Eberspermien

Für die Versuche standen flüssigkonservierte Spermien von Ebern der Rasse Piétrain, vereinzelt auch der Rassen Duroc, Deutsches Edelschwein, Deutsche Landrasse und Leicoma zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Ejakulate erfolgte ganzjährig in Besamungseberstationen nach standardisierten Protokollen. Die Ejakulate wurden in BTS auf ca. 2-3,5*10⁷ Spermien/ml verdünnt und in geschlossenen Plastiktuben (ca. 90 ml) bei 17°C gelagert. Unter diesen Bedingungen bleiben Eberspermien mehrere Tage befruchtungsfähig.

Vor jedem Versuchstag wurden die verwendeten Eberspermien hinsichtlich ihrer Motilität und Morphologie mikroskopisch beurteilt. Diese Untersuchungen erfolgten im spermatologischen Labor des Instituts für Fortpflanzung landwirtschaftlicher Nutztiere Schönow e.V. (IFN). Als Mindestanforderung für den Praxiseinsatz bei der künstlichen Besamung gelten bei flüssigkonservierten Eberspermien 65% motile und 75% morphologisch intakte Spermien. Weitere Untersuchungen zur Einschätzung der Spermienqualität, wie z.B. ein Thermoresistenztest (Inkubation der in BTS flüssigkonservierten Spermien bei 38,5°C bis zu 5 h) oder ein Kapazitationstest (Auslösbarkeit der Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors) erfolgten für ausgewählte Proben ebenfalls im IFN.

Kapazitation

Um Spermien in vitro zu kapazitieren, wurden spezielle Medien entwickelt, die in etwa dem natürlichen Ionenmilieu einer In-vivo-Kapazitation im Eileiter des weiblichen Tieres entsprechen. Die flüssigkonservierten Eberspermien müssen zunächst in dieses Medium überführt werden. Dabei wird auch das in den flüssigkonservierten Proben enthaltene Seminalplasma entfernt. Für eine erfolgreiche Kapazitation von Eberspermien ist des weiteren eine Temperatur von 38-39°C erforderlich.

Protokoll - Kapazitation IFN

3 ml flüssigkonserviertes Ebersperma + 2 ml TALP
Zentrifugation 6 min, 600xg (langsames Beschleunigen und Abbremsen!)
Überstand bis auf 1 ml absaugen und mit 1 ml TALP auffüllen
vorsichtiges Resuspendieren des Spermienpellets
Zentrifugation 6 min, 600xg (langsames Beschleunigen und Abbremsen!)
Überstand bis auf 0,5 ml absaugen und mit 1,5 ml TALP auffüllen
Pellet vorsichtig resuspendieren (~ 3x10⁷ Zellen/ml)
Zugabe von 6 µg/ml (1,18 USP/ml) Heparin zur Spermiensuspension
Inkubation im Thermoblock bei 38,5°C für 45 min

Die Versuche wurden nach einem Standardprotokoll (IFN) zur Kapazitation von Eberspermien durchgeführt. Abweichend von diesem Standardprotokoll wurden Kontrollexperimente durchgeführt, in denen einzelne Komponenten des Kapazitationsmediums variiert wurden (BSA, Heparin, CaCl₂). Eine Inkubation im Zellkulturschrank mit 5% CO₂ wurde getestet und die Inkubationszeit variiert. Diese Abweichungen vom Protokoll „Kapazitation IFN“ sind im Ergebnisteil ausgewiesen.

Für einige Versuche wurde das flüssigkonservierte Ebersperma über einen Percoll-Dichtegradienten nach dem Protokoll von Harrison et al. aufbereitet Harrison, et al. (1993). Diese Methode bietet die Möglichkeit, motile Spermien anzureichern und sehr effektiv von Zytoplasmatropfen, Seminalplasma und anderen Verunreinigungen zu trennen.

Protokoll - Kapazitation Harrison

Percollgradienten im Reagenzglas schichten: 2 ml / 70% (vol/vol); 3 ml / 35% (vol/vol)
3 ml flüssigkonservierte Eberspermien vorsichtig überschichten
Zentrifugation 5 min / 200xg; 15 min / 900xg
Überstand vorsichtig absaugen
Pellet im Kapazitationsmedium resuspendieren (~1x10⁷ Zellen/ml)
Inkubation im Zellkulturschrank mit 5% CO₂ bei 38,5°C für 2 h

Wie bereits bei der „Kapazitation IFN“ beschrieben, wurden auch bei dieser Methode verschiedene Faktoren variiert, wie im Ergebnisteil angegeben.

Versuche, bei denen eine Markierung der Plasmamembran mit fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga vorgenommen wurde, erfolgten in BSA-freiem TALP. Die Kapazitation erfolgte im Zellkulturschrank mit 5% CO₂. Nach Harrison et al. ist eine Kapazitation von Eberspermien allein in Gegenwart von Bikarbonat möglich Harrison, et al. (1993).

Als sichtbares Indiz der Kapazitation von Eberspermien gilt unter anderem die zunehmende Agglutination der Spermien. Dies ist bereits makroskopisch im Reagenzglas bzw. im Zellkulturschälchen zu erkennen. Ein weiteres gut sichtbares Zeichen ist die Änderung der Bewegungsform der Spermien, die mikroskopisch beurteilt werden kann. Es kommt zur Hyperflagellation, die durch größere Amplitude und Frequenz der Kopfauslenkung gekennzeichnet ist. Diese beiden Kapazitationsmerkmale wurden bei allen Inkubationen in unterschiedlichem Ausmaß beobachtet. Der klassische Nachweis einer erfolgreichen Kapazitation ist die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion.

Akrosomreaktion

Die Akrosomreaktion kann bei kapazitierten Eberspermien durch Zugabe eines Kalziumionophors (z.B. A-23187) ausgelöst werden. Die Versuche wurden nach einem Standardprotokoll zur Induktion der Akrosomreaktion von Eberspermien IFN durchgeführt.

Protokoll - Akrosomreaktion

Resuspendieren der zuvor kapazitierten Spermien durch vorsichtiges Schwenken

1 ml Spermiensuspension + 15 µl A-23187 (200 µM Stammlösung in TALP/DMSO) in einem Eppendorfgefäß gut mischen ( = 3 µM)

Inkubation des geschlossenen Eppendorfgefäßes im Thermoblock bei 38,5°C für 30 min

Das Ausmaß der Akrosomreaktion vor (frühzeitig) und nach (induziert) Zugabe des Ionophors dient als Maß für die Kapazitation der Spermien. Diese Auswertung kann sowohl mikroskopisch als auch, nach geeigneter Färbung, durchflusszytometrisch erfolgen. Man unterscheidet dabei vier Subpopulationen der Spermien:

lebend und morphologisch intaktes Akrosom

leb./NAR

lebend und defekte oder abgelöste Kopfkappe

leb./akrosomreagiert

tot und morphologisch intaktes Akrosom

tot/NAR

tot und defekte oder abgelöste Kopfkappe

tot/akrosomreagiert

Dieser „Kapazitationstest“ wurde nicht für alle in dieser Arbeit genutzten Spermienproben durchgeführt. Zur Kontrolle und zum Vergleich verschiedener Inkubationsbedingungen wurden einzelne Proben hinsichtlich ihres Akrosomstatus nach Kapazitation und Akrosomreaktion beurteilt.

Zona-pellucida-Bindungsassay

Um die Bindungsfähigkeit der Spermien zu charakterisieren, wurde ein Zona-pellucida-Bindungsassay als „Qualitätstest“ für Eizellen und Säugerspermien entwickelt. Dabei werden kapazitierte Spermienzellen zusammen mit isolierten Zonae inkubiert. Nach dem Waschen der Zonae kann man die fest assoziierten Spermien mikroskopisch beurteilen.

Der an der Tierärztlichen Hochschule Hannover für Eberspermien etablierte Hemizona-Assay und die Arbeiten von Fazeli et al. dienten als Grundlage und wurde an die Fragestellung angepasst Fazeli, et al. (1997) ;Ferreira (1998). Als Ausgangsmaterial wurden Schlachtovarien vom Schwein nach ihrer Entnahme bei -70°C gelagert und am Versuchstag in TALP bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut.

Protokoll – Zona-pellucida-Assay

mit Hilfe einer Spritze Eizellen aus den Follikeln absaugen und in eine große Petrischale mit TALP überführen
unter dem Stereomikroskop die Eizellen mehrmals in eine Kapillare aufsaugen, um die Granulosazellen abzulösen
„saubere“ Eizellen zügig in frische Petrischale mit TALP umsetzen
unter dem Stereomikroskop die Eizellen mit einer sehr engen Kapillare ansaugen und aufbrechen, um das Zytoplasma und den Zellkern zu entfernen
leere Zona-pellucida-Hüllen nochmals zügig in frisches TALP überführen und über Nacht im Kühlschrank bzw. bei -20°C lagern
für Bindungsversuche 2-3 Zonae in ein kleines Zellkulturschälchen mit 50 µl TALP überführen und für 15 minim Zellkulturschrank (5% CO₂) bei 38,5°C inkubieren
Eberspermien, wie oben beschrieben, in TALP waschen und auf eine Zellkonzentration von 1x10⁵/ ml einstellen
Kapazitation und Markierung der Eberspermien
50 µl Spermiensuspension zu den vorbereiteten Zonae hinzugeben
Inkubation im Zellkulturschrank (5% CO₂) bei 38,5°C für 15 min
unter dem Stereomikroskop Zonae vorsichtig in eine Kapillare Aufsaugen und in 50 µl frisches, vorgewärmtes TALP überführen

Die an den Zonae assoziierten Eberspermien wurden sofort fluoreszenzmikroskopisch untersucht.

Kavitation

Die Kavitation von Zellen wird seit vielen Jahren zur selektiven Isolierung von Plasmamembranvesikeln genutzt. Dabei werden die Zellen für kurze Zeit einem hohen Gasdruck ausgesetzt. Das Gas, in der Regel Stickstoff, löst sich im Medium und im Zytoplasma der Zellen. Wird schließlich der Druck reduziert, bilden sich kleine Gasblasen, die Löcher in die Zellmembran reißen oder diese völlig ablösen. Gillis et al. isolierten mit dieser Methode erstmals Plasmamembranvesikel von Eberspermien. In den folgenden Jahren wurden die Produkte der Kavitation von Spermien mikroskopisch und biochemisch charakterisiert Gillis, et al. (1978). Bei geeigneter Wahl der Kavitationsbedingungen wird lediglich die Plasmamembran im Bereich über der Kopfkappe abgelöst, während die äußere Akrosommembran intakt bleibt Althouse, et al. (1995). In Anlehnung an die von Peterson et al. beschriebene Methode erfolgte die Kavitation der Eberspermien nach folgendem Protokoll Peterson, et al. (1980).

Protokoll - Kavitation

Zweimaliges Waschen der flüssigkonservierten Eberspermien in TALP
Resuspendieren der Spermien (~10⁹ Zellen) in 15 ml frischem TALP mit 15 µl Protease-Cocktail (500 units/ml)
oder
Resuspendieren der Spermien (~10⁹ Zellen) in 15 ml frischem TALP ♢ Kapazitation ♢ Zugabe von 15 µl Protease-Cocktail (500 units/ml) zu den kapazitierten Spermien
Kavitation bei 650 PSI (45 bar) für 10 min auf Eis
Langsames Ablassen des Überdrucks
Lagerung des Kavitates auf Eis

Die Spermien wurden unmittelbar nach der Kavitation markiert und fluoreszenz-mikroskopisch untersucht.

Markierungen

Um Aussagen über die Membranstrukturen der Eberspermien zu erhalten, wurden diese mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und anschließend analysiert. Die verwendeten Marker bauen sich in definierte Zellkompartimente ein oder binden an bestimmte Zellstrukturen und ermöglichen somit eine detaillierte Aussage über die Integrität oder Organisation dieser Zellbestandteile. Tabelle 4 und Abbildung 4 zeigen die verwendeten Marker und ihre Eigenschaften im Überblick.

Kapazitierte Eberspermien reagieren äußerst empfindlich auf jeglichen „Stress“, wie z.B. Temperaturänderung oder Wechsel des Mediums. Deshalb erfolgten alle Manipulationen an den kapazitierten oder akrosomreagierten Spermien ohne Fixierung bei 38,5°C im vorgewärmten TALP (wenn nicht anders beschrieben). Überschüssiger Farbstoff bzw. ungebundener Marker wurden nur ausgewaschen wenn unbedingt nötig. In der Regel reichte die ohnehin nötige Verdünnung der Proben für die Durchflusszytometrie als "Waschschritt“ aus.

Marker / Label

Bindung / Einbau

MW [d]

λ_abs[nm]

λ_em[nm]

{ε×10^-3}

Propidiumjodid

DNS

668

535

617

Aarts and Tymianski (2003)

Rhodamin 123

Mitochondrien

381

507

529

Chen and Wang)

NBD-PS, -PC

PM

860

465

535

Adams and Cory)

AnnexinV

PS (+Ca²⁺)

36x10³

-

-

-

PSA

akrosomaler Inhalt

49x10³

-

-

-

PNA

äAM

110x10³

-

-

-

FITC

AnnexinV, PNA, PSA

389

494

518

)

Alexa Fluor^® 594

AnnexinV, PNA

k.A.

590

617

k.A.

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Marker und Label: Molekulargewicht (MW) in Dalton (d), Absorbtionsmaxima (λ_abs), Emmisionsmaxima (λ_em), Extinxtionskoeffizient (ε); Desoxyribonukleinsäure (DNS), Plasmamembran (PM), äußere Akrosommembran (äAM).

Abb. 4: Strukturformeln verwendeter Fluoreszenzmarker: nach Molecular Probes bzw. Avanti Polar Lipids.

Lebend-Tot-Färbung mit Propidiumjodid

Der Farbstoff Propidiumjodid (PI) wird in der Regel von lebenden Zellen ausgeschlossen. Zellen, deren Plasmamembranintegrität gestört ist, erscheinen intensiv rot, da die Fluoreszenzintensität des PI nach Bindung an die Desoxyribonukleinsäure (DNS) auf das 20-30fache steigt. PI baut sich durch Interkalation zwischen den Basenpaaren der DNS im Verhältnis 1 Molekül PI pro 4-5 Basenpaare ein. Für eine konstante Färbung muss PI im Überschuss vorhanden sein, darf aber im Untersuchungszeitraum nicht zytotoxisch wirken.

Protokoll – PI-Färbung

Aliquot der PI-Stammlösung 1-15 min (Standard: 5 min) vor der Messung direkt in die Messküvette mit 2 ml Spermiensuspension (10⁵-10⁶ Zellen; = 0,75-1,88 µM) geben und im Dunkeln weiter inkubieren
oder

Aliquot der PI-Stammlösung die letzten 1-15 min (Standard: 5 min) der Inkubationszeit zu 250 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension (10⁵-10⁶ Zellen; = 1,5-15,0 µM) hinzufügen und im Dunkeln weiter inkubieren

Die Konzentration der Spermien und des PI sowie die Inkubationszeit der Spermien mit dem PI variierten in den einzelnen Versuchen und sind im Ergebnisteil ausgewiesen. Es wurde eine 1,5mM Stammlösung von PI in physiologischer Kochsalzlösung (pNaCl) angesetzt, portioniert und bei 4°C aufbewahrt.

Färbung der Mitochondrien mit Rhodamin 123 (R123)

R123 ist ein lipophiles Kation, das in Abhängigkeit vom Mitochondrienmembranpotential in diesem akkumuliert wird. Bricht das Membranpotential der Mitochondrien zusammen, kann der Farbstoff ausgewaschen werden. Für Krebszellen wurde eine carriervermittelte Aufnahme von R123 gezeigt Cho, et al. (2000). Motile Spermien erscheinen bei dieser Färbung intensiv markiert, während Spermien, deren Mitochondrienmembranpotential Störungen aufweist, eine schwache oder keine Markierung zeigen. Die Färbung der Eberspermien mit R123 erfolgte nach folgender Vorschrift.

Protokoll – Rhodamin-Färbung

- 1 µl einer 0,13 mM (0,05 mg/ml) Stammlösung in Aqua bidest. zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension geben (10⁵-10⁶ Zellen; = 0,52 µM)

- Probe für 5-20 min im Dunkeln weiter inkubieren

Bindung von Lektinen an akrosomale Zuckerstrukturen

Peanut Agglutinin (PNA) ist ein Lektin, das spezifisch an ß-D-Galaktose-Reste bindet. Für Säugerspermien wurde gezeigt, das es vor allem an der äAM bindet. Pisum sativum Agglutinin (PSA) bindet hingegen spezifisch an α-Methyl-Mannose-Reste, die bei Säugerspermien vor allem an Komponenten des akrosomalen Inhalts (Akrosin) gefunden wurden. Beide Lektine binden nicht an Eberspermien mit intakter Plasmamembran. Eine Markierung mit PNA detektiert man an Spermien deren Integrität der Plasmamembran zerstört ist, deren äußere Akrosommembran aber noch nicht abgelöst ist. Eine PSA-Markierung charakterisiert hingegen ein akrosomreagiertes Spermium. Die Markierung der Eberspermien wurde wie folgt durchgeführt.

Protokoll – Lektinbindung

1 µl einer 0,5 mg/ml Stammlösung in pNaCl zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension geben (10⁵-10⁶ Zellen; = 2 µg/ml)

Probe für 10 min im Dunkeln weiter inkubieren

AnnexinV-Bindung an endogenes Phosphatidylserin

AnnexinV (AnV) ist ein phospholipidbindendes Protein, das in Anwesenheit von Kalzium mit hoher Affinität an PS bindet. Es wurde in Kombination mit einem Lebend-Tot-Farbstoff als Marker der transversalen Asymmetrie der Phospholipide in der Zellmembran der Eberspermien genutzt. Des weiteren wurde die Verteilung des endogenen PS in der äußere Akrosommembran nach Ablösung der Plasmamembran untersucht. Die Markierung der Spermien erfolgte entsprechend nachstehendem Protokoll.

Protokoll – AnnexinV-Bindung

1 µl einer 250 µg/ml FITC-AnV (Alexa-AnV) Stammlösung zu 249 µl der zu untersuchenden Spermiensuspension dazu geben (10⁵-10⁶ Zellen; = 1 µg/ml)

Probe im Dunkeln weiter inkubieren

Sowohl die Temperatur (4°C; RT; 38,5°C) als auch die Dauer der Markierung (1-30 min) mit AnV variierten in den einzelnen Versuchen und sind im Ergebnisteil angegeben.

Einbau und Translokation von fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga in die Zellmembran der Spermien

Als zweiten Versuchsansatz zur Untersuchung der transversalen Asymmetrie der Phospholipide in der Plasmamembran von Eberspermien nutzten wir den spontanen Einbau von fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga (NBD-PL), deren Fluoreszenz im äußeren Monolayer selektiv gelöscht werden kann. Die zunächst in Methanol/Chloroform (1:1) gelösten NBD-PL wurden im Reagenzglas mit Stickstoff abgedampft und durch Vortexen in Pufferlösung resuspendiert. Die verwendeten NBD-PL sind partiell wasserlöslich und liegen im Monomer-Mizell-Gleichgewicht vor. Nach Zugabe der Spermiensuspension bauen sich die Labelmonomere spontan in die Zellmembran ein. Der Einbau von NBD-PL in die Plasmamembran von Eberspermien wurde zunächst am Fluoreszenzspektrometer verfolgt.

Protokoll – Einbau NBD-PL / Spektrometer

1 nmol NBD-PL in 30 µl Medium resuspendieren und Aliquot der NBD-Label in 2 ml TALP in der Messküvette mischen ♢ Nulllinie
60 µl Spermiensuspension (~1x10⁷Zellen) zugeben ♢ Kinetik des Einbaus der NBD-PL (1-20 % Label/endogenem Plasmamembranphospholipid (mol/mol))
Zugabe von 20 µl Triton X-100 (1%) ♢ Auflösen der Mizellen ♢ Dequenching

Die Eigenfluoreszenz der Spermien war in den verwendeten Konzentrationen und Messeinstellungen vernachlässigbar. Der Einbau der NBD-PL wurde nur an in TALP gewaschen Spermien bei Raumtemperatur untersucht. Vergleichende Untersuchungen an gewaschenen und kapazitierten Eberspermien erfolgten am Durchflusszytometer, um zwischen membranintakten und -defekten Zellen unterscheiden zu können.

NBD-Lipidderivate fluoreszieren mit hoher Quantenausbeute. Die Zugabe von Dithionit führt zur Reduktion der Nitrogruppe am C4 des konjugierten Ringsystems und somit zum Erlöschen der Fluoreszenz. McIntyre und Sleight etablierten diesen Assay zur Bestimmung der transversalen Lipidverteilung in Membranen McIntyre and Sleight (1991). Unter der Voraussetzung, dass die Dithionitionen nicht die Plasmamembran durchdringen, werden nur die NBD-Gruppen der Analoga in der äußeren Lamelle reduziert. Da die Reduktion um Größenordnungen schneller ist als die transversale Bewegung der NBD-PL über die Membran, kann mit diesem Assay die transversale Phospholipidverteilung in der Plasmamembran von Zellen bestimmt werden Pomorski, et al. (1994). Zu beachten ist dabei jedoch, dass sowohl der Abbau der Label durch Phospholipasen als auch der innerzelluläre Lipidtransport (z.B. Endozytose) die Ergebnisse verfälschen können. Um die Kapazitation der Eberspermien nicht zu blockieren - die Hydrolyse von Phospholipiden ist hierbei wahrscheinlich ein wesentlicher Bestandteil - wurde auf die Zugabe von Hemmstoffen (z.B. DFP oder PMSF) verzichtet.

Das molare Verhältnis des Labels zu endogenen Membranphospholipiden wurde so gewählt, dass ein Labelanteil von 2% (mol/mol) nicht überschritten wurde. Dabei wurde für die Eberspermien ein Gesamtphospholipidgehalt von 2 µmol/10⁹ Zellen angenommen (eigene Messungen und Werte für Bullenspermien aus Parks, et al. (1987)). Nach Abschätzungen aus Membranpräparationen von Forellen- und Bullenspermien entfallen 1/3 bis 1/5 auf die Plasmamembranphospholipide. Die Versuche wurden in Anlehnung an bereits beschriebene Protokolle zur Markierung von Spermien mit NBD-PL durchgeführt Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1999).

Protokoll – Einbau und Einwärtstranslokation NBD-PL / Durchflusszytometrie

1 nmol NBD-PL in 30 µl Medium resuspendieren
60 µl Spermiensuspension (~1x10⁷Zellen) zugeben und im Dunkeln inkubieren ♢ spontaner Einbau der NBD-PL (~1% Label/endogenem PM-PL (mol/mol))
Zugabe von 1 ml Medium ♢ Zentrifugation 2 min, 1200xg
Überstand absaugen (Abtrennen nicht eingebauten Labels)
Pellet in frischem Medium resuspendieren
weitere Inkubation im Dunkeln ♢ Translokation
Aliquot für 1. Messung (Gesamtfluoreszenz Innen + Außen) entnehmen, in Messküvette mit 2 ml TALP überführen und mit PI (1,88µM; 2-5 min) färben
15.000 Zellen am Durchflusszytometer vermessen

für die 2. Messung (Fluoreszenz Innen) 20 µl Dithionit (1 M in 1 M Tris, pH 9, = 10 mM) in die Messküvette pipetieren, gut mischen und 1 min im Dunkeln inkubieren

15.000 Zellen am Durchflusszytometer vermessen

Die Zentrifugation und die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Die jeweilige Inkubationstemperatur und -zeit ist im Ergebnisteil ausgewiesen. Um die sehr schnelle Translokation des NBD-PS auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran zeitlich besser auflösen zu können, wurde bei einigen Versuchen auf ein Auswaschen der nicht eingebauten Label verzichtet und die Dauer der PI-Färbung auf 2 min reduziert. Genaue Erläuterungen zur Auswertung der einzelnen Messungen und zu den durchgeführten Berechnungen sind im Ergebnisteil dargestellt.

Um die Translokation der NBD-PL von der zytoplasmatischen zur exoplasmatischen Seite zu analysieren, wurde die Fluoreszenz der NBD-PL im äußeren Monolayer mit Dithionit gelöscht, die Spermien in BSA-haltigem Medium gewaschen und weiter inkubiert.

Protokoll – Auswärtstranslokation NBD-PL / Durchflusszytometrie

1 nmol NBD-PL in 30 µl Medium resuspendieren
60 µl Spermiensuspension (~1x10⁷Zellen) zugeben und im Dunkeln inkubieren ♢ spontaner Einbau der NBD-PL (~1% Label/endogenem PM-PL (mol/mol))
Zugabe von 1 ml TALP +Dithionit (20 mM) +BSA (6 mg/ml)
Zentrifugation 2 min, 1200xg ♢ Überstand vorsichtig absaugen
Pellet in frischem TALP (+BSA) resuspendieren
weitere Inkubation im Dunkeln ♢ Auswärtstranslokation
Aliquot in 2 ml gefiltertes TALP-Medium überführen
Färbung mit PI (1,88 µM; 5 min)
15.000 Zellen am Durchflusszytometer vermessen

Auch für diese Versuche sind die genauen Erläuterungen zur Auswertung der einzelnen Messungen und zu den durchgeführten Berechnungen im Ergebnisteil dargestellt.

Fluoreszenzspektroskopie

Die Fluoreszenzspektren der verwendeten Label und die Kinetiken des Einbaus der NBD-PL wurden an einem Shimadzu RF 5001 PC Spektrometer aufgenommen. Mit Hilfe eines kleinen Magnetrührers wurden die Spermien und die Fluoreszenzmarker zu einer homogenen Suspension vermischt. Die Messdaten wurden exportiert und mit SigmaPlot bearbeitet.

Die gemessenen Einbaukinetiken wurden nach den Messungen normiert. Unter der Annäherung, dass die Quantenausbeute der NBD-PL in der Spermienmembran vergleichbar ist mit der in Tritonvesikeln, erfolgte die Normierung wie folgt:

Dabei entspricht der Nullwert der gemittelten Fluoreszenzintensität der NBD-PL im Puffer und der Maximalwert der gemittelten Fluoreszenzintensität der NBD-PL in Triton.

Die jeweils verwendeten Geräteeinstellungen für die Anregung und Emission (Wellenlänge, Spaltbreite) sind im Ergebnisteil angegeben.

Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ermöglicht es in kurzer Zeit die Fluoreszenzeigenschaften von mehreren tausend markierten Einzelzellen aufzuzeichnen und zu analysieren. Somit können auch kleine Subpopulationen, die durch eine bestimmte Eigenschaft gekennzeichnet sind, erkannt werden. Die zu untersuchenden Zellen müssen in einer relativ hohen Verdünnung in Suspension vorliegen. Die Einzelzelluntersuchungen gefärbter Eberspermien erfolgten an einem Durchflusszytometer (Particle Analysing System - PAS) der Firma Partec GmbH (Münster, Deutschland). Dieses Gerät ist mit einem Argon-Ionen-Laser (200 mW, 488 nm) ausgestattet und ermöglicht die Analyse des Fluoreszenz- (FL1, FL3) und Streulichts (FSC, SCC) der gemessenen Partikel in folgenden Kanälen.

FL1 (grün): TK500, EM 515-560 // FL3 (rot): TK610, RG630 // FSC: Ex488 // SCC: Ex488

Ein Aliquot der zu untersuchenden Spermiensuspension wurde in 2ml gefiltertem Messpuffer (in der Regel TALP) gleichmäßig suspendiert und zügig vermessen. Bei einer Messgeschwindigkeit von 100-150 Zellen pro Sekunde wurden in 2 Minuten 15.000 Zellen erfasst.

Die Auswertung erfolgte mit der Software von Partec. Nachdem anhand des Streulichtes die Spermien identifiziert wurden, konnten die Fluoreszenzeigenschaften dieser Zellen in den 1-Parameter-Histogrammen der Einzelkanäle analysiert werden. Es wurden Intensitätsbereiche festgelegt, in denen die Spermien nicht (Ø), schwach (+) oder stark (++) fluoreszierten. Eine Peakanalyse der Histogramme lieferte die arithmetischen Mittelwerte der Intensitätspeaks und die Prozentsätze der im jeweiligen Bereich gemessenen Zellen. Des weiteren wurden bei allen Doppelfärbungen die Fluoreszenzen der gemessenen Spermienzellen gegeneinander in einem 2-Parameter-Diagramm aufgetragen. Dies ermöglichte die Einteilung in Quadranten oder Regionen unterschiedlicher Fluoreszenzeigenschaften (z. B. unmarkiert / nur grün / nur rot / grün und rot).

Für einige Messungen war eine sogenannte Farbkompensierung nötig. Das Emissionsspektrum von R123 und NBD reichte aufgrund ihrer hohen Quantenausbeuten in den Bereich der roten Wellenlängen. Anhand einer Einzelfärbung von Eberspermien mit diesen Markern wurde die jeweilige Kompensierung festgelegt und für die entsprechende Doppelfärbung mit PI (oder Alexa-PNA) übernommen.

Mikroskopie

Vor jedem Versuchstag erfolgte eine Einschätzung der flüssigkonservierten Eberspermien im Phasenkontrast (Jenaval, Carl Zeiss Jena). Für die Motilitätsbeurteilung der Spermien (250fache Vergrößerung) werden drei Bewegungsformen (vorwärtsbeweglich, ortsbeweglich, unbeweglich) unterschieden. Bei der morphologischen Differenzierung der Eberspermien (800fache Vergrößerung) werden verschiedene Veränderungen des Kopfes, der Kopfkappe, des Halses und des Spermienschwanzes unterschieden. Zwei wesentliche Subpopulationen wurden für alle in den Versuchen eingesetzten Ejakulate erfasst: Der Anteil morphologisch intakter Zellen, die durch einen sich deutlich abzeichnenden „normalen akrosomalen Rand“ (NAR) und eine unveränderte Schwanzform gekennzeichnet sind, und der Anteil an Spermien, mit denen Zytoplasmatropfen assoziiert waren. Die Spermienkonzentration wurde, wenn erforderlich, mit Hilfe einer Zählkammer (Bürker-Thürk) bestimmt und entsprechend eingestellt. Dazu wurde die Motilität der Eberspermien in einer hypertonen Kochsalzlösung blockiert. Die Beurteilung der Hyperaktivierung, Agglutination und des Akrosomstatus nach Kapazitation und Akrosomreaktion erfolgte für ausgewählte Proben ebenfalls an einem Lichtmikroskop unter Phasenkontrast-Optik (Jenaval, Carl Zeiss Jena).

Fluoreszenzmikroskopie

Die mikroskopische Beurteilung fluoreszenzmarkierter Eberspermien erfolgte entweder an einem Fluoreszenzmikroskop der Firma Zeiss (Axiovert 100) oder an einem Olympus-IX81. Dazu wurde eine Aliquot der markierten Spermien unverdünnt auf einen vorgewärmten Objektträger gebracht und mit einem warmen Deckgläschen (20×30) abgedeckt. Beide Mikroskope sind mit einem Wärmetisch ausgestattet, so dass die Proben (wenn nicht anders angegeben) bei 38,5°C untersucht werden konnten. Die Morphologie der Spermien wurde unter Phasenkontrast-Optik (Zeiss) oder im differentiellen Interferenzkontrast (Olympus) beurteilt. Für die Aufnahme von monochromatischen Bildern sind beide Mikroskope mit einer Digitalkamera ausgerüstet.

Standardfilter (Zeiss): Ex BP 450-490, Em LP 520; Ex BP 546/12, Em LP 590
Kamera (Zeiss): Photometrics Cool SNAP fx^TM (Visitron Systems GmbH)
Standardfilter (Olympus): NIBA BP 470-490, BA 515-550, DM 505; NG BP 530-550, BA 590, DM 570
Kamera (Olympus): Spot RT (Diagnostic Instruments, inc., Sterling Heights, USA)

Die Bildauswertung erfolgte mit der Software MetaVue der Firma Universal Imaging Corp. (Las Vegas, USA), die eine Überlagerung einzelner Fluoreszenzbilder ermöglicht.

Elektronenmikroskopie

Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgten am Institut für Zoo- und Wildtierforschung (IZW) in Berlin. Die fixierten Proben wurden entsprechend der unten aufgeführten Protokolle, für die Elektronenmikroskopie aufgearbeitet. Die Ultradünnschnitte wurden mit einem Ultracut Ultramikrotom der Firma Reichert-Jung (Iowa City, USA) angefertigt und die fertigen Präparate an einem Elektronenmikroskop TEM Zeiss 902A der Firma Carl Zeiss (Oberkochen, Deutschland) untersucht. Proben kapazitierter und kavitierter Eberspermien wurden elektronenmikroskopisch zunächst bezüglich ihrer Membranstruktur untersucht (Protokoll I).

Protokoll – Elektronenmikroskopie I

Fixierung der Spermien in 2,5%igem Glutaraldehyd
Lagerung der Proben im Kühlschrank
Waschen der fixierten Proben in PBS (nach Sörensen, pH 7,2)
Nachfixierung der Lipide mit 2%igem Osmiumtetroxid
Dehydrieren in aufsteigender Ethanolreihe
Einbetten in EPON 812
Ultradünnschnitte kontrastieren mit Uranylacetat und Bleicitrat

Weitere Versuche zur Analyse von an Spermien gebundenem AnV mit Hilfe eines goldmarkierten Antikörpers erfolgten in Anlehnung an bestehende elektronenmikroskopische Arbeiten nach Protokoll II Nagae, et al. (1986) ;Pellicciari, et al. (1997) ;Szöllösi and Hunter (1978) ;Töpfer-Petersen, et al. (1983).

Die Fixierung der kapazitierten Spermien erfolgte die ersten 30 min bei 38,5°C mit anschließender Abkühlung der Proben auf Raumtemperatur. Bei den Proben kavitierter Spermien erfolgte die Markierung mit Biotin-AnV und die Fixierung auf Eis.

Protokoll – Elektronenmikroskopie II

Markierung der Eberspermien mit Biotin-gelabeltem AnV:

50 µl AnV-Biotin zu 5 ml der zu untersuchenden Spermiensuspension (~10⁸ Zellen, = 1 µg/ml) dazugeben und für 10 min weiter inkubieren

Fixierung der Spermien:

Zugabe von 5ml temperiertem Immunkarnovsky (+2mM CaCl₂!!!) und Inkubation der Spermiensuspension für weitere 30 min
Zentrifugation 5 min, 1200xg (langsames Beschleunigen und Abbremsen!)
Überstand vorsichtig absaugen und Pellet in frischem Immunkarnovsky (+2mM CaCl₂!!!) resuspendieren
Lagerung der Proben im Kühlschrank

Einbettung, Ultradünnschnitte und Kontrastierung:

Waschen der fixierten Proben in PBS (nach Sörensen, pH 7,2)
Dehydrieren in aufsteigender Ethanolreihe
Einbetten in LR-White
Ultradünnschnitte für 30 min (RT) mit Anti-Biotin-Antikörper (1:5) inkubieren
Kontrastieren der Schnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat

Bei allen Versuchsansätzen wurde je ein Aliquot der Spermiensuspension ohne Biotin-AnV präpariert, um unspezifische Bindung des Anti-Biotin-Antikörpers analysieren zu können.