Methoden

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Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien waren Endotoxin frei. Endotoxin freies Fetales Kälber Serum (FCS) wurde von Biochrom KG/Seromed (Berlin) bereitgestellt. Die zur Monozytenisolierung verwendeten Dynabeads erhielten wir von Dynal, Fluoreszenz-konjugierte monoklonale antihumane Maus-Antikörper lieferte Pharmingen (Beckton Dickinson), Abciximab (ReoPro) Lilly. Der AT1-Rezeptor Antagonist Losartan ist von Merk, den AT1-Autoantikörper stellte freundlicherweise Prof. Dr. G. Wallukat von der Franz Volhard Klinik des Max Delbrück Zentrums für Molekularmedizin in Berlin zur Verfügung. Angiotensin II und LPS sowie alle nicht anderweitig gekennzeichneten Chemikalien lieferte Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA).

Einschlußkriterien der Studie

Gemessen wurden die Adhäsionsmoleküle von 29 Patienten (17 Männern und 12 Frauen) mit essentieller Hypertonie. Alle Patienten wurden in der Hypertonie Sprechstunde der medizinischen Poliklinik der Charité bzw. im St. Hedwigs Krankenhaus Berlin betreut. Die Studie wurde von der lokalen Ethikkommission (Ethikkommission der Charité, EK-Votum vom 22.09.1999) zugelassen. Die Entnahme von Proben bei Routineblutentnahmen erfolgte freiwillig und nach Aufklärung.

Die Hypertonie-Gruppe setzt sich aus Patienten mit essentieller Hypertonie vor jeder medikamentösen Behandlung oder nach Unterbrechung der Behandlung für mindestens 72 h zusammen. Die Hypertonie wurde mittels kontinuierlicher 24 h Blutdruckmessung gesichert. Nur Patienten mit einem diastolischem Blutdruck zwischen 95 und 120 mmHg (mittlerer diastolischer Blutdruck 100 mmHg) und einem systolischem Blutdruck größer als 139 mmHg wurden in die Studie aufgenommen (Tab. 4).

Hypertoniker

Mittelwert (min-max)

Normalkontrollen

Mittelwert (min-max)

Alter in Jahren

55 (41-72)

45 (32-68)

Systolischer Blutdruck / mmHg

161(140-200)

124 (107-140)

Diastolischer Blutdruck / mmHg

100 (95-120)

77 (60-90)

Body Mass Index / kg/m2

24,1 (21,3-25,4)

23,9 (21,4-25,3)

Tab. 4: Klinische Parameter von Hypertonie- und Normalkontroll-Kollektiv zum Zeitpunkt der
Blutentnahme

Ausschlußkriterien waren alle infektiösen oder autoimmunen Krankheiten sowie die sekundäre Hypertonie. Patienten mit einer Vorgeschichte von Diabetes, Nikotinabusus, Schlaganfall, pAVK bzw. Angina pectoris wurden nicht in die Studie einbezogen. Bei abnormen Laborwerten für Hämatokrit, Leukozyten, Thrombozyten, Elektrolyte, C-reaktives Protein (CRP), Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG), Cholesterin bzw. LDL-Niveau, ALAT, ASAT, Kreatinin sowie Blutzucker wurde das Blut nicht verwendet (Tab. 5).

Parameter /

Einheit

Normbereich

Hypertonie-Patienten

Mittelwerte (min-max)

Cholesterin / mg/dl

<200

191 (148-198)

LDL / mg/dl

<180

128 (98-155)

Glukose / mg/dl

60-126

105 (67-125)

CRP / mg/dl

<1

0.3 (<0.1-0.6)

BSG / mm/h

6-11/6-20 (f), 3-8/5-18 (m)

9/18 (4-12/10-20)

Leukozyten / nl

3.1-9.5

4.9 (3,4-6,7)

Thrombozyten / nl

130-340

237 (181-330)

Hämatokrit / %

40-54

44 (37-51)

Kreatinin / mg/dl

<1.2

0,9 (0,7-1.0)

Na / mmol/l

135-145

141,5 (135-145)

K / mmol/l

3.6-4.8

4,0 (3,8-4,6)

ALAT/ U/l

<19

18 (13-19)

ASAT / U/l

<18

13,1 (8-16)

Tab. 5: Laborwerte und Normbereiche der Hypertonie-Patienten

Verglichen wurden die Adhäsionsmoleküle von 35 gesunden, freiwilligen Normalkontrollen (20 Männer, 15 Frauen) mit einem diastolischen Blutdruck zwischen 60 und 90 mmHg (Mittelwert 77 mmHg) und systolischen Blutdruckwerten zwischen 107 und 140 mmHg (Tab.3) bei zweimaliger Messung und ohne Anamnese von Hypertonie, Diabetes, Hypercholesterinämie, Nikotinabusus, pAVK, Angina pectoris, Schlaganfall und entzündlichen Erkrankungen sowie mit unauffälligem Blutbild. Patienten- und Kontrollgruppe wurden weitestgehend hinsichtlich Alter und Geschlecht gematcht. Bei Adhäsionsmolekülen, für die eine Korrelation mit dem Alter ermittelt werden konnte, wurde das Vergleichskollektiv exakt bezüglich des Alters angeglichen.

Eine Zusammenstellung der zum Vergleich Hypertoniker versus Normalkontrollen gewerteten Versuche gibt Tabelle 6.

Vers. Nr.

f/ m

Alter

/

J

RRsys

/

mmHg

RRdia

/

mmHg

Vers Nr.

f/m

Alter

/

J

RRsys

/

mmHg

RRdia

/

mmHg

Hypertoniker

Normalkontrollen

14

m

41

160

100

15

f

43

136

75

18

f

58

200

95

16

m

51

127

72

19

f

69

165

100

17

f

58

110

90

23

m

61

140

95

20

f

53

111

88

24

m

50

150

110

21

f

58

140

90

25

f

63

170

100

27

m

51

120

75

26

m

43

140

100

28

m

36

140

78

31

f

46

160

100

29

m

41

108

71

32

m

46

140

95

30

f

40

107

86

33

f

54

150

100

36

m

47

134

81

34

m

56

170

120

37

m

32

140

60

35

f

52

160

100

38

f

45

107

74

58

m

72

160

95

39

f

45

115

69

59

f

60

150

95

41

m

47

113

74

60

m

51

140

100

50

m

68

130

80

61

f

57

160

100

51

f

50

130

70

85

m

56

170

105

52

f

39

121

73

86

m

65

175

100

53

f

42

131

90

62

m

37

125

75

63

m

36

120

80

Tab. 6: Aufstellung der zum Vergleich Normalkontrollen-Hypertonie gewerteten Versuche
mit Angabe von Versuchsnummern, Geschlecht (m/f), Alter, systolischem Blutdruck (RRsys),
diastolischem Blutdruck (RRdia) bei Probenentnahme

Methoden der Monozytenisolierung

Venöse Blutproben von gesunden Normalkontrollen und hypertensiven Patienten wurden mit Heparin in physiologischer Kochsalzlösung antikoaguliert (30ml Vollblut zu 20ml 0.9% NaCl und 5000 IE Heparin (Dörffel et al. 1999)). Verschiedene Antikoagulantien (Citrat versus Heparin) bewirken lt. Mickelson et al. 1999 keinen Unterschied der CD11b-Expression. Monozyten wurden mittels Dichte-Gradienten-Zentrifugation über Ficoll und nachfolgender negativer Dynabead-Isolierung gewonnen. Verglichen wurde die Monozyten-Isolierung mittels Plastik-Adhäsion. Die unterschiedlichen Methoden wurden hinsichtlich Isolierungseffizienz (Reinheit), Vitalität und Einfluß auf Adhäsionsmoleküle evaluiert.

Dichte-Gradienten-Zentrifugation

Die Zentrifugation über Ficoll (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) ist eine schnelle, einfache und verläßliche Methode um mononukleäre Zellen aus Vollblut zu isolieren. Antikoaguliertes Blut wird sorgfältig über Ficoll geschichtet. Durch die niedrige Viskosität, die entsprechende Dichte und osmotischen Eigenschaften der Ficoll-Lösung führt Zentrifugation zur differenzierten Migration und zur Ausbildung von Schichten, die verschiedene Zelltypen enthalten (Abb.3).

Abbildung 3: Dichte Gradienten-Zentrifugation zur Isolierung mononukleärer Zellen (MNZ)

Die unterste Schicht enthält Erythrozyten, die durch Ficoll aggregieren und deshalb komplett sedimentieren. Die Schicht unmittelbar über den Erythrozyten bilden vorwiegend Granulozyten, welche durch den osmotischen Druck der Ficoll-Lösung eine Dichte erhalten, die groß genug ist, um durch die Ficoll-Schicht zu migrieren. Wegen ihrer geringen Dichte werden Lymphozyten und Monozyten mit den anderen langsam sedimentierenden Teilchen, wie z.B. Plättchen, an der Grenze zwischen Plasma und der Ficoll-Schicht gefunden.

Wir überschichten 15ml Ficoll mit 35 ml verdünntem, antikoaguliertem Blut in 50 ml PP-Falcon Tubes und zentrifugierten sofort bei 20°C. Zur Minimierung der Plättchenkontamination wurde statt einem einmaligem Zentrifugationsschritt über 40 min (Ficoll-Protokoll) ein erster Zentrifugationsschritt mit 160g für 20 min mit anschließendem Verwerfen des Überstandes und ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 350g für 20 min genutzt (Dyna-Bead Protokoll, Dörffel et al. 1999). Nach Verwerfen des Plasmas wurde die sorgfältig abpipettierte Schicht mononukleärer Zellen durch mehrfache Waschenschritte in balancierter Salzlösung (PBS+ 0.1% HSA) von Plättchen, Ficoll-Resten und Plasma gereinigt.

Negativ-Isolierung mittels Dynabeads

Dynabeads (Dynal, Prod. 113.09) sind uniforme, superparamagnetische monodisperse, polymere Polystyren-Beads mit einem Durchmesser von 4.5 mm (Abb.4).

Abbildung 4: Von Dyna-Beads isolierte T Lymphozyten (aus Dynal Produktinformation)

Beads können zur Isolierung beliebiger Zellpopulationen mittels Negativ- bzw. PositivIsolierung verwendet werden. Bei der angewandten Negativ-Isolierung werden die Monozyten durch Entfernen der ungewünschten Natürlichen-Killer-Zellen (NK), T-und B-Lymphozyten aus einer mononukleären Zellsuspension gewonnen (Abb. 5). Ein Antikörpermix wird zur Zellsuspension gegeben und die Dynabeads binden an die antikörpergebundenen Zellen. Die Bead-umhüllten Zellen werden mittels eines Magneten (Dynal MPC) separiert und verworfen. Die isolierten Monozyten sind frei von Antikörpern und Beads und nicht durch Adhäsion aktiviert.

Abbildung 5: Negativisolierung von Monozyten

Das Monozyten-Isolierungs-Set von Dynal enthält Beads, Antikörper-Mix und BlockingReagenz. Die Dynabeads sind mit einem humanen IgG4 Antikörper gegen Maus IgG beschichtet. Der Antikörper-Mix besteht aus einer Mischung von monoklonalen MausAntikörpern gegen humanes CD2 (exprimiert von T-Lymphozyten), humanes CD7 (exprimiert von T-Lymphozyten, NK Zellen), humanes CD16 (auf NK Zellen), humanes CD19 (auf BLymphozyten) und humanes CD56 (auf NK-Zellen). Das Blocking-Reagenz enthält Gammaglobulin, um FcR auf Monozyten zu blocken. Die Isolierung erfolgte entsprechend dem Isolierungsprotokoll von Dynal.

Isolierung mittels Adhäsion an Plastik

Zum Vergleich der Isolierungsmethoden für Monozyten wurde die von Dörffel et al. 1999 u. a. beschriebene Isolierungsmethode mittels Adhäsion an Plastik ausgetestet. Dazu wurden die MNZ nach Dichte-Gradienten-Zentrifugation auf Polystyren-Petrischalen 1h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nicht adhärente Zellen wurden durch Waschen mit RPMI 1640 (37°C) entfernt. Durch Spülen mit kaltem RPMI 1640 (4°C) und vorsichtigem mechanischem Kratzen konnten 99% der adhärenten Zellen gewonnen werden. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und gefärbt.

Monozyten im Vollblut nach Erythrolyse

Zur Bestimmung des Einflusses der Isolierungsmethode erfolgten einige Messungen in erythrolysierten Vollblut. Für die Färbung wurden 200 μl Vollblut mit 1 ml Erythrolyse-Puffer versetzt und 10 min im Dunklen bei 4°C inkubiert (Vgl. Stent et al. 1997). Die gewaschenen Zellen wurden mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gefärbt. Als Erythrolyse-Puffer wurde 0.01 M KHCO3 + 0.155 M NH4CL + 0.1 mM EDTA mit einem ph=7.5 von Syrbe/ Hamann (Deutsches Rheumazentrum) verwendet. Laut Arkin et al. 1991 verändern unterschiedliche Erythrolyse-Puffer in unterschiedlichem Maße die Expression von Oberflächenmarkern.

Monozyten-Stimulation

Das Verhalten verschiedenster Adhäsionsmoleküle auf Monozyten nach Einwirkung unterschiedlicher Stimulanzien wurde untersucht. Dazu wurden die mittels Negativ-Isolierung gewonnenen Monozyten in einer Konzentration von 1 Millionen Zellen pro 1ml in RPMI 1640 (mit 10% Fetalem Kälber Serum (FCS von Biochrom S0112 676S) und Glutamin 20mM/l) bei 37°C und 5 % CO2für 7 h inkubiert. Um adhäsionsvermittelte Aktivierung der Monozyten zu verhindern, erfolgte die Inkubation in offenen Polypropylen-Röhrchen. Zur Stimulation wurden LPS, AT oder AT1-AK verwendet. Entsprechend dem Versuchsablauf erfolgte 30 min vor Stimulationsbeginn eine Zugabe von Abciximab bzw. Losartan bei 37 °C. Die optimalen Stimulationsbedingungen wurden mittels Zeit- und Konzentrationskinetik ermittelt. Eine Stimulationszeit von 7h erwies sich in Übereinstimmung mit Daten aus der Literatur für alle Stimulanzien als optimaler Stimulationszeitraum.

Angiotensin II: Getestet wurden AT-Konzentrationen von 10-10 M bis 10-5 M. AT stimuliert Monozyten dosisabhängig ab einer Konzentration von 10-10 mol/l (physiologisch relevante Konzentration, Dörffel 2002, Hahn et al. 1994). Wir wählten für die Stimulationsversuche AT-Konzentrationen von 10-6 M mit optimaler Stimulation im Sättigungsbereich (Hahn et al. 1994). Die Aufbewahrung des stabilen Peptids erfolgte gefroren in einer Konzentration von 10–5 M.
AT1-AK: Wir verwenden die IgG Fraktionen von Präeklampsie Patientinnen, deren Serum AT1-AA enthielt. Die Gewinnung der IgG Fraktion wird detailliert in Wallukat et al. 1999 beschrieben. Die Stimulation erfolgte mitgereinigtem AT1-AK in einer Konzentration von 1:100, mit ungereinigtem AT1-AK sind Konzentrationen von 1:40 notwendig. Konzentrationen von 1:1000 bis zu 1:20 wurden ausgetestet.
Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonist Losartan: Monozyten wurden 30 min vor AT bzw. AT1-AK Stimulation in 10-6 M Losartan inkubiert (entsprechend Wallukat et al. 1999). Ausgetestet wurden Konzentrationen von 10-8 M (lt. Dörffel et al. 1999), 10-5 M (lt. Kranzhöfer et al. 1999) und 10-3 M.
LPS (E.coli Serotyp): Zeit- und Konzentrationskinetiken zeigten bereits nach 4 h eine Monozytenaktivierung bei LPS-Konzentrationen zwischen 10ng/ml und 1000 ng/ml (Dörffel et al. 1999). Getestet wurden LPS-Konzentrationen von 10 ng/ml, 100 ng/ml und 300 ng/ml. Zur Stimulation wurden LPS in einer optimalen Konzentration von 100 ng/ml verwendet.
Abciximab (ReoPro): Der therapeutische Bereich von Abciximab liegt in vivo bei 5μg/ml (Neumann et al. 1999, Mick et al. 1999). Für in vitro Versuche wurden Konzentrationen zwischen 3.5μg/ml und 50μg/ml (Mickelson et al. 1999, Frederikson et al. 2000, Neumann et al. 1999) verwendet, wobei kein Unterschied zwischen Konzentrationen von 0.35 μg/ml bis 350 μg/ml feststellbar war (Mickelson et al. 1999). Übereinstimmend konnten wir in unseren Versuchen keine Veränderung der CD11a und CD11b-Expression bei Abciximab-Konzentrationen von 3.5μl/ml, 20μl/ml und 100μl/ml feststellen. Wir verwenden eine Inkubationskonzentration von 20 μg/ml Abciximab.

Bestimmung der Expression von Oberflächenmolekülen mittels FACS Meßprinzip

Für die Zytofluorometrie wurde ein FACS-Calibur verwendet. Das Durchflußzytometer FACScan von Becton Dickinson ermöglicht die zuverlässige Charakterisierung von Zellen aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften.

Die Zellsuspension aus dem Probenröhrchen wird mittels Überdruck der Meßküvette zugeführt. Die Zellen werden im Trägermedium (Sheat fluid: PBS) einzeln durch den Strahlengang eines Argon-Ionen-Lasers (Wellenlänge 488nm, Abb. 6) geführt. Die Interaktion von Laserstrahl und Zelle ist u.a. von der Größe, der Struktur von Zellmembran und Zellinnerem abhängig. Die Beugung des Lichtes in Richtung des einfallenden Strahles wird als Vorwärtslicht (forward light scatter, FSC) bezeichnet und ist abhängig von der Partikelgröße. Hinweis auf die Granularität der Zellen gibt das im rechten Winkel zum Strahleneingang gestreute Licht, das sogenannte Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC). Sowohl im FSC als auch im SSC wird jede Zelle von Detektoren mit je 1.024 Kanälen erfaßt.

Partikel mit hoher Eigenfluoreszenz oder nach Fluorochrom-Markierung werden von weiteren Detektoren mit hoher Sensitivität für bestimmte Wellenlängen gemessen. Dabei werden die fluoreszierenden Marker durch einen Laserstrahl bestimmter Wellenlänge angeregt und emittieren Lichtquanten mit einer für das jeweilige Fluorochrom spezifischen Wellenlänge. Die Fluoreszenzintensität ist ein relatives Maß für die Zahl der emittierten Signale und somit für die Anzahl der pro Zelle gebundenen Fluorochrom-Moleküle.

Das FASCcan erlaubt unter anderem die Erfassung von Grün- (FL 1, Wellenlänge 515-545 nm), von Orange- (FL 2, Wellenlänge 564- 606 nm) und von Rotfluoreszenzen (FL 3, Wellenlänge > 650 nm). Die Fluoreszenzaktivität wird logarithmisch verstärkt und auf einer linearen Skala mit 1.024 Kanälen, die 4 Log-Dekaden (0-10.000) entspricht, dargestellt. Wir messen somit gleichzeitig zwei morphologische Charakteristika und drei Fluoreszenzen.

Die Auswertung erfolgt mittels der zugehörigen Software (Cellquest) als Histogramm oder als „Dot Plot“. Beim „Dot Plot“ (Punktgraph) werden zwei Parameter gegeneinander aufgetragen und bei jeder Schnittstelle der beiden Werte ein Punkt angezeigt (korrelierte Zweiparameterdarstellung). Im Histogramm stellt die Abszisse die 1.024 Kanäle des jeweiligen Parameters dar und die Ordinate die Anzahl der jeweiligen Meßsignale in diesem Kanal. Mit Hilfe dieser Darstellungen lassen sich die gemessenen Partikel empfindlich charakterisieren und gezielt untersuchen. Es ist möglich, durch „Gates“ nur Meßwerte aus definierten Teilbereichen zu erfassen.

Abbildung 6: Aufbau eines dualen Durchflußzytometers mit sechs Detektionsparametern
(aus Pharmingen Technical Protocols, S.887)

Direkte und indirekte Membranimmunfluoreszenz

Für die direkte Immunfluoreszenz werden Fluorochrom-gekoppelte Antikörper verwendet. Bei der indirekten Immunfluoreszenz wird ein Primärantikörper, welcher an Oberflächestrukturen bindet, von einem sekundären, flourochrom-gekoppelten Antikörper erkannt. Die Fluoreszenzintensität kann mit Hilfe des Durchflußzytometers gemessen werden und dient zum Nachweis bestimmter Oberflächenstrukturen. Wir verwendeten industriell mit Fluorochromen gekoppelte primäre Antikörper (Abb.7), nur der Nachweis der Expression von 9eg7 erfolgte nach der Methode der indirekten Immunfluoreszenz.

Abbildung 7: Färbung mit direkt fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur FACS Auswertung

Messung der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten

Für die Bestimmung der Adhäsionsmoleküle auf Monozyten wurden die mittels NegativIsolierung gewonnenen Monozyten gefärbt. Verwendet wurden Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte monoklonale Maus-IgG-Antikörper gegen die folgenden humanen Oberflächenmoleküle:

Allophycocyanin (APC)-markierter Maus-Antikörper gegen den humanen Monozytenmarker CD14. CD14-Antikörper reagieren mit dem 53-55 Glykosylphosphatidylinnositol Glykoprotein, daß von Monozyten stark exprimiert wird. CD14 ist ein Zelloberflächen-Rezeptor mit hoher Affinität für Lipopolisaccharide. CD14Antikörper reagieren auch mit dendritischen Zellen, einigen Langerhanszellen und einigen Makrophagen.
Fluorescine isothiozyanat (FITC)-markierte Antikörper gegen CD11a, CD54, CD49d, CD29
Phycoeryrtrine (PE)-markierte Antikörper gegen CD11b, CD31, CD44, CD62L
Isotyp-Kontroll-Antikörper (PE-konjugierter monoklonaler Maus-IgG1, FITCkonjugierter monoklonaler Maus-IgG2)
monoklonaler Antikörper (mAb) 9eg7 gegen α6β1 (VLA-6) auf Mausendothelzellen von Hamann (Lenter et al. 1993), Färbung der an Monozyten gebundenen 9eg7 Antikörper mittels FITC-konjugierter Sekundär-Anti-Maus-IgG-Antikörper

Es wurden je 1 Millionen Monozyten mit 20μl des jeweiligen Antikörpers (sättigende Konzentration) in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS + 0.2% HSA für 20 min bei 4 °C inkubiert. Danach erfolgten drei Waschschritte und die Fixierung in 300μl 1% Paraformaldehyd (PFA). Die Proben wurden bei 4°C dunkel gelagert und innerhalb von 48 h gemessen.

Die Monozyten wurden durch ein typisches Fluoreszenzmuster im FSC- und SSC-Bild von eventuell kontaminierenden anderen Leukozytensubpopulationen differenziert und ausgewertet (Mickelson et al. 1999) (Abb.8).

Abbildung 8: Monozytendifferenzierung im Dot-Plot FSC-SSC-Bild durch Wahl von R1

Durch Färbung mit spezifischen fluoreszierenden Antikörpern ist eine weitere Differenzierung von Monozyten (CD14), T-Lymphozyten (CD3) und B-Lymphozyten (CD19) möglich. Zur Optimierung des Monozyten-Gates wurde der Monozytenmarker CD14 verwendet. Nur CD14 positive Ereignisse im APC-Fluoreszenz-Histogramm wurden ausgewertet (Abb.9). Es wurden mindestens 10.000 Ereignisse gemessen.

Abbildung 9: Monozytendifferenzierung im CD14-APC-Histogramm durch Wahl von R2

Die Expression der Adhäsionsmoleküle wurde durch PE- oder FITC-gekoppelte Antikörper bestimmt. Zur Feststellung unspezifischer Fluoreszenz wurden Kontroll-Antikörper des gleichen Isotyps verwendet. Anhand dieser wurde der Cut-off für die als positiv zu definierenden Zellen gesetzt. Die Isotyp-Fluoreszenz wurde bei nur mit ISO-Antikörpern gefärbten Kontrollproben pro Versuch über Verstärkungswahl zwischen 0 und 10 mit einem Mittelwert von 4 MFI eingestellt (Abb.10). Unter diesen Bedingungen sind <1% der gemessenen Zellen positiv in M1.

Abbildung 10: Abgrenzung unspezifisch gefärbter PE-Isotyp-Kontrollen durch Wahl von M1

Die mittlere Fluoreszenz Intensität ist ein Maß für die Antikörperbindung und somit für die Antigen-Oberflächenexpression (Neumann et al. 1999) (Abb.11).

Abbildung 11: CD11b-PE Expression auf Monozyten (in G3=R1 und R2 und M1) im Histogramm, Auswertung des Mittelwertes ( in MFI)

Vitalitätsbestimmung Ausschlußfärbung mit Trypanblau

Die bei Nekrose auftretende frühe Zerstörung der Zytoplasmamembran kann man durch Ausschlußfärbungen nachweisen. Der Farbstoff Trypanblau dringt nur in sterbende oder abgestorbene Zellen ein, deren Zytoplasmamembran geschädigt ist. Zellen mit intakter Zytoplasmamembran werden nicht angefärbt. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch. Nekrotische Zellen sind deutlich blau gefärbt, während lebende Zellen durchsichtig erscheinen.

Durchflußzytometrische Bestimmung der Vitalität

Geschädigte Zellen zeigen Veränderungen in Größe und Komplexität und sind im FSC-SSC Bild abzugrenzen. Außerdem lassen sich Membranintegritätsverluste durch Anwendung des Fluorochroms Propidiumjodid (PI, rotfluoreszierenden Farbstoff, 543 nm) nachweisen. Dieser Fluoreszenzfarbstoff gelangt ebenfalls nach Schädigungen der Membranen in die Zelle und bindet spezifisch an Nukleinsäuren, hauptsächlich an die doppelsträngige genomische DNA, und dient so zur Beurteilung der morphologischen Integrität und damit der Vitalität der untersuchten Zelle. Die Analyse kann sowohl im Fluoreszenzmikroskop, als auch in einem Durchflußzytometer erfolgen. PI positive Zellen liefern Fluoreszenz-Signale in FL2 und FL3 und sind so von membranintakten Zellen abgrenzbar. Zur Methodenevaluation bei durchflußzytometrischen Messungen wurde PI mit einer Endkonzentration von 2 μg/ml zur Vitalitätsbestimmung eingesetzt.

Methode der mikroskopischen Immunfluoreszenz

Als alternativer Meßansatz wurde die Methode der Herstellung von Präparaten der mikroskopischen Immunfluoreszenz untersucht. Die Arbeit erfolgte mit Dr. Schulze und Prof. Dr. G. Wallukat des Max Delbrück Zentrums Berlin Buch. Erarbeitet wurden Möglichkeiten der Fixierbarkeit, des Transportes und Färbbarkeit der Monozyten. Da Temperaturschwankungen und Transportzeit die Expression der Adhäsionsmoleküle beeinflußen, ist eine unmittelbare Färbung und Fixierung zu bevorzugen. Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind unbelichtet über mindestens 48 h stabil, aber instabil bei Belichtung. Eine quantitative Auswertung der Fluoreszenzstärke ist auf Grund der Flüchtigkeit der Fluoreszenz und der Schwierigkeit der Quantifizierung der Fluoreszenzstärke nicht möglich und in der Literatur unüblich. Fotografiert wurde mit unterschiedlichen Belichtungszeiten und im Phasenkontrastmodus (Abb.12).

Abbildung 12: Isolierte Monozyten im Phasenkontrast-Mikroskop

FITC positive Granula bzw. Membranen leuchten grün (Abb.13). Mit Propidiumjodid (PI) sind gute Kernfärbungen möglich (Anregung wie FITC, Emission orange-rot) (Abb.14). Allerdings überdeckt die starke Fluoreszenz von PI geringere FITC-Fluoreszenzen der Zellmembran bei Doppelfärbung.

Abbildung 13: CD11a –FITC gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop

Abbildung 14:PI gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop, Darstellung der Kerne

Datenanalyse

Die statistischen Auswertung wurde mittels SPSS 10.0 (Chicago) für Windows erstellt.

Als Maß der Fluoreszenzstärke (und somit als Maß für die Adhäsionsmolekülexpression) wurde der Mittelwert (MW) ± Standardabweichung verwendet. Die Angabe erfolgte als Mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI). N bezeichnet die Anzahl der Experimente.

Häufigkeitsverteilungen dienten zur visuellen Veranschaulichung der Verteilungsunterschiede zwischen Hypertonikern und Normalkontrollen.

Um festzustellen, ob die Expression der untersuchten Adhäsionsmoleküle bei Hypertonikern signifikant unterschiedlich zu Normalkontrollen ist wurde der U-Test nach Mann und Whitney verwendet. Der Test ist ein nichtparametrischer Test für unabhängige Stichproben und prüft Lageunterschiede zwischen Populationen (Wernicke et al. 1999). Bei p < 0.05 (Irrtumswahrscheinlichkeit) werteten wir den Unterschied als signifikant.

Der Grad des linearen Zusammenhangs zwischen zwei Merkmalen wie z.B. von Alter und Blutdruck zur Höhe der Oberflächenmarkerexpression wird statistisch repräsentativ im Pearson’schen Korrelationskoeffizienten ausgedrückt. Bei p < 0.05 ist die Korrelation signifikant.

Die Auswertung der Stimulationsversuche erfolgte mittels T-Test für gepaarte Stichproben (Mittelwertvergleich bei abhängigen Stichproben). Da ein Merkmal am selben Probandenblut beobachtet wird, handelt es sich um abhängige oder verbundene Stichproben. Die Nullhypothese („Der Erwartungswert, geschätzt durch den Mittelwert der Fluoreszenz, ist vor und nach Stimulation gleich“) wird bei zweiseitiger Fragestellung abgelehnt, wenn die dem berechneten t-Wert zugehörige Wahrscheinlichkeit p kleiner als die Irrtumswahrscheinlichkeit α =0.05 ist. Sind die Testergebnisse in Form der Ablehnung der Nullhypothese signifikant, so sind die Unterschiede ebenfalls signifikant.