Aus der Poliklinik für Innere Medizin
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Adhäsionsmoleküle auf zirkulierenden humanen Monozyten bei essentieller
Hypertonie

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl. Ing. Susan Katrin Lau

aus Rostock

Dekane: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. S. Schreiber
2. Prof. Dr. R. Ewert
3. PD Dr. med. Y. Dörffel

Datum der Promotion: 22.11.2004

Zusammenfassung

HINTERGRUND: Das Ziel dieser Studie bestand darin, die mögliche Rolle von zirkulierenden humanen Monozyten in der Pathologie der essentiellen Hypertonie zu untersuchen. Wir verglichen die Expressionsmuster unterschiedlicher Adhäsionsmoleküle auf isolierten Monozyten des peripheren Blutes von Normalkontrollen und Hypertonikern. Wir bestimmten die Veränderungen durch Stimulation mit Lipopolysaccharide (LPS), Angiotensin II (AT) und agonistische Angiotensin Rezeptor Typ I-Autoantikörper (AT1-AK) sowie den Einfuß des AT1­Rezeptor-Antagonist Losartan und des auch an MAC-1 bindenden Glykoprotein IIb/IIIa Rezeptor-Antikörper Abciximab. METHODIK: Blutproben von 18 Patienten mit essentieller Hypertonie und 20 gesunden Normalkontrollen wurden verglichen. Die Monozyten wurden mittels Dynabead-Negativ-Isolierung gewonnen. Die Adhäsionsmolekül-Expression wurden nach Färbung mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen CD11a, CD11b, CD29, CD31, CD44, CD49d, CD54 und CD62L mittels FACS Messung bestimmt. ERGEBNISSE: Auf Monozyten hypertensiver Patienten ist die Expression von CD11a, CD11b und CD54 signifikant erhöht. Mit Inkubation erhöht sich die Expression von CD54 und CD44, während CD11b, CD31 und CD49d erniedrigt werden und CD11a konstant bleibt. LPS-Stimulation führt zu einer signifikanten Erhöhung der CD11b und CD54 Expression. Ausdruck der Aktivierung durch AT­Stimulation ist eine erhöhte CD11b Expression. AT1-AK erhöhen die Expression von CD11b, CD54 und CD49d signifikant. Losartan verringert nur tendenziell und teilweise die AT und AT1-AK bedingten Expressionsveränderungen. Der LPS bedingte Anstieg der CD11b Expression auf Monozyten wird durch Abciximab vermindert. SCHLUSSFOLGERUNG: Wir demonstrieren die Bedeutung von voraktivierten Monozyten bei Hypertonie in der Pathogenese der Arteriosklerose.

Eigene Schlagworte: Monozyten, Hypertonie, Adhäsionsmoleküle, Autoantikörper

Abstract

Monocyte expression of adhesion molecules in patients with essential hypertension

BACKGROUND: The purpose of this study was to investigate the possible involvement of human peripheral blood monocytes in the pathology of hypertensive disease. We determined the in vitro expression patterns of adhesion molecules on isolated peripheral blood monocytes from normal controls and from hypertensive patients. We investigated and compared the ability of lipopolysaccharide (LPS), angiotensin II (Ang II) and Agonistic AT1 receptor autoantibodies (AT1-AA) to stimulate monocytes and the influence of preincubation with an Ang II type 1 receptor antagonist (losartan) or Glykoprotein IIb/IIIa rezeptor-antibody Abciximab. METHODS: Blood samples were obtained from 18 patients with essential hypertension and from 20 normotensive healthy individuals used as a control group. Peripheral blood monocytes were isolated by negative Dyna Bead Isolation. Adhesion molecules were measured using immunofluorescence of monocytes labelled with antibody against CD11a and b, CD29, CD31, CD44, CD49d, CD54 and CD62L by flow cytometry. RESULTS: The expression of CD11a, CD11b and CD54 was significantly higher in hypertensive patients versus healthy individuals directly after isolation. With incubation the expression of CD44 and CD54 was increased and the expression of CD 11b, CD31 and CD49d was decreased, whereas CD11a shows a constant expression. Monocytes showed increased expression of CD11b and CD54 after LPS stimulation. CD11b expression was significantly increased after stimulation with Ang II, stimulation with AT1-AA an increased expression of CD11b, CD54 and CD49. Losartan was partially but not significantly effective in blocking the effects of Ang II or AT1-AA stimulation. Abciximab was reducing the LPS induced CD11b Epression. CONCLUSIONS: These data indicate that preactivated monocytes from hypertensives may be of pathogenic importance in atherosclerosis.

Keywords: Monocytes, hypertension, adhesion molekules, autoantibody

Die Arbeit ist meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Die essentielle Hypertonie
  • 1.2. Die Immunpathologie der essentiellen Hypertonie
  • 1.3. Das Renin- Angiotensin- System in der Pathologie der Hypertonie
  • 1.4. Periphere Monozyten
    • 1.4.1. Aktivierung peripherer Monozyten
  • 1.5.  Adhäsionsmoleküle auf Monozyten
    • 1.5.1. Familien von Adhäsionsmolekülen
    • 1.5.2.  Adhäsionskaskade der Monozyten
    • 1.5.3. Pathologische Expression
  • 1.6.  Hypertonie und Arteriosklerose
    • 1.6.1. Definition und Bedeutung von Arteriosklerose
    • 1.6.2. Entwicklung arteriosklerotischer Läsionen
    • 1.6.3. Ätiologie der Arteriosklerose
  • 1.7.  Mögliche neue therapeutische Ansätze
    • 1.7.1. Beeinflussung des RAS durch AT-1-Rezeptor Antagonisten
    • 1.7.2.  Der Glykoprotein IIb/IIIa-Rezeptor Antikörper Abciximab
• 2.  Aufgabenstellung
• 3.  Methoden
  • 3.1. Chemikalien
  • 3.2. Einschlußkriterien der Studie
  • 3.3.  Methoden der Monozytenisolierung
    • 3.3.1. Dichte-Gradienten-Zentrifugation
    • 3.3.2. Negativ-Isolierung mittels Dynabeads
    • 3.3.3. Isolierung mittels Adhäsion an Plastik
    • 3.3.4. Monozyten im Vollblut nach Erythrolyse
  • 3.4.  Monozyten-Stimulation
  • 3.5.  Bestimmung der Expression von Oberflächenmolekülen mittels FACS
    • 3.5.1. Meßprinzip
    • 3.5.2. Direkte und indirekte Membranimmunfluoreszenz
    • 3.5.3. Messung der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten
  • 3.6.  Vitalitätsbestimmung
    • 3.6.1. Ausschlußfärbung mit Trypanblau
    • 3.6.2. Durchflußzytometrische Bestimmung der Vitalität
  • 3.7.  Methode der mikroskopischen Immunfluoreszenz
  • 3.8.  Datenanalyse
• 4. Ergebnisse
  • 4.1. Methodenevaluation
    • 4.1.1. Reinheit und Vitalität der Monozyten nach Isolierung
    • 4.1.2.  Monozyten im Vollblut
    • 4.1.3. Monozyten nach Dichtegradientenzentrifugation
    • 4.1.4.  Einflußfaktoren auf die FACS Messung
  • 4.2.  Adhäsionsmoleküle auf Monozyten bei Hypertonie
    • 4.2.1. CD54
    • 4.2.2.  CD11b
    • 4.2.3. CD11a
    • 4.2.4.  CD29
    • 4.2.5. CD31
    • 4.2.6.  CD44
    • 4.2.7. CD49d
    • 4.2.8.  CD62L
    • 4.2.9. 9eg7
  • 4.3.  Einfluß von Stimulation auf die Expression von Monozytenadhäsionsmolekülen
    • 4.3.1. Veränderungen durch Inkubation
    • 4.3.2.  Stimulation mit LPS
      • 4.3.2.1. Adhäsionsmolekühl-Veränderungen durch LPS
      • 4.3.2.2.  Einfluß von Abciximab auf LPS stimulierte Monozyten
    • 4.3.3.  Stimulation mit Angiotensin II und AT1-AK
      • 4.3.3.1. Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch Angiotensin II
      • 4.3.3.2. Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch AT1-Rezeptor Antikörper
      • 4.3.3.3.  Einfluß von Losartan auf AT bzw. AT1-AK stimulierte Monozyten
    • 4.3.4.  Unterschiede der Stimulation bei Hypertonie versus Normalkontrollen
• 5. Diskussion
  • 5.1. Effekte von Monozytenisolierung und Inkubation auf die Adhäsionsmoleküle
  • 5.2. Analyse möglicher Einflußfaktoren
  • 5.3. Veränderte Adhäsionsmoleküle bei Hypertonie
  • 5.4. Einfluß von Aktivatoren auf die Expression von Monozytenadhäsionsmolekülen
    • 5.4.1. LPS
    • 5.4.2. Angiotensin II
    • 5.4.3. Autoantikörper gegen den AT1-Rezeptor
  • 5.5. Bedeutung von Tissue Faktor in der Angiotensin-induzierten Adhäsion
  • 5.6. Wirkung von Abciximab auf MAC-1 isolierter Monozyten
• 6.  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Versicherung

Tabellen

• Tab. 1: Klassifikation des Blutdrucks für Erwachsene nach JNC-VI (Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure, 1997)
• Tab. 2: Integrine, zusammengehörige α und β Einheit, von Monozyten exprimiert bei M=Ja
• Tab. 3: Selektine und Immunglobuline zur Adhäsion auf Monozyten
• Tab. 4: Klinische Parameter von Hypertonie- und Normalkontroll-Kollektiv zum Zeitpunkt der Blutentnahme
• Tab. 5: Laborwerte und Normbereiche der Hypertonie-Patienten
• Tab. 6: Aufstellung der zum Vergleich Normalkontrollen-Hypertonie gewerteten Versuche mit Angabe von Versuchsnummern, Geschlecht (m/f), Alter, systolischem Blutdruck (RRsys), diastolischem Blutdruck (RRdia) bei Probenentnahme
• Tab. 7: Expression der Adhäsionsmoleküle nach Erythrolyse, Ficollzentrifugation und Bead- Isolierung (angegeben als MFI) für Versuch 28, 29 und 30
• Tab. 8: Rang (U-Test) und Mittelwerte der CD54 Expression bei Hypertonie im Vergleich  zur Kontrolle (NK) (angegeben als MFI=Mittlere Fluoreszenz Intensität)
• Tab. 9: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (angegeben als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation für 7h (T1) verglichen.
• Tab. 10: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (in MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation für 7h (T1) verglichen.
• Tab. 11: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD31 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation (T1) verglichen.
• Tab. 12: T-Test für CD44 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD44 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation (T1) verglichen.
• Tab. 13: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach Stimulation mit LPS verglichen.
• Tab. 14: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.
• Tab. 15: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD31 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.
• Tab. 16: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT verglichen.
• Tab. 17: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK verglichen.
• Tab. 18: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (angegeben als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK und AT1-AK in doppelter Konzentration (1:50) verglichen.
• Tab. 19: T-Test für CD49d bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD49d (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK verglichen
• Tab. 20: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Stimulation mit AT bzw. AT1-AK mit der Expression nach Stimulation mit Losartan und AT ( AT+L) bzw. AT1-AK verglichen ( Versuche ohne ISO -AK, deshalb MW erhöht).
• Tab. 21: Änderung der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten durch Hypertonie, Inkubation, Stimulantion mit AT, AT1-AK, LPS:

Bilder

• Abbildung 1: Monozyt im Blutausstrich
• Abbildung 2: Adhäsionskaskade (nach BD Katalog)
• Abbildung 3: Dichte Gradienten-Zentrifugation zur Isolierung mononukleärer Zellen (MNZ)
• Abbildung 4: Von Dyna-Beads isolierte T Lymphozyten (aus Dynal Produktinformation)
• Abbildung 5: Negativisolierung von Monozyten
• Abbildung 6: Aufbau eines dualen Durchflußzytometers mit sechs Detektionsparametern (aus Pharmingen Technical Protocols, S.887)
• Abbildung 7: Färbung mit direkt fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur FACS Auswertung
• Abbildung 8: Monozytendifferenzierung im Dot-Plot FSC-SSC-Bild durch Wahl von R1
• Abbildung 9: Monozytendifferenzierung im CD14-APC-Histogramm durch Wahl von R2
• Abbildung 10: Abgrenzung unspezifisch gefärbter PE-Isotyp-Kontrollen durch Wahl von M1
• Abbildung 11: CD11b-PE Expression auf Monozyten (in G3=R1 und R2 und M1) im Histogramm, Auswertung des Mittelwertes ( in MFI)
• Abbildung 12: Isolierte Monozyten im Phasenkontrast-Mikroskop
• Abbildung 13: CD11a –FITC gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop
• Abbildung 14:PI gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop, Darstellung der Kerne
• Abbildung 15: Zellen nach Erythrolyse im FACS als Dot-Plot
• Abbildung 16: Zellen nach Ficoll-Zentrifugation a) Dot-Plot und b) zugehöriges FACS Histogramm der CD19 positiven B- Lymphozyten sowie c) der CD3 positiven T Lymphozytenpopulation in R1
• Abbildung 18: CD54–PE Expression im FACS-Histogramm (in MFI)
• Abbildung 19: Häufigkeitsverteilung der CD54-Expression in MFI bei NK und Hypertonie
• Abbildung 20: Korrelation von CD54 Expression (in MFI) und diastolischem Blutdruck
• Abbildung 21: CD11b Expression (angegeben als MFI) im FACS-Histogramm
• Abbildung 22: Häufigkeitsverteilung der CD11b Expression(angegeben als MFI)  bei Kontrollen (MW=417) und Hypertonikern (MW=275)
• Abbildung 23: Korrelation von CD11b-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck
• Abbildung 24: Häufigkeitsverteilung der Expressionshöhe von CD11a für NK und Hypertonie
• Abbildung 25: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck
• Abbildung 26: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und Alter
• Abbildung 27: Expression von CD29 (als MFI) auf Monozyten im FACS Histogramm
• Abbildung 28: Häufigkeitsverteilung der CD29-Expression (als MFI) bei Hypertonie und NK
• Abbildung 29: FACS Histogramm CD31(als MFI)
• Abbildung 30: CD44-Expression im FACS Histogramm
• Abbildung 31: FACS Histogramm CD49-PE
• Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der CD49d-Expression in MFI bei Hypertonie und NK
• Abbildung 33: FACS Histogramm CD62L
• Abbildung 34: Wirkung von Abciximab (Reo) auf LPS stimulierte CD11b Expression (angegeben als MFI) in den Versuchen 60, 62, 63. Expression nach 7h Inkubation, nach LPS Stimulation (100ng/ml) und nach Inkubation mit ReoPro und LPS.
• Abbildung 35: Abciximab erhöht die unstimulierte CD11b Expression (angegeben als MFI) in den Versuchen 60, 62, 63. Vergleich der Expression nach 7h Inkubation mit und ohne Abciximab (Reo).
• Abbildung 36: Veränderte CD54 Expression nach Inkubation. MW der CD54-Fluoreszenz (angegeben als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung (T0) bzw. Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und Normalkontrollen
• Abbildung 37: Veränderte CD11b -Expression nach Inkubation. MW der CD11b-Fluoreszenz (als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung (T0) bzw. Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und Normalkontrollen
• Abbildung 38: Häufigkeitsverteilung der CD11b-Expressionshöhe (angegeben als MFI) bei AT1- AK Stimulation, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und NK. Die unteren Diagramme stellen die Verteilung bei unstimulierten, inkubierten Monozyten (T1) dar, jeweils darüber die CD11b- Expression nach AT1-AK Stimulation.