Eine Suspension von Spermienzellen enthält immer einen gewissen Anteil toter Zellen, der im Laufe der Inkubation z.T. erheblich ansteigen kann. Um Membranänderungen an intakten Zellen analysieren zu können, ist eine Lebend-Tot-Färbung unerlässlich. PI fluoresziert im Bereich roter Wellenlängen (617nm) und wird häufig zur Identifizierung toter Zellen genutzt, da es eine Gegenfärbung mit zahlreichen Fluoreszenzmarkern (NBD, R123, FITC) ermöglicht. Der geringe Extinktionskoefizient des PI machte eine hohe Verstärkung der roten Fluoreszenzsignale nötig. Messungen PI-gefärbter Eberspermien am Durchflusszytometer ergaben drei Populationen (PI Ø, PI+, PI++) zunehmender Fluoreszenzintensität.

Abb. 6: Durchflusszytometrische Erfassung von kapazitierten Eberspermien nach Markierung mit PI und R123. Das Histogramm zeigt das Ergebnisse der Einzelfärbungen mit PI, das 2-Parameter-Diagramm die Auswertung der Doppelfärbung (1µl R123 20min bei RT inkubiert und ausgewaschen, 2,5µl PI in Küvette 5min vor Messung).

Um entscheiden zu können, ob die mittlere Population (PI+) Zellen kennzeichnet, deren Membranintegrität gestört war oder ob es sich um eine unspezifische Wechselwirkung des PI mit den Spermien handelte, erfolgte eine Gegenfärbung mit R123, einem Mitochondrien-Farbstoff. Die Motilität der Spermien muss bis zur Befruchtung erhalten bleiben und ist unmittelbar von der Mitochondrienfunktion abhängig. Doppelfärbungen der Eberspermien mit R123 und PI zeigten deutlich (Abb. 6), dass nur die stark PI-gefärbten Zellen (PI++) toten, nicht motilen (R123Ø) Spermien entsprachen. Die Bedeutung der schwach gefärbten PI-Populationen blieb unklar. Wurde R123 nach der Färbung nicht ausgewaschen, sondern nur durch Überführen der markierten Spermiensuspension in die Messküvette verdünnt, erschienen alle defekten Zellen schwach R123 gefärbt.

Der Einbau der fluoreszenzmarkierten PL-Analoga in die Zellmembran der Eberspermien wurde zunächst am Fluoreszenzspektrometer verfolgt. Mit diesen Messungen war eine hohe zeitliche Auflösung gerade im Anfangsbereich der Einbaukinetik möglich. Sie stellen allerdings immer nur Mittelwerte über alle Zellen der untersuchten Spermiensuspension dar. Die Untersuchungen an kapazitierten Proben, die immer einen relativ hohen Anteil toter Zellen enthalten, wurden deshalb ausschließlich am Durchflusszytometer durchgeführt.

Am Beispiel des NBD-PS ist in Abbildung 10 der konzentrationsabhängige Einbau des Labels in die Zellmembran von Eberspermien dargestellt. Die eingesetzte Menge des NBD-Labels entsprach in den Varianten a, b, c, d ca. 5/10/15/20% der endogenen Phospholipide der Plasmamembran. Im Experiment wurden die ersten 60 sec die Fluoreszenzintensität des NBD-PS im Puffer aufgezeichnet. Nach der Zugabe von Spermien in die Messküvette erfolgte der Einbau der Label in die Plasmamembran der Zellen bei allen untersuchten Konzentrationen mit einer sehr schnellen Anfangskinetik. In der Variante a erreichte die Fluoreszenzintensität nach ca. 1 min ein Plateau, während in den Varianten b, c, d ein biphasischer Anstieg über die gesamte Messzeit (7 min) beobachtet wurde. Nach Zugabe von Triton (1%) zu den markierten Spermien stieg die Fluoreszenzintensität bei diesen Varianten sprungartig auf einen Plateauwert an. Die NBD-PL-Mizellen, in denen es zum Quenching der NBD-Fluoreszenz kam, sowie nicht eingebaute NBD-Monomere aus der wässrigen Phase wurden in Triton solubilisiert und zeigten nun eine hohe Quantenausbeute. Bei einer Labelmenge von ca. 5% der endogenen Membranphospholipide (Kurve a), erfolgte der Einbau der Phospholipidanaloga in die Plasmamembran vollständig, da es auch nach Tritonzugabe zu keinem weiteren Fluoreszenzanstieg kam. Die Quantenausbeute des Labels war in Triton somit unverändert zu jener in der Spermienmembran.

Abb. 10: Kinetiken des Einbaus von NBD-PS in die Zellmembran von Eberspermien: Bei gleichbleibender Spermienkonzentration (~5*106 Zellen/ml) wurde die Konzentration des NBD-Labels variiert (a) 0,12 µM, (b) 0,24 µM, (c) 0,36 µM, (d) 0,48 µM und dessen Einbau verfolgt. Die letzten 120 sec zeigt die Fluoreszenzintensität nach Zugabe von Triton (1%).

Entsprechend den Erläuterungen im Methodikteil (2.3.6. Fluoreszenzspektroskopie, S.44f) wurden die Kinetiken in SigmaPlot normiert (Kurven nicht gezeigt). Die Einbaukinetik der Variante a konnte sehr gut durch eine monoexponentielle Funktion mit einer Halbwertszeit von 8,8 sec angepasst werden. Die Kinetiken b, c, d konnten nicht monoexponentiell angepasst werden, mehrere Prozesse überlagern sich. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei zum einen um den Einbau der NBD-Monomere in die äußere Lamelle der Plasmamembran, zum zweiten um die Einwärtstranslokation des NBD-PS auf die zytoplasmatische Seite. Eine einfache Überlagerung zweier exponentieller Funktionen ergab eine gute Anpassung an die Messkurve b mit Halbwertszeiten von 8,8 sec und 4,8 min. Letztere Halbwertszeit stimmt in der Größenordnung gut mit bereits veröffentlichten Translokationszeiten für NBD-PS in Säugerspermien bei Raumtemperatur überein: Bulle t_1/2= 1,8 min; Schafbock t_1/2 ca. 3 min; Eber t_1/2= 7,5 min Gadella, et al. (1999) ;Müller, et al. (1994) ;Nolan, et al. (1995). Für die Varianten c und d war auch die Überlagerung zweier Exponentialfunktionen nicht ausreichend, die Anfangskinetik des Labeleinbaus konnte aber auch bei diesen Kurven mit einer Halbwertszeit von ca. 9 sec gut angepasst werden. Welche Prozesse sich bei diesen Messungen überlagerten, konnte nicht im Detail geklärt werden. Ein Quenching der NBD-Fluoreszenz benachbarter Label in der Membran ist wahrscheinlich.

Für alle folgenden Messungen am Durchflusszytometer wurde die Menge der verwendeten NBD-PL so eingestellt, dass ein Labelanteil von 2% der endogenen Membranphospholipide nicht überschritten wurde. Trotzdem kam es bei allen Experimenten zu einem Fluoreszenzanstieg der Spermien während der Inkubationszeiten. Ein Dequenchingeffekt aufgrund zu hoher Labelkonzentration ist nach den oben beschriebenen Versuchen am Photometer unwahrscheinlich. Die Intensität der Markierung der Spermien nahm auch nach dem Waschen der markierten Zellen weiter zu. Dies könnte einerseits durch den Verbleib nicht eingebauter Label in Interzellularräumen erklärt werden, aber auch eine Zentrifugation der markierten Spermien über einen Percollgradienten änderte an diesem Fluoreszenzanstieg nichts. Ein Teil der Label könnte mit der Plasmamembran der Spermien assoziiert sein, sich aber erst allmählich einbauen und/oder homogen über diese verteilen.

Abbildung 11 zeigt die Kinetik des Einbaus der NBD-PL in gewaschene (a, c) und in kapazitierte (b, d) Eberspermien im Vergleich. Auf ein Auswaschen nicht eingebauter Label wurde verzichtet. Die PI-Färbung (1,88 µM) erfolgte für jedes Aliquot direkt vor der Messung in der Messküvette für 2 min. NBD-PS (a, b; n=5) wurde sowohl in lebende (offene Symbole) als auch in tote (gefüllte Symbole) Spermien sehr schnell eingebaut, wobei (PI++)-Spermien zunächst deutlich mehr Label pro Zeit aufnahmen als (PI-)-Zellen.

Nach 15-20 min erreichte die Fluoreszenzintensität der toten, NBD-PS markierten Zellen ein Maximum bzw. Plateau, während in lebenden Zellen bei allen Versuchen ein kontinuierlicher Fluoreszenzanstieg beobachtet wurde. Dieser Anstieg könnte mit dem Transport des Labels auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran einhergehen. Nach einer Markierungsdauer von einer Stunde waren die NBD-Fluoreszenzintensitäten lebender und toter Spermien annähernd gleich.

Auch für NBD-PC (c, d; n=3) war die Fluoreszenzintensität des Markers in (PI++)-Zellen deutlich höher als in den (PI-). Im Gegensatz zu PS stieg in den toten Zellen die Intensität über die gesamte Messzeit weiter an. Die Integrität der Plasmamembran war offensichtlich so verändert, dass NBD-PC vermehrt aufgenommen wurde oder ins Zellinnere gelangen konnte und sich dort auch in andere Membranen einbaute. In lebenden Zellen erreichte die Einbaukurven nach ca. 30 min ein Plateau. Wurden die Eberspermien zunächst kapazitiert und anschließend markiert, konnte man vergleichbare Einbaukinetiken der NBD-PL (Abb. 11 (b) PS; (d) PC) beobachten.

Abb. 11: Einbau NBD-markierter PL in die Membran von Eberspermien: In TALP gewaschene Spermien wurden vor (a, c) und nach (b, d) Kapazitation der Zellen mit NBD-PL markiert. Im Laufe der Markierung wurde je ein Aliquot der Spermiensuspension entnommen in der Messküvette für 2 min mit 2,5 µl PI gefärbt und am Durchflusszytometer gemessen. Gefüllte Symbole kennzeichnen (PI++)-Zellen, offene Symbole hingegen (PI-)-Zellen (▲∆ NBD-PS, ●○ NBD-PC).

Für die Translokationsexperimente an Eberspermien war es erforderlich, zu jedem Untersuchungszeitpunkt einen Fluoreszenzwert vor und nach Dithionitzugabe zu ermitteln und zwischen lebenden und toten Zellen sauber zu unterscheiden.

In TALP (ohne BSA) gewaschene Eberspermien wurden für 10 min mit NBD-PS markiert. Nicht eingebaute bzw. nicht zur zytoplasmatischen Seite transportierte Label wurde durch Waschen in BSA-haltigem TALP (6 mg/ml) entfernt. Die Spermien blieben morphologisch intakt und motil. Die Mehrzahl der Spermien erschien über ihre gesamte Oberfläche gleichförmig intensiv grün markiert. Schwach grün fluoreszierende Zellen nahmen den Lebend-Tot-Farbstoff PI auf.

Abb. 21: Mit NBD-PS markierte Eberspermien nach kapazitativer Inkubation: Die Zellen wurden mit NBD-PS markiert (siehe Material und Methoden) und für 45 min bei 38,5°C in BSA-haltigem TALP kapazitiert. Unmittelbar vor Entnahme der Probe zur Mikroskopie wurde die NBD-Fluoreszenz zugänglicher Label mit Dithionit gelöscht. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen das NBD-Fluoreszenzbild der untersuchten Spermien.

Nach einer 45 minütigen Kapazitation der Eberspermien blieb der Großteil der Zellen gleichförmig markiert. In PI-gefärbten Spermien führte die Zugabe von Dithionit zum vollständigen Löschen der NBD-Fluoreszenz. PI-negative Zellen sowie ein Teil der markierten Vesikel zeigten hingegen weiterhin eine intensive NBD-Fluoreszenz. Abbildung 21 zeigt beispielhaft NBD-PS/PI markierte Eberspermien nach Kapazitation. In den Proben NBD-PS/PI markierter Eberspermien wurde nie ein motiles oder PI-negatives Spermium beobachtet, dessen NBD-Fluoreszenz gelöscht werden konnte. Einige geschlossene Vesikel mit einer Lokalisation von NBD-PS im inneren Monolayer entstanden scheinbar durch vorzeitig ablaufende Akrosomreaktionen in den Proben kapazitierter Eberspermien. Eine genauere Auswertung dieser Versuche (Fluoreszenzintensitäten von Einzelzellen oder Vesikeln vor und nach Dithionitzugabe, prozentualer Anteil der Zellen einer Subpopulation) wurde aus folgenden Gründen nicht durchgeführt:

(i) Die Beobachtung eines Spermiums vor und nach Dithionitzugabe bei motilen, frei schwimmenden Zellen ist nicht möglich.

(ii) Um die Kapazitation der Spermien nicht zu blockieren, wurde der Stoffwechsel und damit verbunden auch der Abbau von NBD-PS nicht inhibiert. Ein Teil der NBD-Label war nach der Inkubation der Zellen sicher nicht mehr an den eigentlichen Marker (PS) gebunden.

Für alle weiteren Untersuchungen wurde deshalb die Bindung von FITC-AnV an endogenes PS genutzt.

An frisch gewaschenen Eberspermien wurde keine AnV-Bindung beobachtet, während zahlreiche abgelöste Zytoplasmatropfen intensiv mit FITC-AnV markiert waren (Bilder nicht gezeigt).

Nach Kapazitation der Eberspermien erschien die Mehrzahl der Zellen hyperaktiviert, agglutiniert und unmarkiert. Eine FITC-AnV-Markierung wurde vor allem an nicht agglutinierten, PI-gefärbten Spermien beobachtet. Abbildung 22 zeigt charakteristische Bilder kapazitierter, FITC-AnV/PI-markierter Eberspermien. Sowohl an morphologisch intakten als auch an vorzeitig akrosomreagierten Eberspermien, deren Kopfkappen sich oftmals als kompakte Strukturen abheben, bindet FITC-AnV im Bereich des Akrosoms. Relativ selten beobachtet man vorzeitig akrosomreagierte Zellen, bei denen sich kleine Membranvesikel, die teilweise FITC-AnV binden, vom apikalen Kopfbereich ablösen. Spermien, deren Akrosom komplett abgelöst war, zeigten am vorderen Kopfbereich hingegen keine FITC-AnV-Bindung, waren aber immer mit PI-gefärbt. Ein ebenfalls charakteristisches wenn auch relativ seltenes Bindungsmuster von FITC-AnV an kapazitierte, jedoch morphologisch defekte Spermien, scheint die Markierung der Becherhülse zu sein. Im Schwanzbereich der Eberspermien assoziierte Zytoplasmatropfen zeigten nur dann eine FITC-AnV-Bindung, wenn die Zelle PI gefärbt war.

Nach Auslösen der Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophor zu kapazitierten Eberspermien nehmen diese zum überwiegenden Teil (> 50%) den Lebend-Tot-Farbstoff PI auf, während keine spezifische FITC-AnV-Bindung am Spermienkopf beobachtet wurde. Auch die Gegenwart von FITC-AnV während der Akrosomreaktion führte nicht zu einer Markierung der Zellen.

Abb. 22: FITC-AnV/PI-Markierung kapazitierter Eberspermien: Die dargestellten Mikroskopiebilder wurden bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen der untersuchten Spermien. (a) Typische Zellagglutinate, in denen die Spermien zum überwiegenden Teil unmarkiert sind. (b) Bei einem Teil der PI-gefärbten Zellen, die morphologisch intakt erscheinen, bindet FITC-AnV im Bereich der Kopfkappe. (c) An Eberspermien im Schwanzbereich assoziierte Zytoplasmatropfen zeigen nur dann eine AnV-Bindung, wenn die Zelle PI aufnimmt. Bei einem vorzeitig akrosomreagierten Spermium lösen sich Membranvesikel vom apikalen Bereich der Kopfkappe. Diese binden teilweise FITC-AnV, ebenso die Becherhülse.

Lediglich im Bereich des Spermienschwanzes waren kleine FITC-AnV markierte Bereiche zu erkennen. Eine spezifische AnV-Bindung zeigten jedoch abgelöste Zytoplasmatropfen und andere vesikuläre Membranreste, charakterisiert durch ihre intensive FITC-Fluoreszenz. Abbildung 23 zeigt ein charakteristisches Bild akrosomreagierter, FITC-AnV/PI-markierter Eberspermien. Eine Inkubation der Spermien mit Kalziumionophor (10-60 min, 3-30 µM) führte unter keiner der getesteten Bedingungen zu einer Bindung von AnV an exponiertes, endogenes PS. Weder an frisch gewaschenen noch an kurzzeitig bei 38,5°C inkubierten oder kapazitierten Eberspermien konnte ein Scrambling von PS ausgelöst werden.

Abb. 23: FITC-AnV/PI-Markierung Akrosomreagierter Eberspermien: Das dargestellte Mikroskopiebild wurde bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen. Während an den Spermien keine spezifische AnV-Bindung zu erkennen ist, zeigen abgelöste vesikuläre Membranstrukturen eine FITC-Markierung.

Die mikroskopischen Untersuchungen FITC-AnV/PI markierter Eberspermien konnten die durchflusszytometrischen Ergebnisse prinzipiell bestätigen. Die Kapazitation bewirkte zwar eine Zunahme des Anteils FITC-AnV-bindender Spermien, jedoch unter Mikroskopie-bedingungen ausschließlich an PI-gefärbten Zellen. Nach Zugabe des Kalziumionophor waren die AnV-Bindungsstellen im Kopfbereich nicht mehr vorhanden.

Die folgenden Versuche sollten eine bessere Differenzierung des morphologischen Zustandes der Eberspermien mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung funktioneller Strukturen der Spermienzelle (Mitochondrien, äußere Akrosommembran, akrosomaler Inhalt) ermöglichen.

Als Alternative zur PI-Färbung wurde der Mitochondrienfarbstoff R123 als Marker für motile, lebensfähige Spermien genutzt. Die Exposition von PS wurde über die Bindung von Alexa-AnV verfolgt. Die Versuche bestätigten die oben dargestellten Ergebnisse der FITC-AnV/PI-Markierungen. Spermien mit intensiver R123-Färbung der Mitochondrien erschienen morphologisch intakt und zeigten keine Alexa-AnV-Bindung am Spermienkopf. Bei einem Teil der Eberspermien, deren R123-Fluoreszenz der Mitochondrien deutlich verringert war, konnte eine Alexa-AnV-Bindung im Bereich des Akrosoms beobachtet werden (Bilder nicht gezeigt). Wurden die Farbstoffe nicht ausgewaschen, erschienen die R123 gefärbten Mitochondrien motiler Spermien zudem intensiv rot fluoreszierend. Dies könnte zum einen auf eine Wechselwirkung zwischen R123 und Alexa-AnV zurückzuführen sein (z. B. Energieübertragung) oder R123 fluoresziert bei Grünanregung im Bereich roten Lichtes.

Dieser Versuchsansatz wurde nicht weiterverfolgt, da er einerseits keine weiteren Aussagen (im Vergleich zur FITC-AnV/PI-Markierung) ergab, andererseits ein Waschen der R123-gefärbten Spermien für ein „gutes“ Mikroskopiebild (geringe Hintergrundfluoreszenz und keine bzw. geringe unspezifische Bindung an Membranen) unabdingbar war. Wie bereits vorne erläutert, sind kapazitierte und akrosomreagierte Eberspermien sehr instabil und jeder Wasch- und Zentrifugationsschritt bedeutet erheblichen Stress für die Zellen.

Zur besseren Differenzierung von intakten Spermien und Spermien mit defekter Zell- und/oder Akrosommembran wurden die Lektine PSA und PNA genutzt. PSA bindet bei Eberspermien vor allem an Strukturen der akrosomalen Matrix, während die PNA-Bindung charakteristisch für die äußere Akrosommembran ist.

PSA – akrosomaler Inhalt

Eine intensive spezifische Markierung des Akrosoms mit FITC-PSA zeigten Spermien, deren Kopfkappe im Phasenkontrast expandiert, aber nicht abgelöst erschien. An diesen Spermien konnte sowohl in kapazitierten als auch in kavitierten Zellen eine Alexa-AnV-Bindung beobachtet werden. An einigen Zellen trat zudem eine FITC-PSA-Markierung von Becherhülse und Mittelstück auf. Auch diese Zellen zeigten eine Alexa-AnV-Bindung an der Kopfkappe. Die PSA-Markierung wurde für die mikroskopischen Untersuchungen nicht weiter verfolgt, da einerseits ein Auswaschen unspezifisch assoziierten Lektins nötig war und andererseits keine eindeutige morphologische Zuordnung der einzelnen Spermien getroffen werden konnte. Je nach Fortschreiten der Expansion des Akrosoms bzw. der Zugänglichkeit des akrosomalen Inhalts variierten die Fluoreszenzintensitäten z.T. beträchtlich.

PNA – äußere Akrosommembran

Die Bindung von PNA an die äußere Akrosommembran der Eberspermien erfolgte spezifisch. Lediglich die Kopfkappe membrandefekter Spermien erschien intensiv fluoreszenzmarkiert, während alle übrigen Membranen unmarkiert blieben. Im folgenden werden die Ergebnisse der Komarkierung von Eberspermien mit AnV und PNA systematisch dargestellt.

Für die Auswertungen der mikroskopischen Aufnahmen wurden die in Abbildung 24 dargestellten Spermienpopulationen unterschieden. Zunächst wurde die Morphologie im Phasenkontrast bzw. im Phaseninterferenzbild beurteilt. Spermien mit sich deutlich abzeichnendem (normalem) akrosomalem Rand (NAR) werden in der Spermatologie als morphologisch intakte Zellen bezeichnet. Sie wurden je nach Fluoreszenzmarkierung den Gruppen A-D zugeordnet. Im Phaseninterferenzbild zeichnete sich der akrosomale Rand, vor allem nach Kavitation der Eberspermien, nicht immer eindeutig ab. Wenn die Kopfkappe eindeutig vorhanden und mit glatter Oberfläche fest am Spermium assoziiert war (in Abb. 24 mit # gekennzeichnet), wurde die Zelle entsprechend ihrer Fluoreszenzeigenschaften ebenfalls einer der Gruppen A-D zugeordnet.

Abb. 24: Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Es wurden die Kategorien A-G unterschieden. Alle mikroskopisch untersuchten Spermien wurden entsprechend ihrer Morphologie im Phasenkontrast und ihren Bindungseigenschaften für FITC-AnV und Alexa-PNA eingeteilt. Dabei wurden nur die Merkmale der Kopfkappe, nicht aber teilweise vorhandene Markierungen der Becherhülse und/oder des Schwanzes berücksichtigt.

Bei kavitierten und akrosomreagierten Spermien löste sich oft die gesamte Kopfkappe vom Spermium ab oder es waren sich ablösende Membranvesikel im Bereich des Akrosoms zu erkennen. Diese Zellen wurden der Kategorie E oder F zugeordnet. Spermien, denen die Kopfkappe vollständig fehlte, wurden in der Kategorie G erfasst. Zur Beurteilung der Bindung von AnV und PNA an die Spermien wurden nacheinander die beiden Fluoreszenzbilder aufgenommen und überlagert. Eine Markierung der Becherhülse oder des Schwanzes (nur bei toten Zellen) wurde zur besseren Übersichtlichkeit in den Kategorien A-G nicht berücksichtigt.

Frische Eberspermien

An die Mehrzahl der frischen, in TALP gewaschenen Eberspermien konnte weder AnV noch PNA binden. In einem exemplarischen Versuch waren 84% der Zellen morphologisch intakt und ohne Fluoreszenzmarkierung (Kategorie A), 15% zeigten eine PNA-Markierung mit (Kategorie D 9%) bzw. ohne (Kategorie C 6%) AnV-Bindung.

Frische, kavitierte Eberspermien

Mittels N₂-Kavitation wurde von frisch gewaschenen Eberspermien die Plasmamembran im Bereich des Akrosoms abgelöst, um die äußere Akrosommembran und abgelöste Reste der Plasmamembran bezüglich der Präsenz von PS zu untersuchen.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

5

0

6

5

2

52

29

57

12

Versuch 2

3

0

0

15

1

74

7

89

35

Versuch 3

1

0

0

24

0

70

5

94

15

MW ± SD

3 ± 2

0

2 ± 4

15 ± 9

1 ± 1

65 ± 12

14 ± 13

80 ± 20

21 ± 13

Tab. 11: AnV/PNA-Markierung kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche. Die gewählten Kavitationsbedingungen (45 bar, 10 min, auf Eis) führten zu einer sehr effektiven Ablösung der apikalen Plasmamembran in nahezu allen Zellen. Weniger als 5% der Spermien erschienen nach dieser Behandlung morphologisch intakt ohne eine Zugänglichkeit der äußeren Akrosommembran für PNA zu zeigen (Kategorien A/B). Ungefähr 15% der kavitierten Eberspermien waren morphologisch scheinbar intakt, zeigten aber eine intensive AnV- und PNA-Bindung (Kategorie D#). Bei diesen Spermien wurde wahrscheinlich die apikale Plasmamembran komplett abgelöst, während das Akrosom kompakt anliegend blieb (elektronenmikroskopische Arbeiten unterstützen dies, siehe 3.3.5). Die AnV-Bindung erfolgte demnach an zytoplasmatisch exponiertes PS der äußeren Akrosommembran. Bei der Mehrzahl der kavitierten Eberspermien (Kategorie F, 65%) erschien das Akrosom vor allem am apikalen Rand expandiert. An diese Spermien konnten fast ausschließlich beide Marker binden. An welchem Monolayer, welcher Membran (PM oder äAM) die AnV-Bindung erfolgte, kann nicht entschieden werden, wahrscheinlich ist aber auch hier eine zytoplasmatische PS-Exposition auf der äußeren Akrosommembran. Durchschnittlich 14% der Zellen haben bei der Kavitation auf Eis ihre Kopfkappe komplett verloren (Kategorie G) und zeigten im akrosomalen Bereich keine Fluoreszenzmarkierung.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Unterschiede zwischen den Einzelversuchen z.T. erheblich waren. So hatte z.B. die Kavitation auf die im ersten Versuch untersuchten Eberspermien einen deutlich stärkeren Effekt. In dieser Probe waren nach Kavitation bei 29% der Zellen die Kopfkappen komplett abgelöst. Da die Versuchsbedingungen für die untersuchten Proben gleich waren, könnte es sich hierbei um ejakulats- bzw. tierspezifische Unterschiede der Spermienstabilität handeln. Einen vergleichbaren Effekt zeigten kapazitiert/kavitierte und akrosomreagierte Spermien (siehe Tab. 13 und 14).

Kapazitierte Eberspermien

Die kapazitierten Eberspermien wurden bei 38,5°C markiert und mikroskopisch untersucht. Tabelle 12 zeigt im Überblick die Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche. Die Zellen waren hoch motil und zum überwiegenden Teil morphologisch intakt (Kategorie A-D, 97%). Die Hälfte der erfassten Zellen zeigte keine Fluoreszenzmarkierung (Kategorie A, 49%). Die Integrität der Plasmamembran dieser Spermien blieb somit während der Kapazitation erhalten. Die andere Hälfte (Kategorie B-D, 48%) zeigte eine Bindung von AnV und/oder PNA an ihrer Kopfkappe. In den meisten Fällen war eine sichere Einteilung in die Kategorien möglich (siehe unten). Eher selten (10%) traten beide Markierungen an einer Zelle kombiniert auf (Kategorie D), meist war zudem eine der beiden Fluoreszenzen (FITC, Alexa) intensiver.

Insgesamt 26% der Spermien zeigten eine AnV-Bindung (∑AnV), was in guter Übereinstimmung zu den durchflusszytometrischen Analysen (23 ± 11%, Tab. 6 bzw. 19 ± 13, Tab. 10) steht. 16% der Spermien hatten ausschließlich AnV am Akrosom gebunden (Kategorie B), ein Zeichen für die exoplasmatische Lokalisation von PS im äußeren Monolayer der Plasmamembran. 22% zeigten eine ausschließliche PNA-Bindung.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

41

20

24

8

0

0

7

28

14

Versuch 2

59

12

18

10

0

0

1

22

6

Versuch 3

48

16

25

11

0

0

0

27

16

MW ± SD

49 ± 9

16 ± 4

22 ± 4

10 ± 2

0

0

3 ± 4

26 ± 3

12 ± 5

Tab. 12: AnV/PNA-Markierung kapazitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Häufig war die Markierung mit PNA am apikalen Spermienkopf auch nach Tausch der Labelgruppen (Alexa-AnV, FITC-PNA), deutlich intensiver. Eine mögliche Energieübertragung zwischen den Labeln wurde daher als Ursache ausgeschlossen. Eine Konkurrenz bzw. Behinderung bei gleichzeitiger Bindung beider Marker könnte jedoch eine Rolle spielen.

Kapazitiert, kavitierte Eberspermien

Zuvor kapazitierte Eberspermien wurden kavitiert, um die äußere Akrosommembran zugänglich zu machen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben werden auch hier in der Übersicht (Tab. 13) deutlich. Im ersten Versuch bewirkte die Kavitation bei 42% aller Spermien die vollständige Ablösung des Akrosoms, während in den Versuchen 2 und 3 das Akrosom lediglich in 3 bzw. 11% der Zellen abgelöst wurde. Zellen der Kategorie F waren in allen drei Proben am häufigsten vertreten (ca. 55%), jedoch zeigte sich auch hier eine große Abstufung (42-79%). Die Kategorie E war im ersten Versuch gar nicht vertreten, im dritten hingegen mit ca. 26% die zweithäufigste. Erstaunlicher Weise war in diesen Spermien die äußere Akrosommembran frei zugänglich, endogenes PS hingegen nicht!

Trotz dieser Unterschiede konnten einige charakteristische Muster bei allen drei Versuchen wiedergefunden werden. Etwa 12% der kapazitierten Spermien erschienen auch nach Kavitation morphologisch intakt, zeigten aber eine AnV-Bindung an ihrer Kopfkappe (Kategorie B). Die Kategorien C und D blieben bei allen Versuchen unbesetzt. Eine selektive Ablösung der Plasmamembran vom Spermienkopf ohne Störung der äußeren Akrosommembran war somit bei kapazitierten Eberspermien nicht möglich. Die auffällig häufige Bindung von AnV an der Becherhülse (ca. 63%) spricht zudem für eine Destabilisierung dieses Bereiches. In frisch gewaschenen, kavitierten Spermien zeigten vergleichsweise nur ca. 21%, in kapazitierten ca. 12% eine solche Markierung.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

5

11

0

0

0

42

42

53

67

Versuch 2

0

10

0

0

8

79

3

89

72

Versuch 3

2

16

0

0

26

45

11

61

49

MW ± SD

2 ± 3

12 ± 3

0

0

11 ± 13

55 ± 21

19 ± 21

68 ± 19

63 ± 12

Tab. 13: AnV/PNA-Markierung kapazitierter und anschließend kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Akrosomreagierte Eberspermien

In zuvor kapazitierten Eberspermien wurde die Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors ausgelöst. In drei Versuchen konnten Unterschiede zwischen den Proben sowie charakteristische Merkmale akrosomreagierter Spermien beobachtet werden. Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse im Überblick. Die Spermienproben der drei Versuche unterschieden sich deutlich in ihrer Akrosomstabilität. Die Proben enthielten zu 35/10/1% morphologisch intakte Spermien (Kategorie A-D). Spermien mit vollständig abgelöster Kopfkappe (Kategorie G) wurden zu 39/76/58% beobachtet. Die restlichen Zellen zeigten ein sich abhebendes Akrosom mit intensiver PNA-Markierung (Kategorie E). Auch in der Spermienprobe vorhandene abgelöste Kopfkappen, die formstabil erhalten blieben, zeigten eine intensive PNA-Bindung. Wie bereits im Abschnitt 3.3.2 erläutert, bestätigten die Versuche zur AnV/PNA-Markierung von akrosomreagierten Eberspermien den nahezu vollständigen Verlust des AnV-Bindungsvermögens am Spermienkopf. Eine intensive AnV-Bindung konnte hingegen an vesikulären Membranstrukturen beobachtet werden. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um abgelöste Zytoplasmatropfen und Vesikel aus der Plasmamembran und/oder äußeren Akrosommembran. Wurden akrosomreagierte Spermien kavitiert und anschließend mit AnV und PNA markiert, zeigten alle an den Spermien vorhandenen, sich ablösenden Kopfkappen eine deutliche AnV- und PNA-Bindung (Kategorie F, 29%). Die Mehrzahl der Zellen hatte die Kopfkappe vollständig verloren (Kategorie G, 69%). Nach dieser Behandlung waren auch die Becherhülsen bzw. das Äquatorialsegment der meisten Spermien durch eine AnV-Bindung charakterisiert. Eine schnelle Abkühlung der akrosomreagierten Eberspermien von 38,5°C auf 4°C ergab ein vergleichbares Ergebnis.

Kategorie

A

B

C

D

E

F

G

∑AnV

AnV

B-hülse

Versuch 1

26

0

0

9

27

0

39

9

0

Versuch 2

10

0

0

0

14

0

76

0

17

Versuch 3

1

0

0

0

41

0

58

0

0

MW ± SD

12 ± 12

0

0

3 ± 5

27 ± 14

0

58 ± 19

3 ± 5

6 ± 10

Tab. 14: AnV/PNA-Markierung akrosomreagierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.

Zusammenfassend ergaben die mikroskopischen Untersuchungen AnV/PNA-markierter Eberspermien folgende Ergebnisse:

• In frischen, in TALP gewaschenen Eberspermien befindet sich PS in intakten Zellen auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran.

• Bei frischen, in TALP gewaschen Spermien befindet sich PS auf der zytoplasmatischen Seite der äußeren Akrosommembran.

• Die Kapazitation der Eberspermien bewirkt in einem Teil der morphologisch intakt erscheinenden Zellen (ca. 16%) eine Exposition von PS.

• Während die äußere Akrosommembran nach Kapazitation bzw. Akrosomreaktion in zahlreichen Spermien (32/27%) mit PNA markiert werden konnte, zeigten die meisten dieser Zellen (22/27%) keine AnV-Bindung im Bereich der Kopfkappe.

• Die Kavitation kapazitierter Eberspermien führte scheinbar nicht zur selektiven Ablösung der Plasmamembran über dem Akrosom.

• An kapazitierten und akrosomreagierten Eberspermien wurde nach anschließender Kavitation häufig (63%) eine AnV-Bindung an der Becherhülse beobachtet.

• Nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor konnte AnV nicht an den verbleibenden Strukturen der Kopfkappe binden.

• Der Vergleich der Einzelversuche macht die große Variabilität zwischen den einzelnen Spermienproben deutlich. Während die Kopfkappen der Spermien einer Probe sehr stabil einer Kavitation oder Akrosomreaktion standhielten und fest am Spermienkopf assoziiert blieben, konnte die gleiche Behandlung in einer anderen Spermienprobe das Akrosom teilweise oder komplett ablösen.

Abb. 25: Charakteristische Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Die Einteilung der Kategorien A-G erfolgte entsprechend der Abb. 24 und den Erläuterungen im Text. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC-AnV und Alexa-PNA Fluoreszenzen. Unter den Abbildungen ist die prozentuale Häufigkeit jeder Kategorie angebeben.

Die morphologische Charakterisierung der Eberspermien ist trotz Phasenkontrastoptik am Lichtmikroskop nur begrenzt möglich, zumal die zu untersuchenden Membranen (PM, äAM) räumlich sehr eng benachbart sind. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie sollten die Feinstruktur von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, insbesondere die auftretenden Membranstörungen (z.B. Löcher, Vesikulationen, u.a.), genauer analysiert werden. Des weiteren wurde die AnV-Bindung an kapazitierten und kavitierten Eberspermien untersucht. Dazu wurden die entsprechenden Zellen mit einem Biotin-AnV inkubiert und dessen Lokalisation mittels goldmarkiertem Biotin-Antikörper verfolgt.

Frische, kavitierte Eberspermien

Die Kavitation von in TALP gewaschenen Eberspermien bewirkte eine effektive Ablösung der Plasmamembran vom akrosomalen Kopfbereich. Die äußere Akrosommembran blieb teilweise eng am Spermienkopf assoziiert, die akrosomale Matrix erschien bei diesen Zellen als elektronendichte Struktur. Die Mehrzahl der Spermien zeigte eine wellenförmig expandierte äußere Akrosommembran. An der Becherhülse blieb die Plasmamembran fest mit dem Spermium assoziiert. Abbildung 26 zeigt typische Bilder kavitierter Eberspermien.

Abb. 26: Elektronenmikroskopische Aufnahme kavitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. (a) Übersichtsbild zeigt ein Spermium mit fest assoziiertem Akrosom und mehrere mit expandierter äußerer Akrosommembran (äAM), die Plasmamembran (PM) ist jeweils vollständig abgelöst; (b) an der Becherhülse assoziierte PM und sich einrollende äußere Akrosommembran; (c) Spermium mit wellenförmig expandierter äußerer Akrosommembran und Reststruktur der abgelösten PM.

An zahlreichen kavitierten Spermien konnte eine Bindung des goldmarkierten Biotin-Antikörpers beobachtet werden. Die Membranstruktur erschien an diesen Stellen oft sehr verschwommen, wahrscheinlich aufgrund der methodisch bedingten ungenügenden Fixierung der Membranlipide. Die Fixierung der Zellen mit Immunkarnovsky erfolgte nach Bindung des Biotin-AnV an exponiertes PS, so dass eine Vernetzung des gebundenen AnV mit anderen Membranproteinen wahrscheinlich ist. Auf ein Nachfixieren der Lipide mit Osmiumtetroxid wurde bei diesen Versuchen verzichtet, da dies die Antikörperbindung behindern könnte.

Abb. 27: AnV-Bindung an kavitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper gegen Biotin-AnV (a) an der äußeren Akrosommembran, (b) an abgelösten Membranvesikeln. Das Spermium mit intakter Plasmamembran (b) zeigt hingegen keine Goldmarkierung.

Abbildung 27 zeigt zwei charakteristische Beispiele für eine AnV-Bindung an kavitierten Eberspermien. Zum einen wurde eine Markierung der äußern Oberfläche beobachtet, zum anderen eine Bindung an vesikulären Membranstrukturen. Das Vorhandensein des akrosomalen Inhalts in Abbildung 27a spricht für die Intaktheit der äußeren Akrosommembran und somit für eine PS Exposition auf dem zytoplasmatischen Monolayer der äußeren Akrosommembran. Einige wenige Spermien wiesen in diesen Präparaten eine intakte Plasmamembran, gekennzeichnet durch einen elektronendichten Bilayer, auf. An diesen Zellen wurde nie eine Bindung goldmarkierter Antikörper beobachtet.

Kapazitierte Eberspermien

Die Kapazitation von Eberspermien bewirkte die Herausbildung morphologisch differenzierter Zellpopulationen. Abbildung 28 zeigt im Überblick einige charakteristische elektronenmikroskopische Aufnahmen kapazitierter Eberspermien. Bei der Mehrzahl der Zellen blieb der akrosomale Inhalt als elektronendichte Struktur erhalten. Nur selten wurde ein vorzeitig akrosomreagiertes Spermium mit Vesikulation der Plasmamembran und äußeren Akrosommembran (Abb. 27e, f) beobachtet. Die Plasmamembran war entweder leicht expandiert, wellenförmig dicht der äußeren Akrosommembran überlagert oder abschnittsweise aufgelöst bzw. diffus verbreitet (Abb. 27a-d).

Abb. 28: Elektronenmikroskopische Aufnahme kapazitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Abgebildet sind charakteristische Aufnahmen kapazitierter Eberspermien: (a) Spermium mit intakter, teilweise expandierter Plasmamembran; (b) Ausschnittsvergrößerung von a), Pfeile markieren Bereiche, in denen Plasmamembran und äußere Akrosommembran eng miteinander assoziiert sind; (c) Plasmamembran ist eng mit der äußeren Akrosommembran assoziiert und weist in Abständen Löcher auf (Pfeile); (d) akrosomintaktes Spermium mit vom Kopf abgelöster Plasmamembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse; (e, f) vorzeitig akrosomreagierte Spermien mit Vesikulation von Kopf und/oder äußerer Akrosommembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse.

Versuche zur Markierung kapazitierter Eberspermien mit Biotin-AnV und anschließender Bindung goldmarkierter Biotin-Antikörper hatten keine intensive Markierung der Zellen zur Folge. Lediglich vereinzelt, an wellenförmigen Membranausstülpungen oder abgelösten Membranfetzen wurden Goldpartikel in den Präparationen gefunden. Es wurde nie eine Goldmarkierung kapazitierter Eberspermien mit intakter Plasmamembran beobachtet.

Abb. 29: AnV-Bindung an kapazitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper an (a) Störstellen der Plasmamembran, (b) wellenförmigen Membranausstülpungen, (c) abgelösten Membranfetzen.

Mit den folgenden Versuchen sollte geklärt werden, ob eine bestimmte Subpopulation der kapazitierten Eberspermien (z.B. die wenigen AnV-bindenden Zellen) selektiv an isolierte Zonae binden. Dazu wurden einerseits kapazitierte, markierte Spermien mit isolierten Zonae zusammen inkubiert, andererseits sollten kapazitierte, markierte Spermien möglichst aktiv die Zonae anschwimmen.

In zwei Versuchen wurde zunächst getestet, ob flüssigkonservierte, gewaschene Spermien unspezifisch an die isolierten Zonae binden. Dies konnte in den beiden Versuchen ausgeschlossen werden. Wurden hingegen kapazitierte Spermien direkt zu den Zonae hinzugegeben und zusammen für 15 min inkubiert, waren sowohl lebende (PI-) als auch tote (PI+) Zellen mit den isolierten Eizellhüllen assoziiert, wobei es nicht zu einer Akkumulation von Spermien an den Zonae kam. Versuche zur Koinkubation zuvor AnV- und PNA-markierter, kapazitierter Eberspermien führten ebenfalls zur Bindung markierter (membrandefekter) und unmarkierter (morphologisch intakter oder akrosomreagierter) Zellen an die isolierten Zonae. In den Abbildungen 30 und 31 wird dies an charakteristischen Beispielen deutlich. Alle motilen, hyperaktivierten Spermien erschienen auch nach Bindung an die Zonae unmarkiert.

Abb. 30: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet sind links die Phaseninterferenzbilder und rechts die Fluoreszenzbilder des FITC-AnV (grün) einer Zona in zwei Bildebenen (Aufsicht, Querschnitt).

Abb. 31: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV und Alexa-PNA markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet ist die Überlagerung von Phaseninterferenzbild und den beiden Fluoreszenzbildern des FITC-AnV (grün) und Alexa-PNA (rot).

Da PNA-bindende Spermien vergleichsweise häufig an den Zonae gebunden waren, könnte dies für eine Auslösung der Akrosomreaktion an den Eizellhüllen sprechen, AnV-bindende Spermien waren, in Übereinstimmung mit allen bisher beschriebenen Versuchen, auch nach Koinkubation kapazitierter Zellen mit den Zonae nur selten zu beobachten. Die Morphologie der gebundenen Spermien war sowohl im Phasenkontrast als auch im Phaseninterferenzbild schwer zu beurteilen.

Versuche, die kapazitierten Spermien an die Zonae heranschwimmen zu lassen, erwiesen sich als äußerst kompliziert, da die auftretenden Kapillarkräfte stets zur Durchmischung der Proben führten. Ließ man von den zuvor kapazitierten und markierten Spermien die defekten zunächst auf dem Objektträger sedimentieren und führte anschließend den Tropfen mit den kapazitierten Eberspermien und einen zweiten mit den ebenfalls sedimentierten Zonae durch Ausziehen einer schmalen Flüssigkeitsbrücke vorsichtig zusammen, konnten nur die hoch motilen Spermien die Zonae erreichen. Nur wenige dieser generell nicht markierten Spermien wurden nach einer 15 minütigen Koinkubation an einer Zona assoziiert gefunden. Auffällig war die Bindung von wenigen Spermienaggregaten (3-10 Zellen) an ausgewählten Stellen der Zona. Selbst nach einer Stunde Inkubation waren diese Spermien noch hoch motil und fest mit der Zona assoziiert.

Die dargestellten Ergebnisse zum Zona-pellucida-Bindungsassay entsprechen Tendenzen, die aus wenigen Vorversuchen abgeleitet wurden, eine abschließende Aussage erlauben sie noch nicht. Eine passive Koinkubation kapazitierter, markierter Spermien mit isolierten Zonae ermöglichte die Bindung von toten (PI-gefärbt), membrandefekten (PNA- bzw. AnV-markiert), aber auch von intakten unmarkierten Zellen. In keinem Versuch wurde eine selektive Bindung einer bestimmten Subpopulation kapazitierter, markierter Eberspermien beobachtet. Generell unterstützen die Versuche jedoch die Aussage, dass hoch motile, kapazitierte Eberspermien, die durch aktive Bewegung zur Zona gelangen, weder durch PI noch durch PNA oder AnV markiert werden. Sie erhalten die Integrität der Plasmamembran und können an isolierte Zonae binden. Weitere Versuche würden einen hohen präparativen und methodischen Aufwand erfordern, um den Assay zu optimieren und zu standardisieren.

Die Spermienkonzentration der zur Lyse eingesetzten Suspension wurde von 10¹⁰ über 10⁹ zu 10⁸ Zellen/ml erniedrigt. Als Maß für die Effizienz der Lyse wurde die Wiederfindungsrate des Cholesterols (CHO) und der Phospholipide (PL) im Überstand, nach Abtrennung der schweren Zelltrümmer (siehe Abb.5, S.50) gewählt.

CHO [nmol/10⁹Sp.]

PL [nmol/10⁹Sp.]

CHO/PL

[mol/mol]

Proteine [mg/10⁹Sp.]

PL/Protein [nmol/mg]

CHO/Protein

[nmol/mg]

412 ± 64

1000 ± 282

0,35 ± 0,06

1,0 ± 0,3

1428 ± 565

483 ±153

Tab. 15: Lipid- und Proteingehalt von Forellenspermien: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen von n unabhängigen Einzelbestimmungen (CHO, PL: n=10; Protein: n=6).

Für die Gesamtspermiensuspension wurden die in Tabelle 15 angegebenen Konzentrationen und die daraus resultierenden Verhältnisse von CHO, PL und Protein zueinander ermittelt. Verglichen mit bereits veröffentlichten Ergebnissen von kavitierten Forellenspermien liegen die Werte für das resultierende CHO/PL etwas niedriger (0,47±0,08), während die Werte für den absoluten Proteingehalt der Forellenspermien (1,2±0,2 mg/10⁹ Spermien) sehr gut miteinander übereinstimmen Labbé and Loir (1991).

Bei einer Zelldichte von 10¹⁰ Spermien/ml konnte der überwiegende Teil der Lipide während der 20minütigen Inkubation in 1%igem Triton (Versuchsansätze A und C, siehe Abb. 32) nicht lysiert werden. Nahezu das gesamte Zellmaterial konnte durch eine Zentrifugation bei 1300xg im Pellet angereichert werden. Eine Lyse in 2%igem Triton (Versuchsansätze B und D) war hinsichtlich des solubilisierten CHO (12/32% und 58/74%) etwas effektiver, wobei der massive Unterschied zwischen den beiden verwendeten Spermiensuspensionen (A/B und C/D) sich wiederholte. Hinsichtlich der Effektivität der PL-Solubilisation ergab sich zwischen den Inkubationen mit 1 oder 2%igem Triton kein wesentlicher Unterschied. Wiederholte Inkubation des Pellets in Triton führte zur weiteren Lyse der Spermienmembranen. Die schweren Zelltrümmer wurden nochmals abgetrennt und die beiden Überstände für die Ultrazentrifugation gepoolt.

Versuchs-ansatz

10¹⁰ Zellen/ml

A / C

10⁹ Zellen/ml

E/G/I/K/N/O

10⁸ Zellen/ml

F/H/J/L

10⁹ Zellen/ml

(mit EDTA)

Q / R

10⁹ Zellen/ml

(ohne Triton)

M / P

CHO [%]

12 / 58

92 ± 3

78 ± 3

47 / 76

28 / 47

PL [%]

13 / 14

77 ± 10

72 ± 14

39 / 58

21 / 24

Tab. 16: Effektivität der Tritonlyse von Forellenspermien: Die Lyse der Spermien erfolgte in 1%igem Triton. Angegeben ist der prozentuale Anteil der Lipide im Überstand nach Abtrennung schwerer Zelltrümmer bezogen auf die eingesetzte Gesamtlipidmenge des Lysates (Wiederfindungsrate).

Die Lyse von 10⁹Spermien/ml in 1%igem Triton (n=6) führte zu einer maximalen Solubilisierung der Lipide. 92 ± 3% des CHO und 77 ± 10% der PL wurden im Überstand angereichert. Wurde die Tritonlyse im kalziumfreien SFMM durchgeführt (n=2), war der Anteil CHO (47 bzw.76%) und PL (39 bzw. 58%) im Überstand deutlich geringer. Wurden die Spermien nur durch Homogenisieren mit dem Potter zerstört (n=2), sank der Anteil an Lipiden, die im Überstand angereichert werden konnten, noch deutlicher ab. Lediglich 28,3 bzw. 47,1% des CHO und 21,4 bzw. 23,7% der PL gingen in Lösung. Bei diesem relativ schonenden Aufschluss von Zellen blieben die Zellorganellen wahrscheinlich weitestgehend erhalten und wurden bei der Zentrifugation mit 1300xg im Pellet angereichert. Tabelle 16 zeigt zusammenfassend die prozentualen Anteile der im Überstand solubilisierten Lipide.

Eine Zellkonzentration von 10⁸ Spermien/ml führte zu einer effektiven Lyse der Membranen durch 1%iges Triton. 78 ± 3% des Gesamt-CHO und 72 ± 14% der Gesamt-PL wurden im Überstand angereichert (n=4).

Die Lysate aller zuvor beschriebenen Versuchsansätze wurden einem Saccharosegradienten unterschichtet und durch Ultrazentrifugation aufgetrennt. Es wurden unterschiedliche Gradienten und verschiedene Zentrifugationszeiten getestet. Die Membranfraktionen konnten über einen „kontinuierlichen“ Saccharosegradienten am besten aufgetrennt werden. Bei der verwendeten mittleren Beschleunigung von 100.000xg befanden sich nach 18 h Ultrazentrifugation die obersten Banden im Bereich der 15-17,5%igen Saccharoselösung. Die jeweilige Dichte im Gradienten nach Zentrifugation wurde nicht bestimmt.

Bei den Versuchen, die eine Auftrennung der Membranfraktionen über einen diskontinuierlichen Gradienten zum Ziel hatten, waren die Banden breiter und nicht so weit im Gradienten aufgestiegen. Für das Erreichen des Gleichgewichtszustandes wäre wahrscheinlich eine längere Ultrazentrifugation nötig gewesen.

Abbildung 32 zeigt im Überblick die Ergebnisse der Ultrazentrifugationen aller Proben. Links ist jeweils der im Ultrazentrifugenröhrchen geschichtete Saccharosegradient mit dem unterschichteten Überstand der Zelllyse (30 ml in 40%iger Saccharose) dargestellt, rechts hingegen die Bandenmuster nach Ultrazentrifugation. Die Banden wurden, wie in der Abbildung eingezeichnet, abgenommen und das Volumen genau bestimmt. Bei einer Ausgangskonzentration von 10⁸ Zellen/ml waren keine Banden klar zu erkennen. Es wurden jene Bereiche abgesammelt, in denen bei den parallelen Versuchsansätzen mit 10⁹ Zellen/ml Banden angereichert waren.

Eine deutliche Erhöhung des CHO/PL in der obersten Bande aller 18 Versuchsansätze deutet auf die Existenz einer cholesterolreichen Membranfraktion bei Forellenspermien hin. Der Proteingehalt relativ zum CHO war um das 2-30fache geringer im Vergleich zum Überstand des Lysates. Beim PL-Gehalt war die Tendenz nicht bei allen Versuchen eindeutig.

Abb. 32: Auftrennung der lysierten Membranfraktionen über eine Gradientenzentrifugation: Angegeben sind die Variationen der einzelnen Versuchsansätze (mit Ausnahme von M und P jeweils Doppelbestimmungen): Schichtung des Gradienten // eingesetzte Spermienkonzentration // Tritonkonzentration bei der Lyse // Dauer der Ultrazentrifugation (UZ) und die Bandenauftrennungen aller durchgeführter Versuche.

Die Abbildung 33 zeigt an einem Beispiel (n=4) die Ergebnisse der Isolation einer Triton-unlöslichen Membranbande. Die Ausgangskonzentration der Forellenspermien zur Lyse in 1%igem Triton betrug jeweils 10⁹ Zellen/ml (Präparationen I, K, N,O). Da die PL etwas schlechter solubilisiert wurden als das CHO, war das CHO/PL-Verhältnis im Überstand nach Abtrennung der schweren Zelltrümmer bereits leicht erhöht.

Abb. 33: Isolierung einer Membranbande geringer Dichte mit signifikant erhöhtem CHO/PL-Verhältnis. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 Versuchsansätzen. Lyse von 109 Zellen/ml in 1%igem Triton und anschließende Ultrazentrifugation (Präparationen I, K, N,O).

In der oberen Bande wurden ungefähr 10% (40 ± 11 nmol pro 10⁹ Zellen) des CHO und 4% (37 ± 8 nmol pro 10⁹ Zellen) der PL angereichert. Das CHO/PL-Verhältnis war mit 1,05±0,07 signifikant erhöht. Der CHO- bzw. PL-Gehalt stieg im Verhältnis zum Proteingehalt ungefähr auf das Doppelte verglichen mit dem Überstand, der dem Gradienten unterschichtet wurde.

Obwohl bei allen Teilschritten exakt auf die eingesetzten Volumina geachtet wurde, konnte der Verbleib des ursprünglich im Spermienlysat vorhandenen CHO, der PL und der Proteine nicht immer eindeutig nachvollzogen werden. Am Beispiel der Versuche M-R sei dieses Problem noch einmal genauer erläutert. Die für das Gesamtspermienlysat ermittelten Werte (100%) sollten der Summe aus den Werten des Überstandes und des Pellets nach Zentrifugation entsprechen. Für den Cholesterolgehalt stimmt dies gut überein (95,9±19,8%), für den PL- (68,7±14,0%) und Proteingehalt (135,1±38,5%) allerdings nicht.

Setzt man nun die Werte, die für den jeweiligen Überstand ermittelt wurden, auf 100%, findet man in den Triton-unlöslichen Banden (x, a, b) und im Pellet (c) nach Ultrazentrifugation 48,9±23,3% des CHO, 40,1±22,9% der PL und 26,3±8,2% der Proteine wieder. In den Versuchen, bei denen die Spermien ohne Triton homogenisiert wurden, lag der Anteil an CHO (78,7% bzw. 68,8%) und PL (75,4% bzw. 54,8%) in diesen Fraktionen deutlich höher.

Für die CHO- und PL-Bestimmungen wurde untersucht, ob das in den Proben anwesende Triton (0,5 bzw. 1%) oder Saccharosekonzentrationen zwischen 5-40% die Lipidanalysen stören. Tabelle 17 zeigt Ergebnisse der Lipidanalysen im Überblick.

Triton [%]

Saccharose [%]

CHO [nmol/ml]

PL [nmol/ml]

-

-

222

901

1,0

-

220

1140

-

40

231

1183

0,5

40

207

1236

Tab. 17: Lipidbestimmungen an Forellenspermien: Einfluss der Triton- und Saccharosekonzentration suspendierter Forellenspermien (1x109 Zellen/ml) auf die CHO- und PL-Bestimmungen.

Weder Triton noch Saccharose störten in den getesteten Konzentrationen die Lipidanalysen. Wahrscheinlich befand sich das nicht „wiedergefundene“ Material über den gesamten Gradienten verteilt.

Versuche zur Tritonlyse von Forellenspermien wurden in der Zwischenzeit im französischen Labor mehrfach wiederholt. Die oben dargestellten Ergebnisse zur Isolierung einer Membranbande geringer Dichte konnten sicher reproduziert werden. Es wurden jeweils 2-3 Triton-unlösliche Banden isoliert, deren CHO/PL ca. 1,4 betrug. Weitere Untersuchungen zur genauen Lipid- und Proteinzusammensetzung dieser Banden sind in Arbeit.