaks. Die PI-Konzentration und molare PI-Menge pro Zelle sind in Tabelle 1 angegeben. Die Spermien wurden jeweils 5min mit PI inkubiert und anschließend zügig am Durchflusszytometer gemessen. Die mit einem Pfeil markierten Säulen kennzeichnen die Versuchsbedingungen, bei denen eine deutliche Trennung der PI-Peaks erreicht wurde, ohne das der Anteil (PI++)-gefärbter Zellen massiv anstieg.

Als repräsentatives Beispiel sind die Ergebnisse eines Versuchstages dargestellt. Der Versuch wurde dreimal wiederholt. Die jeweiligen Resultate zeigten immer die gleiche Tendenz. Aufgrund der großen Streuung in der Lebensfähigkeit der Spermien nach Kapazitation wurden die Ergebnisse nicht gemittelt. Bei der Markierung kapazitierter Eberspermien im Eppendorfgefäß kann man mit deutlich geringeren Mengen an PI (nmol PI/Spermium) nach 5min Inkubation eine deutliche Trennung der PI-Peaks erhalten. Entscheidend für eine schnelle Farbstoffpenetration in permeable Zellen ist offensichtlich die höhere Konzentration von PI und Zellen im Volumen.

Wurden die zunächst im Eppendorfgefäß PI-gefärbten Spermien in die Messküvette mit vorgewärmten Puffer überführt und mehrere Minuten stehen gelassen, wurde ein Teil des Farbstoffes wieder ausgewaschen (Ergebnisse nicht gezeigt). Bei geringer PI-Konzentration (0,3µl PI/Eppendorfgefäß ♢1,8µM PI +2ml Messpuffer ♢ 0,23µM PI) konnte dann der Anteils toter Spermien in der Probe nicht mehr sicher bestimmt werden. Besonders bei Mehrfachmarkierungen war es deshalb wichtig, die PI-Konzentration nicht zu niedrig zu wählen und die Proben nach der PI-Färbung zügig am Durchflusszytometer zu vermessen.

▼ 76 

Ein Abfall der Temperatur von 38,5°C auf Raumtemperatur sollte während der PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien unbedingt vermieden werden. Wurden die Spermien hingegen erst auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend in der Messküvette 5min mit PI markiert, war der Anteil toter Zellen nicht massiv erhöht (Ergebnisse nicht gezeigt). Da kapazitationsbedingte Prozesse teilweise reversibel sind und eine reversible Umverteilung der Phospholipide in der Plasmamembran allein durch ein Absenken der Temperatur nicht ausgeschlossen werden kann, wurden alle Inkubationen möglichst bei 38,5°C durchgeführt.

In Abbildung 9 ist die Kinetik der PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien dargestellt. Der Anteil toter Spermienzellen erreichte nach ca. 10 min bei allen getesteten PI-Konzentrationen ein Plateau, das im Versuchszeitraum von 30 min relativ konstant blieb. Somit definiert die PI-Färbung auch für kapazitierte, nicht fixierte Spermien eine stabile Population plasmamembranintakter Zellen. Die relativ große Standardabweichung in diesen Kurven macht deutlich, wie hoch die Variabilität der untersuchten Proben hinsichtlich der Lebensfähigkeit kapazitierter Eberspermien war, obwohl für die Versuche nur Spermienproben guter Morphologie (75-83% morphologisch intakte Spermien) und hoher Motilität (70-80%) verwendet wurden.

Für die nachfolgenden Versuche wurde die Lebend-Tot-Färbung von Eberspermien mit PI entsprechend der oben erläuterten Ergebnisse durchgeführt. Die Markierung erfolgte entweder im Eppendorfgefäß mit 3/6 µM PI oder direkt in der Messküvette mit 0,75/1,88 µM PI für 5 min bei 38,5°C (wenn nicht anders ausgewiesen).

▼ 77 

Abb. 9: Zeitabhängigkeit der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien: Die Markierung der Spermien erfolgte im Eppendorfgefäß bei 38,5°C. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von 3 Spermienproben, die an einem Tag untersucht wurden (▼ 0,5 µl PI; ∆ 1,0 µl PI; ● 2,5 µl PI).

Innerhalb einer Versuchsreihe wurden grundsätzlich alle Proben mit der gleichen PI-Konzentration gefärbt, um die einzelnen Ergebnisse miteinander vergleichen zu können. Für Proben, die eine Doppelmarkierung mit NBD-PL zum Ziel hatten, wurde immer die höhere PI-Konzentration gewählt.

3.1.2 Einbau NBD-markierter Phospholipide in die Plasmamembran

Der Einbau der fluoreszenzmarkierten PL-Analoga in die Zellmembran der Eberspermien wurde zunächst am Fluoreszenzspektrometer verfolgt. Mit diesen Messungen war eine hohe zeitliche Auflösung gerade im Anfangsbereich der Einbaukinetik möglich. Sie stellen allerdings immer nur Mittelwerte über alle Zellen der untersuchten Spermiensuspension dar. Die Untersuchungen an kapazitierten Proben, die immer einen relativ hohen Anteil toter Zellen enthalten, wurden deshalb ausschließlich am Durchflusszytometer durchgeführt.

▼ 78 

Am Beispiel des NBD-PS ist in Abbildung 10 der konzentrationsabhängige Einbau des Labels in die Zellmembran von Eberspermien dargestellt. Die eingesetzte Menge des NBD-Labels entsprach in den Varianten a, b, c, d ca. 5/10/15/20% der endogenen Phospholipide der Plasmamembran. Im Experiment wurden die ersten 60 sec die Fluoreszenzintensität des NBD-PS im Puffer aufgezeichnet. Nach der Zugabe von Spermien in die Messküvette erfolgte der Einbau der Label in die Plasmamembran der Zellen bei allen untersuchten Konzentrationen mit einer sehr schnellen Anfangskinetik. In der Variante a erreichte die Fluoreszenzintensität nach ca. 1 min ein Plateau, während in den Varianten b, c, d ein biphasischer Anstieg über die gesamte Messzeit (7 min) beobachtet wurde. Nach Zugabe von Triton (1%) zu den markierten Spermien stieg die Fluoreszenzintensität bei diesen Varianten sprungartig auf einen Plateauwert an. Die NBD-PL-Mizellen, in denen es zum Quenching der NBD-Fluoreszenz kam, sowie nicht eingebaute NBD-Monomere aus der wässrigen Phase wurden in Triton solubilisiert und zeigten nun eine hohe Quantenausbeute. Bei einer Labelmenge von ca. 5% der endogenen Membranphospholipide (Kurve a), erfolgte der Einbau der Phospholipidanaloga in die Plasmamembran vollständig, da es auch nach Tritonzugabe zu keinem weiteren Fluoreszenzanstieg kam. Die Quantenausbeute des Labels war in Triton somit unverändert zu jener in der Spermienmembran.

Abb. 10: Kinetiken des Einbaus von NBD-PS in die Zellmembran von Eberspermien: Bei gleichbleibender Spermienkonzentration (~5*106 Zellen/ml) wurde die Konzentration des NBD-Labels variiert (a) 0,12 µM, (b) 0,24 µM, (c) 0,36 µM, (d) 0,48 µM und dessen Einbau verfolgt. Die letzten 120 sec zeigt die Fluoreszenzintensität nach Zugabe von Triton (1%).

Entsprechend den Erläuterungen im Methodikteil (2.3.6. Fluoreszenzspektroskopie, S.44f) wurden die Kinetiken in SigmaPlot normiert (Kurven nicht gezeigt). Die Einbaukinetik der Variante a konnte sehr gut durch eine monoexponentielle Funktion mit einer Halbwertszeit von 8,8 sec angepasst werden. Die Kinetiken b, c, d konnten nicht monoexponentiell angepasst werden, mehrere Prozesse überlagern sich. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei zum einen um den Einbau der NBD-Monomere in die äußere Lamelle der Plasmamembran, zum zweiten um die Einwärtstranslokation des NBD-PS auf die zytoplasmatische Seite. Eine einfache Überlagerung zweier exponentieller Funktionen ergab eine gute Anpassung an die Messkurve b mit Halbwertszeiten von 8,8 sec und 4,8 min. Letztere Halbwertszeit stimmt in der Größenordnung gut mit bereits veröffentlichten Translokationszeiten für NBD-PS in Säugerspermien bei Raumtemperatur überein: Bulle t1/2= 1,8 min; Schafbock t1/2 ca. 3 min; Eber t1/2= 7,5 min Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1994) ;Nolan, et al. (1995). Für die Varianten c und d war auch die Überlagerung zweier Exponentialfunktionen nicht ausreichend, die Anfangskinetik des Labeleinbaus konnte aber auch bei diesen Kurven mit einer Halbwertszeit von ca. 9 sec gut angepasst werden. Welche Prozesse sich bei diesen Messungen überlagerten, konnte nicht im Detail geklärt werden. Ein Quenching der NBD-Fluoreszenz benachbarter Label in der Membran ist wahrscheinlich.

▼ 79 

Für alle folgenden Messungen am Durchflusszytometer wurde die Menge der verwendeten NBD-PL so eingestellt, dass ein Labelanteil von 2% der endogenen Membranphospholipide nicht überschritten wurde. Trotzdem kam es bei allen Experimenten zu einem Fluoreszenzanstieg der Spermien während der Inkubationszeiten. Ein Dequenchingeffekt aufgrund zu hoher Labelkonzentration ist nach den oben beschriebenen Versuchen am Photometer unwahrscheinlich. Die Intensität der Markierung der Spermien nahm auch nach dem Waschen der markierten Zellen weiter zu. Dies könnte einerseits durch den Verbleib nicht eingebauter Label in Interzellularräumen erklärt werden, aber auch eine Zentrifugation der markierten Spermien über einen Percollgradienten änderte an diesem Fluoreszenzanstieg nichts. Ein Teil der Label könnte mit der Plasmamembran der Spermien assoziiert sein, sich aber erst allmählich einbauen und/oder homogen über diese verteilen.

Abbildung 11 zeigt die Kinetik des Einbaus der NBD-PL in gewaschene (a, c) und in kapazitierte (b, d) Eberspermien im Vergleich. Auf ein Auswaschen nicht eingebauter Label wurde verzichtet. Die PI-Färbung (1,88 µM) erfolgte für jedes Aliquot direkt vor der Messung in der Messküvette für 2 min. NBD-PS (a, b; n=5) wurde sowohl in lebende (offene Symbole) als auch in tote (gefüllte Symbole) Spermien sehr schnell eingebaut, wobei (PI++)-Spermien zunächst deutlich mehr Label pro Zeit aufnahmen als (PI-)-Zellen.

Nach 15-20 min erreichte die Fluoreszenzintensität der toten, NBD-PS markierten Zellen ein Maximum bzw. Plateau, während in lebenden Zellen bei allen Versuchen ein kontinuierlicher Fluoreszenzanstieg beobachtet wurde. Dieser Anstieg könnte mit dem Transport des Labels auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran einhergehen. Nach einer Markierungsdauer von einer Stunde waren die NBD-Fluoreszenzintensitäten lebender und toter Spermien annähernd gleich.

▼ 80 

Auch für NBD-PC (c, d; n=3) war die Fluoreszenzintensität des Markers in (PI++)-Zellen deutlich höher als in den (PI-). Im Gegensatz zu PS stieg in den toten Zellen die Intensität über die gesamte Messzeit weiter an. Die Integrität der Plasmamembran war offensichtlich so verändert, dass NBD-PC vermehrt aufgenommen wurde oder ins Zellinnere gelangen konnte und sich dort auch in andere Membranen einbaute. In lebenden Zellen erreichte die Einbaukurven nach ca. 30 min ein Plateau. Wurden die Eberspermien zunächst kapazitiert und anschließend markiert, konnte man vergleichbare Einbaukinetiken der NBD-PL (Abb. 11 (b) PS; (d) PC) beobachten.

Abb. 11: Einbau NBD-markierter PL in die Membran von Eberspermien: In TALP gewaschene Spermien wurden vor (a, c) und nach (b, d) Kapazitation der Zellen mit NBD-PL markiert. Im Laufe der Markierung wurde je ein Aliquot der Spermiensuspension entnommen in der Messküvette für 2 min mit 2,5 µl PI gefärbt und am Durchflusszytometer gemessen. Gefüllte Symbole kennzeichnen (PI++)-Zellen, offene Symbole hingegen (PI-)-Zellen (▲∆ NBD-PS, ●○ NBD-PC).

Für die Translokationsexperimente an Eberspermien war es erforderlich, zu jedem Untersuchungszeitpunkt einen Fluoreszenzwert vor und nach Dithionitzugabe zu ermitteln und zwischen lebenden und toten Zellen sauber zu unterscheiden.

3.1.3  Kombination verschiedener Fluoreszenzmarker

3.1.3.1  Wechselwirkungen zwischen den Markern

▼ 81 

Um Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Markern bzw. Fluoreszenzgruppen auszuschließen, wurden zunächst alle Label in Einzel- und Doppelmarkierungen getestet. Bei allen Komarkierungen zeigte sich eine geringe Intensitätsverschiebung der Fluoreszenzpeaks. Solange die Peaks deutlich voneinander getrennt blieben, hatte dies keinen Einfluss auf die prozentuale Anzahl der Zellen, die rot (PI) oder grün (FITC-AnV, -PSA, -PNA, R123, NBD-PL) markiert erschienen. Allerdings mussten die Regionen der nicht (Ø), schwach (+) oder stark (++) gefärbten Spermien entsprechend angepasst werden.

Am Beispiel der FITC-AnV/PI Markierung von Eberspermien werden die beobachteten Wechselwirkungen genauer dargestellt. Für die Kombinationen von R123/PI sowie NBD-PL/PI wurden die gleichen Untersuchungen durchgeführt. Wechselwirkungen dieser Marker untereinander, die einen Einfluss auf die Auswertung der Messungen am Durchflusszytometer haben könnten, wurden ausgeschlossen.

Bei der Doppelmarkierung von Eberspermien mit FITC-AnV und PI kam es zu einer leichten Überschätzung des Anteils (PI++)-gefärbter Spermien und einer Unterbewertung des Anteils AnV-markierter Zellen durch die Intensitätsveränderungen der Fluoreszenzpeaks. Dies ließ zunächst einen Energietransfer vom FITC auf das PI vermuten.

▼ 82 

Abb. 12: Vergleich von Einzel- und Doppelmarkierung von Eberspermien mit FITC-AnV (○) und PI (●). Im linken Diagramm sind die arithmetischen Mittelwerte der Fluoreszenzpeaks (FITC bzw. PI) markierter Spermien aufgetragen, im rechten Diagramm dagegen der prozentuale Anteil der jeweils fluoreszenzmarkierten Zellen. Die Regressionsgeraden sollen die Tendenzen verdeutlichen. Für jeden Messpunkt wurde zunächst ein Aliquot der nur FITC-AnV markierten Spermien bzw. eines der nur PI-gefärbter Zellen vermessen. Im Anschluss wurde ein Aliquot der FITC-AnV markierten Spermien mit PI komarkiert und vermessen. Die PI-Färbung erfolgte für 5min in der Messküvette mit 2,5µl PI (1,88µM).

Abbildung 12 zeigt die Auswertungen von Einzel- und Doppelmarkierungen kapazitierter Eberspermien mit PI und/oder FITC-AnV nach Messung der Proben am Durchflusszytometer. Im linken Diagramm sind die arithmetischen Mittelwerte der Fluoreszenzpeaks markierter Spermien aufgetragen, im rechten dagegen der prozentuale Anteil der jeweils fluoreszenzmarkierten Zellen nach Anpassung der Regionen. Die Abbildung 12 macht deutlich, dass es durch die Anpassung der Auswertung (Verschiebung der Region markierter Zellen) trotz relativ großer Peakverschiebungen (relativ große Abweichung der Regressionsgeraden von der zu erwartenden Gerade y=x) möglich war, den Anteil stark markierter Spermien auch in den Doppelmarkierungen sicher zu bestimmen (relativ geringe Abweichung der Regressionsgeraden von der zu erwartenden Gerade y=x).

Abb. 13: Spektren von mit FITC-AnV und PI markierten Spermien: Die Zellen wurden wie in Material und Methoden beschrieben markiert und je 25µl der markierten Spermiensuspension in 2ml Puffer im Fluoreszenzspektrometer gemessen. Spaltbreite FITC-Fluoreszenz (oben): 5/10, PI-Fluoreszenz (unten): 10/20 PI (— —), FITC-AnV/PI (——), FITC-AnV (—٠٠—).

▼ 83 

Messungen am Fluoreszenzspektrometer (Abb.13) ergaben keinen Hinweis auf eine Energieübertragung von FITC-AnV auf PI. In diesem Fall hätte man einen Intensitätsanstieg des Emissionsspektrums im Bereich roter Wellenlängen (600nm) bei doppelt markierten Spermien im Vergleich zu einfach markierten erwartet (unten rechts). Waren die Spermien nur mit einem der Label markiert, ergab sich hingegen eine geringfügig höhere Intensität im Absorptions- und Emissionsspektrum. Diese Tendenz wurde auch bei Komarkierung von R123 bzw. NBD-PL mit PI beobachtet. Abbildung 13 macht des weiteren deutlich, dass die Fluoreszenzspektren des FITC-AnV und des PI durch die optischen Filter des Durchflusszytometer (FL1: TK500, EM 515-560; FL3: TK610, RG630) sauber voneinander getrennt werden konnten. Die Fluoreszenzintensität des FITC war bei einer Anregung mit 488nm um Größenordnungen höher als die des PI.

Eine Wechselwirkung zwischen FITC-AnV und PI an Einzelzellen konnte mit den Messungen am Fluoreszenzspektrometer nicht bestätigt aber auch nicht ausgeschlossen werden. Die Untersuchungsbedingungen für markierten Zellen im Vergleich zu Messungen am Durchflusszytometer unterscheiden sich erheblich.

3.1.3.2 Farbkompensierung am Durchflusszytometer

Die im Bereich grüner Wellenlängen fluoreszierenden Label können mit dem 488nm-Argon-Laser wesentlich effektiver angeregt werden als die im roten Bereich emittierenden Label, deren Fluoreszenzanregung weit vor dem Extinktionsmaximum erfolgt. Um die roten Fluorophore überhaupt anregen zu können, ist eine relativ hohe Laserleistung nötig. Dies hat ein gewisses Überstrahlen der Grünfluoreszenz in den Rotkanal zur Folge, da mit zunehmender Fluoreszenzintensität auch die Breite des Emissionspeaks zunimmt. Zu Beginn eines jeden Versuchstages wurde deshalb eine mit einem grünen Fluoreszenzlabel (z.B. FITC-AnV) markierte Spermienprobe am Durchflusszytometer gemessen und die entsprechende Kompensierung festgelegt. Zahlreiche Kontrollen haben gezeigt, dass bei gleichbleibendem Markierungsprotokoll diese Kompensierung für alle folgenden Doppelmarkierungen übernommen werden kann.

3.2  Die transversale Lokalisation der Phospholipide in der Plasmamembran von Eberspermien während der Genese - Durchflusszytometrische Analysen

▼ 84 

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Durchflusszytometrie von unterschiedlich markierten Eberspermien während der Kapazitation und Akrosomreaktion zusammenhängend dargestellt. Zahlreiche Untersuchungen der markierten Eberspermien erfolgten zudem mikroskopisch. Die Ergebnisse dieser Versuche werden im Kapitel 3.3 zusammengefasst.

3.2.1  Transversale Organisation fluoreszenzmarkierter Phospholipidanaloga

3.2.1.1  Einwärtstranslokation der NBD-Phospholipide

Für alle Translokationsexperimente erfolgte der Einbau der NBD-PL in die Plasmamembran der Eberspermien für NBD-PS 2-10 min und für NBD-PC 20-30 min (wenn nicht anders angegeben).

Abb. 14: Auswertung durchflusszytometrischer Messungen zur Translokation von NBD-PL: In TALP gewaschene Eberspermien wurden für 5 min mit NBD-PS und PI (1,8 µM) markiert und ein Aliquot in 2 ml TALP am Durchflusszytometer analysiert (obere Abb.). Direkt in die Messküvette wurde im Anschluss an die erste Messung 10 mM Dithionit gegeben und die Probe nach 1 min noch einmal gemessen (untere Abb.). Im 2-Parameter-Plot der Fluoreszenzen wurden die Populationen lebender (∗) und toter (†) Zellen festgelegt. Im Histogramm der NBD-Fluoreszenz wird die Verschiebung des Intensitätspeaks (angegeben ist der arithmetische Mittelwert) intakter Spermien deutlich sichtbar. Die Markierung und Messung erfolgte bei Raumtemperatur.

▼ 85 

Die PI-Färbung erfolgte unmittelbar vor der jeweiligen Messung (1,88 µM) für 5 min in der Messküvette. Je ein Aliquot der markierten Spermienprobe wurde zunächst ohne und 3 min später mit Dithionit (10 mM, 1 min) am Durchflusszytometer gemessen.

Anhand der Abbildung 14 soll die Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen der mit NBD-PL markierten Spermien erläutert werden. Aufgrund der unterschiedlichen Fluoreszenzintensität lebender und toter Spermien war eine Auswertung in Quadranten (unmarkiert / nur grün / nur rot / rot und grün) nicht möglich. Deshalb wurden im 2-Parameter-Plot der Fluoreszenzen die Populationen lebender (∗) und toter (†) Zellen durch Festlegung von Regionen eingeteilt. Die Fluoreszenzintensitäten und die Anzahl der in diesen Regionen registrierten Zellen konnten somit separat ausgewertet werden.

Der Anteil PI-unmarkierter Partikel, deren NBD-Fluoreszenz des PS-Labels zu einem großen Teil oder komplett gelöscht werden konnte (siehe Abb.14, unteres Bild, ?, gestrichelter Kasten, 9%) betrug bei gewaschenen 12±7% (n=14), bei kapazitierten 24±6% (n=15) und bei akrosomreagierten Eberspermien 35±9% (n=3). Für die weitere Auswertung der Translokationsexperimente wurden bei den Versuchen mit NBD-PS-Markierung nur die lebenden Zellen betrachtet, deren Fluoreszenz im Bereich des schmalen Peaks, wie im Histogramm (Abb. 14) eingezeichnet, lag. Bei den Versuchen mit NBD-PC-Markierung war eine derartige Ausgrenzung nicht möglich.

▼ 86 

Der Labelanteil, der sich zum Zeitpunkt der Messung auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran befand, wurde wie folgt berechnet:

Um den Anfangsbereich der Kinetik der PS-Translokation messen zu können, wurde eine minimale Markierungszeit von 2 min für den Einbau des NBD-PS und 3 min für die PI-Färbung (1,88µM) nach Überführen des Aliquots in die Messküvette gewählt. Zum Zeitpunkt der ersten Messung am Durchflusszytometer befanden sich bei membranintakten Zellen bereits 64% des NBD-PS auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran, während nach 10 min nur 8,5% des NBD-PC für die Reduktion durch Dithionit unzugänglich waren. NBD-PS wurde bei frischen Eberspermien zu 93±7% (n=5, 80 min) auf der zytoplasmatischen Seite angereichert. Die Translokation von NBD-PC erfolgte hingegen sehr langsam. Nach 95 min befanden sich bei lebenden Zellen 36±2% (n=3) auf der zytoplasmatischen Seite.

▼ 87 

Abbildung 15 zeigt die Auswertung der Translokationsexperimente an frisch gewaschenen sowie an kapazitierten Eberspermien. Für NBD-PC wurde in den drei gepaarten Versuchen keine Änderung der Geschwindigkeit oder des Ausmaßes der Einwärtsbewegung des Analogons gefunden. Die Translokation des NBD-PS zur zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran war hingegen bei den kapazitierten Eberspermien immer verlangsamt.

Abb. 15: Kinetik der Translokation NBD-markierter PL in der Zellmembran von Eberspermien. Dargestellt sind Mittelwerte (NBD-PS: n=5, ●○; NBD-PC: n=3, ■□) und Standardabweichung. Die Translokationsdaten für NBD-PS wurden an eine monoexponentielle Funktion angepasst. Geschlossene Symbole kennzeichnen die Werte für frisch gewaschene Spermien, offene Symbole hingegen Werte für kapazitierte Zellen.

Die monoexponentiellen Anpassungen an die gemittelten Translokationsdaten von NBD-PS ergaben für frische Spermien: Linnen = 89,5 ± 1,7%, ki = 0,236 ± 0,024 min-1 und für kapazitierte Eberspermien: Linnen = 79,2 ± 0,9%, ki = 0,153 ± 0,008 min-1. Ein statistischer Vergleich der Einzelwerte mittels t-Test weist eine signifikante Verringerung des zytoplasmatisch akkumulierten Labelanteils in kapazitierten Spermien nach 10 min sowie nach 80 min, nicht aber zwischen den Werten bei 45min auf.

▼ 88 

In die Auswertung der Translokationskinetiken wurden nur die Versuche mit einbezogen, bei denen mindestens 60% der Spermien nach der entsprechenden Inkubation vital waren. Proben, in denen die Lebensfähigkeit der Spermien zu schlecht war, zeigten auch bei den PI-ungefärbten Zellen eine deutlich verlangsamte Translokation des NBD-PS – unabhängig von der Vorbehandlung der Zellen. Die Abbildung 16 soll diesen Zusammenhang deutlich machen. Von 10 Einzelversuchen wurde der Anteil lebender (PI-negativer) Zellen im Verhältnis zum Anteil des zytoplasmatisch angereicherten NBD-PS in den lebenden Spermien dargestellt. Vergleichende Versuche an Spermienproben verschiedener Eber zeigten des weiteren eine schnellere Translokation von NBD-PS in den Proben, deren Morphologie, Stabilität im Thermoresistenztest und Akrosomreaktionsvermögen am besten war (Daten nicht gezeigt).

Abb. 16: Zusammenhang zwischen der Gleichgewichsverteilung des NBD-PS in der PM und dem Anteil lebender Zellen in den untersuchten Spermienproben: Dargestellt sind die Ergebnisse von 10 unabhängigen Einzelversuchen (● frische, ○ kapazitierte Eberspermien). In Proben, in denen viele tote (PI++) Zellen enthalten sind, wird auch in den lebenden (PI-) Spermien NBD-PS in geringerem Ausmaß auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran akkumuliert.

3.2.1.2 Auswärtstranslokation der NBD-Phospholipide

Ziel dieser Versuche war es, unterscheiden zu können, ob die Verlangsamung der Translokation durch eine schnellere Auswärtsbewegung der Phospholipide in der Plasmamembran oder durch einen tatsächlich verlangsamten Einwärtstransport erklärt werden kann. Dazu wurden die zuvor inkubierten Eberspermien (frisch gewaschen bzw. kapazitiert) mit NBD-markierten Phospholipiden gelabelt und schließlich aller zugänglicher Label reduziert bzw. mit BSA entzogen. Die nun nur auf der zytoplasmatischen Seite markierten Eberspermien wurden weiter im BSA-haltigen TALP inkubiert (bei RT bzw. 38,5°C). Ein Aliquot wurde in Abständen am Durchflusszytometer vermessen. Abbildung 17 zeigt die Auswertung von je zwei unabhängigen Versuchen. Die Auswärtstranslokation des NBD-PC zur exoplasmatischen Seite erfolgte in allen Versuchen schneller als die des NBD-PS. Lediglich 8-15% der NBD-PS-Analoga erschienen innerhalb der 2stündigen Messdauer auf dem äußeren Monolayer der Plasmamembran.

▼ 89 

Abb. 17: Auswärtsbewegung NBD-markierter PL in der Zellmembran von Eberspermien. Dargestellt sind je 2 unabhängige Versuche. Geschlossene Symbole kennzeichnen die Werte für frisch gewaschene, bei RT inkubierte Spermien, offene Symbole hingegen Werte für kapazitierte Spermien.

In lebenden Spermienzellen konnte keine Änderung der Auswärtsbewegung der Phospholipide nach Kapazitation nachgewiesen werden.

3.2.2 Exposition von endogenem PS: FITC-AnV/PI-Markierung von Eberspermien

3.2.2.1  Veränderung der FITC-AnV/PI-Markierung im Verlauf der Inkubation

▼ 90 

Die kalziumvermittelte Bindung von FITC-AnV an endogenes PS wurde in Kombination mit dem Lebend-Tot-Farbstoff PI als Marker der transversalen Asymmetrie der Phospholipide in der Zellmembran der Eberspermien genutzt. Die Stabilität der Phospholipidasymmetrie wurde während der In-vitro-Kapazitation und Akrosomreaktion untersucht.

Zur Kontrolle der Inkubationsbedingungen wurde mittels PSA-Markierung der Anteil akrosomreagierter Spermien verfolgt. In allen untersuchten Proben konnte die Akrosomenreaktion in kapazitierten Eberspermien durch die Zugabe des Kalziumionophors ausgelöst werden. Aus der Differenz PI-gefärbter und PSA-markierter Zellen ergibt sich jeweils der Anteil lebender akrosomreagierter Spermien (*), der für die Routineuntersuchung von Eberspermien bewertet wird. Im rechten Diagramm der Abbildung 18 wird dies am Beispiel einer Spermienprobe mit sehr stabiler Lebensfähigkeit verdeutlicht. Der Anteil AnV-bindender Zellen war in dieser Probe über den gesamten Inkubationszeitraum sehr niedrig.

Generell bindet die Mehrzahl (87±6%) der frischen, in TALP gewaschen Eberspermien FITC-AnV nicht. Lediglich 6±3% der Zellen erscheinen mit FITC-AnV markiert. Eine 10 minütige Inkubation der Spermien bei 38,5°C in TALP ohne Heparin führte zu einer Zunahme der FITC-AnV-Bindung an die Zellen. Gleichzeitig stieg aber auch die Anzahl der PI-gefärbten Zellen. Nach Kapazitation der Eberspermien kam es zu einer signifikanten Zunahme der FITC-AnV-bindenden und der PI-gefärbten Spermien. Abbildung 18 und Tabelle 6 zeigen die Ergebnisse von 12 Versuchen, bei denen im Zeitverlauf der Spermieninkubation mehrmals eine Markierung und durchflusszytometrische Analyse eines Aliquots der Proben erfolgte.

▼ 91 

Abb. 18: Markierung von Eberspermien im Verlauf der In-vitro-Inkubation der Zellen: Dargestellt sind das veränderte AnV-Bindungsverhalten, die zunehmende Destabilität der Plasmamembran (PI-Färbung) sowie die Akrosomreaktion – gekennzeichnet durch eine PSA-Bindung an Komponenten des akrosomalen Inhalts. Die Eberspermien wurden entsprechend des Protokolls „Kapazitation IFN“ 45 min kapazitiert. Anschließend wurde die Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors ausgelöst. Die Markierung erfolgte entsprechend der Angaben im Methodikteil. Im linken Diagramm sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen von 12 unabhängigen Versuchen dargestellt. Das rechte Diagramm verdeutlicht hingegen am Beispiel einer Spermienprobe mit sehr stabiler Lebensfähigkeit die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion in lebenden, kapazitierten (*) Spermien durch Ionophorzugabe. Der Anteil AnV-bindender Zellen war in dieser Probe über den gesamten Inkubationszeitraum sehr niedrig.

Nach 30minütiger Inkubation der kapazitierten Eberspermien mit dem Ionophor nahm die Anzahl lebender Zellen signifikant ab. Die Intensität der FITC-AnV-Bindung und der Anteil FITC-AnV-markierter Zellen sank hingegen nach Ionophorzugabe ab. Bei den meisten Spermienproben war nach 30 min durchflusszytometrisch keine intensive FITC-AnV-Markierung der Zellen detektierbar. Ein Quenching der FITC-Fluoreszenz durch das Ionophor konnte entsprechend der mikroskopischen Untersuchungen (siehe 3.3.2, S.76ff) ausgeschlossen werden.

Tab. 6: Entwicklung der AnV/PI–Markierung von Eberspermien im Zeitverlauf der In-vitro-Kapazitation und Akrosomreaktion: Ausgewertet wurden 12 unabhängige Einzelversuche, deren durchflusszytometrische Ergebnisse als Mittelwert und Standardabweichung der prozentualen Anteile der jeweiligen Zellenkategorie angegeben sind. Der gepaarte t-Test der Ausgangsdaten ergab zwischen den gekennzeichneten Gruppen signifikante Unterschiede (Pa/b<0,0005; Pc/d<0,005; Pe/f<0,05).

 

AnV-/PI- [%]

∑AnV+ [%]

AnV+/PI- [%]

AnV+/PI+ [%]

∑PI+ [%]

gewaschen in TALP

87 ± 6 a

5 ± 3 c

1 ± 1

4 ± 2 c

12 ± 5 a,c

10 min bei 38,5°C

76 ± 12

13 ± 8

5 ± 2

7 ± 6

19 ± 10 e

Kapazitation für 45 min

57 ± 11 b

22 ± 11 d

6 ± 5

17 ± 8 d

37 ± 8 d,f

10 min Kalziumionophor

62 ± 23

20 ± 22

8 ± 9

12 ± 13

31 ± 14 f

30 min Kalziumionophor

57 ± 14 b

7 ± 6 c

3 ± 2

3 ± 4 c

42 ± 16 b,f

3.2.2.2 Variabilität der FITC-AnV/PI–Markierung kapazitierter Eberspermien

▼ 92 

Im Laufe der Untersuchungen zu dieser Arbeit wurden viele verschiedene Spermienproben hinsichtlich ihrer FITC-AnV-Bindung nach Kapazitation analysiert. Dabei unterschieden sich nicht nur die Prozentsätze der jeweils markierten Spermien erheblich, sondern auch die Intensität der AnV-Markierung.

Abb. 19: AnV-Markierung und PI-Färbung kapazitierter Eberspermien: Die Inkubation der Spermien erfolgte entweder für 45 min bei 38,5°C im Wärmeblock (●) oder für 2 h im Zellkulturschrank bei 38,5°C (○), die nachfolgende Markierung für 5 min bei 38,5°C im Dunkeln (1 µg/ml FITC-AnV, 1,9-6 µM PI).

In Abbildung 19 sind die prozentualen Anteile FITC-AnV-markierter und PI-gefärbter Spermien der einzelnen Versuche gegeneinander aufgetragen. Abbildung 20 zeigt charakteristische Bilder der 2-Parameter-Darstellung kapazitierter, FITC-AnV- und PI-markierter Spermien am Durchflusszytometer. Die Inkubation der Eberspermien erfolgte bei den in Abbildung 20 dargestellten Beispielen jeweils entsprechend des Protokolls „Kapazitation IFN“ für 45 min bei 38,5°C in TALP (+BSA, +CaCl2, +Heparin).

▼ 93 

Abb. 20: Variabilität der AnV / PI – Markierung verschiedener Spermienproben nach Kapazitation: Dargestellt sind die 2-Parameter-Diagramme der FITC und der PI Fluoreszenz durchflusszytometrisch untersuchter Eberspermien. Die Inkubation der Zellen erfolgte nach dem Protokoll „Kapazitation IFN“, die nachfolgende Markierung für 5min bei 38,5°C im Dunkeln (1µg/ml FITC-AnV, 3µM PI).

3.2.2.3 Einflussfaktoren auf die FITC-AnV/PI–Markierung kapazitierter Eberspermien

Hinsichtlich der Aufarbeitung und Inkubation der Eberspermien wurden entsprechend den Erläuterungen im Methodikteil folgende Faktoren variiert: (i) zweimaliges Waschen in TALP oder Aufreinigung über Percollgradienten, (ii) eine Inkubation in An- bzw. Abwesenheit von Kanamycin, BSA, CO2, Heparin und (iii) eine Verlängerung der Kapazitationsdauer von 45 min auf bis zu 4 h.

Percoll

▼ 94 

(i) Im Vergleich zum zweimaligen Waschen in TALP wurden die flüssigkonservierten Spermien über einen Percollgradienten aufgereinigt, um aufgelagerte Seminalplasmaproteine, die eventuell eine AnV-Bindung blockieren könnten, effektiver zu entfernen. In einem gepaarten Versuch zeigte sich bei den über Percoll aufgereinigten Spermien ein geringerer Anteil markierter Spermien im Vergleich zu den in TALP gewaschenen Zellen (∑AnV+ 2%/4%, PI+ 5%/13% und AnV+/PI- 0,3%/2%). Offensichtlich wurden durch die Percollzentrifugation intakte Spermien selektiv angereichert und Verunreinigungen effektiv abgetrennt. Auch im Streulicht, dass eine eng abgegrenzte Spermienpopulation zeigte, wurde die bessere Trennung der Spermien von anderen Partikeln deutlich.

Tab. 7: Einfluss einer Percollaufbereitung der Spermien auf den Anteil AnV- und PI-markierter Zellen nach Kapazitation: Die Inkubation der Spermien erfolgte für 45 min im WB. Angegeben sind die prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen zweier gepaarter Versuche.

AnV+/PI-

AnV +

PI +

in TALP gewaschen

6,2% 15,1%

14,9% 29,1%

42,2% 25,9%

über Percoll aufgereinigt

0,9% 6,0%

8,6% 26,6%

45,7% 25,4%

Nach Kapazitation unterschied sich der prozentuale Anteil PI-gefärbter Zellen zwischen den beiden Varianten nicht mehr, während der Anteil AnV-bindender Spermien in den Varianten nach Percollaufbereitung etwas niedriger war. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse von zwei gepaarten Versuchen. Ein Teil der durchflusszytometrisch erfassten (AnV+/PI-)-Partikel in den einfach gewaschenen Proben könnte somit von zusammengelagerten Plasmatropfen, abgelösten Kopfkappen oder anderen “Nicht-Spermien-Ereignissen” herrühren.

▼ 95 

(ii) Bei der Flüssigkonservierung und der In-vitro-Inkubation von Spermienzellen werden häufig Antibiotika zur Unterdrückung des Keimgehaltes eingesetzt. Es sollte untersucht werden, ob die Anwesenheit von Kanamycin während der Kapazitation der Eberspermien einen Einfluss auf deren Lebensfähigkeit oder die transversale Phospholipidasymmetrie hat.

Kanamycin

In einem gepaarten Versuch führte die Anwesenheit von Kanamycin im HBT-Kapazitationsmedium zu einer stärkeren Destabilisierung der Plasmamembran im Vergleich zur Kapazitation in HBT ohne Kanamycin. Der Anteil PI-gefärbter Zellen war erhöht (19,8 %/13,9 %), ebenso der Anteil AnV-bindender Zellen (gesamt: 41,7 %/27,9 % bzw. AnV+/PI-: 27,3 %/21,4 %). In diesem Versuch wurde scheinbar ein Scrambling der Phospholipide durch Kanamycin gefördert, allerdings war der Anteil AnV-bindender bzw. PI-gefärbter Zellen in der Variante ohne Antibiotikum auch sehr hoch. Weitere Versuche zur Kapazitation von Eberspermien in HBT (+Kanamycin) für zwei Stunden ergaben im Mittel keine Erhöhung des Anteils AnV-bindender Spermien (AnV+/PI- 3±2%, AnV+ 8±4%, PI+ 29±5%, n=5) verglichen mit mittleren Werten nach zweistündiger Kapazitation (siehe Tabelle 10). Diese Spermienproben zeigten jedoch alle eine sehr stabile Lebensfähigkeit, ein direkter Vergleich ohne Kanamycin erfolgte bei diesen Versuchen nicht.

▼ 96 

Kapazitationsfaktoren

Als wichtige Kapazitationsfaktoren gelten unter anderem BSA, und Heparin (siehe Einleitung). Ziel der folgenden Versuche war es, einen eventuellen Effekt einer der Substanzen auf die Membranintegrität während der Kapazitation von Eberspermien zu untersuchen. Die Gegenwart von BSA im Kapazitationsmedium führte zu einem starken Anstieg des Anteils PI-gefärbter Zellen im Vergleich zu dem Aliquot, das ohne BSA inkubiert wurde. Der Anteil AnV-bindender Spermien war in den Proben vergleichbar. Die gleiche Tendenz zeigte sich beim Vergleich der Inkubation im Wärmeblock bzw. im Zellkulturschrank (5% CO2). Im Zellkulturschrank starben die Spermien in den unten dargestellten Versuchen massiv ab. Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der gepaarten Versuche mit und ohne BSA und CO2 im Überblick.

Tab. 8: Einfluss von BSA und CO2 auf die FITC-AnV/PI Markierung kapazitierter Spermien: Angegeben sind die prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen bzw. die Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 gepaarten Versuchen.

Einzelmarkierung

AnV +

PI +

ohne BSA

40,1%

15,5%

mit BSA

35,0%

41,4%

Doppelmarkierung

AnV+ / PI-

AnV +

PI +

ohne CO2

7,5% 15,3%

21,1% 20,1%

39,2% 37,4%

mit CO2

7,9% 7,1%

32,1% 20,0%

56,7% 67,0%

ohne BSA / mit CO2

7,4 ± 5,4 %

15,0 ± 8,4 %

27,2 ± 3,6 %

mit BSA / ohne CO2

7,3 ± 3,7 %

17,0 ± 6,3 %

34,8 ± 5,6 %

▼ 97 

In den Versuchen, die eine Inkubation mit und ohne BSA kombiniert mit der Ab- bzw. Anwesenheit von CO2 untersuchten, war kein Unterschied hinsichtlich der Membranintegrität zu erkennen. Sie dienten vor allem zur Kontrolle der Inkubationsbedingungen beim Einbau von NBD-PL in die Zellmembran der Eberspermien. Für die Ergebnisse dieser 4 gepaarten Versuche sind in der Tabelle 8 die Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Spermien angegeben. Sowohl die AnV-Markierung als auch die PI-Färbung waren in diesen Versuchen unabhängig von der Anwesenheit von BSA und CO2 während der Inkubation der Spermien.

Tab. 9: Einfluss von Heparin auf die FITC-AnV/PI-Markierung kapazitierter Spermien: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen von 6 gepaarten Versuchen. Der gepaarte t-Test ergab bezüglich des Anteils PI-gefärbter Zellen einen signifikanten Unterschied (Pa/b=0,02) zwischen den beiden Versuchsvarianten.

AnV+ / PI-

AnV +

PI +

ohne Heparin

12,4 ± 4,8 %

22,9 ± 8,3 %

24,0 ± 12,6 % a

mit Heparin

14,2 ± 6,1 %

24,7 ± 13,0 %

29,2 ± 13,2 % b

Erfolgte die Kapazitation der Eberspermien mit Heparin im Kapazitationsmedium, war der Anteil PI-gefärbter Zellen im Vergleich zu den Proben, die ohne Heparin inkubiert wurden, signifikant erhöht (P=0,02). Hinsichtlich der AnV-Bindung ergaben die Versuche, deren Ergebnisse in Tabelle 9 dargestellt sind, keinen signifikanten Unterschied.

▼ 98 

Unter den getesteten Versuchsbedingungen konnte keiner der untersuchten Kapazitationsfaktoren (BSA, CO2, Heparin) ein massives Scrambling der Phospholipide in der Plasmamembran lebender Spermien induzieren, obwohl sich die Membranstabilität gegenüber dem PI durch ihre Anwesenheit während der Kapazitation deutlich verringerte.

Kapazitationsdauer

(iii) Eberspermien wurden vergleichsweise für 45 min im Wärmeblock oder für bis zu 4 h im Zellkulturschrank jeweils bei 38,5°C inkubiert. Eine 2-4stündige Kapazitation führte zu einem Abfall des Anteils intakter Spermien. Sowohl der Anteil AnV-bindender als auch der Anteil PI-gefärbter Zellen nahm zu. Tabelle 10 zeigt zusammenfassend die Mittelwerte und Standardabweichungen der bereits in Abbildung 19 dargestellten Versuche. Eine statistische Auswertung der Ausgangsdaten mittels t-Test ergab einen signifikanten Anstieg des Anteils PI-gefärbter Spermien (P=0,03) nach 2stündiger Inkubation im CO2-Schrank.

▼ 99 

Tab. 10: Einfluss der Inkubationszeit auf den Anteil AnV- und PI-markierter Spermien nach Kapazitation: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen. Der t-Test ergab bezüglich der AnV-Markierung signifikante Unterschiede (Pa/b=0,06; Pc/d=0,03) zwischen den beiden Versuchsvarianten.

AnV+/PI-

AnV+

PI+

1 h; 38,5°C (n=33)

7,8 ± 5,3 %

18,7 ± 12,5 % a

28,5 ± 12,3 % c

2 h; CO2; 38,5°C (n=22)

9,3 ± 6,0 %

24,5 ± 8,4 % b

36,3 ± 13,9 % d

Der Anteil AnV-markierter, lebender Spermien erhöhte sich auch nach einer Inkubation im Zellkulturschrank für 2 h nicht.

3.3  Die transversale und laterale Lokalisation von PS in Eberspermien – mikroskopische Untersuchungen zur Zell- und Membranmorphologie

Um weitere Erkenntnisse über den morphologischen Zustand AnV-positiver Spermien zu erhalten und somit genauere Aussagen zur Lokalisation des PS zu erhalten, wurden mikroskopische Untersuchungen angeschlossen. In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Mikroskopie markierter Eberspermien dargestellt.

3.3.1  Transversale Organisation von NBD-PS in kapazitierten Eberspermien

▼ 100 

In TALP (ohne BSA) gewaschene Eberspermien wurden für 10 min mit NBD-PS markiert. Nicht eingebaute bzw. nicht zur zytoplasmatischen Seite transportierte Label wurde durch Waschen in BSA-haltigem TALP (6 mg/ml) entfernt. Die Spermien blieben morphologisch intakt und motil. Die Mehrzahl der Spermien erschien über ihre gesamte Oberfläche gleichförmig intensiv grün markiert. Schwach grün fluoreszierende Zellen nahmen den Lebend-Tot-Farbstoff PI auf.

Abb. 21: Mit NBD-PS markierte Eberspermien nach kapazitativer Inkubation: Die Zellen wurden mit NBD-PS markiert (siehe Material und Methoden) und für 45 min bei 38,5°C in BSA-haltigem TALP kapazitiert. Unmittelbar vor Entnahme der Probe zur Mikroskopie wurde die NBD-Fluoreszenz zugänglicher Label mit Dithionit gelöscht. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen das NBD-Fluoreszenzbild der untersuchten Spermien.

Nach einer 45 minütigen Kapazitation der Eberspermien blieb der Großteil der Zellen gleichförmig markiert. In PI-gefärbten Spermien führte die Zugabe von Dithionit zum vollständigen Löschen der NBD-Fluoreszenz. PI-negative Zellen sowie ein Teil der markierten Vesikel zeigten hingegen weiterhin eine intensive NBD-Fluoreszenz. Abbildung 21 zeigt beispielhaft NBD-PS/PI markierte Eberspermien nach Kapazitation. In den Proben NBD-PS/PI markierter Eberspermien wurde nie ein motiles oder PI-negatives Spermium beobachtet, dessen NBD-Fluoreszenz gelöscht werden konnte. Einige geschlossene Vesikel mit einer Lokalisation von NBD-PS im inneren Monolayer entstanden scheinbar durch vorzeitig ablaufende Akrosomreaktionen in den Proben kapazitierter Eberspermien. Eine genauere Auswertung dieser Versuche (Fluoreszenzintensitäten von Einzelzellen oder Vesikeln vor und nach Dithionitzugabe, prozentualer Anteil der Zellen einer Subpopulation) wurde aus folgenden Gründen nicht durchgeführt:

▼ 101 

(i) Die Beobachtung eines Spermiums vor und nach Dithionitzugabe bei motilen, frei schwimmenden Zellen ist nicht möglich.

(ii) Um die Kapazitation der Spermien nicht zu blockieren, wurde der Stoffwechsel und damit verbunden auch der Abbau von NBD-PS nicht inhibiert. Ein Teil der NBD-Label war nach der Inkubation der Zellen sicher nicht mehr an den eigentlichen Marker (PS) gebunden.

Für alle weiteren Untersuchungen wurde deshalb die Bindung von FITC-AnV an endogenes PS genutzt.

3.3.2 Lokalisation von endogenem PS in lebenden Eberspermien

▼ 102 

An frisch gewaschenen Eberspermien wurde keine AnV-Bindung beobachtet, während zahlreiche abgelöste Zytoplasmatropfen intensiv mit FITC-AnV markiert waren (Bilder nicht gezeigt).

Nach Kapazitation der Eberspermien erschien die Mehrzahl der Zellen hyperaktiviert, agglutiniert und unmarkiert. Eine FITC-AnV-Markierung wurde vor allem an nicht agglutinierten, PI-gefärbten Spermien beobachtet. Abbildung 22 zeigt charakteristische Bilder kapazitierter, FITC-AnV/PI-markierter Eberspermien. Sowohl an morphologisch intakten als auch an vorzeitig akrosomreagierten Eberspermien, deren Kopfkappen sich oftmals als kompakte Strukturen abheben, bindet FITC-AnV im Bereich des Akrosoms. Relativ selten beobachtet man vorzeitig akrosomreagierte Zellen, bei denen sich kleine Membranvesikel, die teilweise FITC-AnV binden, vom apikalen Kopfbereich ablösen. Spermien, deren Akrosom komplett abgelöst war, zeigten am vorderen Kopfbereich hingegen keine FITC-AnV-Bindung, waren aber immer mit PI-gefärbt. Ein ebenfalls charakteristisches wenn auch relativ seltenes Bindungsmuster von FITC-AnV an kapazitierte, jedoch morphologisch defekte Spermien, scheint die Markierung der Becherhülse zu sein. Im Schwanzbereich der Eberspermien assoziierte Zytoplasmatropfen zeigten nur dann eine FITC-AnV-Bindung, wenn die Zelle PI gefärbt war.

Nach Auslösen der Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophor zu kapazitierten Eberspermien nehmen diese zum überwiegenden Teil (> 50%) den Lebend-Tot-Farbstoff PI auf, während keine spezifische FITC-AnV-Bindung am Spermienkopf beobachtet wurde. Auch die Gegenwart von FITC-AnV während der Akrosomreaktion führte nicht zu einer Markierung der Zellen.

▼ 103 

Abb. 22: FITC-AnV/PI-Markierung kapazitierter Eberspermien: Die dargestellten Mikroskopiebilder wurden bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen der untersuchten Spermien. (a) Typische Zellagglutinate, in denen die Spermien zum überwiegenden Teil unmarkiert sind. (b) Bei einem Teil der PI-gefärbten Zellen, die morphologisch intakt erscheinen, bindet FITC-AnV im Bereich der Kopfkappe. (c) An Eberspermien im Schwanzbereich assoziierte Zytoplasmatropfen zeigen nur dann eine AnV-Bindung, wenn die Zelle PI aufnimmt. Bei einem vorzeitig akrosomreagierten Spermium lösen sich Membranvesikel vom apikalen Bereich der Kopfkappe. Diese binden teilweise FITC-AnV, ebenso die Becherhülse.

Lediglich im Bereich des Spermienschwanzes waren kleine FITC-AnV markierte Bereiche zu erkennen. Eine spezifische AnV-Bindung zeigten jedoch abgelöste Zytoplasmatropfen und andere vesikuläre Membranreste, charakterisiert durch ihre intensive FITC-Fluoreszenz. Abbildung 23 zeigt ein charakteristisches Bild akrosomreagierter, FITC-AnV/PI-markierter Eberspermien. Eine Inkubation der Spermien mit Kalziumionophor (10-60 min, 3-30 µM) führte unter keiner der getesteten Bedingungen zu einer Bindung von AnV an exponiertes, endogenes PS. Weder an frisch gewaschenen noch an kurzzeitig bei 38,5°C inkubierten oder kapazitierten Eberspermien konnte ein Scrambling von PS ausgelöst werden.

Abb. 23: FITC-AnV/PI-Markierung Akrosomreagierter Eberspermien: Das dargestellte Mikroskopiebild wurde bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen. Während an den Spermien keine spezifische AnV-Bindung zu erkennen ist, zeigen abgelöste vesikuläre Membranstrukturen eine FITC-Markierung.

▼ 104 

Die mikroskopischen Untersuchungen FITC-AnV/PI markierter Eberspermien konnten die durchflusszytometrischen Ergebnisse prinzipiell bestätigen. Die Kapazitation bewirkte zwar eine Zunahme des Anteils FITC-AnV-bindender Spermien, jedoch unter Mikroskopie-bedingungen ausschließlich an PI-gefärbten Zellen. Nach Zugabe des Kalziumionophor waren die AnV-Bindungsstellen im Kopfbereich nicht mehr vorhanden.

Die folgenden Versuche sollten eine bessere Differenzierung des morphologischen Zustandes der Eberspermien mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung funktioneller Strukturen der Spermienzelle (Mitochondrien, äußere Akrosommembran, akrosomaler Inhalt) ermöglichen.

3.3.3 Lokalisation von endogenem PS in motilen Eberspermien

Als Alternative zur PI-Färbung wurde der Mitochondrienfarbstoff R123 als Marker für motile, lebensfähige Spermien genutzt. Die Exposition von PS wurde über die Bindung von Alexa-AnV verfolgt. Die Versuche bestätigten die oben dargestellten Ergebnisse der FITC-AnV/PI-Markierungen. Spermien mit intensiver R123-Färbung der Mitochondrien erschienen morphologisch intakt und zeigten keine Alexa-AnV-Bindung am Spermienkopf. Bei einem Teil der Eberspermien, deren R123-Fluoreszenz der Mitochondrien deutlich verringert war, konnte eine Alexa-AnV-Bindung im Bereich des Akrosoms beobachtet werden (Bilder nicht gezeigt). Wurden die Farbstoffe nicht ausgewaschen, erschienen die R123 gefärbten Mitochondrien motiler Spermien zudem intensiv rot fluoreszierend. Dies könnte zum einen auf eine Wechselwirkung zwischen R123 und Alexa-AnV zurückzuführen sein (z. B. Energieübertragung) oder R123 fluoresziert bei Grünanregung im Bereich roten Lichtes.

▼ 105 

Dieser Versuchsansatz wurde nicht weiterverfolgt, da er einerseits keine weiteren Aussagen (im Vergleich zur FITC-AnV/PI-Markierung) ergab, andererseits ein Waschen der R123-gefärbten Spermien für ein „gutes“ Mikroskopiebild (geringe Hintergrundfluoreszenz und keine bzw. geringe unspezifische Bindung an Membranen) unabdingbar war. Wie bereits vorne erläutert, sind kapazitierte und akrosomreagierte Eberspermien sehr instabil und jeder Wasch- und Zentrifugationsschritt bedeutet erheblichen Stress für die Zellen.

3.3.4 Lokalisation von endogenem PS an morphologisch intakte und defekte Eberspermien - Lektinbindung an akrosomale Strukturen

Zur besseren Differenzierung von intakten Spermien und Spermien mit defekter Zell- und/oder Akrosommembran wurden die Lektine PSA und PNA genutzt. PSA bindet bei Eberspermien vor allem an Strukturen der akrosomalen Matrix, während die PNA-Bindung charakteristisch für die äußere Akrosommembran ist.

PSA – akrosomaler Inhalt

▼ 106 

Eine intensive spezifische Markierung des Akrosoms mit FITC-PSA zeigten Spermien, deren Kopfkappe im Phasenkontrast expandiert, aber nicht abgelöst erschien. An diesen Spermien konnte sowohl in kapazitierten als auch in kavitierten Zellen eine Alexa-AnV-Bindung beobachtet werden. An einigen Zellen trat zudem eine FITC-PSA-Markierung von Becherhülse und Mittelstück auf. Auch diese Zellen zeigten eine Alexa-AnV-Bindung an der Kopfkappe. Die PSA-Markierung wurde für die mikroskopischen Untersuchungen nicht weiter verfolgt, da einerseits ein Auswaschen unspezifisch assoziierten Lektins nötig war und andererseits keine eindeutige morphologische Zuordnung der einzelnen Spermien getroffen werden konnte. Je nach Fortschreiten der Expansion des Akrosoms bzw. der Zugänglichkeit des akrosomalen Inhalts variierten die Fluoreszenzintensitäten z.T. beträchtlich.

PNA – äußere Akrosommembran

Die Bindung von PNA an die äußere Akrosommembran der Eberspermien erfolgte spezifisch. Lediglich die Kopfkappe membrandefekter Spermien erschien intensiv fluoreszenzmarkiert, während alle übrigen Membranen unmarkiert blieben. Im folgenden werden die Ergebnisse der Komarkierung von Eberspermien mit AnV und PNA systematisch dargestellt.

▼ 107 

Für die Auswertungen der mikroskopischen Aufnahmen wurden die in Abbildung 24 dargestellten Spermienpopulationen unterschieden. Zunächst wurde die Morphologie im Phasenkontrast bzw. im Phaseninterferenzbild beurteilt. Spermien mit sich deutlich abzeichnendem (normalem) akrosomalem Rand (NAR) werden in der Spermatologie als morphologisch intakte Zellen bezeichnet. Sie wurden je nach Fluoreszenzmarkierung den Gruppen A-D zugeordnet. Im Phaseninterferenzbild zeichnete sich der akrosomale Rand, vor allem nach Kavitation der Eberspermien, nicht immer eindeutig ab. Wenn die Kopfkappe eindeutig vorhanden und mit glatter Oberfläche fest am Spermium assoziiert war (in Abb. 24 mit # gekennzeichnet), wurde die Zelle entsprechend ihrer Fluoreszenzeigenschaften ebenfalls einer der Gruppen A-D zugeordnet.

Abb. 24: Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Es wurden die Kategorien A-G unterschieden. Alle mikroskopisch untersuchten Spermien wurden entsprechend ihrer Morphologie im Phasenkontrast und ihren Bindungseigenschaften für FITC-AnV und Alexa-PNA eingeteilt. Dabei wurden nur die Merkmale der Kopfkappe, nicht aber teilweise vorhandene Markierungen der Becherhülse und/oder des Schwanzes berücksichtigt.

Bei kavitierten und akrosomreagierten Spermien löste sich oft die gesamte Kopfkappe vom Spermium ab oder es waren sich ablösende Membranvesikel im Bereich des Akrosoms zu erkennen. Diese Zellen wurden der Kategorie E oder F zugeordnet. Spermien, denen die Kopfkappe vollständig fehlte, wurden in der Kategorie G erfasst. Zur Beurteilung der Bindung von AnV und PNA an die Spermien wurden nacheinander die beiden Fluoreszenzbilder aufgenommen und überlagert. Eine Markierung der Becherhülse oder des Schwanzes (nur bei toten Zellen) wurde zur besseren Übersichtlichkeit in den Kategorien A-G nicht berücksichtigt.

▼ 108 

Frische Eberspermien

An die Mehrzahl der frischen, in TALP gewaschenen Eberspermien konnte weder AnV noch PNA binden. In einem exemplarischen Versuch waren 84% der Zellen morphologisch intakt und ohne Fluoreszenzmarkierung (Kategorie A), 15% zeigten eine PNA-Markierung mit (Kategorie D 9%) bzw. ohne (Kategorie C 6%) AnV-Bindung.

Frische, kavitierte Eberspermien

▼ 109 

Mittels N2-Kavitation wurde von frisch gewaschenen Eberspermien die Plasmamembran im Bereich des Akrosoms abgelöst, um die äußere Akrosommembran und abgelöste Reste der Plasmamembran bezüglich der Präsenz von PS zu untersuchen.

Tab. 11: AnV/PNA-Markierung kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

5

0

6

5

2

52

29

57

12

Versuch 2

3

0

0

15

1

74

7

89

35

Versuch 3

1

0

0

24

0

70

5

94

15

MW ± SD

3 ± 2

0

2 ± 4

15 ± 9

1 ± 1

65 ± 12

14 ± 13

80 ± 20

21 ± 13

Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche. Die gewählten Kavitationsbedingungen (45 bar, 10 min, auf Eis) führten zu einer sehr effektiven Ablösung der apikalen Plasmamembran in nahezu allen Zellen. Weniger als 5% der Spermien erschienen nach dieser Behandlung morphologisch intakt ohne eine Zugänglichkeit der äußeren Akrosommembran für PNA zu zeigen (Kategorien A/B). Ungefähr 15% der kavitierten Eberspermien waren morphologisch scheinbar intakt, zeigten aber eine intensive AnV- und PNA-Bindung (Kategorie D#). Bei diesen Spermien wurde wahrscheinlich die apikale Plasmamembran komplett abgelöst, während das Akrosom kompakt anliegend blieb (elektronenmikroskopische Arbeiten unterstützen dies, siehe 3.3.5). Die AnV-Bindung erfolgte demnach an zytoplasmatisch exponiertes PS der äußeren Akrosommembran. Bei der Mehrzahl der kavitierten Eberspermien (Kategorie F, 65%) erschien das Akrosom vor allem am apikalen Rand expandiert. An diese Spermien konnten fast ausschließlich beide Marker binden. An welchem Monolayer, welcher Membran (PM oder äAM) die AnV-Bindung erfolgte, kann nicht entschieden werden, wahrscheinlich ist aber auch hier eine zytoplasmatische PS-Exposition auf der äußeren Akrosommembran. Durchschnittlich 14% der Zellen haben bei der Kavitation auf Eis ihre Kopfkappe komplett verloren (Kategorie G) und zeigten im akrosomalen Bereich keine Fluoreszenzmarkierung.

▼ 110 

Es sei darauf hingewiesen, dass die Unterschiede zwischen den Einzelversuchen z.T. erheblich waren. So hatte z.B. die Kavitation auf die im ersten Versuch untersuchten Eberspermien einen deutlich stärkeren Effekt. In dieser Probe waren nach Kavitation bei 29% der Zellen die Kopfkappen komplett abgelöst. Da die Versuchsbedingungen für die untersuchten Proben gleich waren, könnte es sich hierbei um ejakulats- bzw. tierspezifische Unterschiede der Spermienstabilität handeln. Einen vergleichbaren Effekt zeigten kapazitiert/kavitierte und akrosomreagierte Spermien (siehe Tab. 13 und 14).

Kapazitierte Eberspermien

Die kapazitierten Eberspermien wurden bei 38,5°C markiert und mikroskopisch untersucht. Tabelle 12 zeigt im Überblick die Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche. Die Zellen waren hoch motil und zum überwiegenden Teil morphologisch intakt (Kategorie A-D, 97%). Die Hälfte der erfassten Zellen zeigte keine Fluoreszenzmarkierung (Kategorie A, 49%). Die Integrität der Plasmamembran dieser Spermien blieb somit während der Kapazitation erhalten. Die andere Hälfte (Kategorie B-D, 48%) zeigte eine Bindung von AnV und/oder PNA an ihrer Kopfkappe. In den meisten Fällen war eine sichere Einteilung in die Kategorien möglich (siehe unten). Eher selten (10%) traten beide Markierungen an einer Zelle kombiniert auf (Kategorie D), meist war zudem eine der beiden Fluoreszenzen (FITC, Alexa) intensiver.

▼ 111 

Insgesamt 26% der Spermien zeigten eine AnV-Bindung (∑AnV), was in guter Übereinstimmung zu den durchflusszytometrischen Analysen (23 ± 11%, Tab. 6 bzw. 19 ± 13, Tab. 10) steht. 16% der Spermien hatten ausschließlich AnV am Akrosom gebunden (Kategorie B), ein Zeichen für die exoplasmatische Lokalisation von PS im äußeren Monolayer der Plasmamembran. 22% zeigten eine ausschließliche PNA-Bindung.

Tab. 12: AnV/PNA-Markierung kapazitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

41

20

24

8

0

0

7

28

14

Versuch 2

59

12

18

10

0

0

1

22

6

Versuch 3

48

16

25

11

0

0

0

27

16

MW ± SD

49 ± 9

16 ± 4

22 ± 4

10 ± 2

0

0

3 ± 4

26 ± 3

12 ± 5

Häufig war die Markierung mit PNA am apikalen Spermienkopf auch nach Tausch der Labelgruppen (Alexa-AnV, FITC-PNA), deutlich intensiver. Eine mögliche Energieübertragung zwischen den Labeln wurde daher als Ursache ausgeschlossen. Eine Konkurrenz bzw. Behinderung bei gleichzeitiger Bindung beider Marker könnte jedoch eine Rolle spielen.

▼ 112 

Kapazitiert, kavitierte Eberspermien

Zuvor kapazitierte Eberspermien wurden kavitiert, um die äußere Akrosommembran zugänglich zu machen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben werden auch hier in der Übersicht (Tab. 13) deutlich. Im ersten Versuch bewirkte die Kavitation bei 42% aller Spermien die vollständige Ablösung des Akrosoms, während in den Versuchen 2 und 3 das Akrosom lediglich in 3 bzw. 11% der Zellen abgelöst wurde. Zellen der Kategorie F waren in allen drei Proben am häufigsten vertreten (ca. 55%), jedoch zeigte sich auch hier eine große Abstufung (42-79%). Die Kategorie E war im ersten Versuch gar nicht vertreten, im dritten hingegen mit ca. 26% die zweithäufigste. Erstaunlicher Weise war in diesen Spermien die äußere Akrosommembran frei zugänglich, endogenes PS hingegen nicht!

Trotz dieser Unterschiede konnten einige charakteristische Muster bei allen drei Versuchen wiedergefunden werden. Etwa 12% der kapazitierten Spermien erschienen auch nach Kavitation morphologisch intakt, zeigten aber eine AnV-Bindung an ihrer Kopfkappe (Kategorie B). Die Kategorien C und D blieben bei allen Versuchen unbesetzt. Eine selektive Ablösung der Plasmamembran vom Spermienkopf ohne Störung der äußeren Akrosommembran war somit bei kapazitierten Eberspermien nicht möglich. Die auffällig häufige Bindung von AnV an der Becherhülse (ca. 63%) spricht zudem für eine Destabilisierung dieses Bereiches. In frisch gewaschenen, kavitierten Spermien zeigten vergleichsweise nur ca. 21%, in kapazitierten ca. 12% eine solche Markierung.

▼ 113 

Tab. 13: AnV/PNA-Markierung kapazitierter und anschließend kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

5

11

0

0

0

42

42

53

67

Versuch 2

0

10

0

0

8

79

3

89

72

Versuch 3

2

16

0

0

26

45

11

61

49

MW ± SD

2 ± 3

12 ± 3

0

0

11 ± 13

55 ± 21

19 ± 21

68 ± 19

63 ± 12

Akrosomreagierte Eberspermien

In zuvor kapazitierten Eberspermien wurde die Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors ausgelöst. In drei Versuchen konnten Unterschiede zwischen den Proben sowie charakteristische Merkmale akrosomreagierter Spermien beobachtet werden. Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse im Überblick. Die Spermienproben der drei Versuche unterschieden sich deutlich in ihrer Akrosomstabilität. Die Proben enthielten zu 35/10/1% morphologisch intakte Spermien (Kategorie A-D). Spermien mit vollständig abgelöster Kopfkappe (Kategorie G) wurden zu 39/76/58% beobachtet. Die restlichen Zellen zeigten ein sich abhebendes Akrosom mit intensiver PNA-Markierung (Kategorie E). Auch in der Spermienprobe vorhandene abgelöste Kopfkappen, die formstabil erhalten blieben, zeigten eine intensive PNA-Bindung. Wie bereits im Abschnitt 3.3.2 erläutert, bestätigten die Versuche zur AnV/PNA-Markierung von akrosomreagierten Eberspermien den nahezu vollständigen Verlust des AnV-Bindungsvermögens am Spermienkopf. Eine intensive AnV-Bindung konnte hingegen an vesikulären Membranstrukturen beobachtet werden. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um abgelöste Zytoplasmatropfen und Vesikel aus der Plasmamembran und/oder äußeren Akrosommembran. Wurden akrosomreagierte Spermien kavitiert und anschließend mit AnV und PNA markiert, zeigten alle an den Spermien vorhandenen, sich ablösenden Kopfkappen eine deutliche AnV- und PNA-Bindung (Kategorie F, 29%). Die Mehrzahl der Zellen hatte die Kopfkappe vollständig verloren (Kategorie G, 69%). Nach dieser Behandlung waren auch die Becherhülsen bzw. das Äquatorialsegment der meisten Spermien durch eine AnV-Bindung charakterisiert. Eine schnelle Abkühlung der akrosomreagierten Eberspermien von 38,5°C auf 4°C ergab ein vergleichbares Ergebnis.

▼ 114 

Tab. 14: AnV/PNA-Markierung akrosomreagierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

26

0

0

9

27

0

39

9

0

Versuch 2

10

0

0

0

14

0

76

0

17

Versuch 3

1

0

0

0

41

0

58

0

0

MW ± SD

12 ± 12

0

0

3 ± 5

27 ± 14

0

58 ± 19

3 ± 5

6 ± 10

Zusammenfassend ergaben die mikroskopischen Untersuchungen AnV/PNA-markierter Eberspermien folgende Ergebnisse:

▼ 115 

Abb. 25: Charakteristische Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Die Einteilung der Kategorien A-G erfolgte entsprechend der Abb. 24 und den Erläuterungen im Text. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC-AnV und Alexa-PNA Fluoreszenzen. Unter den Abbildungen ist die prozentuale Häufigkeit jeder Kategorie angebeben.

3.3.5 Feinstruktur der Zell- und Akrosommembran - Elektronenmikroskopie

Die morphologische Charakterisierung der Eberspermien ist trotz Phasenkontrastoptik am Lichtmikroskop nur begrenzt möglich, zumal die zu untersuchenden Membranen (PM, äAM) räumlich sehr eng benachbart sind. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie sollten die Feinstruktur von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, insbesondere die auftretenden Membranstörungen (z.B. Löcher, Vesikulationen, u.a.), genauer analysiert werden. Des weiteren wurde die AnV-Bindung an kapazitierten und kavitierten Eberspermien untersucht. Dazu wurden die entsprechenden Zellen mit einem Biotin-AnV inkubiert und dessen Lokalisation mittels goldmarkiertem Biotin-Antikörper verfolgt.

Frische, kavitierte Eberspermien

▼ 116 

Die Kavitation von in TALP gewaschenen Eberspermien bewirkte eine effektive Ablösung der Plasmamembran vom akrosomalen Kopfbereich. Die äußere Akrosommembran blieb teilweise eng am Spermienkopf assoziiert, die akrosomale Matrix erschien bei diesen Zellen als elektronendichte Struktur. Die Mehrzahl der Spermien zeigte eine wellenförmig expandierte äußere Akrosommembran. An der Becherhülse blieb die Plasmamembran fest mit dem Spermium assoziiert. Abbildung 26 zeigt typische Bilder kavitierter Eberspermien.

Abb. 26: Elektronenmikroskopische Aufnahme kavitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. (a) Übersichtsbild zeigt ein Spermium mit fest assoziiertem Akrosom und mehrere mit expandierter äußerer Akrosommembran (äAM), die Plasmamembran (PM) ist jeweils vollständig abgelöst; (b) an der Becherhülse assoziierte PM und sich einrollende äußere Akrosommembran; (c) Spermium mit wellenförmig expandierter äußerer Akrosommembran und Reststruktur der abgelösten PM.

An zahlreichen kavitierten Spermien konnte eine Bindung des goldmarkierten Biotin-Antikörpers beobachtet werden. Die Membranstruktur erschien an diesen Stellen oft sehr verschwommen, wahrscheinlich aufgrund der methodisch bedingten ungenügenden Fixierung der Membranlipide. Die Fixierung der Zellen mit Immunkarnovsky erfolgte nach Bindung des Biotin-AnV an exponiertes PS, so dass eine Vernetzung des gebundenen AnV mit anderen Membranproteinen wahrscheinlich ist. Auf ein Nachfixieren der Lipide mit Osmiumtetroxid wurde bei diesen Versuchen verzichtet, da dies die Antikörperbindung behindern könnte.

▼ 117 

Abb. 27: AnV-Bindung an kavitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper gegen Biotin-AnV (a) an der äußeren Akrosommembran, (b) an abgelösten Membranvesikeln. Das Spermium mit intakter Plasmamembran (b) zeigt hingegen keine Goldmarkierung.

Abbildung 27 zeigt zwei charakteristische Beispiele für eine AnV-Bindung an kavitierten Eberspermien. Zum einen wurde eine Markierung der äußern Oberfläche beobachtet, zum anderen eine Bindung an vesikulären Membranstrukturen. Das Vorhandensein des akrosomalen Inhalts in Abbildung 27a spricht für die Intaktheit der äußeren Akrosommembran und somit für eine PS Exposition auf dem zytoplasmatischen Monolayer der äußeren Akrosommembran. Einige wenige Spermien wiesen in diesen Präparaten eine intakte Plasmamembran, gekennzeichnet durch einen elektronendichten Bilayer, auf. An diesen Zellen wurde nie eine Bindung goldmarkierter Antikörper beobachtet.

Kapazitierte Eberspermien

▼ 118 

Die Kapazitation von Eberspermien bewirkte die Herausbildung morphologisch differenzierter Zellpopulationen. Abbildung 28 zeigt im Überblick einige charakteristische elektronenmikroskopische Aufnahmen kapazitierter Eberspermien. Bei der Mehrzahl der Zellen blieb der akrosomale Inhalt als elektronendichte Struktur erhalten. Nur selten wurde ein vorzeitig akrosomreagiertes Spermium mit Vesikulation der Plasmamembran und äußeren Akrosommembran (Abb. 27e, f) beobachtet. Die Plasmamembran war entweder leicht expandiert, wellenförmig dicht der äußeren Akrosommembran überlagert oder abschnittsweise aufgelöst bzw. diffus verbreitet (Abb. 27a-d).

Abb. 28: Elektronenmikroskopische Aufnahme kapazitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Abgebildet sind charakteristische Aufnahmen kapazitierter Eberspermien: (a) Spermium mit intakter, teilweise expandierter Plasmamembran; (b) Ausschnittsvergrößerung von a), Pfeile markieren Bereiche, in denen Plasmamembran und äußere Akrosommembran eng miteinander assoziiert sind; (c) Plasmamembran ist eng mit der äußeren Akrosommembran assoziiert und weist in Abständen Löcher auf (Pfeile); (d) akrosomintaktes Spermium mit vom Kopf abgelöster Plasmamembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse; (e, f) vorzeitig akrosomreagierte Spermien mit Vesikulation von Kopf und/oder äußerer Akrosommembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse.

Versuche zur Markierung kapazitierter Eberspermien mit Biotin-AnV und anschließender Bindung goldmarkierter Biotin-Antikörper hatten keine intensive Markierung der Zellen zur Folge. Lediglich vereinzelt, an wellenförmigen Membranausstülpungen oder abgelösten Membranfetzen wurden Goldpartikel in den Präparationen gefunden. Es wurde nie eine Goldmarkierung kapazitierter Eberspermien mit intakter Plasmamembran beobachtet.

▼ 119 

Abb. 29: AnV-Bindung an kapazitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper an (a) Störstellen der Plasmamembran, (b) wellenförmigen Membranausstülpungen, (c) abgelösten Membranfetzen.

3.3.6 Zona-pellucida-Bindungsassay

Mit den folgenden Versuchen sollte geklärt werden, ob eine bestimmte Subpopulation der kapazitierten Eberspermien (z.B. die wenigen AnV-bindenden Zellen) selektiv an isolierte Zonae binden. Dazu wurden einerseits kapazitierte, markierte Spermien mit isolierten Zonae zusammen inkubiert, andererseits sollten kapazitierte, markierte Spermien möglichst aktiv die Zonae anschwimmen.

In zwei Versuchen wurde zunächst getestet, ob flüssigkonservierte, gewaschene Spermien unspezifisch an die isolierten Zonae binden. Dies konnte in den beiden Versuchen ausgeschlossen werden. Wurden hingegen kapazitierte Spermien direkt zu den Zonae hinzugegeben und zusammen für 15 min inkubiert, waren sowohl lebende (PI-) als auch tote (PI+) Zellen mit den isolierten Eizellhüllen assoziiert, wobei es nicht zu einer Akkumulation von Spermien an den Zonae kam. Versuche zur Koinkubation zuvor AnV- und PNA-markierter, kapazitierter Eberspermien führten ebenfalls zur Bindung markierter (membrandefekter) und unmarkierter (morphologisch intakter oder akrosomreagierter) Zellen an die isolierten Zonae. In den Abbildungen 30 und 31 wird dies an charakteristischen Beispielen deutlich. Alle motilen, hyperaktivierten Spermien erschienen auch nach Bindung an die Zonae unmarkiert.

▼ 120 

Abb. 30: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet sind links die Phaseninterferenzbilder und rechts die Fluoreszenzbilder des FITC-AnV (grün) einer Zona in zwei Bildebenen (Aufsicht, Querschnitt).

Abb. 31: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV und Alexa-PNA markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet ist die Überlagerung von Phaseninterferenzbild und den beiden Fluoreszenzbildern des FITC-AnV (grün) und Alexa-PNA (rot).

▼ 121 

Da PNA-bindende Spermien vergleichsweise häufig an den Zonae gebunden waren, könnte dies für eine Auslösung der Akrosomreaktion an den Eizellhüllen sprechen, AnV-bindende Spermien waren, in Übereinstimmung mit allen bisher beschriebenen Versuchen, auch nach Koinkubation kapazitierter Zellen mit den Zonae nur selten zu beobachten. Die Morphologie der gebundenen Spermien war sowohl im Phasenkontrast als auch im Phaseninterferenzbild schwer zu beurteilen.

Versuche, die kapazitierten Spermien an die Zonae heranschwimmen zu lassen, erwiesen sich als äußerst kompliziert, da die auftretenden Kapillarkräfte stets zur Durchmischung der Proben führten. Ließ man von den zuvor kapazitierten und markierten Spermien die defekten zunächst auf dem Objektträger sedimentieren und führte anschließend den Tropfen mit den kapazitierten Eberspermien und einen zweiten mit den ebenfalls sedimentierten Zonae durch Ausziehen einer schmalen Flüssigkeitsbrücke vorsichtig zusammen, konnten nur die hoch motilen Spermien die Zonae erreichen. Nur wenige dieser generell nicht markierten Spermien wurden nach einer 15 minütigen Koinkubation an einer Zona assoziiert gefunden. Auffällig war die Bindung von wenigen Spermienaggregaten (3-10 Zellen) an ausgewählten Stellen der Zona. Selbst nach einer Stunde Inkubation waren diese Spermien noch hoch motil und fest mit der Zona assoziiert.

Die dargestellten Ergebnisse zum Zona-pellucida-Bindungsassay entsprechen Tendenzen, die aus wenigen Vorversuchen abgeleitet wurden, eine abschließende Aussage erlauben sie noch nicht. Eine passive Koinkubation kapazitierter, markierter Spermien mit isolierten Zonae ermöglichte die Bindung von toten (PI-gefärbt), membrandefekten (PNA- bzw. AnV-markiert), aber auch von intakten unmarkierten Zellen. In keinem Versuch wurde eine selektive Bindung einer bestimmten Subpopulation kapazitierter, markierter Eberspermien beobachtet. Generell unterstützen die Versuche jedoch die Aussage, dass hoch motile, kapazitierte Eberspermien, die durch aktive Bewegung zur Zona gelangen, weder durch PI noch durch PNA oder AnV markiert werden. Sie erhalten die Integrität der Plasmamembran und können an isolierte Zonae binden. Weitere Versuche würden einen hohen präparativen und methodischen Aufwand erfordern, um den Assay zu optimieren und zu standardisieren.

3.4  Untersuchungen zu lateralen Lipiddomänen in Spermienzellen - Präparation Triton-unlöslicher Membranfraktionen

▼ 122 

Diese Versuche an Forellenspermien bildeten den Ausgangspunkt für weitere funktionelle Arbeiten zur Rolle spezifischer Lipiddomänen in Säugerspermien bei Kapazitation, Akrosomreaktion und Befruchtung. Wie in Material und Methoden erläutert, wurden Forellenspermien lysiert und das entstandene Lysat nach Abtrennung grober Zelltrümmer mittels Dichtegradienten-Zentrifugation aufgetrennt. Der Einfluss verschiedener Faktoren, wie eingesetzte Zellkonzentration bei der Lyse, Tritonkonzentration und Zentrifugationsdauer wurde untersucht. Die Versuchen hatte die Präparation von Membrandomänen mit unterschiedlichem Cholesterolgehalt zum Ziel. Dabei diente das jeweilige CHO/PL-Verhältnis als wesentliches Kriterium. Des weiteren wurden nach jedem Präparationsschritt die prozentualen Anteile vom ursprünglich eingesetzten Zellmaterial der Ausgangssuspension ermittelt (Wiederfindungsrate).

3.4.1  Charakterisierung der Lysate

Die Spermienkonzentration der zur Lyse eingesetzten Suspension wurde von 1010 über 109 zu 108 Zellen/ml erniedrigt. Als Maß für die Effizienz der Lyse wurde die Wiederfindungsrate des Cholesterols (CHO) und der Phospholipide (PL) im Überstand, nach Abtrennung der schweren Zelltrümmer (siehe Abb.5, S.50) gewählt.

Tab. 15: Lipid- und Proteingehalt von Forellenspermien: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen von n unabhängigen Einzelbestimmungen (CHO, PL: n=10; Protein: n=6).

CHO [nmol/109Sp.]

PL [nmol/109Sp.]

CHO/PL

[mol/mol]

Proteine [mg/109Sp.]

PL/Protein [nmol/mg]

CHO/Protein

[nmol/mg]

412 ± 64

1000 ± 282

0,35 ± 0,06

1,0 ± 0,3

1428 ± 565

483 ±153

▼ 123 

Für die Gesamtspermiensuspension wurden die in Tabelle 15 angegebenen Konzentrationen und die daraus resultierenden Verhältnisse von CHO, PL und Protein zueinander ermittelt. Verglichen mit bereits veröffentlichten Ergebnissen von kavitierten Forellenspermien liegen die Werte für das resultierende CHO/PL etwas niedriger (0,47±0,08), während die Werte für den absoluten Proteingehalt der Forellenspermien (1,2±0,2 mg/109 Spermien) sehr gut miteinander übereinstimmen Labbé and Loir (1991).

Bei einer Zelldichte von 1010 Spermien/ml konnte der überwiegende Teil der Lipide während der 20minütigen Inkubation in 1%igem Triton (Versuchsansätze A und C, siehe Abb. 32) nicht lysiert werden. Nahezu das gesamte Zellmaterial konnte durch eine Zentrifugation bei 1300xg im Pellet angereichert werden. Eine Lyse in 2%igem Triton (Versuchsansätze B und D) war hinsichtlich des solubilisierten CHO (12/32% und 58/74%) etwas effektiver, wobei der massive Unterschied zwischen den beiden verwendeten Spermiensuspensionen (A/B und C/D) sich wiederholte. Hinsichtlich der Effektivität der PL-Solubilisation ergab sich zwischen den Inkubationen mit 1 oder 2%igem Triton kein wesentlicher Unterschied. Wiederholte Inkubation des Pellets in Triton führte zur weiteren Lyse der Spermienmembranen. Die schweren Zelltrümmer wurden nochmals abgetrennt und die beiden Überstände für die Ultrazentrifugation gepoolt.

Tab. 16: Effektivität der Tritonlyse von Forellenspermien: Die Lyse der Spermien erfolgte in 1%igem Triton. Angegeben ist der prozentuale Anteil der Lipide im Überstand nach Abtrennung schwerer Zelltrümmer bezogen auf die eingesetzte Gesamtlipidmenge des Lysates (Wiederfindungsrate).

Versuchs-ansatz

1010 Zellen/ml

A / C

109 Zellen/ml

E/G/I/K/N/O

108 Zellen/ml

F/H/J/L

109 Zellen/ml

(mit EDTA)

Q / R

109 Zellen/ml

(ohne Triton)

M / P

CHO [%]

12 / 58

92 ± 3

78 ± 3

47 / 76

28 / 47

PL [%]

13 / 14

77 ± 10

72 ± 14

39 / 58

21 / 24

▼ 124 

Die Lyse von 109Spermien/ml in 1%igem Triton (n=6) führte zu einer maximalen Solubilisierung der Lipide. 92 ± 3% des CHO und 77 ± 10% der PL wurden im Überstand angereichert. Wurde die Tritonlyse im kalziumfreien SFMM durchgeführt (n=2), war der Anteil CHO (47 bzw.76%) und PL (39 bzw. 58%) im Überstand deutlich geringer. Wurden die Spermien nur durch Homogenisieren mit dem Potter zerstört (n=2), sank der Anteil an Lipiden, die im Überstand angereichert werden konnten, noch deutlicher ab. Lediglich 28,3 bzw. 47,1% des CHO und 21,4 bzw. 23,7% der PL gingen in Lösung. Bei diesem relativ schonenden Aufschluss von Zellen blieben die Zellorganellen wahrscheinlich weitestgehend erhalten und wurden bei der Zentrifugation mit 1300xg im Pellet angereichert. Tabelle 16 zeigt zusammenfassend die prozentualen Anteile der im Überstand solubilisierten Lipide.

Eine Zellkonzentration von 108 Spermien/ml führte zu einer effektiven Lyse der Membranen durch 1%iges Triton. 78 ± 3% des Gesamt-CHO und 72 ± 14% der Gesamt-PL wurden im Überstand angereichert (n=4).

3.4.2 Charakterisierung der Membranbanden nach Ultrazentrifugation

Die Lysate aller zuvor beschriebenen Versuchsansätze wurden einem Saccharosegradienten unterschichtet und durch Ultrazentrifugation aufgetrennt. Es wurden unterschiedliche Gradienten und verschiedene Zentrifugationszeiten getestet. Die Membranfraktionen konnten über einen „kontinuierlichen“ Saccharosegradienten am besten aufgetrennt werden. Bei der verwendeten mittleren Beschleunigung von 100.000xg befanden sich nach 18 h Ultrazentrifugation die obersten Banden im Bereich der 15-17,5%igen Saccharoselösung. Die jeweilige Dichte im Gradienten nach Zentrifugation wurde nicht bestimmt.

▼ 125 

Bei den Versuchen, die eine Auftrennung der Membranfraktionen über einen diskontinuierlichen Gradienten zum Ziel hatten, waren die Banden breiter und nicht so weit im Gradienten aufgestiegen. Für das Erreichen des Gleichgewichtszustandes wäre wahrscheinlich eine längere Ultrazentrifugation nötig gewesen.

Abbildung 32 zeigt im Überblick die Ergebnisse der Ultrazentrifugationen aller Proben. Links ist jeweils der im Ultrazentrifugenröhrchen geschichtete Saccharosegradient mit dem unterschichteten Überstand der Zelllyse (30 ml in 40%iger Saccharose) dargestellt, rechts hingegen die Bandenmuster nach Ultrazentrifugation. Die Banden wurden, wie in der Abbildung eingezeichnet, abgenommen und das Volumen genau bestimmt. Bei einer Ausgangskonzentration von 108 Zellen/ml waren keine Banden klar zu erkennen. Es wurden jene Bereiche abgesammelt, in denen bei den parallelen Versuchsansätzen mit 109 Zellen/ml Banden angereichert waren.

Eine deutliche Erhöhung des CHO/PL in der obersten Bande aller 18 Versuchsansätze deutet auf die Existenz einer cholesterolreichen Membranfraktion bei Forellenspermien hin. Der Proteingehalt relativ zum CHO war um das 2-30fache geringer im Vergleich zum Überstand des Lysates. Beim PL-Gehalt war die Tendenz nicht bei allen Versuchen eindeutig.

▼ 126 

Abb. 32: Auftrennung der lysierten Membranfraktionen über eine Gradientenzentrifugation: Angegeben sind die Variationen der einzelnen Versuchsansätze (mit Ausnahme von M und P jeweils Doppelbestimmungen): Schichtung des Gradienten // eingesetzte Spermienkonzentration // Tritonkonzentration bei der Lyse // Dauer der Ultrazentrifugation (UZ) und die Bandenauftrennungen aller durchgeführter Versuche.

Die Abbildung 33 zeigt an einem Beispiel (n=4) die Ergebnisse der Isolation einer Triton-unlöslichen Membranbande. Die Ausgangskonzentration der Forellenspermien zur Lyse in 1%igem Triton betrug jeweils 109 Zellen/ml (Präparationen I, K, N,O). Da die PL etwas schlechter solubilisiert wurden als das CHO, war das CHO/PL-Verhältnis im Überstand nach Abtrennung der schweren Zelltrümmer bereits leicht erhöht.

Abb. 33: Isolierung einer Membranbande geringer Dichte mit signifikant erhöhtem CHO/PL-Verhältnis. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 Versuchsansätzen. Lyse von 109 Zellen/ml in 1%igem Triton und anschließende Ultrazentrifugation (Präparationen I, K, N,O).

▼ 127 

In der oberen Bande wurden ungefähr 10% (40 ± 11 nmol pro 109 Zellen) des CHO und 4% (37 ± 8 nmol pro 109 Zellen) der PL angereichert. Das CHO/PL-Verhältnis war mit 1,05±0,07 signifikant erhöht. Der CHO- bzw. PL-Gehalt stieg im Verhältnis zum Proteingehalt ungefähr auf das Doppelte verglichen mit dem Überstand, der dem Gradienten unterschichtet wurde.

Obwohl bei allen Teilschritten exakt auf die eingesetzten Volumina geachtet wurde, konnte der Verbleib des ursprünglich im Spermienlysat vorhandenen CHO, der PL und der Proteine nicht immer eindeutig nachvollzogen werden. Am Beispiel der Versuche M-R sei dieses Problem noch einmal genauer erläutert. Die für das Gesamtspermienlysat ermittelten Werte (100%) sollten der Summe aus den Werten des Überstandes und des Pellets nach Zentrifugation entsprechen. Für den Cholesterolgehalt stimmt dies gut überein (95,9±19,8%), für den PL- (68,7±14,0%) und Proteingehalt (135,1±38,5%) allerdings nicht.

Setzt man nun die Werte, die für den jeweiligen Überstand ermittelt wurden, auf 100%, findet man in den Triton-unlöslichen Banden (x, a, b) und im Pellet (c) nach Ultrazentrifugation 48,9±23,3% des CHO, 40,1±22,9% der PL und 26,3±8,2% der Proteine wieder. In den Versuchen, bei denen die Spermien ohne Triton homogenisiert wurden, lag der Anteil an CHO (78,7% bzw. 68,8%) und PL (75,4% bzw. 54,8%) in diesen Fraktionen deutlich höher.

▼ 128 

Für die CHO- und PL-Bestimmungen wurde untersucht, ob das in den Proben anwesende Triton (0,5 bzw. 1%) oder Saccharosekonzentrationen zwischen 5-40% die Lipidanalysen stören. Tabelle 17 zeigt Ergebnisse der Lipidanalysen im Überblick.

Tab. 17: Lipidbestimmungen an Forellenspermien: Einfluss der Triton- und Saccharosekonzentration suspendierter Forellenspermien (1x109 Zellen/ml) auf die CHO- und PL-Bestimmungen.

Triton [%]

Saccharose [%]

CHO [nmol/ml]

PL [nmol/ml]

-

-

222

901

1,0

-

220

1140

-

40

231

1183

0,5

40

207

1236

Weder Triton noch Saccharose störten in den getesteten Konzentrationen die Lipidanalysen. Wahrscheinlich befand sich das nicht „wiedergefundene“ Material über den gesamten Gradienten verteilt.

▼ 129 

Versuche zur Tritonlyse von Forellenspermien wurden in der Zwischenzeit im französischen Labor mehrfach wiederholt. Die oben dargestellten Ergebnisse zur Isolierung einer Membranbande geringer Dichte konnten sicher reproduziert werden. Es wurden jeweils 2-3 Triton-unlösliche Banden isoliert, deren CHO/PL ca. 1,4 betrug. Weitere Untersuchungen zur genauen Lipid- und Proteinzusammensetzung dieser Banden sind in Arbeit.


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17.08.2007