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5  DISKUSSION

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das histologische Phänomen der Leukozytoklasie bei der kutanen leukozytoklastischen Vaskulitis (kLV) durch detaillierte licht- und elektronenmikroskopische, immunhistologische und histochemische Untersuchungen zu charakterisieren. Hierzu wurden diagnostisch entnommene Gewebeproben von 9 Patienten so wie 13 Biopsien einer durch Histamin induzierten kLV aufgearbeitet. Die 13 Biopsien wurden freundlicherweise im Rahmen einer Kooperation von der Universitäts-Hautklinik Münster zur Verfügung gestellt.

5.1 Histopathologie der Gewebeproben

Die histologische Analyse der diagnostisch entnommenen Hautbiopsien zeigte erhebliche Variationen in der Ausprägung und Zusammensetzung der vaskulären und perivaskulären entzündlichen Infiltrate. Bei 5 Biopsien dominierten neutrophile Granulozyten, wohingegen in den anderen Gewebeproben ein eher lymphoides und histiozytäres Entzündungsinfiltrat vorherrschte. Die parallel durchgeführte immun­fluoreszenzoptische Aufarbeitung ergab in 7 der 10 Gewebeproben Ablagerungen von Komplement C3 an den kleinen Blutgefäßen der oberen Dermis. Ablagerungen von Immunglobulinen waren demgegenüber lediglich in zwei Hautbiopsien nachzuweisen.

Die Variabilität der histologischen und immunpathologischen Veränderungen ist auf die Dynamik der vaskulären Entzündungsreaktion zurückzuführen. In verschiedenen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass das zunächst granulozytäre Entzündungsinfiltrat im weiteren Verlauf durch histiozytäre und lymphoide Entzündungszellen ersetzt wird [234,179,7]. Ursprünglich wurde diese Dynamik nicht bedacht und davon ausgegangen, dass es sich je nach vorherrschender Zellart um eine andere Art von Vaskulitis und Pathomechanismus handelt [195,180].

Zwar geht die breite Literatur heute davon aus, dass es sich dabei um einen Irrtum handelte, dennoch schien es außerordentlich vorteilhaft zu sein, Biopsien auch im zeitlichen Verlauf zu untersuchen. Dazu dienten die 13 Biopsien, die nach Histamin­Injektionen bei Patienten mit kLV in verschiedenen zeitlichen Abständen entnommen wurden.

Die Möglichkeit, eine lokalisierte leukozytoklastische Vaskulitis durch die Injektion von Histamin zu induzieren und damit detaillierte Einblicke in den zeitlichen Ablauf des entzündlichen Geschehens zu erhalten, wurde erstmals 1975 von Braverman [Seite 70↓]und Yen beschrieben [12]. Histamin induziert eine Vasodilatation und Permeabilitätssteigerung der kleinen Blutgefäße, so dass sich zirkulierende Immunkomplexe an der Gefäßwand ablagern können [19,20]. Es wurde nicht nur eine direkte Korrelation zwischen klinischer und histologischer Ausprägung möglich, sondern es konnten auch die schon in Tierversuchen beschriebenen Veränderungen in der Nachweisbarkeit von Komplement und Immunglobulinen im zeitlichen Verlauf am Menschen bewiesen werden [29,18]. Üblicherweise lassen sich in Läsionen, die älter sind als 24h keine Immunkomplexe mehr in der IF nachweisen [12]. Wigbels und Mitarbeiter fanden 1997 heraus, dass folgend auf Histamin-Injektionen C3 nach einer Stunde bei all denjenigen Patienten nachzuweisen war, die an der Injektionsstelle eine Läsion entwickelten. Dabei war diese Ablagerung zu 66% gekoppelt mit der Ablagerung von Immunkomplexen. Interessanterweise nahm die Ablagerung von C3 und Ig in ihrer Untersuchung schon nach 2 Stunden wieder ab. Deshalb meinten sie, dass der fehlende Nachweis von Ig mit einer sehr schnell stattfindenden Maskierung durch gebundenes C3 zustande kommen könnte [225].

Bei der histologischen Begutachtung der Gewebeproben aus Münster konnte bei frühzeitig entnommenen Biopsien eine vorwiegend granulozytäre Infiltration des perivaskulären Gewebes gesehen werden. In den zu späteren Zeitpunkten ent-nommenen Proben wurde die schon beschriebene Umwandlung in ein eher lymphoides und histiozytäres Infiltrat deutlich. Dementsprechend konnte die schon von anderen Autoren beschriebene Dynamik in diesem Prozess bewiesen werden.

Schon Savill erwähnte 1993, dass es von großem Interesse sein könnte, die kLV als in/ex vivo Modell für die Aufklärung des Absterbens der neutrophilen Granulozyten zu untersuchen [186]. Als noch idealer ist aber die hier vorliegende Kombination der Untersuchungen von spontan entstandenen und durch Histamin induzierten Läsionen kutaner leukozytoklastischer Vaskulitis zur Analyse der Morphologie der Granulozyten-infiltration anzusehen.

5.2 Licht- und Elektronenmikroskopie der Leukozytoklasie

Das besondere histomorphologische Korrelat der kLV, die Leukozytoklasie, beschreibt den geordneten Zerfall der neutrophilen Granulozyten während dieser Entzündung [54,124]. Charakteristischerweise sieht man in früh entnommenen Gewebeproben zahlreiche neutrophile Granuloyzten intravasal, intramural und perivaskulär. Dabei unterscheiden sich diese je nach ihrer Lokalisation teilweise erheblich in ihrer Morphologie. Intravasal und intramural sind sie noch intakt, aber [Seite 71↓]schon in unmittelbar perivaskulärer Lokalisation beginnen ihre Zellkerne dichter zu werden und zu fragmentieren. Je nach Dichte des Infiltrats finden sich zahlreiche kleine Zellkern-fragmente in der Umgebung der Gefäße oder durchsetzen das ganze obere bis mittlere Corium. Je weiter entfernt sich dabei die Granulozyten vom Gefäßlumen befinden, desto weniger intakt sind sie. Fast kreisförmig um die Gefäße herum lässt sich stufenweise das Fortschreiten der Desintegration dieser Zellen beobachten. In späteren Stadien zeigt sich auch erst nur in unmittelbarer Nähe zum Gefäßlumen die lymphoide Infiltration, weiter peripher finden sich nach wie vor die zerfallenden neutrophilen Granulozyten und immer zahlreichere Histiozyten. Soweit lichtmikroskopisch beurteil-bar, scheinen die Kernfragmente während dieses Prozesses von der Zellmembran umschlossen zu bleiben. Inwieweit dabei die Zellen insgesamt der Schrumpfung unterliegen, lässt sich lichtmikroskopisch schwer beurteilen, da Fragmente dieser Zellen dem Aspekt angeschnittener älterer, noch intakter neutrophiler Granulozyten, die somit mehrere Zellkern-Segmente aufweisen, stark ähneln. Einen Zerfall mit Schwellung und Lyse sieht man jedoch lichtmikroskopisch nicht. In der Literatur lassen sich einige lichtmikroskopische Beschreibungen der Leukozytoklasie finden. Ansatzweise wurden in diesen ähnliche, jedoch meist weniger umfassende Beobachtungen gemacht [7,8,191].

Weitere Aufschlüsse über die Morphologie ergaben die elektronenmikroskopischen Beobachtungen. Intravasal und intramural bestätigten sich die lichtmikroskopischen Erkenntnisse. Perivaskulär wurden neutrophile Granulozyten in verschiedenen Stadien der Desintegration gesehen. Im Frühstadium zeigten sich in der Elektronenmikroskopie periphere Vakuolisierungen der Granulozyten. Das Zytoplasma stellte sich elektronen-dichter dar und die Septierung der Kerne wurde deutlich sichtbar. Im Verlauf konnte das für die Apoptose charakteristische 'blebbing' der Zellmembran gesehen werden. Es kam zur Separation des Zellkerns, und es bildeten sich Kernfragmente. Dabei blieben Zytoplasma, Organellen und die äußere Membran intakt. Zwischen Zellen mit apoptotischer Morphologie konnten nur einzelne mit nekrotischen Veränderungen gesehen werden. Diese zeigten eine Vakuolisierung und Ödematisierung des Zytoplasmas. Die Zellmembran war dabei an umschriebenen Stellen eingerissen und die Ultrastruktur bis auf die Lysosomen zerstört. Außerdem waren von Histiozyten phagozytierte Fragmente der Granulozyten zu sehen. Diese zeigten sekundär im Zytoplasma lokalisiert einen Verlust der Integrität der Organellen. Die gleichen Beobachtungen machten Shi und [Seite 72↓]Mitarbeiter 1998 [191]. In weiteren Publikationen zur Leukozytoklasie wurde entweder auf die elektronenmikroskopische Evaluierung verzichtet oder nicht näher auf die gemachten Beobachtungen eingegangen.

5.3 Apoptose und DNA-Fragmentierung

Für neutrophile Granulozyten wurde in der Mehrzahl der in vitro Studien beschrieben, dass sie morphologisch apoptotisch absterben [26, 28,113,72,183]. In diesen Arbeiten zeigten alternde Neutrophile unter anderem auch die charakteristische DNA-Fragmentierung [183]. Des Weiteren konnte eine Korrelation zwischen den Veränderungen im Sinne der Apoptose und der Aufnahme durch Makrophagen beobachtet werden. Diese Aufnahme schien mit fortschreitender Zeit vermehrt und sehr schnell abzulaufen [183,106]. Diese Veränderungen wurden nicht nur in vitro, sondern auch in vivo an entzündeten Gelenken [183], an entzündeten Atemwegen bei mechanisch beatmeten Neugeborenen [61], bei Glomerulonephritis [185] und experimentell induzierter Peritonitis (Meerschweinchen) [181] beschrieben. Das Vorkommen der Apoptose in dieser Zellartschließt natürlich andere Formen des Zelltodes nicht aus. Einzelne Autoren sind der Meinung, dass Nekrose die übliche Form des Zelltodes der neutrophilen Granulozyten ist [75]. Im Zentrum von Abszessen sterben sie beispielsweise nekrotisch ab [223]. Die allgemein vertretene Hypothese ist jedoch, dass Apoptose und anschließende Phagozytose der bevorzugte Entfernungsmechanismus der neutrophilen Granulozyten in akut entzündeten Geweben sind [109,183]. Dies soll sich auch limitierend auf die Gewebeschädigung auswirken, da apoptotische Zellen im Gegensatz zu nekrotischen nicht zu degenerativen Veränderungen des umliegenden Gewebes führen [224,129].

Das charakteristischste Merkmal der Apoptose, die DNA-Fragmentierung, lässt sich in situ mittels der TUNEL-Methode (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) nachweisen. Mit dieser Methode werden die neu entstandenen freien 3'OH-Enden der DNA-Fragmente in morphologisch identifizierbaren Kernen und apoptotischen Fragmenten markiert. Im Gegensatz dazu werden normale proliferative Kerne, die relativ unsignifikante Anzahlen von freien 3'OH-Enden aufweisen, nicht angefärbt [55]. Es ist nicht klar, ob die Methode diejenigen Stadien der Apoptose nachzuweisen vermag, in denen es zur Kondensation/Verdichtung des Chromatins kommt und die DNA-Fragmentierung noch gering ist. Auch Zellen, die morphologisch die Kriterien der Nekrose aufweisen, können angefärbt werden. Sie erscheinen aufgrund des [Seite 73↓]geringeren Vorkommens von freien 3'OH-Enden aber eher diffus positiv [97]. Daher sollten nur deutlich positive Kerne zur Evaluation herangezogen werden, da unter anderem auch die nötigen Vorbehandlungen (Mikrowellen-Behandlung, Andauen) zu einer DNA-Fragmentierung führen können [145]. In experimentellen Systemen zeigt sich außerdem eine große Variabilität hinsichtlich der DNA-Fragmentierung [59]. Diese kann trotz Apoptose in manchen Zellarten fehlen [24] oder verzögert stattfinden, d.h. sich in manchen Fällen erst den morphologischen Veränderungen anschließen [232,1]. Die Ergebnisse müssen deshalb immer mindestens mit morphologischen Kriterien korreliert werden, und zwar durch die Beurteilung der Zellen bei starker Vergrößerung [25]. Insgesamt ist die Methode kritisch zu beurteilen, auch wenn sie in manchen Fällen spezifischer und sensitiver den Nachweis der Apoptose erbringen kann als andere histochemisch-morphologische Untersuchungen [115].

Die licht- und elektronenmikroskopische Analyse der Leukozytoklasie ergab einen geordneten, den Kriterien der Apoptose entsprechenden Zellzerfall. Um so mehr verwunderte es, dass die TUNEL-Methode für die Neutrophilen sowohl in den spontan entstandenen als auch in den durch Histamin-induzierten Läsionen eindeutig negativ ausfiel. Positiv waren einige Zellen der Epidermis und einige mononukleäre Zellen. Die positiven Zellen der Epidermis können als interne Positiv-Kontrolle gewertet werden, d.h. sie zeigen an, dass die Reaktion stattgefunden hat. Freie klastische Fragmente erschienen schwach positiv oder negativ. Zusätzlich waren jedoch Konglomerate von deutlich TUNEL-positivem Material zu sehen. Bei einem Vergleich der mit der TUNEL-Methode gefärbten Schnitte mit denjenigen, die immunhistochemisch mit dem Makrophagen/Monozyten-Marker CD68 gefärbt wurden, stellte sich heraus, dass es sich um von Makrophagen phagozytierte Kernfragmente handelte. Dies wurde auch durch Shi et al 1998 erkannt [191].

Aufgrund dieser Befunde ist somit festzuhalten, dass leukozytoklastische Neutrophile zwar die licht- und elektronenmikroskopische Morphologie einer Apoptose aufweisen, jedoch keine DNA-Fragmentierung zeigen. Die DNA-Fragmentierung scheint erst nach Ablauf des Zellzerfalls und phagozytotischer Eliminierung zu erfolgen. Ein solcher dissoziierter Prozess wurde schon für HL-60- und Testis-Tumor-Zellen beschrieben [1], nicht jedoch für neutrophile Granulozyten.


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5.4  Expression von Apoptose-regulierenden Proteinen

Um erste Einblicke in die molekulare Regulation des leukozytoklastischen Zellzerfalls zu erhalten, wurde die Expression von Molekülen der CD95- und bcl-2-Familie, sowie der Proteine des p53- und p21-Gens immunhistochemisch untersucht. Alle diese Moleküle und Proteine spielen eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Inhibition von Apoptose.

5.4.1 Expression von CD95 und CD95 Ligand

Ein schon seit langem bekannter pro-apoptotischer Vertreter ist der ubiquitär exprimierte, transmembranöse Oberflächenrezeptor CD95/Fas, der Homologien zur TNF-Familie aufweist [79,143,144]. Getriggert wird die Apoptose durch die Bindung des CD95-Liganden oder durch Bindung von Anti-CD95-Antikörpern. CD95L kommt sowohl als Oberflächenrezeptor, als auch in löslicher Form vor und gehört zur korrespondierenden TNF-Familie [200]. Folgend auf die CD95-CD95L- oder CD95­anti-CD95-Ak-Interaktion führt offensichtlich ein von Caspasen und Mitochondrien abhängiger Mechansimus zur Apoptose in vielen Zellarten [81,216,40,128,221]. Die Rolle dieser Rezeptoren in der konstitutioellen Auslösung der Apoptose in Granulozyten wird jedoch kontrovers beurteilt.

Insgesamt scheint das CD95/CD95L-System eine entscheidende Rolle in der Regulation des peripheren Immunsystems zu spielen [107,60]. Aktivierte natürliche Killerzellen lösen, vermittelt über ihre CD95L-Rezeptoren, die als tödliche Waffe auf CD95 positive und somit sensible Zellen wirken, das Todesprogramm aus [219,152]. Des Weiteren wird CD95 auf CD4- und CD8-positiven T-Lymophozyten exprimiert [37,38]. CD8-positive T-Zellen können im aktivierten Zustand CD95L bilden [88,2] und so ihren eigenen Selbstmordoder das Todesprogramm in benachbarten, sensiblen Zellen auslösen [89,120,198,209]. Auf diese Weise kann die Deletion von reaktiven Zellen und das Überleben von Gedächniszellen reguliert werden. Es ist leicht vorstellbar, dass ein Ungleichgewicht in diesem Mechanismus drastische Folgen nach sich ziehen kann. Zu wenig CD95-Expression und damit zu wenig programmierter Zelltod führt bei transgenen Mäusen zu Lymphadenopathie und/oder Autoimmunerkrankungen [207]. Dies wurde auch bei Kindern mit ähnlichen genetischen Defekten beobachtet [107,35,125]. Zuviel CD95-Expression, bzw. Hyperaktivität des CD95-Systems hingegen, wird bei AIDS gesehen und führt zu der Abnahme der T-Helfer-Zellen [32].


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Die Neutrophilen in kLV zeigten nur in bis zu 50% der Zellen eine CD95-Expression. CD95L wurde kaum exprimiert. Dabei waren in den meisten Fällen weniger als 50% der Neutrophilen positiv. In intravasaler und intramuraler Lokalisation wurden keine positiven Granuloztyten gesehen. Andere Zellen, wie epidermale Zellen (CD95) und Lymphozyten (CD95 und CD95L) reagierten positiv. Die Negativ-Kontrollen fielen für beide Antikörper negativ aus. Die positive Darstellung der basalen und suprabasalen Keratinozyten der Epidermis durch CD95 kann als interne Positiv-Kontrolle aufgefasst werden [110]. Eine Maskierung der CD95-Rezeptoren durch CD95L (und umgekehrt) scheint eher unwahrscheinlich, da mononukleäre Zellen teilweise beide Rezeptoren deutlich exprimierten. Insgesamt muss erwähnt werden, dass die Färbung mit CD95L wesentlich schwächer ausfiel. Aufgrund der positiv angefärbten Zellen (z.B. Lymphozyten) ist jedoch davon auszugehen, dass die Färbung stattgefunden hat.

Ursprünglich ging man davon aus, dass die konstitutionelle Co-Expression von CD95 und CD95L in reifen Neutrophilen für die hohe Rate rapider, spontaner Apoptose, die in diesen Zellen in vitro gesehen wird, verantwortlich ist [114]. Mittlerweile ist aber bekannt geworden, dass lösliches CD95L sowohl in vitro [153] als auch in vivo [135,190] in Neutrophilen nicht die Apoptose auslöst, sondern chemotaktisch auf diese Zellen wirkt. Des Weiteren haben Experimente mit CD95L(gld)- und CD95(lpr)­Knockout-Mäusen ebenfalls die postulierte Schlüsselrolle dieser beiden Faktoren für die Lebenszeit der Neutrophilen in Frage gestellt [48]. Die Befunde in kLV sprechen ebenfalls dafür, dass diesen Rezeptoren keine maßgebliche Rolle in der Induktion des geordneten Zellzerfalls der Neutrophilen in vivo zukommt.

5.4.2 Expression von bcl-2 und bax

Das Proto-Onkogen bcl-2 ist ein Vertreter einer Genfamilie, die Homologien zu Apoptose-regulierenden-Genen des Nematoden C.elegans aufweisen [161]. Bcl-2 kodiert für ein Protein, das an der äußeren Membran der Mitochondrien lokalisiert ist und die Apoptose inhibiert. Der genaue Wirkungsmechanismus ist bisher nicht bekannt. Angenommen wird, dass bcl-2 den frühen Eintritt in die Apoptose reguliert, indem die Permeabilitätsänderung der Mitochondrien verhindert wird. Diese Permeabilitäts-änderung der Mitochondrien soll zu einem Zusammenbruch des Membranpotentials und folgend darauf zur Apoptose führen [156,126,166,215]. Bcl-2 wurde 1985 bei der genetischen Analyse einer chromosomalen Translokation (t(14;18)), die für das follikuläre B-Zell-Lymphom charakteristisch ist, erkannt [214]. [Seite 76↓]Die bcl-2-Expression kommt außerdem in frühen Myeloidzellen des Knochenmarks vor [71,34], jedoch normalerweise nicht mehr in reifen Neutrophilen [81,137,114]. Hämatologische und immunologische Zellen sollen abhängig von ihrer bcl-2­Expression mehr oder minder anfällig sein, CD95 vermittelt in Apoptose zu gehen [155]. In der Literatur wird über komplette Inhibition [82], nur partielle Inhibition [80,42] und gar keinem Effekt [131] von bcl-2 auf das CD95/CD95L-System berichtet.

Weitere Vertreter der bcl-2-Genfamilie, wie bax, bcl-Xl, bcl-Xs wirken entweder anti­ oder pro-apoptotisch [149]. Das Verhältnis der Expression von bcl-2 und bax determiniert, ob es zum Überleben oder Absterben der Zelle kommt. Dieses gilt unter anderem auch für neutrophile Granulozyten, die im Vergleich zu Monozyten und Lymphozyten den höchsten bcl-2/bax-Quotient aufweisen [217]. Es ist demnach wichtig, nicht nur die Expression von bcl-2, sondern auch diejenige von bax zu untersuchen.

In kLV exprimieren die Neutrophilen weder bcl-2, noch bax. Da sich in beiden Färbungen andere Zellen der Haut positiv darstellten, ist davon auszugehen, dass die Reaktionen stattgefunden haben. Im Einklang mit der schon mehrfach beschriebenen Beobachtung, dass reife neutrophile Granulozyten bcl-2 üblicherweise nicht mehr exprimieren, stellten sie sich auch in diesem Fall negativ dar.

Die fehlende bax-Expression könnte die Erkenntnisse einer kürzlich veröffentlichten Studie, in der neutrophile Granulozyten in Entzündungen auf ihre bax-Expression untersucht wurden, bestätigen. In dieser Studie konnte das schon früher beschriebene verlängerte Leben der neutrophilen Granulozyten in verschiedenen entzündlichen Erkrankungen [10,108,84] durch eine Herunterregulierung von bax erklärt werden. Die bax-Expression wiederrum war abhängig von einigen Zytokinen (GM-CSF, G-CSF), die in Entzündungen eine Rolle spielen. Nach der Entfernung dieser Zytokine wurde die bax-Expression wieder induziert und damit die Apoptose ausgelöst [36,222]. In entzündlichen Prozessen scheinen also verschiedene Zytokine zu determinieren, ob und wann es zur Apoptose und damit zur Resolution der Entzündung kommt.

In leukozytoklastischer Vaskulitis sieht man trotz mangelnder bax-Expression das Phänomen des leukozytoklastischen Zell-/Kernzerfalls der neutrophilen Granulozyten. Folglich reicht eine alleinige Herunterregulierung von bax nicht aus, um den Zerfall zu verhindern.


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5.4.3  Expression von p53 und p21

Weitere in den Prozess des programmierten Zelltodes involvierte Proteine, wie p53 und p21, ließen sich in neutrophilen Granulozyten in kLV nicht nachweisen. Diese Proteine sind in der Lage, bei Schädigungen der DNA den Zellzyklus diverser Zellen anzuhalten, um entweder eine Reparatur der DNA zu ermöglichen oder die Apoptose auszulösen [111,230]. Zu der Expression p53/p21 in reifen neutrophilen Granulozyten liegt kaum Literatur vor. In den meisten Fällen wurden Vorläuferzellen des Knochenmarks während ihrer hämatopoetischen Differenzierung zu reifen Zellen auf die Expression dieser Proteine hin untersucht [194].

5.5 Expression charakteristischer und spezifischer Oberflächenrezeptoren

Neutrophile Granulozyten exprimieren 2 Arten von Zelloberflächen-Rezeptoren, die mit der Fc-Region von Ig und Komplement interagieren, die CD32/FcγRII- und CD16/FcγRIII-Rezeptoren. CD32 ist ein transmembranöses Molekül der Zellmembran, CD16 ein Glykosyl-phosphatidyl-Inositol(GPI)-verankerter, niedrig affiner IgG-Oberflächenrezeptor [218,31,165,50,211]. Beide Rezeptoren sind an der Phagozytose, der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) und der Sekretion von löslichen entzündlichen Mediatoren (freien Radikalen, lysosomalen Enzymen und Zytokinen) beteiligt [56,74,192,78]. Durch ihre Aggregation können diese Funktionen in verschiedenen pathologischen Prozessen getriggert und moduliert werden. Dabei werden je nach Bindungspartner und weiteren Bedingungen teilweise gegenteilige Wirkungen ausgelöst.

Gamberale und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Aktivierung der CD32­Rezeptoren durch verschiedene Immunkomplexe (präzipitierte und an Erythrozyten gebundene Immunkomplexe) eine kritische Rolle in der Stimulation der Apoptose der Neutrophilen spielt [53]. Auch für CD16 wird eine Rolle in der Apoptose angenommen. In vitro verlieren neutrophile Granulozyten gesunder Probanden diesen Rezeptor im Laufe der Zeit, mit zunehmender Zelldesintegration im Sinne der Apoptose [39,72]. Dieser Rezeptor-Verlust kann durch Zugabe der Zytokine GM­CSF, G-CSF und IFNγ verhindert werden [72,114]. Dennoch sind die Publikationen hinsichtlich der Rolle dieses Rezeptors bei der Apoptose nicht eindeutig, da unter anderem Jones und Mitarbeiter darauf hinwiesen, dass der steile Abfall der Expression von CD16 auf der Zelloberflächenicht spezifisch für die Apoptose ist. Während der in vitro Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit [Seite 78↓]Lipoplysacchariden fiel ihnen auf, dass die Apoptose zwar gehemmt wurde, sich dabei aber die Expression von CD16 dennoch auf apoptotische Werte reduzierte [85]. Außerdem wurde gezeigt, dass es durch GM-CSF sogar zu einem Abwurf der CD16-Rezeptoren kam [141]. Dabei wurde die Expression auf der Zelloberfläche durch Mobilisierung des intrazellulären Pools und nicht durch genetische Transkription aufrecht erhalten. Wachstumsfaktoren wahren nicht nur die Expression dieser Rezeptoren, sondern hemmen auch die morphologisch nachweis-baren apoptotischen Veränderungen und die DNA-Fragmentierung, d.h. sie verlängern das Leben insgesamt [199]. Möglicherweise sind es morphologische Veränderungen, die zum Abwurf der CD16-Rezeptoren führen. Die Polymerisation von Aktin, als Bestandteil des Zytoskeletts, führt Zeit- und Dosis-abhängig zum Abwurf von Ober­flächenrezeptoren, unter anderem auch von CD16-Rezeptoren [134].

Es finden weitere Zelloberflächen-Veränderungen statt, von denen einige als ursächlich für die Erkennung der Zellen durch Makrophagenangesehen werden. Welche spezifischen Veränderungen der Zelle bzw. ihrer Zelloberfläche es sind, die durch Makrophagen letztlich erkannt werden und dann zur Phagozytose führen, konnte noch nicht aufgeklärt werden. Manche Autoren bewerten den Vitronektin-Rezeptor und den CD36-Rezeptor (Thrombospondin-Rezeptor) als wichtige Komponenten zur Erkennung der zu phagozytierenden Zellendurch Makrophagen [68,43]. Andere gehen davon aus, dass sich die Ladung der apoptotischen Zellen durch Abwurf der CD16-Rezeptoren ändert [72], mit nachfolgender ladungsabhängiger Phagozytose [184]. Des Weiteren scheinen Phosphatidylrezeptoren von Bedeutung zu sein [43,44]. Möglich und sehr wahrscheinlich ist ein Zusammenspiel verschiedener Faktoren/Rezeptoren bei der Erkennung der zu phagozytierenden Zellen durch Makrophagen.

Die neutrophilen Granulozyten in kLV wurden weder intravasal, intramural, perivaskulär noch peripher im Gewebe durch CD32 angefärbt, obgleich es sich um einen von diesen Zellen konstitutionell exprimierten Rezeptor handelt. Hingegen stellten sich dendritische/Antigen-präsentierende Zellen der Epidermis positiv dar. Nur vereinzelte, vorwiegend große mononukleäre Zellen der Infiltrate waren positiv.

Der fehlende Nachweis der CD32-Rezeptoren auf der Zelloberfläche der Neutrophilen könnte durch die Bindung der an dieser Erkrankung maßgeblich beteiligten Immunkomplexe bedingt sein. In vitro zeigten Koenderman und Mitarbeiter, dass vor allem CD32-Rezeptoren eine Rolle in der Bindung von [Seite 79↓]Immunkomplexen spielen [100]. Beschrieben wurde auch, dass die Abnahme der CD32-Rezeptoren der Granulozyten im Blut von SLE-Patienten mit hohen Spiegeln von Immunkomplexen korrelierte [205]. Die Bindung der Immunkomplexe an diese Rezeptoren könnte einerseits zu einer Aktivierung der Neutrophilen führen, andrerseits bei der Auslösung des Todesprogramms mitwirken [53]. Wigbels et al vermuteten, dass die Immunkomplexe durch Komplement maskiert werden [225]. Wie schon erwähnt, ist der frühzeitige fehlende Nachweis der Immunkomplexe durch ihre Bindung an die CD32-Rezeptoren der Neutrophilen bedingt. Diese erfüllen somit schon innerhalb der Zirkulation eine 'Clearance'-Funktion.

CD16 färbte neutrophile Granulozyten demgegenüber bis in späte Stadien der Zelldesintegration und sogar die Mehrzahl der klastischen Zellfragmente positiv an. Demnach kommt es bei kLV nicht, wie üblicherweise für die Apoptose beschrieben, zu einem frühen Verlust dieser Rezeptoren. Zusätzlich wurden einige Makrophagen positiv angefärbt. Es wurde beschrieben, dass im Gegensatz zu Histiozyten [4], neutrophile Granulozyten nicht über CD16-Rezeptoren phagozytieren können.Erklärt wurde dies durch das Vorliegen von zwei verschiedenen Isotypen dieser Rezeptoren, die geringfügige Unterschiede in der Aminosäuren-Sequenz aufweisen. Der Isotyp der Makrophagen soll sogar eine wichtige Rolle in der Regulation der Phagozytose opsonierter Zellen/Partikel spielen [112]. Es wäre also denkbar, dass die Erkennung und Phagozytose der klastischen Fragmente in kLV durch Makrophagen über diese Rezeptoren reguliert wird. Falls es sich nicht um eine direkte Interaktion handelt, könnte es indirekt über eine Polymerisation von Aktin und darauf folgend zu bevorzugter Phagozytose kommen, wie es schon in vitro für Neutrophile beschrieben wurde [175]. In beiden Fällen würde der mangelnde Abwurf dadurch einen Sinn bekommen.

5.6 CD68, ein lysosomaler Marker und seine Relevanz für die Apoptose

Ein besonderes Merkmal der Apoptose ist, dass apoptotische Zellen zu einer massiven Einwanderung von Makrophagen führen [123]. Letztlich werden die apoptotischen Zellen gänzlich durch Makrophagen ersetzt. Beim Einsatz des Monozyten/Makrophagen Markers CD68, der lysosomale Strukturen nachweist, fiel in einigen Präparaten von kLV eine sehr große Anzahl positiver Zellen auf. Neutrophile wurden, da sie ebenfalls lysosomale Enzyme enthalten, teilweise positiv angefärbt. Wie in den vorliegenden Abbildungen (Abb. 22/23, Seite 56) jedoch zu sehen ist, wurden nicht generell alle neutrophilen Granulozyten positiv angefärbt. [Seite 80↓]Dies ist vereinbar mit der in einer anderen Studie beobachteten Abnahme des toxischen Potentials der neutrophilen Granulozyten in kLV [64].

5.7 Abschließende Bemerkungen

Die Synchronisation der morphologischen Veränderungen, die Morphologie der neutrophilen Granulozyten, der Nachweis zahlreicher Makrophagen und die Tatsache, dass es ein selbstlimitierter Prozess ohne extreme Schädigung des Gewebes ist, machen deutlich, dass es sich bei der Leukozytoklasie um eine Art des programmierten und geplanten Zelltodes der neutrophilen Granulozyten handeln muss. Es ist bekannt, dass es zahlreiche Wege gibt, die zur Apoptose führen und nicht alle Merkmale vorhanden sein müssen, um diese zu beweisen [51]. Bei der kLV handelt es sich um eine Form der Apoptose, die mit verzögerter DNA­Fragmentierung abläuft und von äußeren Faktoren moduliert wird. Offensichtlich spielen dabei die Immunkomplexe und ihre Interaktion mit Fcγ-Rezeptoren eine wichtige Rolle. Sie scheinen sowohl an der Auslösung des Todesprogramms der Neutrophilen als auch an der Phagozytose durch Histiozyten beteiligt zu sein.

Die Herunterregulierung von bax soll in vivo (aus BAL isolierte Neutrophile) für die Verzögerung der Apoptose von Neutrophilen in entzündlichen Prozessen verantwortlich sein. Da die Entfernung der Zytokine in vitro die bax-Expression wieder induziert und die Apoptose der Neutrophilen auslöst, scheint es naheliegend, dass bax in Entzündungen die Resolution reguliert [36]. In kLV findet der Zerfall und letztlich die Resolution jedoch wohl ohne Induktion von bax statt. Andere klassische Apoptose-auslösende Proteine konnten ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch der Abwurf der CD16-Rezeptoren, der ein Merkmal der Apoptose dieser Zellen sein soll, zeigte sich nicht. Dafür waren CD32-Rezeptoren schon innerhalb der Zirkulation nicht nachweisbar Diese spielen einerseits eine wichtige Rolle in der Bindung von Immunkomplexen, andrerseits in der Aktivierung der Neutrophilen. Es ist also zu vermuten, dass Immunkomplexe schon innerhalb der Zirkulation an die CD32­Rezeptoren der Neutrophilen binden und diese aktivieren. Durch die Aktivierung kann es:

  1. zu einer vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen mit Fixierung an die Endothelien kommen,
  2. zu vermehrter Produktion von potentiell schädigenden Mediatoren, die zur Zerstörung der Endothelien führen, und[Seite 81↓]
  3. möglicherweise auch zur Auslösung des Todesprogramms mit Verminderung des toxischen Potentials der Zellen.

Um den Mechanismus der Leukozytoklasie zu klären, bedarf es künftig weiterer Untersuchungen. Hier ist in erster Linie an eine detaillierte Charakterisierung der die Apoptose regulierenden Gene und Proteine zu denken. Zu nennen sind vor allem Mcl-1, ein anti-apoptotisches Mitglied der bcl-2-Familie, das während der Apoptose von Neutrophilen herunterreguliert wird [140]. Gleiches gilt für das A1 Gen und Protein, das bei Knockout-Mäusen zu einer vermehrten Apoptose von Neutrophilen führte [65]. Auch sind die intrazellulären Signal- und Transduktionswege der Apoptose bei Neutrophilen bisher kaum bekannt. Schließlich sind noch die Mediatoren der Apoptose-Induktion zu analysieren. TNFα und NO wurden zwar bei der Purpura Schoenlein-Henoch untersucht [7], jedoch sind die erhobenen Befunde ad hoc nicht eindeutig, zumal für beide Mediatoren Dosis-abhängig auch gegenteilige Ergebnisse vorliegen.

Insgesamt ist festzuhalten, dass die kLV ein hervorragendes in situ Modell für die Klärung des programmierten Zelltodes von neutrophilen Granulozyten darstellt. Eine vollständige Aufklärung des Zerfalls der Granulozyten kann in der Zukunft neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen, da immer deutlicher wird, dass feine Unterschiede in der Auslösung der Apoptose in verschiedenen Zellen bestehen. Im Idealfall könnten selektiv und spezifisch ungewollte Zellen durch Apoptose eliminiert werden.


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13.10.2004