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Kapitel 2. METHODEN UND MATERIAL

2.1 Humorale Immunantwort und Atopie

2.1.1 Patientenauswahl und Studiendesign

Für den ersten Teil der Untersuchung Seren und Informationen der MAS- Multizentrische Allergie Studie untersucht. Die MAS Studie ist eine prospektive Kohorten-Studie mit einer Neugeborenenpopulation von 1314 Kindern.

Die Studie begann 1990 als Beobachtungsstudie mit dem Ziel, auf folgende Fragen eine Antwort geben zu können:

Warum sind allergische Erkrankungen so weit verbreitet?

Welche Frühsymptome treten auf und wie ist der Verlauf von allergischen Erkrankungen?

Gibt es erkennbare Ansatzpunkte zur Allergieprävention?

Dazu wurden Eltern von über 6000 Neugeborenen, die zwischen dem 1.1. und 31.12.1990 in 6 Geburtskliniken der Städte Berlin, Düsseldorf, Freiburg, Mainz und München zur Welt kamen, systematisch nach dem Vorkommen von Allergien in der Familie befragt. Außerdem wurden Nabelschnur-IgE-Bestimmungen durchgeführt. 1314 von diesen Neugeborenen wurden in die Studienkohorte aufgenommen. Etwa 40% dieser Kinder haben eine doppelte familiäre Atopiebelastung oder erhöhtes Nabelschnur-IgE (IgE>0,9kU/l) aufzuweisen. Die Befragung der Eltern bzw. die Allergieuntersuchungen (AUs) der Kinder erfolgten zu festgelegten vom Lebensalter der Kinder abhängigen Terminen und zwar:

AU1	mit 1 Monat
AU2	mit 3 Monaten
AU3	mit 6 Monaten
AU4	mit 12 Monaten
AU5	mit 18 Monaten
AU6	mit 24 Monaten
AU7	mit 36 Monaten.

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Einen Überblick über diese Daten zeigt Abbildung 7.

Manifestationen:	Untersuchungszeitpunkt:
Atopische Dermatitis AD	3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre
Asthma Bronchiale OB	3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre
Rhinokonjunktivitis RK	3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre

Laborparameter:
Gesamt-IgE im Serum	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
spezifisches IgE gegen Milcheiweiß	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Hühnereiweiß	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Soja	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Weize	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Dermatophagoides	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Katze	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Hund	3, 5, 6, 7 Jahre
Birke	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Lieschgras	1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre
Latex	5, 6, 7 Jahre

Abbildung 7: Allergische Symptomatik vom 3. Lebensmonat bis zum 7. Lebensjahr

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Perzentilen	50. Perzentile	75. Perzentile	85. Perzentile	90. Perzentile	95. Perzentile
1. Lebensjahr	5	13	26	40	78
2. Lebensjahr	15	40	75	107	226
3. Lebensjahr	20	58	111	155	261
5. Lebensjahr	34	85	150	212	372
6. Lebensjahr	42	95	170	259	428

Abbildung 8: Bevölkerungsbezogene IgE-Werte in kU/

Die vorliegende Arbeit befaßt sich ausschließlich mit der Untersuchung von Virusinfektionen der Herpesgruppe, der Infektion mit dem Cytomegalievirus (CMV), dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und dem Varizella-Zoster-Virus (VZV). Alle drei Infektionen besitzen eine hohe Prävalenz unter Kindern, hinterlassen eine lebenslange Immunität und führen zur Induktion einer TH1-Immunantwort. Der qualitative und quantitative Nachweis von Virus-spezifischem IgG für CMV, EBV, VZV und IgE für CMV wurde bei 672 Kindern, 351 Jungen (52,2%) und 321 Mädchen (47,8%) im Alter von 1 und 3 Jahren durchgeführt. Diese Altersgruppe war Ziel der Untersuchung, da die ersten Lebensjahre als wichtiger immunologischer Entwicklungszeitraum für die T-Zell-Reifung angesehen werden. Die Bestimmung des CVM-spezifischen IgE erfolgte in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. B. Weber, Laboratoires Reunis Kutter, Lieners-Hastert Junglinster, Luxemburg. Aussagen zum CMV-spezifischen IgE sollten zusätzlich zu den Aussagen über CMV-spezisches IgG eine umfassende Einschätzung des Infektions-Status der Kinder möglich machen, da das CMV-spezifischen IgE gerade für primäre Infektionen ein besserer Marker, als das CMV-spezifische IgM zu sein scheint (54,73,80).

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Das Ziel der Studie bestand darin, zu prüfen, ob seropositive Kinder mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren im späteren Leben (7 Jahre) weniger häufig an atopischen Manifestationen erkranken als seronegative Kinder, die virale Infektion also einen protektiven Effekt hinsichtlich der Allergieentstehung besitzt. Um dies beurteilen zu können, wurden die Ergebnisse der Antikörper-Detektion mittels ELISA-Diagnostik mit den Daten der MAS-Studie zur allergischen Symptomatik der untersuchten Kinder verglichen.

Die MAS-Studie lieferte Daten zur atopischen Manifestation der Kinder für den Zeitraum vom 3. Lebensmonat bis zum 7. Lebensjahr. Die Seropostivität der Kinder gegenüber den untersuchten Infektionen wurde mit den atopischen Manifestationen der Kinder sowohl zum Zeitpunkt der Antikörper-Detektion (mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren) als auch mit 7 Jahren vorgenommen. Diese Vorgehensweise berücksichtigte zum einen den Umstand, daß ein möglicher Einfluß von Virusinfektionen auf die atopische Manifestation Zeit benötigt, um seine Wirkung zu entfalten. Zum anderen war bekannt, daß bereits manifeste atopische Symptome bei Virusinfektion eher verstärkt werden können. Es deutet vieles darauf hin, daß der Zeitpunkt der Infektion eine entscheidende Rolle hinsichtlich eines protektiven Effekts auf die Allergieentstehung spielt. Virale Infektionen bei Patienten mit bereits manifester Allergie führen eher zur Verschlechterung der allergischen Symptomatik. Diesen Umstand galt es zu berücksichtigen. Ein möglicher protektiver Effekt viraler Infektionen auf die Entstehung von atopischen Manifestationen sollte in einer erweiterten statistischen Auswertung allein bei Kindern untersucht werden, die zum Zeitpunkt der Antikörper-Bestimmung noch keine atopischen Manifestation aufwiesen, bei Kindern, die mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren weder Symptome von atopischer Dermatitis, Asthma bronchiale noch Rhinokonjunktivtis zeigten.

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672 untersuchte Kinder (1-Jährige: 362, 3-Jährige: 457, davon Verläufe: 147)

Untersuchungszeitpunkt: Methoden zur Erfassung atopischer und viraler Parameter

AU2	---	3 Monate	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung
AU3	---	6 Monate	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung
AU4	---	12 Monate	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE	----	ELISA CMV IgG, IgE EBV IgG VZV IgG
AU5	---	18 Monate	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung
AU6	---	2 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE
AU7	---	3 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE	----	ELISA CMV IgG, IgE EBV IgG VZV IgG
AU8	---	4 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung
AU9	---	5 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE
AU10	---	6 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE
AU11	---	7 Jahre	----	Fragebogen Strukt. Interview Untersuchung	----	Gesamt IgE spez. IgE

Abbildung 9: Studiendesign der Untersuchung auf humoraler Ebene

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2.1.2 Methoden

ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik

Die Bestimmungen des Virus-spezifischen IgG für CMV, EBV und VZV erfolgten mit ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik.

Dabei wird eine Trägerplatte mit dem zum gesuchten Antikörper korrespondierenden Antikörper beschichtet. Sind diese Antiörper im Serum vorhanden, binden sie an das Antigen. Ein enzymatisch markierter Sekundärantikörper bindet im nächsten Reaktionsschritt an die gesuchten Antikörper. Durch das Enzym wird in der Farbreaktion Substrat umgewandelt. Anhand eines mitgeführten Standards kann dann, nach Erstellung einer Eichkurve, die Farbreaktion direkt mit der Antikörperreaktion korreliert werden (60b).

Abbildung 10: Der ELISA (enzyme linked immunoabsorbent assay)

Antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay-Technik

Die Bestimmungen des CMV-spezifischen IgE erfolgte mit antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay.

Dabei erfolgt die Beschichtung der Träger mit unmarkiertem Anti-IgE-Antikörper und anschließendem Nachweis des gebundenen IgE mit markiertem Anti-IgE-Antikörper, der gegen ein anderes Epitop gerichtet ist. Im Gegensatz zur klassischen ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik, ist dieser Test hochspezifisch, da Antigene, die mit einem Antikörper kreuzreagieren mit großer Wahrscheinlichkeit nicht auch noch an einen zweiten binden (80).

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2.1.3 Material

Cytomegalie-Virus CMV IgG

ETI-CYTOK-G (P2860) DiaSorin:

Methode zur quantitativen/ qualitativen immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Cytomegalovirus IgG-Antikörpern (AD 169 Stamm) im Human-Serum oder -Plasma

Der Cut-Off dieses Tests lag bei 5 AU/ml.

Cytomegalie-Virus CMV IgE

Antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay

Hochspezifische Methode zur immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Cytomegalovirus IgE-Antikörpern im Human-Serum.

Der Cut-Off dieses Tests lag bei 0,4 OD Ag.

Epstein-Barr-Virus EBV IgG

ETI-EBNA-G (P001607) DiaSorin

Methode zur quantitativen/ qualitativen immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Kern-Antigen IgG-Antikörpern des Epstein-Barr-Virus (synthetisches Peptid EBNA-1) in Human-Serum oder -Plasma. Bei diesem Test wurde die sich wiederholende Region Gly-Ala ausgeschlossen, da sie bekannte Kreuzreaktionen mit dem Autoantigen verursacht. Das Protein EBNA-1 dient der Replikation des runden Virus-Genoms. Der Cut-Off dieses Tests lag bei vom Hersteller vorgegeben bei 20 AU/ml. Da der Test bei der Antikörper-Detektion im Serum der 1-Jährigen auch für die mütterlichen Antikörper sensitiv war und dadurch eine kindliche Infektion nicht mit Sicherheit diagnostiziert werden konnte, wurde der Cut-Off auf 100 AU/ml erhöht. Dies entsprach dem Wert, bei dem ein seropositives Kind mit 1 Jahr auch noch mit 3 Jahren seropositiv war.

Varizella-Zoster-Virus VZV IgG

VZV-IgG ELISA (DS5600) DiaSorin

DiaSorin Varizella-Zoster Virus IgG ELISA ist für die Detektion und quantitative Bestimmung von IgG-Antikörpern in Humanserum gegen VZV Virus konzipiert und kann Hilfe bei der Diagnose einer Primärinfektion oder einer Reaktivierung mit dem VZV liefern. Der Cut-Off des Tests lag bei 1,10 ISR Wert.

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2.2 T-Zell-Reaktivität nach CMV-spezifischer Stimulation und Atopie

2.2.1 Patientenauswahl und Studiendesign

Der zweiten Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der zellulären Immunabwehr der Infektion mit dem Cytomegalie-Virus, indem die T-Zell-Reaktivität von Kindern nach einer Infektion untersucht wurden. Aus mehreren Berliner Krankenhäusern wurden insgesamt 100 Kinder und Jugendliche im Alter von 1 bis 16 Jahren mit und ohne atopische Krankheitsgeschichte rekrutiert.

Anamnestische Informationen über atopische Erkrankungen, atopische Familienanamnese wurden in Form eines Fragebogen erfaßt. Auch zusätzliche Einflußgrößen der immunologischen Reaktion, wie medikamentöse Therapien mit immunmodulierenden Substanzen (z.B. Kortikoide) oder akute bzw. chronische Infektionen wurden im Fragebogen festgehalten. Als Atopiker galten alle die Kinder und Jugendliche, die bis zum Zeitpunkt der Befragung und/ oder zum Zeitpunkt der Befragung mindestens eine der drei klassischen atopische Erkrankung (atopische Dermatitis, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis) aufwiesen. Die möglichen chronischen Infektionskrankheiten im Kindesalter (z.B. Morbus Chrohn, Colitis ulcerosa) wurden erfaßt, wenn sie bis zum Zeitpunkt der Befragung und/ oder zum Zeitpunkt der Befragung aufgetreten waren. Nach medikamentösen Therapien bzw. akuten Infektionen (z.B. grippaler Infekt) wurde für den Zeitraum der letzten 3 Wochen gefragt. Besondere Berücksichtigung galt der Erfassung von eventuellen immunsupprimierenden medikamentösen Therapie (z.B. Kortison inhalativ), akuten Infektionen (z.B. grippale Infekte) und entzündlichen Begleiterkrankungen (z.B. Morbus Crohn). Die genannten Faktoren stellen potentielle „confounding variables“ dar, die T-Zell-Reaktivitäten zusätzlich beeinflussen können. Um die Abhängigkeit von Atopie und T-Zell-Reaktivität untersuchen zu können, war es daher unvermeidbar, nur Daten der Kinder in die Auswertung einzubeziehen, die keine zusätzlichen Einflußgrößen boten.

Insgesamt nahmen 100 Kinder im Alter von 1 bis 16 Jahren an der Studie teil. Dabei waren 5% der Kinder jünger als 3 Jahre, 4% jünger als 7 Jahre und 91% 7 Jahre und älter. Die Geschlechtsverteilung belief sich auf 42% Mädchen und 58% Jungen. Bei 24% der Kinder und Jugendlichen zeigten sich in der Anamnese atopische Manifestationen, 76% der Kinder und Jugendlichen hatten keinerlei atopische Symptome gezeigt.

Die mit Immulite bestimmte Seropositivität für CMV lag bei 40% der Untersuchten. Von diesen Kindern und Jugendlichen wiesen 11% akute Infektionen und 18% entzündliche Begleiterkrankungen auf. Eine immunsupprimierende Medikation erhielten 14% der Kinder. Die Daten der Kinder mit einer möglichen Einschränkung der immunologischen Reaktion auf Virusbestandteile flossen nicht in die Berechnung statistischer Signifikanzen ein. Alle weiteren Untersuchungen erfolgten mit 62 Kinder und Jugendlichen im Alter von 1 bis 12 Jahren ohne erkennbare „confounding variables“. Von diesen 62 Kindern und Jugendlichen waren 4,8% jünger als 3 Jahre, 1,6% jünger als 7 Jahre und 93,6% 7 Jahre und älter. Die Geschlechtsverteilung belief sich auf 40,3% Mädchen und 59,7% Jungen. Atopische Manifestationen zeigten 21% der Untersuchten, 79% der Kinder und Jugendlichen wiesen keine atopischen Symptome auf.

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Chemilumescent enzyme immunoassay CMV IgG

2.2.2 Methoden

Mit dem Chemilumescent Enzyme Immunoassay CMV IgG konnten qualitativ Anti-CMV-IgG im Serum der Kinder bestimmt werden. Zur Anwendung kam der Immulite Automatic Analyzer von DPC. Dabei lag das Mischverhältnis bei 400 µl Solution und 20 µl Plasma. Die Standards waren definiert durch:

Diluent	negativ
Negativ	negativ
5 AU	negativ
10 AU	negativ
50 AU	negativ
100 AU	negativ

Durchflußzytometrie

Methode

Nach Stimulation von T-Zellen wurden IFN-gamma produzierende Zellen mit Antikörpern angefärbt und mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersucht. Die Durchflußzytometrie ist ein optisches Meßverfahren, das Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert. Zur durchflußzytometrischen Untersuchung sind Zellen jeder Herkunft geeignet, sofern sie als Suspension von Einzelzellen vorliegen. Die Zellen werden „im Gänsemarsch“ zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie von einem fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden, Abbildung 11. Als Lichtquelle dienen luftgekühlte Argonlaser mit einer 488-nm-Emissionslinie. Das optische Detektionssystem und die Elektronik quantifizieren die Fluoreszenz- und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle. Unter Fluoreszenz wird die rasch abklingende Lichtemission von Molekülen nach Absorption energiereicher Strahlung verstanden. Fluoreszensignale entstehen durch die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen, welche mittels fluorochromkonjugierter Antikörper auf die Zellen aufgebracht oder in die Zellen eingebracht (intrazelluläre Färbung) werden. Daneben besteht die Möglichkeit, die Zellmembran direkt anzufärben. Bei der Mehrfarbenfluoreszenzanalyse werden Floureszenzfarbstoffe gewählt (z.B. PerCP-Peridin-Chlorophyll-a Proteinkomplexe, PE-Phycoerythrine, APC-Allophycocyanin, FITC- Flouresceinisothyocianat), die sich zwar in der Fluoreszenzfarbe unterscheiden, deren Fluoreszenzfarbe jedoch mit derselben Wellenlänge anregbar ist. Trifft ein Lichtstrahl auf eine Zelle, streut sie aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften, wie Größe, Form, Oberfläche und Granularität, Licht mit unterschiedlicher Qualität und Quantität. Die Lichtstreuung ist am größten im

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Die Darstellung der Meßergebnisse erfolgte in einem Zweiparameter-Punkthistogramm (dot plot). Die korrelierte Zweiparameterdarstellung zeigt die Relation zwei verschiedener Eigenschaften einer Zelle zueinander an. Als Beispiele seien angeführt die Korrelation von FSC mit SSC, Abbildung 12b. Der Schnittpunkt zweier Meßwerte einer Zelle ist das Ergebnis der Korrelation, Abbildung 12a.

Bei der Datenauswertung der Immunfluoreszenzmessungen werden die in den Parametrekombinationen vermuteten Lymphozyten eingegrenzt. Der englischsprache Fachausdruch für dieses Fenster wird „gate“ genannt. Bei der weiteren Analyse finden nur solche Ergebnisse Berücksichtigung, die innerhalb dieses eingegrenzten Bereiches liegen.

Ein Nachteil dieser Darstellungsweise ist die schwierige visuelle Abschätzung der Quantität der Populationen in den einzelnen Punktwolken. Zur Vermittlung einer visuellen Dimension stehen daher zusätzliche numerische Daten, wie Anzahl der Ereignisse in verschiedenen Auswertefenstern und deren prozentuale Aufteilung (relative Prozentanteile), Mittelwert, Median und Modus der Signalintensität zur Verfügung (66).

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Abbildung 11: a) 1=Laser, 2=Strahlenerweiterung, 3=Fokusierlinse, 4=Meßkammer, 5=Sammellinse, 6=Teilerspiegel, 7=Lichtfilter, 8=Photomultiplier, 9=Photodiode, 10=Vorverstärker, 11=Impulsanalysatoren, 12=Analog-Digital-Konverter, 13=Datenverarbeitung b) Detailansicht der Meßkammer 1=Laserstrahl, 2=Meßküvette, 3=Trägerflüssigkeit, 4=Zellsuspension, 5=hydrodynamische Fokussierung

Abbildung 12: a) Theoretisches und b) Praktisches Lichtstreuungsdiagramm (66)

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Zunächst wurden 100 µl Vollblut (Lithiumheparinat) mit jeweils 2 µl CMV- Antigen ABI (Verdünnung 1:20 mit PBS, Endkonzentration 5 µg/µl), 10 µl CMV-Peptidgemisch pp56 A, 500 µg/ml DMSO (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 5 µg/µl und 10 µl CMV-Peptidgemisch IE1, 500 µg/ml DMSO (Verdünnung 1:10 mit PBS Stock, Endkonzentration 5 µg/µl) versetzt. Um die generelle Sekretionsfähigkeit für Zytokine zu testen, wurde ein Gemisch aus 2 µl PMA (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 2,5 µl/ml) und 2,5 µl Ionomycin (Verdünnung 1:1000 mit PBS, Endkonzentration 2 µl/ml) eingesetzt. Nach 1-stündiger Stimulation im Brutschrank bei 20°C erfolgte die Zugabe von 2 µl Brefeldin A (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 10 µg/ml). Nach 16-stündiger Stimulation im Brutschrank bei 20°C erfolgte die Lyse mit 1 ml Lysereagenz (Verdünnung 1:10 mit Aqua dest). Anschließend wurde 10 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Nach Zugabe von jeweils 1 ml Permeabilisierungslösung wurde wiederum 10 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Zusätzlich wurden Negativkontrollen und Isotypkontrollen durchgeführt.

Färbung

Im Anschluß erfolgte die Färbung der Zellen. Die mit CMV-Antigen stimulierten Zellen sowie die unstimulierten Negativkontollen wurden mit 35 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD4, CD69 und CD3 gefärbt. Die mit CMV-Peptidgemischen pp65 bzw. IE1 stimulierten Zellen sowie die Positivkontrollen wurden mit 35 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD8, CD69 und CD3 gefärbt. Die unstimulierten Isotypkontrollen wurden sowohl mit 28 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD4, CD69 und CD3 als auch mit 28 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD8, CD69 und CD3 gefärbt. Die Antikörpermischungen setzten sich im einzelnen wie folgt zusammen. Das Gemisch für die Färbung der stimulierten Zelle und der Negativkontrollen bestand in Färbung 1 CD69 FITC 10 µl, Färbung 2 CD3 PE 10 µl, Färbung 3 CD4 bzw. CD8 PercP 10 µl und Färbung 4 IFN-gamma APC 5 µl. Das Gemisch für die Färbung der Isotypkontrollen bestand in Färbung 1 IgG1 FITC 5 µl, Färbung 2 CD3 PE 10 µl, Färbung 3 CD4 bzw. CD8 PercP 10 µl und Färbung 4 IgG2a APC 3 µl. Anschließend wurde 30 Minuten dunkel auf Eis gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Bei großen vorhersehbaren Zeitverlusten zwischen Färbung und Messung der Zellen wurde mit 200 µl PFA 1% refixiert.

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Die Messung der Proben erfolgte mit Hilfe des Durchflußzytometers FacsCalibur von Becton Dickinson.

Überschüssige Zellsuspension wurde nach Präparation für weitere Versuche vor der Stimulation bei -70°C eingefroren.

1 ml Vollblut/ Lithiumheparinat wurde mit 10ml Lysereagenz (Verdünnung 1:10 mit Aqua dest. lysiert, gevortext und 12 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert. Anschließend wurde mit jeweils 30 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 10 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrigugiert, dekantiert und gevortext und erneut zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und das gewonnene Pellet bei -70°C eingefroren.

Die Abbildungen 13 bis 22 zeigen beispielhaft, welche Daten über die IFN-gamma-Produktion der stimulierten CD4- bzw CD8-T-Zellen gewonnen wurden. Eine visuelle Abschätzung der Quantität IFN-gamma-produzierender Zellen ist als Punktwolke im oberen rechten Quadranten („UR Gated“) des Diagramms möglich. Zur Vermittlung einer visuellen Dimension stehen zusätzliche numerische Daten, wie Anzahl der Ereignisse in verschiedenen Auswertefenstern („Gated events“) und deren prozentuale Aufteilung (% Gated“) zur Verfügung. Während in den Abbildungen 13 bis 15 die Daten eines CMV-seronegativen Kindes ohne IFN-gamma-Produktion dargestellt sind, zeigen die Abbildungen 16 bis 18 die Daten eine CMV-seropositiven Kindes mit entsprechender IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit viralem Antigen bzw. Peptidgemisch.

Während die Abbildungen 13 und 16 jeweils die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Antigen widerspiegeln, zeigen die Abbildungen 14 bzw. 17 die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65 und die Abbildungen 15 bzw. 18 die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Peptidgemisch IE1.

Ein Beispiel für unstimulierte Zellen als Negativkontrolle zeigt die Abbildung 19. In Abbildung 20 findet sich ein Beispiel für die Positivkontrollen mit PMA. Beispiele der Isotypkontrollen für CD4- und CD8- positive Zellen sind in den Abbildungen 21 (CD4) bzw. 22 (CD8) dargestellt.

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Abbildungen 13 bis 15

Abbildung 13: Stimulation mit CMV-Antigen, nichtreaktiv

Abbildung 14: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65, nichtreaktiv

Abbildung 15: Stimulation mit CMV- Peptidgemisch IE1, nichtreaktiv

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Abbildungen 16 bis 18

Abbildung 16: Stimulation mit CMV-Antigen, reaktiv

Abbildung 17: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65, reaktiv

Abbildung 18: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch IE1, reaktiv

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Abbildungen 19 bis 22

Abbildung 19: unstimulierte Zellen

Abbildung 20: Stimulation mit PMA als Positivkontrolle

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Abbildung 21: Isotypkontrolle CD4

Abbildung 22: Isotypkontrolle CD8

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2.2.3 Material

Geräte		Hersteller
1.	Immulite Automated Analyzer I3209	DPC Biermann, BadNauheim, BRD
2.	FacsCalibur	BectonDickinson, San Jose, USA

Zentrifugen

3.	CR422	Jouan, Saint Mazaire, Frankreich
4.	Centrifuge5415C	Eppendorf, Hamburg, BRD

Brutschrank

5.	Heraeus instruments/BB6220CU, 51007641	KendroLaboratoryProducts, Hanau, BRD
6.	Pipetten	Eppendorf, Hamburg, BRD
7.	Pipettenspitzen	Sarstedt, Nümbrecht, BRD
8.	Polystyrene Round Bottom Tube 5 ml Falcon352052	BectonDickinson, Franklin Lakes, USA
9.	Polystyrene Conical Tube BlueMax 50 ml Falcon352070	BectonDickinson, Franklin Lakes, USA
10.	Reaktiongefäße,MicroTestTubes Safe-lock 0,5 ml 0030121.023	Eppendorf, Hamburg, BRD
11.	Reaktiongefäße,MicroTestTubes Safe-lock 1,5 ml 0030120.086	Eppendorf, Hamburg, BRD

Reagenzien

Chemilumescent enzyme immunoassay CMV IgG, Immunlite

12.	CMVAReagentWedge FlaconRéactif, LCVA0007	DPC, Los Angeles, USA
13.	CMVBReagentEdge FlaconRéactif, LCVB0007	DPC, Los Angeles, USA
14.	CMVIgGTestUnits, LCV10006	DPC, Los Angeles, USA
15.	IgG/IgMSampleDiluent, LIGZ20004	DPC, Los Angeles, USA

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Stimulation

16.	CMV spezifisches Antigen ABI Human Cytomegalovirus HCMV AD 169, 10-144-000	TEBU Frankfurt am Main, BRD
17.	pp65 Peptidgemisch A, P06725	NMI Reutlingen, BRD
18.	IE1 Peptidgemisch,50mg/ml Major immediate early protein, P13202(72DU)	NMI Reutlingen, BRD
19.	Ionomycin CalciumSalt 1mg in 2ml Ethanol gelöst, I0634	Sigma, St. Louis, USA
20.	Phorbol12-Myristate13-Acetate/PMA 5mg in 1ml DMSO gelöst, P8139	Sigma, St. Louis, USA
21.	Brefeldin A 1mg gelöst in 1ml DMSO, B7651	Sigma, St. Louis, USA
22.	Lysereagenz FacsLysingSolution100ml, 349202	BectonDickinson, San Jose, USA
	Permeabilisierungslösung, NatriumAcid-Puffer in PBS
23.	Albumin, Bovine 50 mg, A6003	BectonDickinson, San Jose, USA
24.	NatriumAcid reinst 50 mg, 30175	Serva, Heidelberg, BRD
25.	Paraformaldehyd reinst DAC,BPC,USP/PFA Verdünnt mit PBS auf 1%, 104005	Merck, Darmstadt, BRD
	Verdünnungsmedien
26.	DimethylsulfoxideSilylatationGrade/DMSO 50 ml, 20684	Pierce, Rockford, Illinois, USA
27.	Ethanol 96% reinst,DAB, 100971	Merck, Darmstadt, BRD
28.	EcotrainerAquaB.Braun,1000ml, 9184P12C	Braun, Melsungen, BRD
29.	PBS 500ml, 14190094	Gibocobrl lifetechnologies Paiseley, Scotland

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30.	CD69(Leu-23)FITC 100Tests, 20 µl/Test, 347823	BectonDickinson, San Jose, USA
31.	CD3PE 100Tests2ml, 20µl/Test, PN IM1282	Immunotech, Marseille, Frankreich
32.	CD4(Leu-3a)PerCP 100Tests, 20 µ/Test, 347324	BectonDickinson, San Jose, USA
33.	CD8(Leu-2a)PerCP 100Tests, 20 µl/Test, 347314	BectonDickinson, San Jose, USA
34.	IFNgammaAPC 100Tests, 10 µl/Test, 10805	ImmuneSource, St. Katharinen, BRD
35.	MouseIgG1FITC 100Tests, 349041	BectonDickinson, San Jose, USA
36.	MouseIgG2aAPC 1ml, 0,1 mg/ml, 340473	BectonDickinson, San Jose, USA

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2.3 Statistische Signifkanz

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS Version 8.0. Neben den Häufigkeitsverteilungen berechneten wir die signifikanten Unterschiede in den Untersuchungsgruppen mittels Chi-Quadrat-Test und Yates-Korrektur.

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