Aus der Klinik für Dermatologie und Venerologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Was ist Leukozytoklasie?
Eine histologische und elektronenmikroskopische Untersuchung an kutaner leukozytoklastischer Vaskulitis

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Kristin Ladell
aus Köln

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. G. Kolde
2. Prof. Dr. med. G.-R. Burmester
3. Prof. Dr. med. C. Sorg

Datum der Promotion: 25.05.2001


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Keywords: cutaneous leukocytoklastic vasculitis, neutrophils, atypical apoptosis, Fcgamma­receptors

Abstract

The aim of this study was to find out whether leukocytoklastic cell disintegration of neutrophils in cutaneous leukocytoklastic vasculitis (clv) is apoptosis. In order to find out more about the underlying mechanisms leading to this form of cell disintegration and subsequent cell death skin sections of 9 patients with clinically and histologically verified clv and of 13 patients with clv after intradermal injection of histamine were examined at different time points. The structural and ultrastructural morphological features of leukoctyoklasia were evaluated by light and electron microscopy. Immunohistochemistry included well known death receptors (CD95/CD95L), mitochondrial proteins (Bax/Bcl-2), proteins interfering with the cell cycle (p53/p21) and cell surface receptors (FcgammaRIII/FcgammaRII). Furthermore DNA fragmentation was assessed by the TUNEL method. Although the structural and ultrastructural features of leukocytoklastic cell disintegration of neutrophils in clv revealed typical apoptotic morphology, the underlying biochemistry did not match apoptotic means. DNA fragmentation was only seen in a minor fraction of fragmented nuclei and prominent in already phagocytosed debris. Neutrophils at different locations (in the lumen of the postcapillary venules, within the wall of the blood vessels and in the perivascular tissue) were always negative. The examined death receptors, mitochondrial proteins and cell cycle proteins play no (Bcl-2/Bax, p53/p21) or only a minor (CD95/CD95L) role in the biochemical mechanisms leading to cell disintegration of these cells in this self-limited inflammation. Interestingly FcgammaRIII was highly expressed not only in intact but also extremely disintegrated neutrophils as well as on the surface of their fragments. One could therefore assume that this receptor not only plays a role in activation of these cells, but also might be involved in the following induction of the cell death program. Maybe this highly glycosylated receptor also functions as an ‘eat-me’ flag in the recognition-mechanism by macrophages. FcgammaRII could not be shown on the cell surface of these cells in this context, which on the one hand could be due to the high expression of FcgammaRIII with no room left for FcgammaRII on the cell surface or due to a separate or additional role in the induction of the cell death program. Finally leukocytoklastic cell disintegration shows strong resemblance to apoptosis but with non-classical underlying biochemical mechanisms, most importantly to mention the delay in DNA fragmentation which could also be due to DNA degradation by DNases of macrophages.


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Eigene Schlagworte: kutane leukozytoklastische Vaskulitis, neutrophile Granulozyten, atypische Apoptose, Fcgamma-Rezeptoren

Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob es sich bei der leukozytoklastischen Zelldesintegration der neutrophilen Granulozyten in kutaner leukozytoklastischer Vaskulitis (kLV) um Apoptose handelt. Um die zugrundeliegenden Mechanismen dieses Zellzerfalls näher zu charakterisieren, wurden Hautbiopsien von 9 Patienten mit klinisch und histologisch gesicherter kLV und 13 Hautbiopsien von Patienten mit kLV folgend auf intrakutane Histamin-Injektion im zeitlichen Verlauf untersucht. Licht­ und elektronenmikroskopisch wurde die Morphologie der Leukozytoklasie beurteilt. Immunhistologische Untersuchungen beinhalteten klassische pro-apoptotische Rezeptoren (CD95/CD95L), desweiteren über die Mitochondrien (Bax/Bcl-2) und auf genetischer Ebene die Apoptose regulierende Proteine (p53/p21). Es wurde zusätzlich die Expression von Zelloberflächen-Rezeptoren (FcgammaRIII/ FcgammaRII) beurteilt. Mittels der TUNEL-Methode wurde versucht die klassische DNA-Fragmentierung nachzuweisen. Obwohl strukturell und ultrastrukturell die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose vorlagen, konnte diese biochemisch nicht untermauert werden. DNA-Fragmentierung liess sich nur in schon von Makrophagen phagozytierten Kernfragmenten nachweisen. Neutrophile waren negativ und ihre Fragmente waren es vorwiegend. Den untersuchten Rezeptoren CD95/CD95L kommt allenfalls eine geringe und den Proteine, Bax/Bcl-2 und p53/p21 keine Rolle im Zellzerfall der Neutrophilen in dieser selbstlimitierten Entzündung zu. Interessanterweise wurde jedoch FcgammaRIII sehr stark auf der Oberfläche nicht nur intakter, sondern auch schon fragmentierter neutrophiler Granulozyten exprimiert. Dementsprechend ist anzunehmen, dass diese konstitutionell exprimierten Rezeptoren nicht nur eine Rolle in der Aktivierung, sondern auch eine Rolle in der darauf folgenden Auslösung der Apoptose in diesen Zellen spielen. Desweiteren dienen diese stark glykosylierten Rezeptoren möglicherweise als Phagozytose-Erkennungsmerkmal für Makrophagen. FcgammaRII liess sich hingegen nicht auf der Oberfläche der Neutrophilen und ihrer Fragmente nachweisen. Dies könnte einerseits durch eine Verdrängung durch FcgammaRIII bedingt sein, andrerseits könnten sie durch Immnunkomplex-Bindung eine separate oder zusätzliche Rolle in der Induktion des Zellzerfalls spielen. Zusammenfassend weist der leukozytoklastische Zellzerfall der Neutrophilen in kLV die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose auf, die biochemisch jedoch auf atypische Weise abläuft. In dieser Hinsicht zu erwähnen, ist vor allem die verzögerte oder durch DNasen der Makrophagen bedingte DNA-Fragmentierung.

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13.10.2004