4. Diskussion

▼ 129 (fortgesetzt)

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Organisation und Dynamik von Phospholipiden in der Plasmamembran und äußeren Akrosommembran von Eberspermien während der Kapazitation und Akrosomreaktion. In Analogie zur Zellmembran anderer eukaryotischer Zellen weist auch die Zellmembran von Spermien eine transversale Asymmetrie der Phospholipide auf. Diese ist durch die Anreicherung der Aminophospholipide PE und PS auf dem zytoplasmatischen Monolayer und der cholinhaltigen Phospholipide PC und SM auf dem exoplasmatischen Monolayer charakterisiert. Sie wird durch die Aktivität einer APLT aufrechtgehalten Devaux and Zachowski (1994) ;Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1994). Die transversale Phospholipidasymmetrie der Zellmembran gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis einer Zelle. Veränderungen der transversalen Phospholipidverteilung haben funktionelle Konsequenzen und sind beispielsweise bei der Zellkommunikation und bei Fusionsprozessen einschließlich Endo- und Exozytose von Bedeutung. Die Kapazitation von Säugerspermien schafft die Voraussetzungen für die Entstehung fusogener Membrandomänen, an denen die Akrosomreaktion vermittelt wird Töpfer-Petersen, et al. (1996). Der Mechanismus der Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran konnte bisher nicht geklärt werden. Um eine Beteiligung der Phospholipide an diesem Fusionsprozess sowie der nachfolgenden Bindung an die Eizellhüllen und/oder der Fusion mit der Eizellmembran zu untersuchen, wurde die transversale Lokalisation insbesondere des PS in der Plasmamembran und äußeren Akrosommembran verfolgt. PS ist mit weniger als 5mol% in den Eberspermienmembranen vertreten, wird in der Plasmamembran allerdings sehr effektiv auf dem zytoplasmatischen Monolayer akkumuliert. PS gilt sowohl als fusionsförderndes Lipid als auch als Vermittler kalziumabhängiger Wechselwirkungen der Plasmamembran mit dem Zytoskelett. Die Lokalisation von endogenem PS als ein wesentliches Kriterium der transversalen Phospholipidasymmetrie wurde in Eberspermien über eine AnnexinV-Bindung verfolgt. AnnexinV ist ein Protein, das kalziumabhängig spezifisch an PS bindet. Eine Markierung der Zellen mit NBD-PL, die als Analoga für die endogenen Phospholipide eingesetzt wurden, lieferte zudem Informationen zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran.

In lateraler Hinsicht wurde bei Spermien eine inhomogene Membranstruktur beobachtet, welche die verschiedenen Bereiche der Zelle (bei Säugerspermien: akrosomaler Bereich, Äquator, Postakrosom, Mittelstück, Schwanz) voneinander unterscheidet. Lateralen Lipiddomänen wird in der Plasmamembran von Säugerzellen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben Simons and Ikonen (1997). Ob jedoch solche Domänen in der Zell- und Akrosommembran von Säugerspermien existieren, kapazitationsbedingt entstehen oder aufgelöst werden, wurde bisher nicht untersucht. Gerade im Hinblick auf die Prozesse, die zur Akrosomreaktion führen, sowie die Eizellerkennung erscheint dies aber von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden erstmalig Triton-unlösliche Lipiddomänen aus Forellenspermien isoliert. Diese Spermien besitzen kein Akrosom und stellen damit ein ideales System zur experimentellen Etablierung der Assays dar.

▼ 130 

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit werden im folgenden zu Thesen zusammengefasst und diskutiert.

Die Plasmamembran frisch ejakulierter, flüssigkonservierter Eberspermien weist eine stabile transversale Phospholipidasymmetrie auf, charakterisiert durch die Anreicherung von PS im zytoplasmatischen Monolayer. Erstmals konnte zudem eine zytoplasmatische Lokalisation von PS auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden! Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußeren Akrosommembran endogenes PS!

Für frisch ejakulierte Spermienzellen konnte eine stabile, transversale Phospholipidasymmetrie der Plasmamembran wiederholt nachgewiesen werden. Diese Asymmetrie beruht auf der Aktivität einer APLT, die einen schnellen Transport der Aminophospholipide PS und PE auf die zytoplasmatische Seite vermittelt Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1994) ;Nolan, et al. (1995). Erst kürzlich beschrieben Wang et al. ein Protein in Mäusespermien, das ausschließlich im akrosomalen Bereich exprimiert wird und 62% Übereinstimmung mit der P-Typ-ATPase FIC1 aus Hepatozyten hat Wang, et al. (2004). Letztere zeigt in der Plasmamembran von Hepatozyten die Aktivität einer APLT Ujhazy, et al. (2001). In der vorliegenden Arbeit konnte für flüssigkonservierte Eberspermien auch nach 1-3 Tagen Lagerung eine schnelle (t1/2~3min) Translokation von NBD-PS auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Auswärtsbewegung erfolgte vergleichsweise sehr langsam, so dass es zur Anreicherung von 90% des NBD-PS auf dem zytoplasmatischen Monolayer kam. In Übereinstimmung damit konnte durchflusszytometrisch an lebenden Spermien nur äußerst selten (in 1% der Zellen) eine AnV-Bindung an exponiertes, endogenes PS beobachtet werden. Etwa 4% der Spermien zeigten eine intensive AnV-Markierung im Bereich der Kopfkappe, jedoch waren diese Zellen tot (PI-gefärbt). AnV war außerdem mit abgelösten Zytoplasmatropfen assoziiert. In den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen wurde in keinem Experiment ein lebendes (PI-) Spermium mit AnV-Markierung beobachtet!

▼ 131 

Zur transversalen Organisation der Phospholipide in der inneren und äußeren Akrosommembran gab es bisher keine Untersuchungen. Die Kavitation von gewaschenen Eberspermien ermöglichte jedoch eine effektive Ablösung der Plasmamembran über dem akrosomalen Bereich, so dass die äußere Akrosommembran einer Markierung mit exogenen Labeln zugänglich gemacht werden konnte. Entsprechend der Arbeiten von Peterson et al. kann bei geeigneter Wahl der Kavitationsbedingungen (45 bar) selektiv die Plasmamembran vom Spermienkopf entfernt werden, während das Akrosom an 99% der Spermien assoziiert bleibt Peterson, et al. (1980). Die eigenen elektronenmikroskopischen Aufnahmen frischer Eberspermien nach Kavitation konnten diesen Befund bestätigen. Während die Plasmamembran über der Kopfkappe i.d.R. vollständig abgelöst war, blieb die äußere Akrosommembran überwiegend mit den Zellen assoziiert. So zeigten auch 83% der frischen, kavitierten Spermien fluoreszenzmikroskopisch die für die äußere Akrosommembran typische PNA-Markierung der Kopfkappe. In 80% der Spermien war sie kombiniert mit einer intensiven AnV-Bindung in diesem Bereich. Dieses Ergebnis spricht deutlich für eine zytoplasmatische Exposition von PS auf der äußeren Akrosommembran. Elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten diesen Befund. Sowohl an der zytoplasmatischen Seite der äußeren Akrosommembran als auch an abgelösten Reststrukturen der Plasmamembran wurde eine Markierung mit goldmarkierten Biotin-Antikörpern beobachtet, nachdem die Zellen zuvor mit Biotin-AnV inkubiert worden waren. Spermien, deren Akrosom komplett abgelöst war, zeigten jedoch keine Markierung. Mit großer Wahrscheinlichkeit blieb bei diesen Zellen die innere Akrosommembran, eine sehr stabile Membran, die selbst einer Ultraschallbehandlung widersteht, über der Kernmembran erhalten Huang and Yanagimachi (1985). Die Tatsache, dass AnV am akrosomalen Bereich solcher Zellen nicht binden konnte, deutet darauf hin, dass die akrosomale Seite der inneren Akrosommembran wahrscheinlich kein PS enthält. Ein spezifischer Marker, der sicher die innere Akrosommembran definiert, ist nicht bekannt.

Das Akrosom entsteht während der Genese aus dem Golgi-Apparat der Spermatiden. Morphologisch könnte es demnach als riesiges sekretorisches Vesikel angesehen werden Tulsiani and Abou-Haila (2004). Eine zytoplasmatische Anreicherung des PS in der äußeren Akrosommembran wird durch Befunde anderer Autoren unterstützt. So wird für die vom Golgi-Apparat entlassenen sekretorischen Vesikel eine asymmetrische Lipidverteilung mit Anreicherung der Aminophospholipide auf dem zytoplasmatischen Monolayer beschrieben Holthuis, et al. (2003). Inwiefern die Aktivität einer APLT an der zytoplasmatischen PS-Lokalisation in der äußeren Akrosommembran beteiligt ist, konnte bisher nicht geklärt werden. Eine selektive Abtrennung und Aufreinigung der äußeren Akrosommembran wurde in der Literatur beschrieben Töpfer-Petersen, et al. (1983);Parks, et al. (1987). Eventuell könnte die Rekonstitution der isolierten äußeren Akrosommembran künftig Aufschluss über eine vorhandene APLT-Aktivität geben.

Lebende Eberspermien sowie die Mehrheit der morphologisch intakten Spermien exponieren während der Kapazitation endogenes PS nicht auf der Zelloberfläche. Die Translokation von NBD-PS in lebenden, kapazitierten Zellen ist verlangsamt, die transversale Asymmetrie des PS in der Plasmamembran bleibt jedoch erhalten!

▼ 132 

Zytoplasmatische Lokalisation von PS in der PM trotz verlangsamter Translokation

Generell führte die Kapazitation von Eberspermien zu einem signifikanten Anstieg des Anteils AnV-bindender Zellen. Die Mehrzahl dieser Zellen erschien allerdings in allen Proben PI-gefärbt. Somit ergab sich eine enge Korrelation zwischen dem Anteil PS exponierender Zellen, detektiert durch die Bindung von AnV, und dem Anteil PI-gefärbter Spermien.

In lebenden (PI-) Eberspermien wurde hingegen auch nach Kapazitation eine ausgeprägte transversal asymmetrische Verteilung von PS in der Zellmembran gefunden. Lediglich eine kleine Subpopulation der lebenden, kapazitierten Eberspermien (6%) zeigte in der Durchflusszytometrie eine AnV-Bindung. Mikroskopisch konnten solche Spermien nie beobachtet werden.

▼ 133 

Ursache für die Exposition endogenen PS auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran könnte zum einen die Verringerung der APLT-Aktivität sein, andererseits wäre ein gesteigerter Auswärtstransport des PS möglich. Die vom Durchflusszytometer erfassten (AnV+/PI-)-Partikel könnten jedoch auch abgelösten Membranstrukturen (z.B. Zytoplasmatropfen) entsprechen, die in allen mikroskopischen Präparaten eine intensive AnV-Markierung aufwiesen. Solche Membranstrukturen sind methodisch in der Durchflusszytometrie nicht von Spermien zu separieren, da sie vergleichbare Streulichteigenschaften aufweisen.

In Untersuchungen zur Verteilung fluoreszenzmarkierter Phospholipidanaloga bewirkte die In-vitro-Kapazitation tatsächlich eine verlangsamte Translokation (t1/2~4,5min) des NBD-PS in lebenden Zellen. Der Anteil der zytoplasmatisch angereicherten PS-Analoga war bei allen Versuchen verringert. Im Mittel ergaben die Versuche eine signifikante Verringerung des Labelanteils von 93 % (frisch) auf 81% (kapazitiert) im inneren Monolayer der Plasmamembran. Die Translokation von NBD-PC sowie die Auswärtsbewegung der NBD-PL blieb allerdings in kapazitierten Eberspermien unverändert. Somit lag die verlangsamte Translokation des NBD-PS wahrscheinlich in einer geringeren Transportaktivität der APLT begründet. Ursache hierfür könnte z.B. eine kapazitationsbedingte erhöhte zytoplasmatische Kalziumkonzentration sein Bevers, et al. (1999). Ein Vergleich der Einzelversuche zeigte jedoch, dass die Verringerung des zytoplasmatischen Labelanteils mit der Zunahme des Anteils toter Spermien in der Probe korreliert. Damit könnte auch ein massiver ATP-Mangel in Proben weniger vitaler Spermien zur Verringerung der Aktivität der APLT führen Müller, et al. (1999). Beide Ursachen könnten in einem Teil der kapazitierten Spermien (Vergleich Durchflusszytometrie, 6% AnV+/PI- Zellen) zunächst zu einer Exposition von PS führen, bevor die Zellen den Lebend-Tot-Farbstoff PI aufnehmen. Die Verminderung des zytoplasmatisch angereicherten NBD-PS könnte schließlich auch durch eine gesteigerte Phospholipaseaktivität in kapazitierten Spermien vorgetäuscht werden, da in den Versuchen kein Hemmstoff verwendet wurde.

Neben der Population lebender (PI-) Zellen, deren NBD-Fluoreszenz durch Dithionit moderat gelöscht werden konnte, ergaben die durchflusszytometrischen Versuche NBD-PS/PI markierter Spermien einen erheblichen Anteil (kapazitiert 24%) PI-ungefärbter Partikel, deren NBD-Fluoreszenz mit Dithionit komplett gelöscht werden konnte. Würde es sich bei diesen Partikeln um lebende Spermien mit Lipidscrambling handeln, sollte allerdings auch eine AnV-Markierung der Zellen möglich sein, was durchflusszytometrisch lediglich für 6% der Spermien zutraf. Aus diesem Grund erscheinen die folgenden Erklärungen wahrscheinlicher als ein Scrambling der Phospholipide in lebenden Eberspermien.

▼ 134 

So könnte die Plasmamembran einiger kapazitierter Spermien den selektiven Durchtritt von Dithionit gestatten. Ein Eintritt von Dithionit ins Zellinnere wurde für die Erythrozytenmembran gezeigt und wird, besonders intensiv bei hoher Temperatur (37°C), durch die Aktivität eines Anionentransporters (Bande 3-Protein, /; /) vermittelt Pomorski, et al. (1994). Da es während der Kapazitation (beim Eber bei 38,5°C) zu einem Anstieg der Ionenpermeabilität der Plasmamembran kommt, wäre ein verstärkter Eintritt von Dithionit denkbar. Diese Theorie konnte aber bisher nicht bewiesen werden, da eine Hemmung des Bande 3-Proteins zwar mit DIDS möglich ist, in Bullenspermien allerdings auch deren Kapazitation blockierte Spira and Breitbart (1992). Wiederum könnte eine starke Hydrolyse des NBD-PS die Reduktion zahlreicher NBD-Gruppen von frei diffundierenden Fettsäuren erklären. So wurde für Eberspermien eine massive Hydrolyse (~65%) von NBD-PS während einer zweistündigen In-vitro-Kapazitation beobachtet Gadella, et al. (1999).

Wie bei der AnV/PI-Markierung deuten auch die mikroskopischen Untersuchungen NBD-PS markierter Eberspermien darauf hin, dass es sich bei einem Teil der durchflusszytometrisch erfassten Partikel um abgelöste Membranstrukturen handeln könnte, in die sich die Phospholipidanaloga ebenfalls einbauen. Durch Zusammenlagerungen von Zytoplasmatropfen und Membranresten abgelöster Kopfkappen könnten Aggregate entstanden sein, deren Streulichteigenschaften sich mit denen der Spermienzellen überlagern. Somit ist eine Unterscheidung der durchflusszytometrisch erfassten Partikel bzw. Spermien nicht exakt möglich. Es ist wiederum auch nicht anzunehmen, dass 24% der durchflusszytometrisch erfassten Partikel keinen Spermienzellen entsprechen. Die mikroskopischen Untersuchungen ergaben keinen Hinweis auf lebende Spermien mit einer NBD-PS-Lokalisation auf dem exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran, da die Zugabe von Dithionit in allen NBD-PS/PI-gefärbten Zellen und in den meisten nichtzellulären Membranresten zur Reduktion der NBD-Gruppen führte. In PI-ungefärbten Spermien und einigen geschlossenen Membranvesikeln blieb die NBD-Fluoreszenz jedoch erhalten. Es besteht somit ein Widerspruch zwischen den Ergebnissen der Durchflusszytometrie und der Mikroskopie.

Es wäre durchaus möglich, dass ein Teil der sehr fragilen, kapazitierten Eberspermien unter den Bedingungen der Mikroskopie PI-gefärbt erscheint, während sie unter den Bedingungen der Durchflusszytometrie den Lebend-Tot-Farbstoff nicht aufnehmen. Demnach müssten vor allem Eberspermien mit einer stark verminderten APLT-Aktivität einen verstärkten Dithioniteintritt und/oder eine erhöhte Phospholipaseaktivität aufweisen und mikroskopisch in allen Proben PI-gefärbt sein. Da aber die Mehrzahl der Zellen während der Mikroskopie hoch motil und PI-ungefärbt war, ermöglicht PI prinzipiell auch unter den Bedingungen der Mikroskopie eine Differenzierung lebender und toter Spermien, wahrscheinlich mit verschobenen Grenzen im Vergleich zur Durchflusszytometrie.

▼ 135 

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen unter Berücksichtigung der Morphologie von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran (Lektinbindung/NAR) ergaben einen nicht zu vernachlässigenden Anteil (16%) morphologisch intakt erscheinender Zellen mit AnV-Bindung an der Kopfkappe ohne Zugänglichkeit der äußeren Akrosommembran für PNA. Demzufolge kann eine transversale Umverteilung der Plasmamembranphospholipide bei diesen Spermien nicht ausgeschlossen werden. Aus dieser Population könnten sich neben losen Membranresten und Zytoplasmatropfen die wenigen durchflusszytometrisch bestimmten PI-negativen Ereignisse erklären, die eine AnV-Bindung aufwiesen. In den elektronenmikroskopischen Aufnahmen kapazitierter Eberspermien erschien die Plasmamembran häufig mit zahlreichen wellenförmigen Ausstülpungen, an denen teilweise eine Biotin-AnV-Markierung beobachtet wurde. Eine ebenfalls beobachtete Struktur war die Ausbildung sehr kleiner, gleichförmiger Plasmamembranvesikel, die eng miteinander assoziiert waren. Über die Bildung kleiner gleichförmiger Vesikel bei spontan ablaufender Akrosomreaktion wurde bereits berichtet Watson, et al. (1992). Beide Veränderungen der Membranstruktur könnten eine Folge des Scrambling von Phospholipiden in der Plasmamembran sein, entsprechen aber nicht der klassischen Vorstellung der induzierten Akrosomreaktion, bei der es punktuell zur Fusion von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran kommt. Dennoch könnten auch diese Spermien in-vivo von Bedeutung sein. Die Auflösung der Hyaluronsäurematrix zwischen den Kumuluszellen erfolgt wahrscheinlich durch die von vorzeitig akrosomreagierten Spermien entlassenen akrosomalen Enzyme (Hyaluronidase). Im Gegensatz zur Bindung an die Zona pellucida erfolgt die Assoziation von Spermien an die Kumuluszellen weder artspezifisch noch proteinvermittelt. Insofern könnte ein Scrambling der Plasmamembranphospholipide in einer kleinen Population der kapazitierten Eberspermien eine Alternative oder Ergänzung zur klassischen Akrosomreaktion darstellen. Es wäre durchaus vorstellbar, dass genau diese Spermien besonders fragil sind und daher mikroskopisch bereits PI-gefärbt erscheinen, während sie unter den Bedingungen der Durchflusszytometrie den Lebend-Tot-Farbstoff noch ausschließen.

Die Tatsache, dass nicht alle PI-gefärbten Spermien eine Bindung von AnV an exponiertes PS aufwiesen, könnte zum einen dem sehr langsamen passiven Flop der Phospholipide über die Plasmamembran geschuldet sein. Andererseits wurde wiederholt gezeigt, dass Membranen, deren Integrität massiv gestört war, kein AnV binden. Dies könnte mit einem Verlust von PS aus der Membran oder einer extremen Abnahme der Fluidität der Membran zusammenhängen Rimon, et al. (1997) ;Vincent and Maiese (1999). Arbeiten zur lateralen Diffusion von Fluoreszenzmarkern zeigten, dass die Plasmamembran toter Bullenspermien sehr rigide ist Ladha, et al. (1997). Da in jeder Spermiensuspension kapazitierter Zellen ein Anteil vorzeitig akrosomreagierter Spermien enthalten ist, kann es sich bei den PI-gefärbten Zellen ohne AnV-Bindung jedoch auch um defekte Zellen handeln, deren Plasmamembran und äußere Akrosommembran vollständig abgelöst war. An den verbleibenden zellulären Strukturen wurde nie eine PS-Exposition beobachtet.

♢ Schlussfolgerung

▼ 136 

Die Ergebnisse sprechen für den Erhalt der transversalen Asymmetrie in lebenden Eberspermien während der Kapazitation. Bei dem durchflusszytometrisch erfassten Anteil an (PI-)-Partikeln mit Zugänglichkeit des endogenen PS für AnV bzw. von NBD-PS für Dithionit sollte es sich entsprechend der mikroskopischen Untersuchungen um abgelöste Membranstrukturen oder besonders fragile Spermien handeln, die unter den Bedingungen der Mikroskopie bereits tot erscheinen. Eine Korrelation von PI-Färbung und PS-Exposition wurde in zweierlei Hinsicht gefunden. Zum einen nahm der prozentuale Anteil zytoplasmatisch lokalisierten NBD-PS in lebenden Zellen mit Anstieg des Anteils PI-gefärbter Zellen in der Probe ab. Wahrscheinlich war die allgemeine Fitness dieser Zellen bzw. die Aktivität ihrer APLT, eventuell durch ATP-Mangel und/oder Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, in den Proben kapazitierter Eberspermien bereits herabgesetzt. Zum anderen zeigten die Untersuchungen zur AnV/PI-Markierung kapazitierter Eberspermien einen Anstieg des Anteils AnV-bindender Zellen korreliert mit dem Anstieg des Anteils PI-gefärbter Spermien. Beides unterstützt die Theorie, das eine PS-Lokalisation im exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran eher ein Zeichen des Absterbens der Zellen, als eine notwendige Voraussetzung für Akrosomreaktion oder Eizellbindung ist.

Einordnung in die Literatur und Diskussion der Konzepte anderer Autoren

Zur transversalen Phospholipidorganisation in kapazitierten Spermien gibt es bisher nur wenige Arbeiten. Seit einigen Jahren wird ein Scrambling der Phospholipide in der Plasmamembran diskutiert. Ausgangspunkt dafür waren zum einen elektronenmikroskopische Arbeiten, die eine Zunahme von anionischen Lipiden im apikalen Kopfbereich kapazitierter Zellen fanden, zum anderen Untersuchungen zur Merocyanin (M540)-Markierung kapazitierter Spermien Bearer and Friend (1982) ;Harrison, et al. (1996). Für kapazitierte Meerschweinspermien wurde die Synthese und Anreicherung von Cardiolipin und Phosphatidsäure nachgewiesen Bearer and Friend (1982). Des weiteren wurden bisher die Aktivierung einer kalziumabhängigen Phospholipase und der Entzug von Cholesterol als Ursache für die Zunahme der Fluidität der Plasmamembran im akrosomalen Bereich des Spermienkopfes und Voraussetzung für die Akrosomreaktion intensiv diskutiert Langlais and Roberts (1985). Ein Scrambling der Phospholipide würde sowohl zur Zunahme anionischer Lipide auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran führen, könnte zugleich aber auch deren Fluidität erhöhen. Aus diesem Blickwinkel erscheint ein Scrambling der Phospholipide als Ursache für die Destabilisierung der Plasmamembran kapazitierter Spermien als eine interessante Hypothese.

▼ 137 

Merocyanin (M540) wird u.a. als Marker für Änderungen der Lipidpackungsdichte in der Membran (bevorzugt Bereiche geringer Lipidordnung) verwendet Williamson, et al. (1983). Einige Autoren nutzen M540 als „Kapazitationsmarker“ für Säugerspermien, da es während der Inkubation der Spermien zu einem sprungartigen Anstieg der Fluoreszenzintensität des M540 in einem Teil der Zellen kommt Green and Watson (2001) ;Harrison, et al. (1996). In Eberspermien ist der sprungartige Anstieg der M540-Fluoreszenz innerhalb weniger Minuten an die Temperatur (>37°C) und Anwesenheit von Bikarbonat im Medium gebunden, erfolgt aber unabhängig von BSA und Kalzium (EGTA) Harrison, et al. (1996). Unter der Annahme, dass M540 in intakten Spermien lediglich den exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran markiert, soll der Anstieg der Fluoreszenzintensität des M540 in diesen Spermien die zunehmende Fluidisierung des Monolayers charakterisieren. Dies wurde in direkten Zusammenhang mit einer transversalen Umverteilung der Phospholipide in der Plasmamembran gebracht Gadella and Harrison (2000) ;Gadella and Harrison (2002) ;Harrison and Miller (2000). Eine Trennung der kapazitierten Eberspermien entsprechend ihrer M540-Fluoreszenz ergab, dass Zellen mit intensiver M540-Markierung einen deutlich geringeren Cholesterolanteil in der apikalen Kopfplasmamembran aufwiesen Flesch, et al. (2001). Die Autoren schlugen ein Modell vor, wonach die Bikarbonat induzierte Umverteilung der Membranlipide (Scrambling, Raftbildung) einen Cholesterolentzug und damit verbunden eine weitere Destabilisierung in Vorbereitung auf die Akrosomreaktion ermöglicht Flesch, et al. (2001). Es wurde für kapazitierte Säugerspermien jedoch nie nachgewiesen, dass sich M540 tatsächlich nur in den äußeren Monolayer der Plasmamembran einbaut. Schlegel et al. nutzten M540 z.B. als Marker für die transversale Asymmetrie der Phospholipide in der Plasmamembran von Erythrozyten, nachdem sie dessen Fluoreszenz selektiv im äußeren Monolayer löschten Schlegel, et al. (1987). Watala et al. zeigten weiterhin für Erythrozyten, dass eine Exposition von PS auf dem äußeren Monolayer zu einer Verringerung des Einbaus von M540 aufgrund der Zunahme der negativen Oberflächenladungen führt Watala, et al. (2002). Auch für Spermien erscheint ein direkter Zusammenhang zwischen M540-Markierung und einem Scrambling der Phospholipide in Auswertung der Arbeit von Wang et al. sehr unwahrscheinlich. Spermien mit einer reduzierten Expression einer APLT zeigten zwar eine deutliche AnV-Bindung, jedoch keine intensive M540-Markierung Wang, et al. (2004).

Die eigenen Versuchsergebnisse stehen, zumindest teilweise, im Widerspruch zu den Arbeiten, die ein kapazitationsbedingtes Scrambling der Phospholipide in der Zellmembran von lebenden (PI-) Eberspermien beschreiben Gadella and Harrison (2000) ;Gadella and Harrison (2002). Ein massives Scrambling der Plasmamembranphospholipide, charakterisiert durch eine extrazelluläre Lokalisation von PS in lebenden Eberspermien, konnte als typisches Ereignis der Kapazitation und Voraussetzung für die Fusogenität der Membran nicht bestätigt werden.

In Analogie zur vorliegenden Arbeit fanden Gadella et al. eine verlangsamte Translokation von NBD-PS zur zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran in kapazitierten Spermien (t1/2 ca. 4 min ♢ ca. 12 min), jedoch ohne Änderung der Gleichgewichtsverteilung dieses Labels (97% innen). Gleichzeitig war die Auswärtsbewegung des NBD-PS nach Kapazitation stark beschleunigt (t1/2 Stunden ca. 12 min). Innerhalb von einer Stunde gelangten 40% des zunächst zytoplasmatisch akkumulierten Labels auf die Zelloberfläche und konnten mit BSA extrahiert werden Gadella and Harrison (2000). Die Aufrechterhaltung der asymmetrischen PS-Verteilung ist unter diesen Bedingungen jedoch theoretisch nicht zu erklären, wenn man Wechselwirkungen der Aminophospholipide mit anderen Zellkompartimenten ausschließt. Eine Exposition von endogenem PS und PE auf dem äußeren Monolayer der Plasmamembran nach Kapazitation der Eberspermien wurde von den gleichen Autoren zwei Jahre später beschrieben Gadella and Harrison (2002). Während PE bereits nach 10 min in 25-75% der intakten (PI- und PNA-, siehe unten) Zellen für ein PE-spezifisches Peptid zugänglich wurde, konnte eine vergleichbare AnV-Bindung erst nach 60 min in 35-85% der Zellen nachgewiesen werden. (In den eigenen Versuchen wurde eine massive AnV-Bindung an einer vergleichbar großen Population nie gefunden!) Die Autoren diskutieren, dass die hohe Affinität der APLT für PS die im Vergleich zu PE langsamere Exposition dieses Aminophospholipids erklären könnte. Parallel zur Zugänglichkeit des PE stieg nach 10 min Kapazitation der Eberspermien die M540-Markierung in 20-75% der lebenden Zellen an. Sollte M540 tatsächlich ein Scrambling der Plasmamembranphospholipide anzeigen, was innerhalb weniger Minuten zu einer Gleichverteilung der Phospholipide führt, müsste die APLT mit hoher und nicht mit verminderter Aktivität weiter arbeiten, so dass PS trotz Scrambling nur allmählich nach außen gelangt. Eine starke Wechselwirkung von PS mit dem Zytoskelett könnte die exoplasmatische Lokalisation von PS allerdings verzögern, was wiederum eine physiologische Bedeutung der zytoplasmatischen Lokalisation des PS auch in kapazitierten Eberspermien nahe legt. Eine Wechselwirkung von PS mit dem Zytoskelett würde eventuell auch eine genauere Differenzierung der AnV-Bindung an endogenes PS und der Lokalisation des NBD-PS erfordern.

▼ 138 

Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit erfolgte die Unterscheidung zwischen intakten und defekten Zellen grundsätzlich mit einer Kombination aus Lebend-Tot-Färbung mit PI und einer Markierung der äußeren Akrosommembran mit einem ebenfalls rot fluoreszierenden PNA. Für die Versuche mit NBD-markierten Phospholipiden wurde mit 3,7 µM PI und 25 µM PNA gearbeitet, während für die Versuche zur Exposition von endogenen Phospholipiden deutlich geringere Markerkonzentrationen (PI 1,5 µM; PNA 2,5 µM) eingesetzt wurden. In Auswertung der vorliegenden Versuche zur Optimierung der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien könnte sich somit zumindest ein Teil der widersprüchlichen Ergebnisse erklären. Mit zunehmender PI-Konzentration stieg auch der Anteil PI-gefärbter Spermien nach Kapazitation an. Dieser Effekt ließ sich jedoch in den verwendeten Konzentrationen nicht auf eine zytotoxische Wirkung des PI zurückführen, da sich jeweils ein Plateau für den prozentualen Anteil lebender Spermien einstellte. Vielmehr schienen die kapazitierten Eberspermien in unterschiedlichem Ausmaß fragil und entsprechend unterschiedlich empfindlich für PI zu sein. Die in der eigenen Arbeit genutzten PI-Konzentrationen lagen zwischen 2 und 6 µM und führten in allen Versuchen zur Abgrenzung einer stabilen PI-ungefärbten Spermienpopulation. Durchflusszytometrisch konnte diese erst oberhalb eines Schwellwertes für die PI-Konzentration detektiert werden. Dabei mussten sowohl die PI-Konzentration, bezogen auf die eingesetzte Zellzahl, als auch das Suspensionsvolumen berücksichtigt werden. Wurden Spermien beispielsweise zunächst in hoher Konzentration gefärbt und anschließend mehrere Minuten in der zur Durchflusszytometrie nötigen Verdünnung inkubiert, wurde ein Auswaschen des PI-Farbstoffes beobachtet. Eine Trennung der PI-gefärbten Population war dann nicht mehr eindeutig möglich. Die Arbeiten von Gadella et al. enthalten keine ausreichenden Angaben, die eine Einschätzung dieser kritischen Parameter erlauben, zumal die PI-Fluoreszenz in allen durchflusszytometrischen Messungen von der PNA-Markierung überlagert wird.

Untersuchungen an epididymalen Mäusespermien ergaben, vergleichbar mit den eigenen Ergebnissen an Eberspermien, nur einen mäßigen kapazitationsbedingten Anstieg der AnV-Bindung. Etwa 24% der kapazitierten Mäusespermien zeigten durchflusszytometrisch eine intensive AnV-Bindung, 13% erschienen mit PI gefärbt Ávalos-Rodríguez, et al. (2004).

Die oben erläuterten Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Gadella, Harrison und Flesch postulieren eine Bikarbonat-induzierte Modifikation der Lipidorganisation der Plasmamembran von Eberspermien, die wahrscheinlich über einen cAMP-abhängigen Proteinphosphorylierungs-Signalweg unter Beteiligung der PKA erfolgt und von extrazellulärem Kalzium unabhängig ist Flesch, et al. (2001) ;Gadella and Harrison (2000) ;Gadella and Harrison (2002) ;Harrison, et al. (1996). Ein massives Scrambling der Phospholipide, charakterisiert durch eine extrazelluläre Lokalisation von PS in lebenden Eberspermien, konnte in der eigenen Arbeit nicht bestätigt werden. Auch die Zugabe eines Kalziumionophors (3-30 µM) in Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium (2mM) – ein klassisches Scrambling-Experiment – hatte zu keinem Zeitpunkt der Genese eine transversale Umverteilung von endogenem PS auf die exoplasmatische Seite der Plasmamembran zur Folge. Für andere tierische Zellen wurde das Scrambling von Phospholipiden generell als kalziumabhängiger Prozess beschrieben, dessen Aktivierung über eine PKC erfolgt Bevers, et al. (1999) ;Kamp, et al. (2001) ;Sims and Wiedmer (2001). Demnach müsste das in kapazitierten Eberspermien beobachtete Scrambling über einen anderen Signalweg aktiviert werden.

▼ 139 

Die Beteiligung einer Floppase oder eines MDR-Proteins an der Auswärtsbewegung der endogenen Phospholipide kann nicht ausgeschlossen werden Sims and Wiedmer (2001). In Bezug auf die Kapazitation von Säugerspermien, in deren Verlauf es zu einem selektiven Entzug von Cholesterol aus der Kopfplasmamembran kommen soll, erscheinen bestimmte ABC-Transporter besonders interessant. (Der Mechanismus des Cholesterolentzugs konnte bisher nicht geklärt werden. Eine Beteiligung lipidbindender Proteine des extrazellulären Mediums wurde wiederholt nachgewiesen, kann aber den selektiven Entzug aus einer intakten Membran wahrscheinlich nicht erklären.) Untersuchungen zum Lipidtransport von ABCA1 in Fibroblasten und Erythrozyten deuten auf einen möglichen Zusammenhang zwischen cholesterol- und kalziumabhängigem Phospholipidtransport über die Zellmembran hin. Erst kürzlich wurde auch in Seeigelspermien ein ABCA1-Transporter nachgewiesen Nengerink and Vacquier (2002). Die Exposition von PS auf der Zelloberfläche von Thrombozyten ist mit der Bildung von kleinen Membranvesikeln verbunden Sims and Wiedmer (2001). Solche kleinen, gleichförmigen Plasmamembranvesikel wurden elektronenmikroskopisch auch an einigen kapazitierten Eberspermien beobachtet.

♢ Schlussfolgerung

Wenn es kapazitationsbedingt in einem Teil der Eberspermien zur transversalen Umverteilung der Phospholipide in der Plasmamembran kommt, erfolgt dies langsam und wahrscheinlich in vorzeitig akrosomreagierten Spermien und/oder absterbenden bzw. toten Zellen. Für ein kalziumabhängiges Scrambling gibt es keinen Hinweis, auch ein direkter Zusammenhang zwischen einer transversalen Umverteilung der Phospholipide und einem Anstieg der M540-Markierung ist fraglich. Die Diskrepanz zu veröffentlichten Arbeiten, die eine schnelle, von Kalzium unabhängige Aufhebung der transversalen Phospholipidasymmetrie in Eberspermien postulieren, bleibt ungeklärt, könnte eventuell auf einem methodischen Problem der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien beruhen.

▼ 140 

Bindung motiler kapazitierter Eberspermien an isolierte Zona pellucida

Zahlreiche Arbeiten zeigten bereits, dass es verbunden mit der Kapazitation von Säugerspermien zu einer Destabilisierung (Fluidisierung) der Zellmembran kommt. Dieser Effekt wird allgemein der Ablösung von Oberflächenproteinen, dem Entzug von Cholesterol sowie der lateralen und transversalen Umverteilung einzelner Membranbestandteile zugeschrieben Töpfer-Petersen, et al. (1996) ;Yanagimachi (1994). In dieser Arbeit wurde einer sicheren Unterscheidung zwischen lebenden und toten bzw. intakten und defekten Zellen große Aufmerksamkeit geschenkt. Die Lebend-Tot-Färbung mit PI wurde für kapazitierte Eberspermien so optimiert, dass eine stabile Differenzierung nicht-fixierter Zellen möglich war. Eine Kombination der PI-Färbung mit einer Mitochondrienfärbung (R123) machte zudem deutlich, dass unter diesen Bedingungen lediglich solche Spermien als tot (PI-positiv) analysiert wurden, deren Mitochondrien-Membranpotential gestört war. Da Spermien zum Durchdringen der Eizellhüllen eine aktive, hyperaktivierte Schwanzbewegung ausführen müssen, kann man davon ausgehen, dass nur Spermien mit intaktem Mitochondrien-Membranpotential (PI-negative) für die Befruchtung einer Eizelle in Frage kommen. Selbst wenn unter den gewählten Bedingungen ein Teil der kapazitierten Eberspermien nicht tot, sondern „nur“ extrem fragil (und somit PI-durchlässig) ist, können diese als für die Befruchtung einer Eizelle entscheidenden Spermien ausgeschlossen werden. Mikroskopische Untersuchungen der in-vitro kapazitierten Eberspermien bestätigten, das lediglich PI-ungefärbte Zellen eine aktive Vorwärtsbewegung ausführten. Nie wurde ein motiles Spermium mit AnV-Bindung beobachtet.

Um die Bindung in-vitro kapazitierter Eberspermien an Zona pellucida vom Schwein zu untersuchen, wurden die Spermien zunächst mit isolierten Zonae koinkubiert. Hierbei wurden sowohl unmarkierte als auch AnV- oder PNA-bindende Zellen assoziiert gefunden. Da häufig PNA-bindende Spermien beobachtet wurden, könnte die Akrosomreaktion an den Eizellhüllen während der gemeinsamen Inkubation ausgelöst worden sein. Mussten die zuvor kapazitierten und markierten Spermien hingegen aktiv die Zonae anschwimmen, konnten nur sehr wenige motile, grundsätzlich unmarkierte Spermien an der Eizellhülle binden. Mit diesen Versuchen konnte zumindest ausgeschlossen werden, dass eine Exposition von PS Voraussetzung für die Bindung kapazitierter Eberspermien an isolierte Zonae pellucidae ist.

▼ 141 

In der Literatur wird die Spermienbindung an die Zona pellucida kontrovers diskutiert. Allgemein geht man nach wie vor von einer artspezifischen Erkennung und Rezeptor-vermittelten primären Bindung kapazitierter, lebender Säugerspermien aus Benoff (1997) ;Yanagimachi (1994). Bei Eberspermien wird die Bindung an ZP3 (ein Glykoprotein der Zona pellucida) dafür verantwortlich gemacht Töpfer-Petersen (1989).

In-vitro binden akrosomintakte Eberspermien an homologe Zonae pellucidae Fazeli, et al. (1997). Dementsprechend konnte an in-vitro kapazitierten PI- und PNA-unmarkierten Eberspermien eine zunehmende Bindung isolierter Zonaproteine beobachtet werden Harkema, et al. (1998). Andere Arbeiten beschrieben allerdings eine Bindung von Spermien verschiedener Subpopulationen an die Zona pellucida Harrison (1997). Ein schnelles Auslösen der Akrosomreaktion an der Zona pellucida könnte die Bindung akrosomreagierter Spermien erklären Benoff (1997). Wahrscheinlich ist die koordinierte Wirkung mehrerer Spermien in Nachbarschaft des die Zona pellucida durchdringenden und letztendlich befruchtenden Spermiums nötig. Insofern erscheint die Heterogenität der Spermiensuspension von wesentlicher physiologischer Bedeutung. Über einen möglichst langen Zeitraum sollten sowohl vorzeitig akrosomreagierte Spermien als auch vollständig kapazitierte, hyperaktivierte Spermien, deren Akrosomreaktion nach Bindung an die Zona pellucida ausgelöst werden kann, vorhanden sein. Diese Heterogenität findet man auch in allen Proben. Welcher Spermiensubpopulation jedoch letztendlich das in-vivo die Eizelle befruchtende Spermium entstammt, bleibt offen. Die meisten Autoren gehen davon aus, dass in-vivo wahrscheinlich eine langsame Kapazitation nötig ist, um ein möglichst langes Überleben der Spermien und eine koordinierte Befruchtung zu sichern Harrison (1997) ;Hunter (1987) ;Pollard, et al. (1991). Im Gegensatz zu einer spezifischen Bindung über eine Rezeptor-Liganden-Erkennung wurde allerdings auch ein unspezifisches Festhalten hyperaktivierter Spermien in den Poren der Zona pellucida diskutiert Hunter (2003). Auch hierfür wäre allerdings eine stabile Integrität der Plasmamembran unerlässlich.

Nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor konnte keine Exposition von endogenem PS am Spermienkopf beobachtet werden!

▼ 142 

Eine Inkubation zuvor kapazitierter Eberspermien mit einem Kalziumionophor führte in ca. 58% der Zellen zu einem vollständigen Verlust der Kopfkappe. An der verbleibenden Reststruktur befand sich wahrscheinlich apikal die innere Akrosommembran, postakrosomal die Plasmamembran exponiert. Für Humanspermien wurde die vollständige Zugänglichkeit der inneren Akrosommembran (Antikörperbindung an CD46) nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor gezeigt. Im Vergleich dazu führte eine spontane Akrosomreaktion oder die Induktion der Akrosomreaktion mit Progesteron zwar zur Zugänglichkeit des akrosomalen Inhaltes (PSA), ermöglichte jedoch nicht die Bindung des Antikörpers an die innere Akrosommembran Jaiswal, et al. (1999). An akrosomreagierten Eberspermien wurde weder eine AnV-Bindung noch eine PNA-Markierung beobachtet. Eine methodische Ursache, die eine Markierung behindern würde, lag nicht vor, da einerseits einige der abgelösten vesikulären Membranstrukturen eine intensive AnV-Bindung auswiesen, andererseits eine deutliche AnV-Markierung der akrosomreagierten Spermien nach anschließender Kavitation oder Abkühlung auf Eis auftrat. Die akrosomale Seite der inneren Akrosommembran enthält somit entweder kein PS, oder vorhandenes PS bzw. die AnV-Bindung an PS wurde blockiert. Solch eine Behinderung der AnV-Bindung könnte z.B. durch eine kalziumvermittelte Wechselwirkung des PS mit Elementen des akrosomalen Inhaltes oder des Zytoskeletts entstehen.

Im Gegensatz zu den eigenen Versuchen an Eberspermien führte die Induktion der Akrosomreaktion an Mäusespermien zum Anstieg der AnV-Bindung. Ein Auslösen der Akrosomreaktion mit Progesteron führte zur AnV-Bindung an 62% der lebenden (PI-) Spermien im akrosomalen Bereich. Nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor beschrieben die Autoren eine intensive AnV-Markierung des akrosomalen und postakrosomalen Bereiches in 59% der PI-ungefärbten Mäusespermien Ávalos-Rodríguez, et al. (2004). Im Unterschied zu ejakulierten Spermien hatten epididymale Spermien nie Kontakt mit Faktoren des Seminalplasmas, denen unter anderem bei der Stabilisierung der Spermienzellen, aber auch bei der Signaltransduktion während der Kapazitation und Befruchtung eine wesentliche Bedeutung zukommt. Eventuell könnte darin die Ursache der widersprüchlichen Ergebnisse begründet liegen. Spezies-spezifische Unterschiede und ein anderer Fusionsverlauf können ebenfalls nicht ausgeschlossen werden.

Im postakrosomalen Bereich der Eberspermien weist die Plasmamembran eine hohe Stabilität auf. Eine Wechselwirkung des zytoplasmatisch akkumulierten PS mit Elementen des Zytoskeletts erscheint vor allem in diesem Bereich wahrscheinlich.

▼ 143 

Der postakrosomale Bereich bzw. die Becherhülse der Säugerspermien stellt eine vergleichsweise sehr stabile morphologische Struktur dar, die in frischen Spermien selbst nach mäßiger Kavitation (10 min, 45 bar) überwiegend intakt erhalten bleibt. Eine AnV-Bindung im Bereich der Becherhülse wurde grundsätzlich nur an wenigen toten Spermien bzw. nach Kavitation der Zellen beobachtet. Lediglich <5% der frischen, 12% der kapazitierten und 6% der akrosomreagierten Eberspermien zeigten eine AnV-Markierung des Postakrosoms. Nach anschließender Kavitation waren vergleichsweise an 21% der frischen, 63% der kapazitierten und 69% der akrosomreagierten Zellen die Becherhülsen markiert. Offensichtlich führte die Kapazitation der Eberspermien auch im Bereich der Becherhülse zu einer Destabilisierung der Plasmamembran, wobei erst eine Kavitation oder ein schnelles Abkühlen auf Eis eine AnV-Bindung an endogenes PS im Äquatorialsegment, an der Becherhülse und/oder am Spermienhals ermöglichte. Diese Ergebnisse legen eine zytoplasmatische Lokalisation des endogenen PS auch im Bereich des Postakrosoms nahe. Eventuell unterstützt die zytoplasmatische Lokalisation des PS gerade in diesem Bereich dessen Stabilität. Eine Wechselwirkung mit dem Zytoskelett erscheint sehr wahrscheinlich. So wurde bereits mehrfach von der speziellen Zytoskelett-Struktur des Postakrosoms berichtet. In epididymalen Bullenspermien wurde in diesem Bereich Aktin detektiert, das nach einer Inkubation mit TritonX-100 nicht extrahiert werden konnte Yagi and Paranko (1995). Castellani-Ceresa et al. fanden F-Aktin in akrosomreagierten Eberspermien (i) im Äquatorialsegment zwischen der Plasmamembran und der äußeren Akrosommembran, (ii) im Postakrosom zwischen der Plasmamembran und der äußeren Oberfläche der fibrillären Zytoskelett-Scheide und (iii) am Verbindungsstück und Spermienhals Castellani-Ceresa, et al. (1992). An Erythrozyten gibt es Hinweise für eine kalziumabhängige Wechselwirkung zwischen Aminophospholipiden mit Spektrin-Aktin-Komplexen Manno, et al. (2002). Ob es in Spermien zu solch einer Interaktion kommt, bleibt Aufgabe weiterer Untersuchungen. Es sei hier darauf hingewiesen, dass in einer Arbeit an aktivierten Thrombozyten eine Interaktion von AnV mit F-Aktin in Anwesenheit von Kalzium gezeigt wurde Tzima, et al. (1999). Ob die beobachtete AnV-Markierung im Bereich des Postakrosoms defekter Eberspermien tatsächlich auf eine Bindung an endogenes PS zurückzuführen ist oder eventuell auf einer Exposition zytoskelettärer Strukturen beruht, kann derzeit nicht beantwortet werden.

Die hohe Stabilität der Plasmamembran im Bereich des Postakrosoms lebender Spermien spricht für deren Bedeutung bei der Eizellbindung und -fusion. In-vivo wird die Akrosomreaktion zuvor kapazitierter Spermien an der Zona pellucida ausgelöst. Das die Eizelle befruchtende Spermium muss hyperaktiviert die Zona durchdringen, um in den Perivitellinraum zu gelangen und schließlich mit der Eizellmembran fusionieren zu können. Das Äquatorialsegment bildet den Ausgangspunkt für die Fusion des Spermiums mit der Eizelle, die wahrscheinlich ein Protein-vermittelter Prozess ähnlich der Virusfusion ist Arts, et al. (1997) ;Bedford (1969). Das die Plasmamembran im Bereich des Postakrosoms akrosomreagierter, lebender Spermien besondere fusogene Eigenschaften aufweist, wurde für Spermien von Rind und Mensch gezeigt Arts, et al. (1994) ;Arts, et al. (1993). Wahrscheinlich ist jedoch auch im Bereich des Postakrosoms eine Exposition von PS, bedingt durch ein Scrambling der Phospholipide, keine Voraussetzung für die stattfindenden Fusionsprozesse.

Es kommt kapazitationsbedingt zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran. Wahrscheinlich ist eine Ausbildung lateraler Membrandomänen in Plasmamembran und äußeren Akrosommembran, in denen PS zytoplasmatisch akkumuliert wird, Voraussetzung für diese enge Assoziation, die letztendlich an vielen Orten zur punktuellen Fusion beider Membranen miteinander führen kann.

▼ 144 

PNA-Bindung an kapazitierte und akrosomreagierte Spermien ohne AnV-Markierung

In einem beträchtlichen Teil der kapazitierten (22%) und der akrosomreagierten (27%) Eberspermien wurde eine alleinige PNA-Bindung am akrosomalen Bereich beobachtet. Endogenes PS war für eine AnV-Markierung hingegen nicht zugänglich. Demnach müsste entweder (i) die apikale Plasmamembran dieser Zellen komplett abgelöst und das PS der äußeren Akrosommembran akrosomal angereichert sein, oder (ii) die Bindung von AnV an endogenes PS in der Plasmamembran und äußeren Akrosommembran müsste blockiert oder (iii) durch die enge Nachbarschaft von PS- und PNA-Rezeptoren sterisch behindert sein. Letzteres konnte experimentell nicht bestätigt werden, da die Ergebnisse unabhängig von der Reihenfolge der Markierung und prozentual vergleichbar in Einzelfärbungen reproduziert werden konnten. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen kapazitierter Spermien zeigten bei einigen Zellen eine sehr dichte Assoziation von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran. Dabei erschien die Plasmamembran einerseits wellenförmig der äußeren Akrosommembran überlagert mit punktuellen Kontaktstellen, andererseits wechselten sich kleine Bereiche aufgelöster Plasmamembran mit Membranbereichen, die fest mit der äußeren Akrosommembran assoziiert waren, ab. Die Kontaktstellen zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran könnten Startpunkte für eine Fusion der beiden Membranen miteinander darstellen. Der Kontakt könnte z.B. von Fusionsproteinen vermittelt werden. An der Fusion intrazellulärer Membranen sind in tierischen Zellen verschiedene fusionsvermittelnde Proteine beteiligt. Eine Gruppe recht kleiner, meist membranverankerter Proteine mit charakteristischer Aminosäurezusammensetzung bilden sogenannte SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor). Sie akkumulieren reversibel zu helikalen Bündeln und sollen damit verbunden die fusionierenden Membranen dicht aneinander ziehen und somit schließlich deren Fusion auslösen Jahn and Südhof (1999). SNARE-Proteine wurden auch im akrosomalen Bereich von Säugerspermien nachgewiesen und könnten dort die Exozytose des Akrosoms vermitteln Ramalho-Santos, et al. (2000). Andererseits kommt es während der Kapazitation von Eberspermien zur Polymerisation von Aktin. Filamentöses Aktin kann wahrscheinlich eine dichte Zusammenlagerung von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran und eventuell auch erste Membranvesikulationen vermitteln Breitbart (2002) ;Saxena, et al. (1986). Nimmt man eine zytoplasmatische Lokalisation des endogenen PS in Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, wie für die Mehrheit der frischen und kapazitierten Eberspermien in dieser Arbeit gezeigt, auch für die nur PNA-bindenden Zellen an, könnte PS an der Ausbildung und Erhaltung der Kontaktstellen zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran direkt beteiligt sein. PS gehört zu den fusogenen Lipiden, deren Struktur die Ausbildung fluider und fusogener Membranbereiche fördert. Seine negative Ladung ermöglicht eine kalziumvermittelte Annäherung von Lipidbilayern Herrmann, et al. (1991). Von einer kalziumabhängigen Wechselwirkung zwischen Aminophospholipiden mit Spektrin-Aktin-Komplexen wurde in Erythrozyten berichtet Manno, et al. (2002). Interessant erscheinen in diesem Blickwinkel auch endogene Annexine, eine Gruppe von Proteinen, die Phospholipide in Anwesenheit von Kalzium binden. Bedingt durch deren bivalente Aktivität können sie kalziumabhängig Membranen miteinander verbinden, aber auch Wechselwirkungen zwischen Zytoskelett und Membran vermitteln Creutz (1992). Hernandez et al. wiesen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie ein Annexin-artiges Protein (sp50) auf der zytoplasmatischen Seite von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran in Meerschweinspermien nach Hernandez, et al. (1996). Auch in Spermien von Bullen, Menschen, Hamstern und Ratten wurden endogene Annexine nachgewiesen Feinberg, et al. (1991).

Die Assoziation von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran in kapazitierten Eberspermien ist offensichtlich sehr stabil, da selbst nach Kavitation der zuvor kapazitierten Zellen ein Teil der Spermien (ca. 11%) nach wie vor nur mit PNA markiert werden konnte. Eberspermien mit ausschließlicher PNA-Markierung könnten ein Zwischenstadium auf dem Weg zur klassischen, exozytotischen Akrosomreaktion darstellen. Verschiedene Exozytose-Prozesse benötigen tatsächlich eine selektive Anreicherung anionischer Phospholipide auf den zytoplasmatischen Seiten der interagierenden Membranen Devaux and Zachowski (1994). Auch für die an den Exozytoseprozessen beteiligten Proteine Synexin (chromaffine Zellen) und verschiedene SNARE-Proteine (neurosekretorische Zellen) wurde gezeigt, dass für ihre kalziumabhängige Wechselwirkung mit Membranen eine zytoplasmatische Lokalisation anionischer Lipide nötig war Pollard, et al. (1988) ;Quetglas, et al. (2002).

▼ 145 

Vesikulation von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran

Sowohl in den Proben kapazitierter Eberspermien als auch in denen nach Induktion der Akrosomreaktion konnten von den Spermien abgelöste vesikuläre Membranstrukturen beobachtet werden. Diese waren entweder unmarkiert, zeigten eine AnV-Bindung, eine PNA-Markierung oder eine Komarkierung mit AnV und PNA. Scheinbar sind verschiedene Mechanismen für die Entstehung solch diverser Vesikel verantwortlich. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von kapazitierten Eberspermien zeigten dementsprechend auch unterschiedliche morphologische Membranstrukturen. Sowohl in den eigenen Versuchen als auch in älteren Arbeiten an Human- und Eberspermien wurde gezeigt, dass Vesikulationen der Plasmamembran, der beiden Akrosommembranen, aber auch zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran stattfinden können Nagae, et al. (1986) ;Szöllösi and Hunter (1978). Die Abbildung 34 zeigt schematisch die aus den Ergebnissen abgeleiteten möglichen Membraninteraktionen während der Spermiengenese.

Abb. 34: Schematische Zusammenfassung möglicher Membraninteraktionen während der Genese von Eberspermien: (a) In frisch gewaschenen, lebenden Eberspermien ist PS auf der zytoplasmatischen Seite von Plasmamembran (PM) und äußerer Akrosommembran (äAM) akkumuliert, während spezifische Lektinbindungsorte lediglich auf der zytoplasmatischen Seite der äAM lokalisiert sind. (b, e) Während der Inkubation der Spermien kommt es zunehmend zum Absterben der Zellen, die Integrität der PM wird gestört. Teilweise kommt es zur Ablösung der PM, die sich eventuell später zu vesikulären Strukturen zusammenlagert. (c) Kapazitationsbedingt kommt es örtlich zu einer dichten Zusammenlagerung von PM und äAM. Dies erfolgt wahrscheinlich kalziumvermittelt über ein Bindeglied. Bei diesem postulierten Bindeglied könnte es sich um endogene Annexine, SNARE-Proteine, Zytoskelett-Elemente u.a. handeln. In den elektronenmikroskopischen Bildern kapazitierter Spermien erscheinen teilweise Löcher in der PM. Solche Fehlstellen können präparationsbedingt entstehen, stellen aber mit Sicherheit laterale PM-Domänen dar, die besonders fragil sind. (d, i) Ein Ablösen der PM führt zur Exposition der äAM, auf deren zytoplasmatischer Seite einerseits PS akkumuliert ist, andererseits PNA an spezifische Zuckerstrukturen bindet. Teilweise kommt es auch zur Vesikulation der äAM. (f-g) Mischvesikel, deren Bildung nach Fusion von PM und äAM entstehen könnten.

▼ 146 

Während die Zusammenlagerung von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, die Ablösung von Teilen der Plasmamembran und die Exposition der äußeren Akrosommembran durch die elektronenmikroskopischen Arbeiten bestätigt wurden, kann über die Entstehung und Zusammensetzung der Vesikel nur spekuliert werden. Die Entstehung von Mischvesikeln nach Induktion der Akrosomreaktion mit Kalziumionophor wurde mehrfach beobachtet, ob es allerdings zu einer symmetrischen Verteilung der Lipide in den Vesikeln kommt, oder ob laterale und transversale Unterschiede zumindest über einen gewissen Zeitraum erhalten bleiben, ist unklar Gillis, et al. (1978).

Der akrosomalen Seite der äußeren Akrosommembran sind Matrixproteine aufgelagert, die auch an den Vesikeln fest assoziiert blieben Watson, et al. (1992). Eventuell sind diese Matrixproteine für den strukturellen Erhalt der Membran verantwortlich. Ebenso könnten die mutmaßlichen Bindeglieder zwischen den zytoplasmatischen Seiten von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran strukturerhaltend wirken. Ein stabil am zytoplasmatischen PS assoziierter Faktor könnte zumindest erklären, warum auch nach Vesikulation z.T. keine AnV-Bindung beobachtet wurde. Solch ein Bindeglied könnte, wie bereits diskutiert, zytoplasmatisches Kalzium in Verbindung mit Zytoskelettelememten, endogenen Annexinen, SNARE-Proteinen u.a. sein. In Untersuchungen an Knorpelzellen (Chondrozyten) wurde z.B. AnV als ein Hauptbestandteil von Matrixvesikeln identifiziert, das hier eine wichtige Rolle in der Regulierung des Kalziumeinstromes in diese Vesikel hat. Die Matrixvesikel unterscheiden sich in ihrer Lipidzusammensetzung deutlich von der Plasmamembran der Chondrozyten und enthalten deutlich mehr PS. In den PS-reichen Liposomen bilden sich AnV-Hexamere, die wahrscheinlich für den beobachteten Anstieg des Kalziumeinstromes verantwortlich waren Kirsch, et al. (1997). Über die Identität und den Verbleib der PNA-Bindungsstellen nach Akrosomreaktion gibt es bisher keine Untersuchungen. PNA ist spezifisch für β-D-Galaktose-Reste und bindet selektiv an die äußere Akrosommembran. Unklar ist jedoch, ob ein Glykolipid oder ein Glykoprotein für diese spezifische Bindung verantwortlich ist und ob es während der Genese zu einer transversalen Umverteilung kommt.

Um in zukünftigen Arbeiten genauere Aussagen zu den stattfindenden Fusions- und Vesikulationsschritten treffen zu können, ist die Nutzung von bisher nur unzureichend bekannten Membran- und Bilayer-spezifischen Proteinmarkern unumgänglich.

▼ 147 

Vorhandensein lateraler Membrandomänen in Säugerspermien

In der Einleitung wurde bereits erläutert (1.3.2.3, S.23), wie kontrovers das Vorkommen lateraler Membrandomänen in der Plasmamembran von Säugerspermien diskutiert wird. Während zahlreiche Befunde für eine differenzierte Organisation entsprechend der morphologischen Spermienstrukturen (Kopf: akrosomal, postakrosomal; Hals; Mittelstück; Schwanz) sprechen, gibt es über das Vorhandensein koexistierender Lipidphasen widersprüchliche Ergebnisse.

Einige Daten der Untersuchungen an Eberspermien könnten durch laterale Lipiddomänen in der Plasmamembran erklärt werden. So blieb unklar, warum es bei der Markierung der Plasmamembran mit NBD-PL über den gesamten Messzeitraum (Durchflusszytometrie) zu einem stetigen Fluoreszenzanstieg in lebenden Zellen kam, obwohl die eingesetzte Labelmenge (< 2mol%) ein Quenching nach Einbau in die Plasmamembran (t1/2 < 10 s) eigentlich ausschließen sollte. Da die Translokation des NBD-PS sehr schnell auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran erfolgte (t1/2 ~ 4,5 min), ist es auch unwahrscheinlich, dass zytoplasmatisch angereicherte Label den zunehmenden Fluoreszenzanstieg über Stunden erklären. Eine Umverteilung der Label zwischen Zellen einer Suspension, ein Transport zu intrazellulären Membranen oder eine laterale Umverteilung zwischen Membrandomänen der Plasmamembran könnte den beobachteten Fluoreszenzanstieg ebenfalls erklären. Für eine Umverteilung des zunächst in defekte Spermien eingebauten Labels in die Plasmamembran der lebenden Zellen spräche zumindest die Angleichung der Fluoreszenzintensitäten lebender und toter, mit NBD-PS markierter Eberspermien. Es wäre allerdings auch möglich, dass sich die NBD-PL in lebenden Zellen zunächst inhomogen in bestimmten Membrandomänen der Plasmamembran einbauen und von dort erst lateral und transversal umverteilt werden.

▼ 148 

Des weiteren deuten die Versuche zur AnV-Bindung an kapazitierten und akrosomreagierten Eberspermien auf das Vorhandensein lateraler Lipiddomänen hin. Die Bindung des PNA erfolgte offensichtlich an Membrandomänen, in denen PS für eine AnV-Bindung nicht zugänglich war. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen kapazitierter Eberspermien unterstützen die Theorie lateraler Membrandomänen. Einerseits wurden stabile, fest mit der äußeren Akrosommembran assoziierte Bereiche der Plasmamembran beobachtet, die sich mit Bereichen aufgelöster Plasmamembran abwechselten, andererseits wurde eine Markierung mit Biotin-AnV, detektiert durch die Bindung eines goldmarkierten Biotin-Antikörpers, an kapazitierten Spermien nur sehr selten und dann vereinzelt an Kontaktstellen sich abschnürender Membranstücke gefunden. Verschiedene ältere elektronenmikroskopische Arbeiten an Säugerspermien zeigten, dass während der Kapazitation protein- und cholesterolfreie Gebiete in Plasmamembran und äußerer Akrosommembran entstehen Bawa, et al. (1993) ;Bearer and Friend (1982) ;Tesarík and Fléchon (1986).

Flesch et al. postulierten in einem Modell für Eberspermien, dass die Umverteilung und der Entzug von Cholesterol aus kapazitierten Spermien durch die Ausbildung eines apikalen Membranrafts erklärt werden könnte Flesch, et al. (2001). Die hohe Cholesterolkonzentration im akrosomalen Bereich der Spermien, charakterisiert über die starke Flipin-Markierung dieser Struktur, das Vorkommen von Caveolin-1 im Spermienkopf (nicht publizierte Daten von B.M. Gadella, zitiert in Flesch, et al. (2001)) sowie die Umverteilung eines GPI-verankerten Plasmamembranproteins (PH-20) auf die Oberfläche des apikalen Kopfes von Rattenspermien Seaton, et al. (2000) könnten demnach auf die Ausbildung apikaler Rafts hindeuten.

Travis et al. wiesen für Spermien von Maus und Meerschwein eine Anreicherung von Caveolin-1 in der Triton-unlöslichen Membranfraktion nach. Untersuchungen mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie zeigten zudem, das Caveolin-1 bei diesen Spezies im Bereich des Akrosoms und des Spermienschwanzes vorkommen. Syntaxin-2, ein Protein, das an der Exozytose des Akrosoms beteiligt ist, befand sich sowohl in der Raftfraktion als auch in der Nichtraftfraktion Travis, et al. (2001). Weitere Arbeiten an Mäusespermien deuten auf ein Vorhandensein mehrerer molekular unterschiedlich zusammengesetzter Raftstrukturen hin Trevino, et al. (2001). So berichten die Autoren einerseits von einer Kolokalisation von Caveolin-1 mit bestimmten Kalziumkanälen (Trp1), die eine wichtige Rolle bei der kalziumgesteuerten Signaltransduktion während der Kapazitation und Akrosomreaktion spielen könnten. Andererseits wurde eine spezifische Raftkomponente – das Gangliosid GM1 – unabhängig von Caveolin-1 identifiziert. Ein Nachweis, dass tatsächlich nur Membrandomänen der Plasmamembran isoliert wurden, erfolgte in keiner der Arbeiten. Auch die Lipidzusammensetzung der isolierten Raftfraktion wurde nicht untersucht. Erste eigene Versuche zur Präparation von Triton-unlöslichen Lipiddomänen aus der Plasmamembran erfolgten an Forellenspermien. Da diese kein Akrosom besitzen, bieten sie sich zur Etablierung der Technik besonders an.

▼ 149 

Die Plasmamembran von Forellenspermien enthält Lipiddomänen mit erhöhtem CHO/PL-Verhältnis. Dies weist auf die physiologische Bedeutung einer lateral asymmetrischen Verteilung der Membranlipide in Spermienzellen hin.

Sogenannten Raftstrukturen in der Plasmamembran tierischer Zellen wurde in den letzten Jahren wiederholt eine entscheidende Rolle bei der Regulation verschiedener Zellfunktionen zugeschrieben. Die ursprüngliche Beschreibung solcher Lipiddomänen bezog sich auf deren Unlöslichkeit in nichtionischem Detergens Simons and Ikonen (1997). Diesem Ansatz folgend sollten die eigenen Untersuchungen klären, ob auch in Forellenspermien Detergens-unlösliche Lipiddomänen separierbar sind. Detergens-unlösliche Membranfraktionen wurden bereits in Seeigel-, Maus- und Meerschweinspermien beschrieben Ohta, et al. (1999) ;Ohta, et al. (2000) ;Travis, et al. (2001) ;Trevino, et al. (2001). Eine nach Tritonlyse und Gradientenzentrifugation isolierte Membranfraktion aus Seeigelspermien wies zwar eine Anreicherung von Glykosphingolipiden, PS und Diacylglycerol, nicht hingegen von Cholesterol, Sphingomyelin und Caveolin-1 auf Ohta, et al. (1999) ;Ohta, et al. (2000). Im Gegensatz dazu wurde in Säugerspermien (Maus und Meerschwein) eine Anreicherung von Caveolin-1 in der Triton-unlöslichen Membranfraktion nachgewiesen, die Lipid-zusammensetzung der Membranfraktion wurde jedoch nicht untersucht Travis, et al. (2001).

In der vorliegenden Arbeit konnten aus Forellenspermien erfolgreich Rafts präpariert werden. In Abhängigkeit von der eingesetzten Spermien- und Tritonkonzentration bei 4°C konnten 12-90% der Gesamtspermienlipide nach zusätzlicher mechanischer Einwirkung (Pottern) solubilisiert werden. Ein wiederholtes Resuspendieren der zunächst nicht gelösten Membranstrukturen in Triton-haltigem Puffer hatte eine weitere Solubilisierung zur Folge. Ob dies letztendlich zur vollständigen Lyse aller Membranen geführt hätte, wurde nicht getestet, deutete sich in den Versuchen jedoch an. Eine effektive Lyse konnte mit 1%igem Triton in einer Spermiensuspension von 109 Zellen/ml in Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium (1,8 mM) erreicht werden. Unter diesen Bedingungen waren ca. 90% der Gesamtspermienlipide solubilisiert. Um eindeutig nur Lipide der Plasmamembran untersuchen zu können, wäre (erst recht bei Säugerspermien) eine vorherige Plasmamembranisolation nötig. Da Forellenspermien kein Akrosom und nur ein ringförmiges Mitochondrium besitzen, wurde jedoch zunächst auf eine Plasmamembranisolation verzichtet.

▼ 150 

Eine Auftrennung der zuvor solubilisierten Zellbestandteile über einen Dichtegradienten gelang prinzipiell in allen Versuchen, am effektivsten jedoch über einen „kontinuierlichen“ Gradienten nach 18 Stunden Ultrazentrifugation. Allerdings war auch in diesen Varianten noch kein Zentrifugationsgleichgewicht erreicht, da die Wiederfindungsrate in den Banden unter 50% lag und das unterschichtete Zellmaterial wahrscheinlich über den gesamten Gradienten verteilt war. Außerdem befand sich die oberste Bande im Bereich 15-20%iger Saccharose, während andere Autoren von einer „Raftbande“ im Bereich 5-7%iger Saccharose nach 18 h Zentrifugation mit 200.000xg berichten Yamamura, et al. (1997).

Die leichteste Membranbande (am weitesten im Gradienten aufgestiegen) war in allen Versuchen durch ein erhöhtes CHO/PL-Verhältnis gekennzeichnet, was auf Lipidebene als typisches Kennzeichen von Raftstrukturen angesehen wird.

Die Untersuchungen an Forellenspermien zeigten vor allem, dass eine feine Abstimmung des Protokolls mit Kontrollen aller Präparationsschritte für weitere Versuche unbedingt nötig ist. Die Abhängigkeit der Tritonlyse von der eingesetzten Spermienkonzentration, der Tritonkonzentration und der Ionenzusammensetzung muss für vergleichende Untersuchungen ebenso beachtet werden, wie die sich anschließenden Zentrifugationsbedingungen, die in den Veröffentlichungen zur Isolierung von Membranrafts stark variieren. Um Aussagen zur physiologischen Relevanz von Lipiddomänen in der Plasmamembran von Spermien treffen zu können, sind funktionelle Untersuchungen während der Genese der Spermien auch unter Berücksichtigung spezifischer Raftproteine nötig. Erste Proteincharakterisierungen der isolierten Raftbanden erfolgten für Forellenspermien in Kooperation mit der französischen Arbeitsgruppe Labbé, et al. (2004). Eine Gefrierkonservierung der Spermien ermöglichte zwar weiterhin die Isolierung einer cholesterolreichen Membranfraktion, deren Proteinmuster unterschied sich allerdings von dem der Raftbande frischer Forellenspermien. Eventuell bieten diese Versuche einen neuen Ansatz zum Verständnis der molekularen Ursachen für die gestörte Fruchtbarkeit gefrierkonservierter Spermien. Ein Cholesterolentzug aus der Plasmamembran der Forellenspermien mittels β-Cyclodextrin bewirkte analog zu anderen tierischen Zellen eine Zerstörung der cholesterolreichen Membrandomänen Labbé, et al. (2004).

▼ 151 

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstreichen die Bedeutung der transversalen Asymmetrie der Phospholipide für die Funktionsfähigkeit der Spermien während der Genese. Diese transversale Asymmetrie geht mit einer lateralen Inhomogenität der Spermienmembranen einher und wird in Vorbereitung auf die Befruchtung der Eizelle sensibel reguliert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
17.08.2007