Laske, Nora: Die Immunantwort auf Virus-Infektion der Herpesgruppe bei Kindern als potentieller Modulator der menschlichen Allergieentwicklung

20

Kapitel 2. METHODEN UND MATERIAL

2.1 Humorale Immunantwort und Atopie

2.1.1 Patientenauswahl und Studiendesign

Für den ersten Teil der Untersuchung Seren und Informationen der MAS- Multizentrische Allergie Studie untersucht. Die MAS Studie ist eine prospektive Kohorten-Studie mit einer Neugeborenenpopulation von 1314 Kindern.

Die Studie begann 1990 als Beobachtungsstudie mit dem Ziel, auf folgende Fragen eine Antwort geben zu können:

Warum sind allergische Erkrankungen so weit verbreitet?

Welche Frühsymptome treten auf und wie ist der Verlauf von allergischen Erkrankungen?

Gibt es erkennbare Ansatzpunkte zur Allergieprävention?

Dazu wurden Eltern von über 6000 Neugeborenen, die zwischen dem 1.1. und 31.12.1990 in 6 Geburtskliniken der Städte Berlin, Düsseldorf, Freiburg, Mainz und München zur Welt kamen, systematisch nach dem Vorkommen von Allergien in der Familie befragt. Außerdem wurden Nabelschnur-IgE-Bestimmungen durchgeführt. 1314 von diesen Neugeborenen wurden in die Studienkohorte aufgenommen. Etwa 40% dieser Kinder haben eine doppelte familiäre Atopiebelastung oder erhöhtes Nabelschnur-IgE (IgE>0,9kU/l) aufzuweisen. Die Befragung der Eltern bzw. die Allergieuntersuchungen (AUs) der Kinder erfolgten zu festgelegten vom Lebensalter der Kinder abhängigen Terminen und zwar:

AU1

mit 1 Monat

AU2

mit 3 Monaten

AU3

mit 6 Monaten

AU4

mit 12 Monaten

AU5

mit 18 Monaten

AU6

mit 24 Monaten

AU7

mit 36 Monaten.


21

Im Verlauf der Untersuchungen wurde eine Vielzahl von Daten zur Familie, zum Wohnumfeld, zu allergischen Symptomen, zu Krankheiten usw. gewonnen. Neben den Laborparametern aus der Analyse von Serum (Sensibilisierung gegenüber häufigen Allergenen und zum IgE-Gesamt-Serum-Spiegel) wurden mit Hilfe eines standardisierten Scorings diagnostische Daten zur atopischen Manifestation der Kinder erhoben. Insgesamt ergaben sich im Zeitraum 1990-1993 je Kind 6827 verschiedene Informationen. Insgesamt lagen Daten zu den atopischen Manifestationen der Kinder vom 3. Lebensmonat bis zum 7. Lebensjahr vor.

Einen Überblick über diese Daten zeigt Abbildung 7.

Manifestationen:

Untersuchungszeitpunkt:

Atopische Dermatitis AD

3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre

Asthma Bronchiale OB

3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre

Rhinokonjunktivitis RK

3, 6, 12, 18 Monate, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Jahre

Laborparameter:

 

Gesamt-IgE im Serum

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

spezifisches IgE gegen Milcheiweiß

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Hühnereiweiß

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Soja

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Weize

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Dermatophagoides

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Katze

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Hund

3, 5, 6, 7 Jahre

Birke

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Lieschgras

1, 2, 3, 5, 6, 7 Jahre

Latex

5, 6, 7 Jahre

Abbildung 7: Allergische Symptomatik vom 3. Lebensmonat bis zum 7. Lebensjahr


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Alle erfaßten Daten wurden zu fünf Bewertungskriterien der atopischen Symptomatik zusammengefaßt. Die Einschätzung der klinischen Manifestation der Atopie gelang durch die Kriterien: Atopische Dermatitis, Asthma bronchiale und Rhinokonjunktivitis. Eine Aussage über den serologischen Hintergrund der Atopie lieferten die Laborparameter: Atopische Sensibilisierung bzw. erhöhtes spezifisches IgE und erhöhtes Gesamt-IgE. Das Kriterium „Atopische Sensibilisierung“ lag vor, wenn die Kinder gegenüber mindestens einem der getesteten Allergene sensibilisiert waren (sens größer gleich 0,35 kU/l). Bei der Bewertung der Gesamt-IgE-Spiegel orientierte sich die Studie an den Perzentilen für Gesamt IgE-Werte im Serum von Kindern, abgelesen aus MAS-Studie (42,79c), die in Abbildung 8 dargestellt sind.

Perzentilen

50. Perzentile

75. Perzentile

85. Perzentile

90. Perzentile

95. Perzentile

1. Lebensjahr

5

13

26

40

78

2. Lebensjahr

15

40

75

107

226

3. Lebensjahr

20

58

111

155

261

5. Lebensjahr

34

85

150

212

372

6. Lebensjahr

42

95

170

259

428

Abbildung 8: Bevölkerungsbezogene IgE-Werte in kU/

Die vorliegende Arbeit befaßt sich ausschließlich mit der Untersuchung von Virusinfektionen der Herpesgruppe, der Infektion mit dem Cytomegalievirus (CMV), dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und dem Varizella-Zoster-Virus (VZV). Alle drei Infektionen besitzen eine hohe Prävalenz unter Kindern, hinterlassen eine lebenslange Immunität und führen zur Induktion einer TH1-Immunantwort. Der qualitative und quantitative Nachweis von Virus-spezifischem IgG für CMV, EBV, VZV und IgE für CMV wurde bei 672 Kindern, 351 Jungen (52,2%) und 321 Mädchen (47,8%) im Alter von 1 und 3 Jahren durchgeführt. Diese Altersgruppe war Ziel der Untersuchung, da die ersten Lebensjahre als wichtiger immunologischer Entwicklungszeitraum für die T-Zell-Reifung angesehen werden. Die Bestimmung des CVM-spezifischen IgE erfolgte in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. B. Weber, Laboratoires Reunis Kutter, Lieners-Hastert Junglinster, Luxemburg. Aussagen zum CMV-spezifischen IgE sollten zusätzlich zu den Aussagen über CMV-spezisches IgG eine umfassende Einschätzung des Infektions-Status der Kinder möglich machen, da das CMV-spezifischen IgE gerade für primäre Infektionen ein besserer Marker, als das CMV-spezifische IgM zu sein scheint (54,73,80).


23

Insgesamt standen 362 Seren 1-jähriger Kinder und 457 Seren 3-jähriger Kinder zur Verfügung. Davon waren 147 Antikörper-Bestimmungen im Verlauf, also Doppelbestimmungen von Kindern, die sowohl im Alter von 1 Jahr als auch im Alter von 3 Jahren untersucht worden waren. Die Abbildung 9 gibt einen Überblick über die verschiedenen Gruppen von Informationen und ihre Erhebungszeiträume.

Das Ziel der Studie bestand darin, zu prüfen, ob seropositive Kinder mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren im späteren Leben (7 Jahre) weniger häufig an atopischen Manifestationen erkranken als seronegative Kinder, die virale Infektion also einen protektiven Effekt hinsichtlich der Allergieentstehung besitzt. Um dies beurteilen zu können, wurden die Ergebnisse der Antikörper-Detektion mittels ELISA-Diagnostik mit den Daten der MAS-Studie zur allergischen Symptomatik der untersuchten Kinder verglichen.

Die MAS-Studie lieferte Daten zur atopischen Manifestation der Kinder für den Zeitraum vom 3. Lebensmonat bis zum 7. Lebensjahr. Die Seropostivität der Kinder gegenüber den untersuchten Infektionen wurde mit den atopischen Manifestationen der Kinder sowohl zum Zeitpunkt der Antikörper-Detektion (mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren) als auch mit 7 Jahren vorgenommen. Diese Vorgehensweise berücksichtigte zum einen den Umstand, daß ein möglicher Einfluß von Virusinfektionen auf die atopische Manifestation Zeit benötigt, um seine Wirkung zu entfalten. Zum anderen war bekannt, daß bereits manifeste atopische Symptome bei Virusinfektion eher verstärkt werden können. Es deutet vieles darauf hin, daß der Zeitpunkt der Infektion eine entscheidende Rolle hinsichtlich eines protektiven Effekts auf die Allergieentstehung spielt. Virale Infektionen bei Patienten mit bereits manifester Allergie führen eher zur Verschlechterung der allergischen Symptomatik. Diesen Umstand galt es zu berücksichtigen. Ein möglicher protektiver Effekt viraler Infektionen auf die Entstehung von atopischen Manifestationen sollte in einer erweiterten statistischen Auswertung allein bei Kindern untersucht werden, die zum Zeitpunkt der Antikörper-Bestimmung noch keine atopischen Manifestation aufwiesen, bei Kindern, die mit 1 Jahr bzw. 3 Jahren weder Symptome von atopischer Dermatitis, Asthma bronchiale noch Rhinokonjunktivtis zeigten.


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Studiendesign (erstellt mit Hilfe der MAS-Studie, Prof. U. Wahn, Virchow-Klinikum Berlin)

672 untersuchte Kinder (1-Jährige: 362, 3-Jährige: 457, davon Verläufe: 147)

Untersuchungszeitpunkt: Methoden zur Erfassung atopischer und viraler Parameter

AU2

---

3 Monate

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU3

---

6 Monate

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU4

---

12 Monate

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

----

ELISA

CMV IgG, IgE

EBV IgG

VZV IgG

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU5

---

18 Monate

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU6

---

2 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU7

---

3 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

----

ELISA

CMV IgG, IgE

EBV IgG

VZV IgG

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU8

---

4 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU9

---

5 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU10

---

6 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AU11

---

7 Jahre

----

Fragebogen

Strukt. Interview

Untersuchung

----

Gesamt IgE

spez. IgE

 

 

Abbildung 9: Studiendesign der Untersuchung auf humoraler Ebene


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2.1.2 Methoden

ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik

Die Bestimmungen des Virus-spezifischen IgG für CMV, EBV und VZV erfolgten mit ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik.

Dabei wird eine Trägerplatte mit dem zum gesuchten Antikörper korrespondierenden Antikörper beschichtet. Sind diese Antiörper im Serum vorhanden, binden sie an das Antigen. Ein enzymatisch markierter Sekundärantikörper bindet im nächsten Reaktionsschritt an die gesuchten Antikörper. Durch das Enzym wird in der Farbreaktion Substrat umgewandelt. Anhand eines mitgeführten Standards kann dann, nach Erstellung einer Eichkurve, die Farbreaktion direkt mit der Antikörperreaktion korreliert werden (60b).

Abbildung 10: Der ELISA (enzyme linked immunoabsorbent assay)

Antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay-Technik

Die Bestimmungen des CMV-spezifischen IgE erfolgte mit antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay.

Dabei erfolgt die Beschichtung der Träger mit unmarkiertem Anti-IgE-Antikörper und anschließendem Nachweis des gebundenen IgE mit markiertem Anti-IgE-Antikörper, der gegen ein anderes Epitop gerichtet ist. Im Gegensatz zur klassischen ELISA-(enzyme-linked immunosorbent assay)-Technik, ist dieser Test hochspezifisch, da Antigene, die mit einem Antikörper kreuzreagieren mit großer Wahrscheinlichkeit nicht auch noch an einen zweiten binden (80).


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2.1.3 Material

Cytomegalie-Virus CMV IgG

ETI-CYTOK-G (P2860) DiaSorin:

Methode zur quantitativen/ qualitativen immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Cytomegalovirus IgG-Antikörpern (AD 169 Stamm) im Human-Serum oder -Plasma

Der Cut-Off dieses Tests lag bei 5 AU/ml.

Cytomegalie-Virus CMV IgE

Antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay

Hochspezifische Methode zur immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Cytomegalovirus IgE-Antikörpern im Human-Serum.

Der Cut-Off dieses Tests lag bei 0,4 OD Ag.

Epstein-Barr-Virus EBV IgG

ETI-EBNA-G (P001607) DiaSorin

Methode zur quantitativen/ qualitativen immunenzymatischen Bestimmung von Anti-Kern-Antigen IgG-Antikörpern des Epstein-Barr-Virus (synthetisches Peptid EBNA-1) in Human-Serum oder -Plasma. Bei diesem Test wurde die sich wiederholende Region Gly-Ala ausgeschlossen, da sie bekannte Kreuzreaktionen mit dem Autoantigen verursacht. Das Protein EBNA-1 dient der Replikation des runden Virus-Genoms. Der Cut-Off dieses Tests lag bei vom Hersteller vorgegeben bei 20 AU/ml. Da der Test bei der Antikörper-Detektion im Serum der 1-Jährigen auch für die mütterlichen Antikörper sensitiv war und dadurch eine kindliche Infektion nicht mit Sicherheit diagnostiziert werden konnte, wurde der Cut-Off auf 100 AU/ml erhöht. Dies entsprach dem Wert, bei dem ein seropositives Kind mit 1 Jahr auch noch mit 3 Jahren seropositiv war.

Varizella-Zoster-Virus VZV IgG

VZV-IgG ELISA (DS5600) DiaSorin

DiaSorin Varizella-Zoster Virus IgG ELISA ist für die Detektion und quantitative Bestimmung von IgG-Antikörpern in Humanserum gegen VZV Virus konzipiert und kann Hilfe bei der Diagnose einer Primärinfektion oder einer Reaktivierung mit dem VZV liefern. Der Cut-Off des Tests lag bei 1,10 ISR Wert.


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2.2 T-Zell-Reaktivität nach CMV-spezifischer Stimulation und Atopie

2.2.1 Patientenauswahl und Studiendesign

Der zweiten Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der zellulären Immunabwehr der Infektion mit dem Cytomegalie-Virus, indem die T-Zell-Reaktivität von Kindern nach einer Infektion untersucht wurden. Aus mehreren Berliner Krankenhäusern wurden insgesamt 100 Kinder und Jugendliche im Alter von 1 bis 16 Jahren mit und ohne atopische Krankheitsgeschichte rekrutiert.

Anamnestische Informationen über atopische Erkrankungen, atopische Familienanamnese wurden in Form eines Fragebogen erfaßt. Auch zusätzliche Einflußgrößen der immunologischen Reaktion, wie medikamentöse Therapien mit immunmodulierenden Substanzen (z.B. Kortikoide) oder akute bzw. chronische Infektionen wurden im Fragebogen festgehalten. Als Atopiker galten alle die Kinder und Jugendliche, die bis zum Zeitpunkt der Befragung und/ oder zum Zeitpunkt der Befragung mindestens eine der drei klassischen atopische Erkrankung (atopische Dermatitis, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis) aufwiesen. Die möglichen chronischen Infektionskrankheiten im Kindesalter (z.B. Morbus Chrohn, Colitis ulcerosa) wurden erfaßt, wenn sie bis zum Zeitpunkt der Befragung und/ oder zum Zeitpunkt der Befragung aufgetreten waren. Nach medikamentösen Therapien bzw. akuten Infektionen (z.B. grippaler Infekt) wurde für den Zeitraum der letzten 3 Wochen gefragt. Besondere Berücksichtigung galt der Erfassung von eventuellen immunsupprimierenden medikamentösen Therapie (z.B. Kortison inhalativ), akuten Infektionen (z.B. grippale Infekte) und entzündlichen Begleiterkrankungen (z.B. Morbus Crohn). Die genannten Faktoren stellen potentielle „confounding variables“ dar, die T-Zell-Reaktivitäten zusätzlich beeinflussen können. Um die Abhängigkeit von Atopie und T-Zell-Reaktivität untersuchen zu können, war es daher unvermeidbar, nur Daten der Kinder in die Auswertung einzubeziehen, die keine zusätzlichen Einflußgrößen boten.

Insgesamt nahmen 100 Kinder im Alter von 1 bis 16 Jahren an der Studie teil. Dabei waren 5% der Kinder jünger als 3 Jahre, 4% jünger als 7 Jahre und 91% 7 Jahre und älter. Die Geschlechtsverteilung belief sich auf 42% Mädchen und 58% Jungen. Bei 24% der Kinder und Jugendlichen zeigten sich in der Anamnese atopische Manifestationen, 76% der Kinder und Jugendlichen hatten keinerlei atopische Symptome gezeigt.

Die mit Immulite bestimmte Seropositivität für CMV lag bei 40% der Untersuchten. Von diesen Kindern und Jugendlichen wiesen 11% akute Infektionen und 18% entzündliche Begleiterkrankungen auf. Eine immunsupprimierende Medikation erhielten 14% der Kinder. Die Daten der Kinder mit einer möglichen Einschränkung der immunologischen Reaktion auf Virusbestandteile flossen nicht in die Berechnung statistischer Signifikanzen ein. Alle weiteren Untersuchungen erfolgten mit 62 Kinder und Jugendlichen im Alter von 1 bis 12 Jahren ohne erkennbare „confounding variables“. Von diesen 62 Kindern und Jugendlichen waren 4,8% jünger als 3 Jahre, 1,6% jünger als 7 Jahre und 93,6% 7 Jahre und älter. Die Geschlechtsverteilung belief sich auf 40,3% Mädchen und 59,7% Jungen. Atopische Manifestationen zeigten 21% der Untersuchten, 79% der Kinder und Jugendlichen wiesen keine atopischen Symptome auf.


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Hinsichtlich einer positiven Familienanamnese läßt sich festhalten, 43,3% der Mütter und 9,1% der Väter gaben an, atopische Symptome aufzuweisen. Die mit Immulite bestimmte Seropositivität für CMV lag bei 50%. Ziel des zweiten Teils der Studie war es, die intrazelluläre Zytokinproduktion in CD4 und CD8-T-Zellen nach kurzzeitiger ex-vivo Stimulation mit viralem Lysat-Antigen und Peptidgemischen (pp65 und IE1) des CMV bei Kindern mit und ohne atopische Symptome mittels Durchflußzytometrie/ FacsCalibur, Becton Dickinson zu vergleichen. Im Gegensatz zum ersten Teil der Arbeit vergleicht der zweite Teil Infektionsstatus und atopische Manifestation der Kinder zum gleichen Zeitpunkt. Es konnten durch die Analyse der Effektorzellen sowohl Aussagen über einen aktuellen, als auch einen länger zurückliegenden Viruskontakt getroffen werden. Die Immunantwort wurde nach Stimulation mit CMV-Antigen und CMV-Peptidgemischen (pp65, IE1) durch Detektion intrazellulärer Zytokine untersucht. Dabei wurden IFN-gamma-produzierenden CD4- (Antigen) und CD8- (Peptid) T-Zellen quantifiziert. Es galt zu prüfen, ob die T-Zellen von Kinder ohne atopische Symptome eher mit einer Produktion von IFN-gamma auf die Stimulation reagieren würden als T-Zellen von Kinder mit atopischen Symptomen. Dies würde darauf hinweisen, daß die Kinder ohne atopische Symptome eher fähig sind, mit einer Typ1-Immunantwort zu reagieren als Kinder mit atopischen Symptomen. Die Reaktivität wurde anhand der IFN-gamma-Produktion nach Stimulation bewertet. Dabei war sowohl die prozentuale Produktionsmenge als auch die visuelle Abgrenzbarkeit einer IFN-gamma-produzierenden Zellpopulation im Durchflußzytometer von Bedeutung. Die Auswertung der Reaktivität auf Antigen (CD4) und Peptid (CD8) erfolgte getrennt als „Reaktivität CD4“ sowie verbunden als „absolute Reaktivität“. Dabei galt diejenige Probe als „absolut reaktiv“, die entweder auf CMV-Antigen (CD4) und/ oder auf eines der CMV-Peptidgemische (CD8) mit einer IFN-gamma-Produktion reagiert hatte. Um eine schärfere Trennung von „stark reaktiven“ und „nicht reaktiven“ bzw. „wenig reaktiven“ Kindern und somit eventuell deutliche Tendenzen bei der statistischen Analyse zu erhalten, wurden aus der Gruppe der „reaktiven Kinder“ die „stark reaktiven Kinder“ („Highresponder“) ermittelt und mit der Gruppe der „nicht reaktiven“ bzw. „wenig reaktiven“ Kinder verglichen. Dabei galten Kinder mit IFN-gamma-produzierenden Zellpopulationen größer gleich 0,30% als „Highresponder“.Neben zellulären Immunantworten beschäftigt sich der zweite Teil der Studie mit humoralen Parametern der Cytomegalie-Virus-Infektion. Mit Hilfe eines Chemilumescent enzyme immunoassays wurde qualitativ das CMV-spezifische IgG bestimmt. So war es möglich, die zelluläre und humorale Immunantwort der Kinder und Jugendlichen zu vergleichen. Als Nebeneffekt lieferte die Studie Aussagen über die Seroprävalenz der untersuchten Infektionen, sowie eine Aussage über T-Zell-Reaktivitäten unter deutschen Kindern und Jugendlichen.


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Chemilumescent enzyme immunoassay CMV IgG

2.2.2 Methoden

Mit dem Chemilumescent Enzyme Immunoassay CMV IgG konnten qualitativ Anti-CMV-IgG im Serum der Kinder bestimmt werden. Zur Anwendung kam der Immulite Automatic Analyzer von DPC. Dabei lag das Mischverhältnis bei 400 µl Solution und 20 µl Plasma. Die Standards waren definiert durch:

Diluent

negativ

Negativ

negativ

5 AU

negativ

10 AU

negativ

50 AU

negativ

100 AU

negativ

Durchflußzytometrie

Methode

Nach Stimulation von T-Zellen wurden IFN-gamma produzierende Zellen mit Antikörpern angefärbt und mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersucht. Die Durchflußzytometrie ist ein optisches Meßverfahren, das Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert. Zur durchflußzytometrischen Untersuchung sind Zellen jeder Herkunft geeignet, sofern sie als Suspension von Einzelzellen vorliegen. Die Zellen werden „im Gänsemarsch“ zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie von einem fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden, Abbildung 11. Als Lichtquelle dienen luftgekühlte Argonlaser mit einer 488-nm-Emissionslinie. Das optische Detektionssystem und die Elektronik quantifizieren die Fluoreszenz- und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle. Unter Fluoreszenz wird die rasch abklingende Lichtemission von Molekülen nach Absorption energiereicher Strahlung verstanden. Fluoreszensignale entstehen durch die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen, welche mittels fluorochromkonjugierter Antikörper auf die Zellen aufgebracht oder in die Zellen eingebracht (intrazelluläre Färbung) werden. Daneben besteht die Möglichkeit, die Zellmembran direkt anzufärben. Bei der Mehrfarbenfluoreszenzanalyse werden Floureszenzfarbstoffe gewählt (z.B. PerCP-Peridin-Chlorophyll-a Proteinkomplexe, PE-Phycoerythrine, APC-Allophycocyanin, FITC- Flouresceinisothyocianat), die sich zwar in der Fluoreszenzfarbe unterscheiden, deren Fluoreszenzfarbe jedoch mit derselben Wellenlänge anregbar ist. Trifft ein Lichtstrahl auf eine Zelle, streut sie aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften, wie Größe, Form, Oberfläche und Granularität, Licht mit unterschiedlicher Qualität und Quantität. Die Lichtstreuung ist am größten im


30

Kleinwinkelbereich (0-10°) des einfallenden Lichtstrahls (Vorwärtssteulicht, Forward Angle Light Scatter FSC), ein geringerer Teil des Lichts streut seitwärts (90°) dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter SSC). Dabei gibt die Intensität des FSC einen Anhalt für die Zellgröße, das SSC einen Anhalt für die Granularität. Mittels beider Lichtstreuparameter lassen sich die wichtigsten Leukozytengruppen unterscheiden.

Die Darstellung der Meßergebnisse erfolgte in einem Zweiparameter-Punkthistogramm (dot plot). Die korrelierte Zweiparameterdarstellung zeigt die Relation zwei verschiedener Eigenschaften einer Zelle zueinander an. Als Beispiele seien angeführt die Korrelation von FSC mit SSC, Abbildung 12b. Der Schnittpunkt zweier Meßwerte einer Zelle ist das Ergebnis der Korrelation, Abbildung 12a.

Bei der Datenauswertung der Immunfluoreszenzmessungen werden die in den Parametrekombinationen vermuteten Lymphozyten eingegrenzt. Der englischsprache Fachausdruch für dieses Fenster wird „gate“ genannt. Bei der weiteren Analyse finden nur solche Ergebnisse Berücksichtigung, die innerhalb dieses eingegrenzten Bereiches liegen.

Ein Nachteil dieser Darstellungsweise ist die schwierige visuelle Abschätzung der Quantität der Populationen in den einzelnen Punktwolken. Zur Vermittlung einer visuellen Dimension stehen daher zusätzliche numerische Daten, wie Anzahl der Ereignisse in verschiedenen Auswertefenstern und deren prozentuale Aufteilung (relative Prozentanteile), Mittelwert, Median und Modus der Signalintensität zur Verfügung (66).


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Abbildung 11: a) 1=Laser, 2=Strahlenerweiterung, 3=Fokusierlinse, 4=Meßkammer, 5=Sammellinse, 6=Teilerspiegel, 7=Lichtfilter, 8=Photomultiplier, 9=Photodiode, 10=Vorverstärker, 11=Impulsanalysatoren, 12=Analog-Digital-Konverter, 13=Datenverarbeitung b) Detailansicht der Meßkammer 1=Laserstrahl, 2=Meßküvette, 3=Trägerflüssigkeit, 4=Zellsuspension, 5=hydrodynamische Fokussierung

Abbildung 12: a) Theoretisches und b) Praktisches Lichtstreuungsdiagramm (66)


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Stimulation

Zunächst wurden 100 µl Vollblut (Lithiumheparinat) mit jeweils 2 µl CMV- Antigen ABI (Verdünnung 1:20 mit PBS, Endkonzentration 5 µg/µl), 10 µl CMV-Peptidgemisch pp56 A, 500 µg/ml DMSO (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 5 µg/µl und 10 µl CMV-Peptidgemisch IE1, 500 µg/ml DMSO (Verdünnung 1:10 mit PBS Stock, Endkonzentration 5 µg/µl) versetzt. Um die generelle Sekretionsfähigkeit für Zytokine zu testen, wurde ein Gemisch aus 2 µl PMA (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 2,5 µl/ml) und 2,5 µl Ionomycin (Verdünnung 1:1000 mit PBS, Endkonzentration 2 µl/ml) eingesetzt. Nach 1-stündiger Stimulation im Brutschrank bei 20°C erfolgte die Zugabe von 2 µl Brefeldin A (Verdünnung 1:10 mit PBS, Endkonzentration 10 µg/ml). Nach 16-stündiger Stimulation im Brutschrank bei 20°C erfolgte die Lyse mit 1 ml Lysereagenz (Verdünnung 1:10 mit Aqua dest). Anschließend wurde 10 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Nach Zugabe von jeweils 1 ml Permeabilisierungslösung wurde wiederum 10 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Zusätzlich wurden Negativkontrollen und Isotypkontrollen durchgeführt.

Färbung

Im Anschluß erfolgte die Färbung der Zellen. Die mit CMV-Antigen stimulierten Zellen sowie die unstimulierten Negativkontollen wurden mit 35 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD4, CD69 und CD3 gefärbt. Die mit CMV-Peptidgemischen pp65 bzw. IE1 stimulierten Zellen sowie die Positivkontrollen wurden mit 35 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD8, CD69 und CD3 gefärbt. Die unstimulierten Isotypkontrollen wurden sowohl mit 28 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD4, CD69 und CD3 als auch mit 28 µl einer Antikörpermischung von IFN-gamma, CD8, CD69 und CD3 gefärbt. Die Antikörpermischungen setzten sich im einzelnen wie folgt zusammen. Das Gemisch für die Färbung der stimulierten Zelle und der Negativkontrollen bestand in Färbung 1 CD69 FITC 10 µl, Färbung 2 CD3 PE 10 µl, Färbung 3 CD4 bzw. CD8 PercP 10 µl und Färbung 4 IFN-gamma APC 5 µl. Das Gemisch für die Färbung der Isotypkontrollen bestand in Färbung 1 IgG1 FITC 5 µl, Färbung 2 CD3 PE 10 µl, Färbung 3 CD4 bzw. CD8 PercP 10 µl und Färbung 4 IgG2a APC 3 µl. Anschließend wurde 30 Minuten dunkel auf Eis gelagert, mit 3 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 8 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrifugiert, dekantiert und gevortext. Bei großen vorhersehbaren Zeitverlusten zwischen Färbung und Messung der Zellen wurde mit 200 µl PFA 1% refixiert.


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Messung

Die Messung der Proben erfolgte mit Hilfe des Durchflußzytometers FacsCalibur von Becton Dickinson.

Überschüssige Zellsuspension wurde nach Präparation für weitere Versuche vor der Stimulation bei -70°C eingefroren.

1 ml Vollblut/ Lithiumheparinat wurde mit 10ml Lysereagenz (Verdünnung 1:10 mit Aqua dest. lysiert, gevortext und 12 Minuten dunkel bei Raumtemperatur gelagert. Anschließend wurde mit jeweils 30 ml Natrium Acid Puffer gewaschen, 10 Minuten bei 1500 Umdrehungen, 4°C, a 9, r 172 zentrigugiert, dekantiert und gevortext und erneut zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und das gewonnene Pellet bei -70°C eingefroren.

Die Abbildungen 13 bis 22 zeigen beispielhaft, welche Daten über die IFN-gamma-Produktion der stimulierten CD4- bzw CD8-T-Zellen gewonnen wurden. Eine visuelle Abschätzung der Quantität IFN-gamma-produzierender Zellen ist als Punktwolke im oberen rechten Quadranten („UR Gated“) des Diagramms möglich. Zur Vermittlung einer visuellen Dimension stehen zusätzliche numerische Daten, wie Anzahl der Ereignisse in verschiedenen Auswertefenstern („Gated events“) und deren prozentuale Aufteilung (% Gated“) zur Verfügung. Während in den Abbildungen 13 bis 15 die Daten eines CMV-seronegativen Kindes ohne IFN-gamma-Produktion dargestellt sind, zeigen die Abbildungen 16 bis 18 die Daten eine CMV-seropositiven Kindes mit entsprechender IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit viralem Antigen bzw. Peptidgemisch.

Während die Abbildungen 13 und 16 jeweils die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Antigen widerspiegeln, zeigen die Abbildungen 14 bzw. 17 die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65 und die Abbildungen 15 bzw. 18 die IFN-gamma-Produktion nach Stimulation mit CMV-Peptidgemisch IE1.

Ein Beispiel für unstimulierte Zellen als Negativkontrolle zeigt die Abbildung 19. In Abbildung 20 findet sich ein Beispiel für die Positivkontrollen mit PMA. Beispiele der Isotypkontrollen für CD4- und CD8- positive Zellen sind in den Abbildungen 21 (CD4) bzw. 22 (CD8) dargestellt.


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Stimulation mit CMV-Antigen bzw. Peptidgemisch ohne IFN-gamma-Produktion

Abbildungen 13 bis 15

Abbildung 13: Stimulation mit CMV-Antigen, nichtreaktiv

Abbildung 14: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65, nichtreaktiv

Abbildung 15: Stimulation mit CMV- Peptidgemisch IE1, nichtreaktiv


35

Stimulation mit CMV- Antigen bzw. Peptidgemisch mit IFN-gamma-Produktion

Abbildungen 16 bis 18

Abbildung 16: Stimulation mit CMV-Antigen, reaktiv

Abbildung 17: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch pp65, reaktiv

Abbildung 18: Stimulation mit CMV-Peptidgemisch IE1, reaktiv


36

Beispiele für unstimulierte Zellen, Positivkontrolle mit PMA und Isotypkontrollen CD4/ CD8

Abbildungen 19 bis 22

Abbildung 19: unstimulierte Zellen

Abbildung 20: Stimulation mit PMA als Positivkontrolle


37

Abbildung 21: Isotypkontrolle CD4

Abbildung 22: Isotypkontrolle CD8


38

2.2.3 Material

Geräte

Hersteller

1.

Immulite Automated Analyzer I3209

DPC Biermann, BadNauheim, BRD

2.

FacsCalibur

BectonDickinson, San Jose, USA

Zentrifugen

3.

CR422

Jouan, Saint Mazaire, Frankreich

4.

Centrifuge5415C

Eppendorf, Hamburg, BRD

Brutschrank

5.

Heraeus instruments/BB6220CU, 51007641

KendroLaboratoryProducts, Hanau, BRD

6.

Pipetten

Eppendorf, Hamburg, BRD

7.

Pipettenspitzen

Sarstedt, Nümbrecht, BRD

8.

Polystyrene Round Bottom Tube 5 ml Falcon352052

BectonDickinson, Franklin Lakes, USA

9.

Polystyrene Conical Tube BlueMax 50 ml Falcon352070

BectonDickinson, Franklin Lakes, USA

10.

Reaktiongefäße,MicroTestTubes Safe-lock 0,5 ml 0030121.023

Eppendorf, Hamburg, BRD

11.

Reaktiongefäße,MicroTestTubes Safe-lock 1,5 ml 0030120.086

Eppendorf, Hamburg, BRD

Reagenzien

Chemilumescent enzyme immunoassay CMV IgG, Immunlite

12.

CMVAReagentWedge FlaconRéactif, LCVA0007

DPC, Los Angeles, USA

13.

CMVBReagentEdge FlaconRéactif, LCVB0007

DPC, Los Angeles, USA

14.

CMVIgGTestUnits, LCV10006

DPC, Los Angeles, USA

15.

IgG/IgMSampleDiluent, LIGZ20004

DPC, Los Angeles, USA


39

Durchflußzytometrie

Stimulation

16.

CMV spezifisches Antigen ABI Human Cytomegalovirus HCMV AD 169, 10-144-000

TEBU Frankfurt am Main, BRD

17.

pp65 Peptidgemisch A, P06725

NMI Reutlingen, BRD

18.

IE1 Peptidgemisch,50mg/ml Major immediate early protein, P13202(72DU)

NMI Reutlingen, BRD

19.

Ionomycin CalciumSalt 1mg in 2ml Ethanol gelöst, I0634

Sigma, St. Louis, USA

20.

Phorbol12-Myristate13-Acetate/PMA 5mg in 1ml DMSO gelöst, P8139

Sigma, St. Louis, USA

21.

Brefeldin A 1mg gelöst in 1ml DMSO, B7651

Sigma, St. Louis, USA

22.

Lysereagenz FacsLysingSolution100ml, 349202

BectonDickinson, San Jose, USA

 

Permeabilisierungslösung, NatriumAcid-Puffer in PBS

 

23.

Albumin, Bovine 50 mg, A6003

BectonDickinson, San Jose, USA

24.

NatriumAcid reinst 50 mg, 30175

Serva, Heidelberg, BRD

25.

Paraformaldehyd reinst DAC,BPC,USP/PFA Verdünnt mit PBS auf 1%, 104005

Merck, Darmstadt, BRD

 

Verdünnungsmedien

 

26.

DimethylsulfoxideSilylatationGrade/DMSO 50 ml, 20684

Pierce, Rockford, Illinois, USA

27.

Ethanol 96% reinst,DAB, 100971

Merck, Darmstadt, BRD

28.

EcotrainerAquaB.Braun,1000ml, 9184P12C

Braun, Melsungen, BRD

29.

PBS 500ml, 14190094

Gibocobrl lifetechnologies Paiseley, Scotland


40

Färbung

30.

CD69(Leu-23)FITC 100Tests, 20 µl/Test, 347823

BectonDickinson, San Jose, USA

31.

CD3PE 100Tests2ml, 20µl/Test, PN IM1282

Immunotech, Marseille, Frankreich

32.

CD4(Leu-3a)PerCP 100Tests, 20 µ/Test, 347324

BectonDickinson, San Jose, USA

33.

CD8(Leu-2a)PerCP 100Tests, 20 µl/Test, 347314

BectonDickinson, San Jose, USA

34.

IFNgammaAPC 100Tests, 10 µl/Test, 10805

ImmuneSource, St. Katharinen, BRD

35.

MouseIgG1FITC 100Tests, 349041

BectonDickinson, San Jose, USA

36.

MouseIgG2aAPC 1ml, 0,1 mg/ml, 340473

BectonDickinson, San Jose, USA


41

2.3 Statistische Signifkanz

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS Version 8.0. Neben den Häufigkeitsverteilungen berechneten wir die signifikanten Unterschiede in den Untersuchungsgruppen mittels Chi-Quadrat-Test und Yates-Korrektur.


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Fri Mar 16 20:12:51 2001