3 MATERIAL & METHODEN

3.1 MATERIAL

3.1.1 Hautbiopsien

Es wurden Hautbiopsien von 9 Patienten mit klinisch und histologisch gesicherter kLV der dermatologischen Abteilung des Universitätsklinikums Charité zu Berlin untersucht. Die Exzisionstelle war entweder der linke oder der rechte Unterschenkel medial oder lateral. Das Alter der 2 männlichen und 7 weiblichen Patienten variierte von 17 bis 85 Jahren. Die Ätiologie der kLV war in fast allen Fällen unklar. In einem Fall schien die Einnahme von ASS im Rahmen eines grippalen Infektes ursächlich zu sein. Bei 4 Patienten kam es zum Rezidiv, wobei dies bei einem Patienten nach Absetzen der systemischen Gabe von Kortison erfolgte. Alle anderen Patienten blieben ohne Therapie. Die Diagnose einer kLV wurde zudem immunfluoreszenzoptisch gesichert. Sieben der untersuchten Proben waren Anti-C3 positiv und in zwei Fällen konnten zusätzlich Immunglobuline (Anti-IgA und Anti-IgA/Anti-IgM) an den kleinen Blutgefäßen nachgewiesen werden.

Außerdem wurden 13 Probeexzisionen von Patienten mit kLV, der dermatologichen Abteilung des Universitätsklinikums Münster zur Verfügung gestellt, die folgend auf eine Histaminquaddelung nach 1, 2, 3, 4.5, 8, 12 Stunden und nach klinischer Manifestation, beziehungsweise in zwei Fällen routinemäßig entnommen wurden, untersucht.


[Seite 26↓]

Als Negativkontrollen dienten 5 Biopsien von Normalhaut, die unter den gleichen Bedingungen gefärbt wurden.

3.1.2 Monoklonale Antikörper

Bei den verwendeten Antikörpern handelte es sich um monoklonale Antikörper von der Maus, die die Induktion oder Inhibition der Apoptose, die Induktion von negativer Zellwachstumskontrolle, die Zellproliferation oder das Vorhandensein verschiedener Zellarten, wie Makrophagen/Monozyten, neutrophilen Granulozyten oder Endothelzellen nachweisen.

CD95/CD95L

CD95/Fas ist ein Zelloberflächen-Antigen, dass zur NGF/TNF-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei der Gewebe-Homöostase spielt. CD95 induziert Apoptose in verschiedenen Zellarten, indem es an den Fas-Ligand oder an Anti-Fas-Antikörper bindet [189,79]. Man ist heute der Ansicht, dass die meisten Zellen CD95 mindestens in geringem Maß exprimieren.

CD95L/FasL gehört zur korrespondierenden TNF-Familie und kommt sowohl als Oberflächenrezeptor, als auch in löslicher Form vor [200]. CD95 und sein Ligand spielen eine Rolle in der Zellalterung [143,144,200].

bcl-2

bcl-2 ist ein Proto-Onkogen. Sein Gen kodiert für ein Protein, das an der Membran der Mitochondrien, an nukleären Strukturen und am endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist [138,103]. Es inhibiert die Apoptose, wobei der Mechanismus noch nicht genau geklärt ist. Bekannt ist, dass es in Tumorzellen dereguliert wird, so z.B. im follikulären B-Zell-Lymphom und chronisch lymphatischer B-Zell-Leukämie [214]. Bcl-2 interagiert mit anderen Proteinen einer ganzen Genfamilie, die ähnliche Aminosäuren-Sequenzen aufweisen. Genprodukte, die dieser Genfamilie angehören, sind: bax, bcl-Xl, bcl-Xs und Mcl-1 [182,150,104]. Diese wirken entweder ebenfalls anti-apoptotisch oder pro-apoptotisch. Es spricht immer mehr dafür, dass bcl-2 die Permeabilitätsänderung der Mitochondrien verhindert, ein frühes Ereignis der Apoptose [156,233,166]. Andere Hypothesen besagen, dass in die Regulation des intrazellulären Calciums eingegriffen wird. Dadurch kann die Aktivität der Calcium­abhängigen Endonuklease, die für die DNA-Fragmentierung nötig ist, beeinflußt werden [130]. Desweiteren wurde ein antioxidativer Effekt für bcl-2 postuliert [91].

[Seite 27↓]bax

Bax ist ein 21 kDa Protein, dass wie schon erwähnt, der bcl-2-Familie angehört. Bax und bcl-2 weisen ausgeprägte Homologien in iher Amionsäuren-Sequenz auf, haben jedoch gegenteilige Wirkungen [104]. Bax formt Heterodimere mit bcl-2. Die apoptotische Aktivität hängt von dem Verhältnis dieser beiden Moleküle ab. Eine Überexpression von bax führt zu einer Beschleunigung der Apoptose [150,66]. Ein apoptotischer Stimulus und damit eine vermehrte Expression von bax kann nach der Entfernung von Wachstumsfaktoren erfolgen [150,102]. Ebenso wird die Synthese durch die Aktivierung von p53-Wildtyp stimuliert, basierend auf der Beobachtung, dass die Promoter-Region von bax 4 Stellen aufweist, die p53-Bindungsstellen entsprechen [136]. Sowohl die mangelnde Bindung von bcl-2 an bax, als auch die Formation von bax-Homodimeren führt zur Apoptose. Einen absoluten Schutz vor apoptotischem Zelltod stellt die Formation von bcl-2-bax-Heterodimeren nicht dar [66].

p53/p21

p53 ist ein Tumorsuppressor-Gen. Das entsprechende Protein befindet sich im Nukleus. Es ist ein multifunktionaler Transkriptionsfaktor, der sowohl die Proliferation, die Differenzierung als auch die Apoptose induzieren kann [111]. Es unterdrückt das Zellwachstum, indem es das WAF1-Gen, dessen Genprodukt p21 genannt wird, aktiviert. Dieses inhibiert als sogenannte cdk (cyclin dependent kinase) den Zellzyklus in der G1 und G2-Phase, wodurch es zur Hemmung der Proliferation kommt. Sowohl G1/G2-Stillstand, als auch Apoptose finden im Anschluß an die Aktivierung von WAF1 statt [230]. Nach derzeitigen Vorstellungen lokalisiert p53 DNA-Strang-Brüche oder Schädigungen und hält den Zellzyklus an, um dadurch eine Reparatur der DNA zu ermöglichen. Findet keine Reparatur statt, kommt es zur Apoptose, wodurch vermieden wird, dass ganze Generationen von Zellen mit genetischem Defekt produziert werden [111]. Zudem kann p53 die Expression von bcl-2 herunter- und diejenige von bax heraufregulieren [49].

PCNA

PCNA steht für ‘proliferating cell nuclear antigen’ und identifiziert proliferierende Zellen. Das 'proliferating cell nuclear antigen' (PCNA) wurde erstmals im Zusammenhang mit sytemischem Lupus erythematodes (SLE) beschrieben, wo es [Seite 28↓]als Zielantigen einer Subpopulation von Autoantikörpern identifiziert wurde [206,148]. Die humane Nukleinsäuresequenz, die bereits bekannt ist [3], ist identisch mit Cyclin [127] und dem Hilfsprotein der DNA-Polymerase δ[208,13]. Im Verlauf eines Zellteilungszyklus kommt es während der G1-Phase zur Akkumulierung von PCNA. In der S-Phase erreicht PCNA seine höchste Konzentration, die dann im Verlauf der G2/M-Phase wieder abfällt[105]. Dieses zeitlich differenzierte Auftreten von PCNA macht es zu einem idealen Marker der Zellproliferation.

CD68 (clone: KP1)

CD68 kann zur Immunphänotypisierung von Monozyten, Makrophagen und myeloischen Zellen verwendet werden, besonders auch zum Nachweis reaktiver Makrophagen [158,159]. Der Antikörper erkennt ein Glykoprotein. Das Antigen wird primär als intrazytoplasmatisches Molekül exprimiert und ist wahrscheinlich mit den lysosomalen Granula assoziiert. Seit 1989 dient der Antikörper offiziell zur Differenzierung humaner Leukozyten. Makrophagen verschiedener Lokalisationen (Leber, Milz, Knochenmark, Magen-Darm-Trakt, Gewebe-Histiozyten) und Mikroglia werden positiv angefärbt. Antigen präsentierende Zellen, wie Langerhans-Zellen sind entweder negativ oder zeigen schwache, örtlich begrenzte Reaktivität. Monozyten des peripheren Blutes zeigen ein granuläres Anfärbungsmuster. Des Weiteren reagiert der Antkikörper auch mit myeloischen Vorläuferzellen und Granulozyten des peripheren Blutes [133].

Faktor 8

Faktor 8 geht mit dem von Willebrand Faktor (vWF) der Endothelzellen eine Komplexbindung ein, und hat plättchenagglutinierende Eigenschaften. Unter normalen Bedingungen zeigt sich ein granuläres Anfärbungsmuster der Endothelzellen. Das Zytoplasma von Megakaryozyten des Knochenmarks reagiert ebenfalls positiv [73].

CD16/ CD32

CD16, auch bekannt als FcγRIII, ist ein Glykosyl-phosphatidyl-Inositol-verankerter niedrig-affiner IgG-Oberflächenrezeptor. Der Isotyp FcγRIIIb wird spezifisch auf neutrophilen Granulozyten des peripheren Blutes und des Knochenmarks exprimiert [33]. CD32/FcγRII ist ein transmembranöses 40 kDa Glykoprotein [46]. Ebenso wie [Seite 29↓]CD16 handelt es sich um einen niedrig-affinen Rezeptor für IgG. Über diese beiden Rezeptoren werden verschiedene Funktionen vermittelt, wie Endozytose, Aktivierung der Sekretion, Signaltransduktion und Zytotoxizität. Insgesamt spielen sie eine Rolle in der Immunmodulation (humorale und Zell-vermittelte Immunantworten) [56,74,194,78].

Eine Übersicht über die verwendeten Antikörper bietet Tabelle 1 (G = Gefrierschnitt, P = Paraffinschnitt).

Tab. 1: Eine Übersicht der verwendeten monoklonalen Antikörper

moAk

CD

Subklasse

Titer

Spezifität/Funktion

Hersteller

Fas

95

IgG1

G: 1:5000 '30

1 WH

Zelloberflächen-

protein,

induziert Apoptose

Dianova

Oncogene Science

FasL

95L

IgG1

G: 1:10 '30

1 WH

zugehörig zur TNF-Familie, bindet an CD95

Pharmingen,

San Diego/USA

bcl-2

 

IgG1

G: 1:80 '30

1 WH

im B-Zell-Lymphom produziert,

inhibiert Apoptose

Dianova

Hamburg/Germany

bax (Ab-1)

 

IgG

G:1:1000 '60

1 WH

AS -Homologie zu bcl-2

beschleunigt Apoptose

Immonotech

A Coulter Company/

France

p53

 

IgG2a

P: 1:50 '30

1 WH

Mikrowelle

Tumorsupressor-Gen,

aktiviert das WAF1-Gen

Oncogene

Sience,

über Dianova

p21

 

IgG1

P: 1:250 '30

1 WH

Mikrowelle

WAF1-Gen,

inhibiert 'cyclin dependent kinases'

(cdk)

Oncogene

Science

PCNA

 

IgG2a

P: 1:200

1WH

='proliferating cell nuclear antigen',
identifiziert proliferierende Zellen

DAKO,

Glostrup/Dänemark

KP1

68

IgG1

P: 1:100 '30

1WH

mit Andauen

Immunphäno-typisierung von myeloischen und histiozytären Zellen

DAKO

Glostrup/Dänemark

Faktor 8

v.Wille-brand Faktor

  

P: 1:2000 '30

1 WH

mit Andauen

F8 reagiert mit vWF in Endothelzellen und dem Zytoplasma von Megakaryozyten

DAKO,

Glostrup/Dänemark

FcγRIII-Rezeptor

16

IgG1

P: 1:50

1 WH

mit Andauen

Immunphäno-typisierung von NK-Zellen, neutrophilen-, und z.T.basophilen Granulozyten

DAKO,

Glostrup/Dänemark

FcγRII-Rezeptor

32

IgG1

G: 1:100 '30

1WH

Rezeptor für die konstante Region von IgG; Immunmodulation

Dianova

Hamburg/Germany


[Seite 30↓]

3.1.3  Quellen der Reagenzien, Geräte & Materialien

Reagenzien

Quelle

AB-Serum (human)

BEHRING, Marburg

Rinderserum

BIOCHROM, Berlin

APAAP mouse monoclonal

DAKO, Glostrup/Dänemark

Rabbit anti-mouse Immunglobulin

DAKO, Glostrup/Dänemark

Aqua destillata

Braun Melsungen AG, Melsungen

RPMI 1640 (ohne L-Glutamin)

GIBCO, Grand-Island/USA

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
w/o Calcium and Magnesium
w/o Sodium Bicarbonate



GIBCO, Grand-Island/USA

Aceton

MERCK, Darmstadt

Aluminiumkaliumsulfat (Kalialaun)

MERCK, Darmstadt

2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol

MERCK-Schuchardt, Hohenburg

Zitronensäure-Monohydrat

MERCK, Darmstadt

Chloroform

MERCK, Darmstadt

Chloralhydrat

MERCK, Darmstadt

Essigsäure 100%

MERCK, Darmstadt

Ethanol absolut

MERCK, Darmstadt

Hämatoxylin

MERCK, Darmstadt

Kaisers Glyceringelatine

MERCK, Darmstadt

Natriumchlorid

MERCK, Darmstadt

Natriumjodat

MERCK, Darmstadt

Neufuchsin

MERCK, Darmstadt

N,N-Dimethylformamid (DMF)

MERCK, Darmstadt

Salzsäure

MERCK, Darmstadt

Xylol

MERCK, Darmstadt

3-Aminopropyltriethoxy-silane

MERCK, Darmstadt

Levamisole

SIGMA, Deideshofen

Naphthol AS-BI Phosphoric Acid

SIGMA, Deideshofen

Natriumnitrit

SIGMA, Deideshofen

Poly-L-Lysine

SIGMA, Deideshofen

Protease

SIGMA, Deideshofen

Tris-Base

SIGMA, Deideshofen

Tris-HCl

SIGMA, Deideshofen

Triton X-100

SIGMA, Deideshofen

Glutar-und Paraformaldehyd

SIGMA, Deideshofen

Collidin

SIGMA, Deideshofen

OsO4

SIGMA, Deideshofen

Propylenoxid

SIGMA, Deideshofen

Araldit

SIGMA, Deideshofen

Uranylazetat

SIGMA, Deideshofen

Bleizitrat

SIGMA, Deideshofen


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Geräte & Materialien

Quelle

Kryostat

BRIGHT Instrument Company
LTD Huntington, England

Kryostat

SLEE Technik MT, Mainz,
Germany

Reichert-Jung Ultramikrotom

Reichert, Wien, Österreich

Gilders Grids, 3,05 mm, G200 Cu

Mikrotechnik Dr. Hert, München

ZEISS Axioskop

Zeiss, Deutschland

ZEISS Immersionsöl

Zeiss, Deutschland

Heraeus Wärmeschrank

Haereus, Osterode/Harz

Abzug (Hyperclean)

SHANDON, England

Magnetrührer (IKAMAG RCT)

JANKE & KUNKEL, Staufen i. Br.

pH-Meter (Mikroprozessor-pH-Meter CG 840)

SCHOTT-Geräte, Hofheim a. Ts.

Schüttler (IKA-Schüttler MTS 4)

JANKE & KUNKEL, Staufen i. Br.

Wärmebad Julabo U3

Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach

Heidolph Type:REAX 2000 Mixer

Heidolph, Kehlheim

Zytozentrifuge

Haereus, Osterode/Harz

Küvetten

Assistent, Sodheim/Röhn

Pipetten

Eppendorf

Objektträger

Menzel, Braunschweig

Deckgläser

Menzel, Braunschweig

PAP-PEN

Science Services, München

Faltenfilter

Macherey-Nagel, Düren

Faltenfilter

Schleicher & Schnell, Dassel

Meßbecher(verschiedene Größen)

SCHOTT, Hofheim a. Ts. und
Assistent, Sondheim/Rhön

Küvetten

Assistent, Sondheim/Rhön

Aqueous Mounting Media

SHANDON, EnglandSHANDON, England

Cryomatrix

SHANDON, EnglandSHANDON, England

MC1 Analytic AC120s Elektronische Waage

Sartorius AG, Göttingen

manuelle Waage Type 2255

Sartorius Werke GmbH, Göttingen

Kühlschrank & Gefrierschrank SIKAFROST

Siemens, Deutschland

Wärmeschrank für Glyzeringelatine

Haereus, Osterode/Harz

Clatronic Mikrowelleherd MW-701

Clatronic, Kempen

3.2 METHODEN

3.2.1 Vorarbeiten

Die Gewebeproben wurden für licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen aufgearbeitet.

3.2.1.1 Verarbeitung der Hautbiopsien

3.2.1.2 Paraffineinbettung

Es wurden in Formalin fixierte Biopsien verarbeitet. Diese wurden in Plastikkassetten (Reichert-Jung) um 16 Uhr über Nacht im Entwässerungsautomat (SHANDON Citadell 2000) stufenweise in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Zuvor wurden sie 1 min in 5%iges Formalin verbracht, um eine ausreichende Stabilisierung durch die Fixierflüssigkeit zu gewährleisten. Nach der Entwässerung wurde, durch zweimaliges Einbringen in ein Intermedium, in diesem Fall Xylol, der Alkohol entfernt. In den letzten beiden Stufen erfolgte das Durchtränken mit Paraffin bei 60°C (Schmelzpunkt 57/58°C).

Es folgte das Ausgießen mit Histowax (Reichert-Jung) in einer Ausgießstation (ReichertHistoStat Tissue Embedding Center). Nach Erstarren konnten die Biopsien dann mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms (Reichert-Jung Histoslide 2000) geschnitten und auf Objektträger aufgezogen werden. Die Schnitte von 4-6μm Dicke wurden in einem Wasserbad schwimmend auf die bereits beschichteten Objektträger (SuperFrostPlus, Menzel) aufgezogen. Vor der Färbeprozedur sollten die Präparate bei 37°C über Nacht oder für 48 Stunden bei Raumtemperatur trocknen.

3.2.1.2.1 Vorbereitung der Paraffinschnitte

Zunächst mussten die Schnitte mindestens 18 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank abschmelzen, dann wurden sie entparaffiniert, indem sie zweimal in Xylol, dann einmal in Aceton und einmal in ein Aceton/TBS-Puffer Gemisch (1:2) verbracht wurden. Bei einigen verwendeten Antikörpern war es zudem notwendig, die Schnitte vor der Färbung in 0.1% Protease-Lösung (37°C) anzudauen, bzw. sie dreimal in 5 [Seite 32↓]min-Zeittakten, in 10 ml Zitratpuffer, pH 6.0, in der Mikrowelle zu kochen. Damit die Schnitte während des Kochvorganges nicht austrockneten, musste der Flüssigkeitsverlust durch Nachfüllen von Aqua dest., ausgeglichen werden. Weiteres Vorgehen wie bei der Färbung der Gefrierschnitte (siehe unten).

Zusammensetzung der 0.1% Proteaselösung:

150 mg Protease (gelagert bei –30°C) werden in 150 ml auf 37°C erwärmten TBS­Puffer gelöst. Diese Lösung ist im Brutschrank max. 2 Tage haltbar.

Zusammensetzung des Zitratpuffers:

9 ml Stammlösung A und 41 ml Stammlösung B zu 450ml Aqua dest. gießen und mischen.

Stammlösung A: 0.1M Zitronensäure (21.01g C6H8O7xH2O) in 1000 ml Aqua dest., SIGMA.

Stammlösung B: 0.1M Natriumzitrat (29.41g C6H5O7xH20) in 1000 ml Aqua dest., SIGMA.

3.2.1.3 Gefierbiopsien

Frisch entnommene Biopsien wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, im Kryostat (Bright cryostat Model: OTF/AS/MR, Shandon, England) in Cryomatrix eingebettet und bei -80°C im Gefrierschrank aufbewahrt.

3.2.1.3.1 Herstellung von Gefrierschnitten

Mit Hilfe des Gefriermikrotoms wurden die Hautproben angeschnitten. Es wurden ca. 5μm dicke Schnitte hergestellt, die auf Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger aufgebracht wurden, indem ein Objekträger dem gefrorenen Schnitt genähert wurde, der dann sofort an die warme Glasoberfläche anschmolz.

Da unfixierte Schnitte durch das Antrocknen, bzw. Anfixieren der in ihnen selbst enthaltenen nativen Eiweißlösung haften, konnten die Schnitte, nachdem sie 2 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet und 10 min bei –20°C in Aceton fixiert worden waren, bei -30°C in Objektträger-Kästen bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.

3.2.1.4 Transmissionselektronenmikroskopie

Die Gewebeproben mussten, da im Elekronenmikroskop Vakuumbedingungen [Seite 33↓]herrschen, stabilisiert werden. Im stabilisierten Zustand sind sie weitgehend unempfindlich, auch gegenüber der Entwässerung und der Einbettung in Kunstharze. Die strukturelle Stabilisierung sollte mit einem Minimum an Veränderung des Vitalzustandes erreicht werden.

Die Gewebeproben wurden zunächst in einem Glutar- und Paraformaldehyd-Gemisch nach Karnovsky mit einem pH-Wert von 7,3 bei 4°C fixiert. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch abpippetiert und die Proben mehrmals mit Leitungswasser gewaschen. Darauf folgten die Nachfixierung und Kontrastierung mit 1,33%igem Osmiumtetroxid (OsO4) bei 4°C über 2 Stunden. Die Osmiumlösung setzte sich aus 0.89 ml Collidin plus 74,11 ml Aqua dest. plus 1 g OsO4 zusammen, mit einem pH­Wert von 7,4. Nach Ablauf der Zeit wurde das Osmium mehrmals mit Leitungswasser ausgewaschen.

Anschließend wurden die Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe folgendermaßen entwässert:

70%iger

Alkohol

 

für 60 min;

90%iger

Alkohol

 

für 15 min;

96%iger

Alkohol

 

für 15 min;

100%iger

Alkohol

 

für 2x15 min;

Propylenoxid

  

für 2x15 min.

Danach erfolgte die Einbettung in ein Gemisch von 1:1 aus Araldit und Propylenoxid für ca. 12 Stunden. Schließlich mussten die Proben in das reine Araldit übertragen werden. Nach der zweiten Übertragung erfolgte die Polymerisation bei ca. 70°C über 48 Stunden. Hinterher konnten die Araldit Blöckchen aus der Gießform gelöst werden.

An einem Reichert-Jung Ultramikrotom (Reichert, Wien, Österreich) wurden die Proben senkrecht zur epidermalen Oberfläche angeschnitten. Sie waren 70 nm dick und wurden auf Kupfernetze (Gilders Grids, 3,05 mm, G200 Cu, Mikrotechnik Dr. Hert, München) aufgeschwemmt.

Die durch das OsO4 erreichte Kontrastierung wurde durch eine Doppelkontrastierung am Schnitt mit Uranylazetat (20 min) und Bleizitrat (2 min) verstärkt. Zwischen diesen beiden Vorgängen wurden die Präparate mit Aqua dest. abgespült.


[Seite 34↓]

3.2.2  Histologische, immunhistologische und histochemische Färbemethoden

3.2.2.1 Histologische Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) [170]

Es handelt sich um eine Übersichtsfärbung, die routinemäßig in histologischen Labors durchgeführt wird. Die Färbung stellt alle basophilen Zell- und Gewebestrukturen (z.B. Chromatin der Zellkerne, manche Zytoplasmabestandteile, Teile der Knorpelgrundsubstanz) blau, alle azidophilen Bestandteile (z.B. Zytoplasma, die meisten Interzellularsubstanzen) in verschiedenen Tonabstufungen rot dar.

3.2.2.1.1 Methodik

  1. Einstellen der entparaffinierten Schnitte in Aqua dest.
  2. In Hämatoxylin zur Kernfärbung einstellen, 3-8 Minuten
  3. Spülen in Aqua dest.
  4. Bläuen in fließendem Leitungswasser, 10 Minuten
  5. Färben in Eosin, 0,1% in Aqua dest., 5-15 Minuten. Es soll mäßig überfärbt werden.
  6. Auswaschen in Wasser, 1-5 Minuten
  7. Differenzieren in 80%igem Äthanol.
  8. 96-100%igem Äthanol, 2 x 2 Minuten.
  9. Xylol, 3-5 Minuten.
  10. Eindecken in Kaisers'Glyzerin Gelatine.

Die Dauer der Färbung mit Eosin hängt von der Konzentration der Farbstofflösung ab, aber auch von der Fixierung der Präparate. Eosin ist die meistgebrauchte Plasma- und Gegenfärbung. Es wird in 0,1%iger wäßriger Lösung angewendet. Man färbt 5 bis 15 min, wäscht in Aqua dest. aus und differenziert in 80%igem Äthanol. Um die Färbeintensität zu steigern, kann man 1 Tropfen Eisessig auf 100 ml Färbelösung zusetzen.

Die verwendete Hämatoxylin-Stammlösung setzte sich aus 10% Hämatoxylin in 96%igem Alkohol zusammen.


[Seite 35↓]

3.2.2.2  Immunhistologische Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase-Methode

3.2.2.2.1 Prinzip der APAAP-Technik

Bei der APAAP-Methode erfolgt zunächst die spezifische Bindung des Primär­antikörpers an das Antigen. Über einen Sekundärantikörper (=Brückenantikörper) wird dann die Anlagerung eines Enzym-Immun-Komplexes (APAAP-Komlex) ermöglicht. Der Enzym-Immun-Komplex besteht aus zwei Molekülen alkalischer Phosphatase und einem dagegen gerichteten Antikörper. Primärantikörper und Anti­alkalische Phosphatase-Antikörper müssen aus derselben Spezies stammen, damit sie über den Brückenantikörper gekoppelt werden können. Der Brückenantikörper sollte im Überschuss vorliegen, um zu gewährleisten, dass genügend freie Fab­Fragmente für die Bindung des Antikörpers aus dem APAAP-Komplex zur Verfügung stehen. Über eine chromogene Substratlösung für die alkalische Phosphatase wird die Antigen-Antikörper-Bindungsstelle sichtbar gemacht. Durch wiederholte Inkubation mit dem Brückenantikörper und dem APAAP-Komplex kann eine Signalintensivierung im Sinne einer verstärkten Farbreaktion erreicht werden.

Abb. 4: Schema der APAAP-Methode

Versuchsablauf

Zur Markierung, sowohl der Gefrierschnitte als auch der Paraffinschnitte mit den an anderer Stelle aufgeführten Antikörpern, wurde die von Cordell erstmals beschriebene APAAP-Methode in folgenden Schritten angewandt [27]:

Vorbereitung

Am Tag der Färbung oder abends zuvor wurden die Schnitte bei RT aufgetaut und mit einem hydrophoben Stift (PAP-PEN) eingekreist, um ein Auseinanderfließen der [Seite 36↓]später aufgetropften Reagenzien zu vermeiden.

Inkubation mit dem Primärantikörper

Die monoklonalen Antikörper wurden entsprechend des anzuwendenden Titers mit einem Medium (pH 7,4-7,6) verdünnt, das sich aus

Das Rinderserum, das vor Gebrauch 30 min bei 56°C im Wasserbad inaktiviert wurde, verhindert durch Anlagerung an elektrisch geladene Gewebselemente eine unspezifische Adsorption der eingesetzten Antikörper. Die Präparate wurden in eine feuchte Kammer gelegt und nach Auftropfen der entsprechenden Antikörperverdünungen 30 min bei RT inkubiert. Gleichzeitig wurde ein Präparat nur mit Verdünnungsmedium inkubiert, zur Negativkontrolle.

Waschvorgang

Nach Abklopfen der Objektträger auf einer saugfähigen Unterlage wurden sie viermal in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) gespült. Der Tris-Puffer (pH 7,4-7,6) setzte sich aus

Das Verbleiben in einem fünften Pufferbad bis zur nächsten Inkubation, verhinderte ein Eintrocknen der Präparate.

Inkubation mit dem Brückenantikörper

Der Brückenantikörper, ein Kaninchen-Immunglobulin Anti-Maus-Immunglobulin (Rabbit Anti-Mouse Immunglobulins, DAKO, Dänemark), wurde 1:40 mit einem Medium verdünnt, das aus 50 ml RPMI 1640 Medium ohne L-Glutamin und 10 ml AB-Serum (human) bestand.

Nach Abklopfen des überflüssigen Spülpuffers wurde dieses Reagenz aufgetropft und in einer feuchten Kammer 30 min bei RT inkubiert. Das AB-Serum, das unspezifische Kreuzreaktionen des Brückenantikörpers mit dem humanen Gewebe verhindert und die Hintergrundfärbung reduziert, wurde vor Gebrauch 30 min bei 56°C im Wasserbad inaktiviert werden. Danach erfolgte ein Waschvorgang (s.o.).

[Seite 37↓]Inkubation mit dem APAAP-Komplex

Der APAAP-Komplex (APAAP, Mouse Monoclonal, DAKO, Dänemark) wurde analog zum Brückenantikörper 1:40 verdünnt. Die Inkubation erfolgte 30 min unter denselbenBedingungen, mit nachfolgendem Waschvorgang (s.o.).

Wiederholung der Inkubation mit Brückenantikörper und APAAP-Komplex

Zur Verstärkung des Signals wurde ein zweites Mal mit dem Brückenantikörper inkubiert, jedoch nur für 10 min. Darauf folgte ein Waschvorgang wie oben beschrieben. Die Inkubation mit dem APAAP-Komplex wurde ebenfalls für 10 min wiederholt, gefolgt von einem Waschvorgang (s.o.). Die Präparate verblieben bis zur Entwicklung in TBS. Der Spülpuffer wurde erneuert.

Entwicklung in hexazotierter Astraneufuchsin-Entwicklungslösung

Um die Antigen-Antikörper-Bindungsstellen über eine Farbreaktion sichtbar zu machen, wurde folgende Substratlösung (250 ml), ausreichend für 40 Präparate, angesetzt:

Lösung A:

175 ml eines Tris-Puffers, bestehend aus

0,98 g Tris-Base,

0,30 g Tris-Hydrochlorid und

1,74 g Natriumchlorid

auf 200ml Aqua dest.,

wurden mit 62,5 ml 0,2 M Propandiol-Stammlösung und 100 mg Levamisole auf dem Magnetrührer gemischt. Levamisole hemmt die endogene alkalische Phosphatase.

Lösung B:

125 mg Naphtol AS-BI Phosphat wurden unter dem Abzug in 1500 μl N,N­Dimethylformamid gelöst. Naphtol AS-BI Phosphat fungiert als Substrat für die eingesetzte alkalische Phosphatase.

Lösung C:

50 mg Natriumnitrit wurden unter dem Abzug tropfenweise in 1250μl Aqua dest. gelöst und danach mit 500 μl Neufuchsin-Stammlösung in 1 min versetzt.

Natriumnitrit aktiviert Neufuchsin zum Farbstoff.

Die Lösungen A und C wurden zuerst auf dem Magnetrührer gemischt, daraufhin wurde Lösung B dazugegeben. Die Einstellung des pH-Wertes der [Seite 38↓]Entwicklungslösung auf 8,8 erfolgte mit 2 N Salzsäure. Nach Filtration der Lösung in eine Küvette wurden die Objektträger eingestellt und auf dem Schüttler 30 min entwickelt.

Der Nachweis von angelagerten monoklonalen Antikörpern zeigt sich in einer Rotfärbung. Der Waschvorgang wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Der Spülpuffer wurde erneuert.

Gegenfärbung mit Mayers’Hämalaun

Die Präparate wurden 10 min in der vorher filtrierten Gebrauchslösung gefärbt. Es folgte ein Waschvorgang (s.o.) mit einer zusätzlichen Küvette.

Eindecken

Die Objektträger wurden vorsichtig um die Gewebsschnitte herum abgetrocknet und luftblasenfrei in Kaisers’Glyzeringelatine eingedeckt.

3.2.2.2.2 Vorblocken

Um die Hintergrundfärbung weiter zu minimieren, war es bei manchen Antikörpern erforderlich, mit 1:10 verdünntem humanem AB-Serum die unspezifischen Bindungen zu reduzieren.

3.2.2.2.3 Stammlösungen für die APAAP-Methode

Die verwendeten Stammlösungen wurden wie folgt angesetzt:

Poly-L-Lysin-Lösung (0,1%):

500 mg lyophilisiertes Poly-L-Lysin wurden in 500ml Aqua dest. gelöst und bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.

Propandiol-Stammlösung (0,2 M):

21 g 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol wurden in 1l Aqua dest. gelöst und in einer dunklen Flasche bei 4°C aufbewahrt.

Neufuchsin-Stammlösung:

5 g Neufuchsin wurden in 100 ml 2 N Salzsäure schrittweise auf dem Magnetrührer gelöst und in einer dunklen Flasche bei 4°C aufbewahrt.

Mayers’ Hämalaun:

1 g Hämatoxylin, 0,2 g Natriumjodat und 50 g Kalialaun (Aluminiumkaliumsulfat­[Seite 39↓]Dodecahydrat) wurden in 1l Aqua dest. über Nacht auf dem Magnetrührer gelöst.

Nach vorsichtiger Zugabe von 50 g Chloralhydrat und 1 g Zitronensäure (Zitronensäure-Monohydrat) wurde wiederum über Nacht gemischt.

Vor Gebrauch musste die Lösung mindestens eine Woche stehen bleiben.

Die Aufbewahrung erfolgte in einer dunklen Flasche bei RT.

Anmerkung:

Eine Titration der Antikörper war nicht erforderlich, da die verwendeten Antikörper schon austitriert waren.

3.2.2.3 Histochemische TUNEL-Färbung

Das ApopTag In SituApoptose Detection Kit Peroxidase (Oncor, Gaithersburg, Catalog #:S7100-KIT) dient zum histochemischen Nachweis der Apoptose. Dargestellt werden die freien 3’OH-Enden der während der Apoptose in charakteristischerweise fragmentierenden DNA [55]. Es handelt sich um eine enzymatische Markierung mit Hilfe des Enzyms Terminale Deoxynukleotidyl­Transferase.

Zunächst wurde entparaffiniert, indem man die Schnitte zweimal je 5 min in Küvetten mit Xylol einstellte; daraufhin zweimal 5 min in absoluten Alkohol und dann jeweils einmal in 95%igen und 70%igen Alkohol. Nach einem Waschgang (5 min in PBS) wurden die Schnitte zum Andauen in eine frisch hergestellte Proteinase K-Lösung (1 mg/50 ml Aqua dest.) verbracht und für 15 min bei Raumtemperatur darin belassen. Es folgten 4 Waschgänge in Aqua dest. für jeweils 2 min.

Zum Blocken der endogenen Peroxidase Aktivität wurden die Schnitte 5 min in eine 2%ige Wasserstoffperoxid-Lösung (hergestellt aus 30%igem H2O2 und PBS) eingestellt und dann zweimal für 5 min in PBS gespült. Nachdem die Objektträger auf einem Papiertuch abgeklopft worden waren, wurden auf jeden Schnitt zwei Tropfen ‘Equilibration Buffer’ aufgetropft und eine Plastikfolie appliziert, damit sich die Flüssigkeit gleichmässig verteilen konnte. Mindestens 10 bis 15 sec bis maximal 30 min wurden die Schnitte bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Abklopfen der Objektträger und Entfernen der Plastikfolien, wurde ca.54μl ‘WORKING STRENGTH TdT Enzym’ auf je einen der beiden Schnitte auf den jeweiligen Objektträgern pipettiert. Dieses Reagenz bestand aus einem Vielfachen von 2 [Seite 40↓]Tropfen ‘Reaction Buffer’ und 1 Tropfen TdT Enzym (dies ergibt ca.108μl, eine Menge, die für 2 Schnitte ausreichend ist) aus vorgegebenen Fläschchen aus dem Kit. Auf den zweiten Schnitt tropfte man zur Negativkontrolle eine Lösung, bei der statt des Enzyms, Aqua dest. mit ‘Reaktion Buffer’ vermischt wurde. Diesmal wurde für jeden einzelnen Schnitt eine separat zugeschnittene Plastikfolie appliziert und dann für 1 Stunde in einer schon vorgewärmten feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.

Der nächste Schritt bestand darin, die Schnitte, ohne sie vorher zu spülen, in ein schon vorgewärmtes Coplin Gefäß mit ebenfalls vorgewärmtem WORKING STRENGTH STOP/WASH BUFFER, den man schon am Anfang des Färbeprotokolls hergestellt hatte, zu belassen. Dieser Puffer wurde aus 1 ml Stop/Wash Buffer (aus dem Kit) und 34 ml Aqua dest. hergestellt und dann sofort in den Inkubator gestellt. Die Schnitte wurden anfangs kurz agitiert und dann 10 min in dieser Lösung belassen. Es folgten 3 Waschgänge in PBS für je 5 min.

Dann wurden je 2 Tropfen Anti-Digoxigenin-Peroxidase und eine Plastikfolie appliziert und in einer feuchten Kammer bei RT 30 min inkubiert.

Nach weiteren Waschgängen wurden die Schnitte in 0,05% DAB gefärbt. Dazu wurde eine Tablette DAB in 18 ml PBS-Puffer (0,05 M, pH 7,4) aufgelöst und filtriert. Kurz vor der Verwendung wurden 15 ml der filtrierten Lösung entnommen und 10μl 30% H2O2 hinein pipettiert. Auf jeden Schnitt wurde genügend Färbelösung verbracht und für 2-5 min bei RT belassen. Es folgten 3 Waschgänge für je 1 min und einer für 5 min in Aqua dest. Gegengefärbt wurde für 10 min in Mayer’s Hämalaun, daraufhin mehrmals in Aqua dest. gespült und mit Kayser’s Glyzeringelatine eingedeckt.

3.2.3 Mikroskopische Auswertung

Für die Auswertung der lichtmikroskopischen Präparate wurde ein Axioskop der Firma Zeiss verwendet.

Die Ultradünnschnitte wurden mit einem Siemens Elektronenmikroskop 910 unter Verwendung des Doppelkondensors bei einer Strahlenspannung von 60 kV betrachtet. Die elekronenmikroskopischen Aufnahmen entstanden mit der im Mikroskop eingebauten Plattenkamera.


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3.2.3.1  Beurteilung der Infiltratstärke

Das histologisch nachweisbare entzündliche Infiltrat wurde semiquantitativ anhand eines sogenannten High Power Fields (HPF=400er Vergößerung) folgendermaßen beurteilt.

+

wenig Infiltrat, ausschließlich vaskulär und perivaskulär

++

perivaskulär ausgeprägteres Infiltrat mit einzelnen Entzündungszellen unmittelbar im umliegenden Gewebe

+++

ausgeprägtes perivaskuläres Infiltrat mit diffuser Infiltration des umliegenden Gewebes durch Entzündungszellen

+++(+)

sehr ausgeprägte Infiltration des Gewebes

3.2.3.2 Bestimmung der Zellzahl

Die Zahl der immunhistologisch und histochemisch positiv angefärbten Zellen wurde semiquantitativ innerhalb eines High Power Fields (HPF=400er Vergrößerung) nach folgender Einteilung erfaßt:

0

keine positiven Zellen

0/+

vereinzelt positive Zellen

+

5-24% positive Zellen

++

25-49% positive Zellen

+++

50->75% positive Zellen

Aufgrund der geringen Fallzahlen wurde auf eine statistische Auswertung verzichtet.


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13.10.2004