Es wurden Hautbiopsien von 9 Patienten mit klinisch und histologisch gesicherter kLV der dermatologischen Abteilung des Universitätsklinikums Charité zu Berlin untersucht. Die Exzisionstelle war entweder der linke oder der rechte Unterschenkel medial oder lateral. Das Alter der 2 männlichen und 7 weiblichen Patienten variierte von 17 bis 85 Jahren. Die Ätiologie der kLV war in fast allen Fällen unklar. In einem Fall schien die Einnahme von ASS im Rahmen eines grippalen Infektes ursächlich zu sein. Bei 4 Patienten kam es zum Rezidiv, wobei dies bei einem Patienten nach Absetzen der systemischen Gabe von Kortison erfolgte. Alle anderen Patienten blieben ohne Therapie. Die Diagnose einer kLV wurde zudem immunfluoreszenzoptisch gesichert. Sieben der untersuchten Proben waren Anti-C3 positiv und in zwei Fällen konnten zusätzlich Immunglobuline (Anti-IgA und Anti-IgA/Anti-IgM) an den kleinen Blutgefäßen nachgewiesen werden.

Außerdem wurden 13 Probeexzisionen von Patienten mit kLV, der dermatologichen Abteilung des Universitätsklinikums Münster zur Verfügung gestellt, die folgend auf eine Histaminquaddelung nach 1, 2, 3, 4.5, 8, 12 Stunden und nach klinischer Manifestation, beziehungsweise in zwei Fällen routinemäßig entnommen wurden, untersucht.

Als Negativkontrollen dienten 5 Biopsien von Normalhaut, die unter den gleichen Bedingungen gefärbt wurden.

Bei den verwendeten Antikörpern handelte es sich um monoklonale Antikörper von der Maus, die die Induktion oder Inhibition der Apoptose, die Induktion von negativer Zellwachstumskontrolle, die Zellproliferation oder das Vorhandensein verschiedener Zellarten, wie Makrophagen/Monozyten, neutrophilen Granulozyten oder Endothelzellen nachweisen.

CD95/Fas ist ein Zelloberflächen-Antigen, dass zur NGF/TNF-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei der Gewebe-Homöostase spielt. CD95 induziert Apoptose in verschiedenen Zellarten, indem es an den Fas-Ligand oder an Anti-Fas-Antikörper bindet [189,79]. Man ist heute der Ansicht, dass die meisten Zellen CD95 mindestens in geringem Maß exprimieren.

CD95L/FasL gehört zur korrespondierenden TNF-Familie und kommt sowohl als Oberflächenrezeptor, als auch in löslicher Form vor [200]. CD95 und sein Ligand spielen eine Rolle in der Zellalterung [143,144,200].

bcl-2 ist ein Proto-Onkogen. Sein Gen kodiert für ein Protein, das an der Membran der Mitochondrien, an nukleären Strukturen und am endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist [138,103]. Es inhibiert die Apoptose, wobei der Mechanismus noch nicht genau geklärt ist. Bekannt ist, dass es in Tumorzellen dereguliert wird, so z.B. im follikulären B-Zell-Lymphom und chronisch lymphatischer B-Zell-Leukämie [214]. Bcl-2 interagiert mit anderen Proteinen einer ganzen Genfamilie, die ähnliche Aminosäuren-Sequenzen aufweisen. Genprodukte, die dieser Genfamilie angehören, sind: bax, bcl-Xl, bcl-Xs und Mcl-1 [182,150,104]. Diese wirken entweder ebenfalls anti-apoptotisch oder pro-apoptotisch. Es spricht immer mehr dafür, dass bcl-2 die Permeabilitätsänderung der Mitochondrien verhindert, ein frühes Ereignis der Apoptose [156,233,166]. Andere Hypothesen besagen, dass in die Regulation des intrazellulären Calciums eingegriffen wird. Dadurch kann die Aktivität der Calcium­abhängigen Endonuklease, die für die DNA-Fragmentierung nötig ist, beeinflußt werden [130]. Desweiteren wurde ein antioxidativer Effekt für bcl-2 postuliert [91].

Bax ist ein 21 kDa Protein, dass wie schon erwähnt, der bcl-2-Familie angehört. Bax und bcl-2 weisen ausgeprägte Homologien in iher Amionsäuren-Sequenz auf, haben jedoch gegenteilige Wirkungen [104]. Bax formt Heterodimere mit bcl-2. Die apoptotische Aktivität hängt von dem Verhältnis dieser beiden Moleküle ab. Eine Überexpression von bax führt zu einer Beschleunigung der Apoptose [150,66]. Ein apoptotischer Stimulus und damit eine vermehrte Expression von bax kann nach der Entfernung von Wachstumsfaktoren erfolgen [150,102]. Ebenso wird die Synthese durch die Aktivierung von p53-Wildtyp stimuliert, basierend auf der Beobachtung, dass die Promoter-Region von bax 4 Stellen aufweist, die p53-Bindungsstellen entsprechen [136]. Sowohl die mangelnde Bindung von bcl-2 an bax, als auch die Formation von bax-Homodimeren führt zur Apoptose. Einen absoluten Schutz vor apoptotischem Zelltod stellt die Formation von bcl-2-bax-Heterodimeren nicht dar [66].

p53 ist ein Tumorsuppressor-Gen. Das entsprechende Protein befindet sich im Nukleus. Es ist ein multifunktionaler Transkriptionsfaktor, der sowohl die Proliferation, die Differenzierung als auch die Apoptose induzieren kann [111]. Es unterdrückt das Zellwachstum, indem es das WAF1-Gen, dessen Genprodukt p21 genannt wird, aktiviert. Dieses inhibiert als sogenannte cdk (cyclin dependent kinase) den Zellzyklus in der G1 und G2-Phase, wodurch es zur Hemmung der Proliferation kommt. Sowohl G1/G2-Stillstand, als auch Apoptose finden im Anschluß an die Aktivierung von WAF1 statt [230]. Nach derzeitigen Vorstellungen lokalisiert p53 DNA-Strang-Brüche oder Schädigungen und hält den Zellzyklus an, um dadurch eine Reparatur der DNA zu ermöglichen. Findet keine Reparatur statt, kommt es zur Apoptose, wodurch vermieden wird, dass ganze Generationen von Zellen mit genetischem Defekt produziert werden [111]. Zudem kann p53 die Expression von bcl-2 herunter- und diejenige von bax heraufregulieren [49].

PCNA steht für ‘proliferating cell nuclear antigen’ und identifiziert proliferierende Zellen. Das 'proliferating cell nuclear antigen' (PCNA) wurde erstmals im Zusammenhang mit sytemischem Lupus erythematodes (SLE) beschrieben, wo es als Zielantigen einer Subpopulation von Autoantikörpern identifiziert wurde [206,148]. Die humane Nukleinsäuresequenz, die bereits bekannt ist [3], ist identisch mit Cyclin [127] und dem Hilfsprotein der DNA-Polymerase δ[208,13]. Im Verlauf eines Zellteilungszyklus kommt es während der G1-Phase zur Akkumulierung von PCNA. In der S-Phase erreicht PCNA seine höchste Konzentration, die dann im Verlauf der G2/M-Phase wieder abfällt[105]. Dieses zeitlich differenzierte Auftreten von PCNA macht es zu einem idealen Marker der Zellproliferation.

CD68 kann zur Immunphänotypisierung von Monozyten, Makrophagen und myeloischen Zellen verwendet werden, besonders auch zum Nachweis reaktiver Makrophagen [158,159]. Der Antikörper erkennt ein Glykoprotein. Das Antigen wird primär als intrazytoplasmatisches Molekül exprimiert und ist wahrscheinlich mit den lysosomalen Granula assoziiert. Seit 1989 dient der Antikörper offiziell zur Differenzierung humaner Leukozyten. Makrophagen verschiedener Lokalisationen (Leber, Milz, Knochenmark, Magen-Darm-Trakt, Gewebe-Histiozyten) und Mikroglia werden positiv angefärbt. Antigen präsentierende Zellen, wie Langerhans-Zellen sind entweder negativ oder zeigen schwache, örtlich begrenzte Reaktivität. Monozyten des peripheren Blutes zeigen ein granuläres Anfärbungsmuster. Des Weiteren reagiert der Antkikörper auch mit myeloischen Vorläuferzellen und Granulozyten des peripheren Blutes [133].

Faktor 8 geht mit dem von Willebrand Faktor (vWF) der Endothelzellen eine Komplexbindung ein, und hat plättchenagglutinierende Eigenschaften. Unter normalen Bedingungen zeigt sich ein granuläres Anfärbungsmuster der Endothelzellen. Das Zytoplasma von Megakaryozyten des Knochenmarks reagiert ebenfalls positiv [73].

CD16, auch bekannt als FcγRIII, ist ein Glykosyl-phosphatidyl-Inositol-verankerter niedrig-affiner IgG-Oberflächenrezeptor. Der Isotyp FcγRIIIb wird spezifisch auf neutrophilen Granulozyten des peripheren Blutes und des Knochenmarks exprimiert [33]. CD32/FcγRII ist ein transmembranöses 40 kDa Glykoprotein [46]. Ebenso wie CD16 handelt es sich um einen niedrig-affinen Rezeptor für IgG. Über diese beiden Rezeptoren werden verschiedene Funktionen vermittelt, wie Endozytose, Aktivierung der Sekretion, Signaltransduktion und Zytotoxizität. Insgesamt spielen sie eine Rolle in der Immunmodulation (humorale und Zell-vermittelte Immunantworten) [56,74,194,78].

Eine Übersicht über die verwendeten Antikörper bietet Tabelle 1 (G = Gefrierschnitt, P = Paraffinschnitt).

moAk

CD

Subklasse

Titer

Spezifität/Funktion

Hersteller

Fas

95

IgG1

G: 1:5000 '30

1 WH

Zelloberflächen-

protein,

induziert Apoptose

Dianova

Oncogene Science

FasL

95L

IgG1

G: 1:10 '30

1 WH

zugehörig zur TNF-Familie, bindet an CD95

Pharmingen,

San Diego/USA

bcl-2

IgG1

G: 1:80 '30

1 WH

im B-Zell-Lymphom produziert,

inhibiert Apoptose

Dianova

Hamburg/Germany

bax (Ab-1)

IgG

G:1:1000 '60

1 WH

AS -Homologie zu bcl-2

beschleunigt Apoptose

Immonotech

A Coulter Company/

France

p53

IgG2a

P: 1:50 '30

1 WH

Mikrowelle

Tumorsupressor-Gen,

aktiviert das WAF1-Gen

Oncogene

Sience,

über Dianova

p21

IgG1

P: 1:250 '30

1 WH

Mikrowelle

WAF1-Gen,

inhibiert 'cyclin dependent kinases'

(cdk)

Oncogene

Science

PCNA

IgG2a

P: 1:200

1WH

='proliferating cell nuclear antigen',
identifiziert proliferierende Zellen

DAKO,

Glostrup/Dänemark

KP1

68

IgG1

P: 1:100 '30

1WH

mit Andauen

Immunphäno-typisierung von myeloischen und histiozytären Zellen

DAKO

Glostrup/Dänemark

Faktor 8

v.Wille-brand Faktor

P: 1:2000 '30

1 WH

mit Andauen

F8 reagiert mit vWF in Endothelzellen und dem Zytoplasma von Megakaryozyten

DAKO,

Glostrup/Dänemark

FcγRIII-Rezeptor

16

IgG1

P: 1:50

1 WH

mit Andauen

Immunphäno-typisierung von NK-Zellen, neutrophilen-, und z.T.basophilen Granulozyten

DAKO,

Glostrup/Dänemark

FcγRII-Rezeptor

32

IgG1

G: 1:100 '30

1WH

Rezeptor für die konstante Region von IgG; Immunmodulation

Dianova

Hamburg/Germany

Tab. 1: Eine Übersicht der verwendeten monoklonalen Antikörper

Die Gewebeproben wurden für licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen aufgearbeitet.

Für die Auswertung der lichtmikroskopischen Präparate wurde ein Axioskop der Firma Zeiss verwendet.

Die Ultradünnschnitte wurden mit einem Siemens Elektronenmikroskop 910 unter Verwendung des Doppelkondensors bei einer Strahlenspannung von 60 kV betrachtet. Die elekronenmikroskopischen Aufnahmen entstanden mit der im Mikroskop eingebauten Plattenkamera.