Ergebnisse

Methodenevaluation

Zur Methodenevaluation wurden zahlreiche Versuche zur Kontrolle der Reinheit und der Vitalität nach verschiedenen Isolierungs-Methoden bzw. -Schritten durchgeführt. Zum Vergleich des Einflusses der Isolierungsmethode wurde die Expression von Adhäsions-Molekülen auf Monozyten nach einzelnen Isolierungsschritte untersucht: die Zellen des Vollblutes nach Erythrolyse, die Zellen nach Dichte-Gradienten-Zentifugation über Ficoll, die Zellen nach DynaBead Negativ-Isolierung bzw. Isolierung mittels Adhäsion an Plastik, unmittelbar nach Isolierung bzw. nach Färbung und nach Fixation.

Reinheit und Vitalität der Monozyten nach Isolierung

Nach Zentrifugation über Ficoll waren 95 % aller Zellen mononukleäre Zellen, ca. 50±10% der Lymphozyten des Vollblutes blieben erhalten. Verunreinigend waren ca. 3 % Granulozyten und bis zu 5 % Erythrozyten. 15-50 % der MNZ waren in Abhängigkeit vom Spenderblut Monozyten. Nach Dynabead-Isolierung sank die Zellzahl durch Entfernung des Lymphozytenanteils. Aus 120 ml Blut erhielten wir durchschnittlich zwischen 10–30 Millionen Monozyten.

Reinheit: Zur Bestimmung von Verunreinigungen durch Lymphozyten wurden Kontrollfärbungen mit CD3-FITC für T-Lymphozyten und CD20-FITC bzw. CD19-PE für BLymphozyten durchgeführt. Die Reinheit nach Dynabead-Isolierung war größer als 90 %, wobei CD2, CD7, CD16, CD19 und CD56 positive Zellen zu mindestens 98 % entfernt waren. Der Anteil kontaminierender T-Lymphozyten lag bei 1% (CD3 Expression positiv) und BLymphozyten (CD19-Expression positiv) waren mit <1% vernachlässigbar.

Die Isolierungsreinheit wurde durch Dichte-Gradienten-Zentrifugation über Lymphoprep statt Ficoll, nochmalige Dichte-Gradienten-Zentrifugation bzw. vollständige nochmalige Isolierung nach abgeschlossener erster Dynal-Bead-Negativ-Isolierung oder Erythrolyse nach DynabeadIsolierung nicht wesentlich verbessert.

Plastikadhärenz: Monozytenisolierung mittels Plastikadhärenz ergab einen erhöhten Anteil verunreinigender B- und T-Lymphozyten. Außerdem erfolgte eine Aktivierung der isolierten Monozyten über die Plastikadhärenz. Die dazu durchgeführten Versuche erfolgten noch ohne Iso-Antikörperfärbung und ermöglichen deshalb keine Quantifizierung des Einflusses auf die Expression der einzelnen Adhäsionsmoleküle.

Blut:Es bestand kein Unterschied in der Expression von Adhäsionsmolekülen zwischen aus Vollblut isolierten Monozyten und Monozyten aus frischen Buffy coats der Blutspendezentrale Ahrensfelde.

Vitalität:Zur Kontrolle der Toxizität der Isolierung erfolgte eine Färbung der Proben mit Trypanblau und in einigen Versuchen mit PI. Die Vitalität betrug ca. 98%. Über eine Auswahl des Gates erfolgte ausschließliche eine Messung der lebenden Zellen.

Monozyten im Vollblut

Abbildung 15: Zellen nach Erythrolyse im FACS als Dot-Plot

In Versuch Nr. 28 und Nr. 74 wurden die Monozyten und Lymphozyten im Vollblut nach Erythrolyse untersucht. Sie wurden als Vergleichspopulation betrachtet, da Monozyten nach Erythrolyse am wenigsten aktiviert sind. Abb.15 zeigt die Zellverteilung im FSC-SSC-Bild: Wegen ihrer höheren Komplexität unterscheiden sich Granulozyten im SSC von mononukleären Zellen und finden sich links oben. MNZ können wiederum durch ihre unterschiedliche Größe im FSC differenziert werden, da Lymphozyten (unten links) im Durchschnitt kleiner sind als Monozyten / Makrophagen (rechts darüber). In Abhängigkeit der Güte der Lyse ist ein unterschiedlich großer Anteil von verunreinigenden Erythrozyten unten links zu finden.

Monozyten nach Dichtegradientenzentrifugation

Während nach Erythrolyse der Monozyten-Anteil ca. 3 % aller Zellen betrug, waren nach Ficoll-Zentifugation ca. 25 % der Zellen Monozyten und nach Bead-Isolierung > 90%. 98 % aller Zellen und 100 % der Monozyten waren vital. Die Bead-Isolierung reduzierte den B- und T- Lymphozyten-Anteil auf unter 1 %.

Die Expression der Adhäsionsmoleküle wurde durch die verschiedenen Isolierungsschritte beeinflußt. Nach Erythrolyse von Vollblut exprimierten Monozyten CD11a unverändert, CD11b niedriger, CD54 und CD62L gering erhöht und CD49d, CD29 stärker als nach Dyna-BeadIsolierung. Nach Ficoll-Dichte-Gradienten-Zentrifugation wurden im Vergleich zur Expression nach Isolierung CD11a unverändert, CD11b niedriger und alle anderen Marker erhöht exprimiert (Tab. 7).

Vers.28

CD 11a

CD 31

CD44

CD62L

CD11b

CD54

CD49

CD29

n.Lyse

47

115

9

154

69

115

395

n.Ficoll

48

95

173

7

240

102

80

267

isoliert

42

55

123

5

263

54

26

124

Versuch 29

n. Ficoll

47

115

210

289

127

121

264

isoliert

42

84

181

434

83

35

157

Versuch 30

n.Ficoll

60

103

293

195

125

110

393

isoliert

62

83

213

591

135

98

153

Tab. 7: Expression der Adhäsionsmoleküle nach Erythrolyse, Ficollzentrifugation und Bead-
Isolierung (angegeben als MFI) für Versuch 28, 29 und 30

Abbildung 16: Zellen nach Ficoll-Zentrifugation a) Dot-Plot und b) zugehöriges FACS
Histogramm der CD19 positiven B- Lymphozyten sowie c) der CD3 positiven T
Lymphozytenpopulation in R1

In Abb.16 ist ein FCS-SSC Bild nach Ficollzentrifugation dargestellt. Ein hoher Anteil von Lymphozyten (60-70%), eine Monozytenpopulation und einige Granulozyten und Erythrozyten waren meßbar. Die CD3-Expression kennzeichnet T-Lymphozyten und CD19 den BLymphozytenanteil.

Einflußfaktoren auf die FACS Messung

Kompensation: Zum Ausschluß von Artefakten, die aus überlappenden Fluoreszenzspektren resultieren, wurden die Detektorkanäle gegeneinander kompensiert. Die Kompensationsparameter wurden dann für alle Messungen beibehalten.

Inkubationsdauer der Fluorochrom-Antikörper: Die Inkubationsdauer hat nach einer Mindestzeit von 20 min keine wesentliche Änderung der Fluoreszenz zur Folge.

Konzentration der Fluorochrom-Antikörper: Zum Finden einer optimalen Färbekonzentration wurden die Fluoreszenz-Antikörper titriert. Eine Konzentration von 20μl Antikörper/100μl pro 1 Mio. Zellen wurde für die Versuche gewählt.

Fixierung: Fixierung vor Färbung erhöht die Fluoreszenz geringfügig, weshalb aus Gründen der Vergleichbarkeit immer vitale Zellen gefärbt und dann fixiert wurden. Die Fluoreszenzintensität von direkt nach Färbung fixierten Zellen entspricht der Fluoreszenzintensität von vitalen, unfixierten Zellen. Die Fluoreszenz bleibt bei 4°C in Dunkelheit mindestens 2 Tage stabil. Fluoreszenz-Messungen fixierter Zellen nach 9 h, 15 h und 36 h belegten die Unabhängigkeit alle Adhäsionsmoleküle vom Meßzeitpunkt.

Verstärkung:. Um den Einfluß unspezifischer Bindungen zu beachten wurden als Kontrolle ungefärbte Proben und mit ISO-Antikörper gefärbte Proben mitgeführt. Die Meßeinstellungen erfolgten so, daß die Fluoreszenz der ISO-Antikörperfärbungen für Monozyten zwischen 0 und 10 MFI mit einem Mittelwert von 4 MFI lag.

Zur Fehleranalyse wurde versucht, den Einfluß der Verstärkung auf die Fluoreszenzleuchtstärke zu quantifizieren. Dazu wurden dieselben Proben mit verschiedenen Verstärkungen gemessen. Da sich kein eindeutiger Zusammenhang ergab, der eine einfache mathematische Korrektur der Ergebnisse ermöglichte, wurden die ohne ISO-Antikörper-Färbung gemessenen Versuche vom Vergleich bezüglich der unterschiedlichen Adhäsionsmolekül-Expression von Hypertonikern und Normalkontrollen ausgeschlossen.

Eine Änderung des Fluoreszenz-Mittelwertes des ISO-Antikörpers um 1 MFI bewirkt eine Änderung von ca. 20 % um den Mittelwert des jeweiligen Adhäsionsmoleküls (Streuung von ±10%). Dieser zufällige Fehler wird durch möglichst exakte Einstellung der Verstärkung und bei großer Probenanzahl minimiert.

Adhäsionsmoleküle auf Monozyten bei Hypertonie

Im folgenden sind die Unterschiede der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten von Hypertonikern und Normalprobanden dargestellt. Verglichen wurde die Expression direkt nach Dyna-Bead-Isolierung aus Blutproben von 18 Hypertonikern und 20 Normalkontrollen.

CD54

CD54 wird auf allen CD14 positiven Monozyten exprimiert (Abb. 18) und ist bei Bluthochdruck signifikant erhöht (Signifikanz 0.000).

Abbildung 18: CD54–PE Expression im FACS-Histogramm (in MFI)

Mittelwerte, Rang und Rangsumme im U-Test sind bei Hypertonikern höher als bei Normalkontrollen (Tab. 8). Auch die Häufigkeitsverteilung der CD54 Expression für Normalkontrollen und Hypertoniker ist deutlich verschieden (Abb. 19).

Abbildung 19: Häufigkeitsverteilung der CD54-Expression in MFI bei NK und Hypertonie

CD54 für

N

Mittlerer Rang

Rangsumme

Mittelwert

Standard-abweichung

Hypertonie

18

25,97

467,50

95,44

28,56

NK

20

13,68

273,50

65,00

19,71

Tab. 8: Rang (U-Test) und Mittelwerte der CD54 Expression bei Hypertonie im Vergleich
zur Kontrolle (NK) (angegeben als MFI=Mittlere Fluoreszenz Intensität)

CD54 korreliert signifikant (Signifikanz 0.016) mit dem diastolischen Blutdruck, dagegen nicht mit dem systolischem Blutdruck und dem Alter (Abb. 20).

Abbildung 20: Korrelation von CD54 Expression (in MFI) und diastolischem Blutdruck

CD11b

Abbildung 21: CD11b Expression (angegeben als MFI) im FACS-Histogramm

CD11b wird auf allen CD14 positiven Monozyten entsprechend Abb.21 exprimiert. CD11b ist bei Hypertonie signifikant erhöht (Signifikanz 0.001, Häufigkeitsverteilung siehe Abb.22).

Abbildung 22: Häufigkeitsverteilung der CD11b Expression(angegeben als MFI)
bei Kontrollen (MW=417) und Hypertonikern (MW=275)

Zwischen diastolischem Blutdruck und CD11b-Expression besteht ein signifikanter Zusammenhang (Signifikanz 0,009, Abb. 23). Dagegen ist für Alter und systolischen Blutdruck keine statistisch signifikante Korrelation nachweisbar.

Abbildung 23: Korrelation von CD11b-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck

CD11a

CD11a wird von allen Monozyten exprimiert. Die Expression ist bei Hypertonie signifikant erhöht (Signifikanz 0.002). Häufigkeitsverteilungen (Abb.24) und Mittelwerte sind bei Hypertonikern (MW=47 MFI) und Normalkontrollen (MW=34 MFI) signifikant unterschiedlich.

Abbildung 24: Häufigkeitsverteilung der Expressionshöhe von CD11a für NK und Hypertonie

Mit dem diastolischem Blutdruck (Signifikanz 0,016, Abb.25) und dem Alter (Signifikanz 0,026, Abb.26) ist die CD11a Expression signifikant korreliert. Auch nach Altersanpassung durch Paarbildung ergibt sich ein signifikanter Unterschied (Signifikanz 0.005) der CD11a-Expression bei Hypertonie.

Abbildung 25: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck

Abbildung 26: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und Alter

CD29

CD29 wird auf allen Monozyten exprimiert (Abb.27). Es gibt gravierende individuelle Unterschiede in der Expression, die sich in einer großen Standardabweichung äußern. Es ist kein Expressions-Unterschied bei Hypertonie nachweisbar (Signifikanz 0,959, Abb.28).

Abbildung 27: Expression von CD29 (als MFI) auf Monozyten im FACS Histogramm

Abbildung 28: Häufigkeitsverteilung der CD29-Expression (als MFI) bei Hypertonie und NK

CD31

CD31 wird, wie in Abb.29 beispielhaft dargestellt, auf allen Monozyten exprimiert. Es besteht kein Unterschied in der Expression zwischen Kontrollgruppe und Hypertonikern.

Abbildung 29: FACS Histogramm CD31(als MFI)

CD44

Alle Monozyten exprimieren CD44 entsprechend Abb.30. Die Expression ist alters- und blutdruckunabhängig (MW=125 MFI, Signifikanz 0.5).

Abbildung 30: CD44-Expression im FACS Histogramm

CD49d

Auch CD49d wird von allen Monozyten exprimiert (Abb.31). Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen der CD49d Expression von Hypertonikern (MW= 74 ± 34 MFI) und Normalkontrollen (MW= 59 ± 32 MFI) festzustellen (Signifikanz 0.21, Abb.32).

Abbildung 31: FACS Histogramm CD49-PE

Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der CD49d-Expression in MFI bei Hypertonie und NK

CD62L

Isolierte Monozyten exprimieren CD62L gering. Die Expressionshöhe ist zwischen 0 und 100 MFI mit Mittelwerte um 12 MFI verteilt (Abb.33). Es besteht kein nachweisbarer Unterschied der Expression in Abhängigkeit vom Blutdruck.

Abbildung 33: FACS Histogramm CD62L

9eg7

Lenter et al. 1993 und Hamann entwickelten einen monoklonalen Antikörper 9eg7 gegen Mausendothelzellen, der die Adhäsion von Lymphozyten an das Endothel blockt. Dieser Antikörper erkennt α6β1 (VLA-6), und definiert somit ein Epitop der β1-Integinkette, welches nur nach Aktivierung des α4β1 Heterodimer z.B. durch Mn 2+ zugänglich ist (Lenter et al. 1993). α6β1 wird konstitutiv auf Endothelzellen exprimiert und ist wahrscheinlich in die späte Phase der Adhäsion von Lymphozyten integriert. Wir testeten, ob der von Hamann isolierten Antikörper auch an humane Monozyten bindet.

Mittels Färbung der an Monozyten gebundenen 9eg7 Antikörper mittels FITC-konjugierter Sekundär-Anti-Maus-IgG-Antikörper ist eine geringfügige Fluoreszenzerhöhung gegenüber der Negativkontrolle belegbar. α6β1 scheint somit auch auf menschlichen Monozyten schwach exprimiert zu werden. Allerdings erlaubte die nur geringfügige Fluoreszenzerhöhung gegenüber der Negativkontrolle auch bei verschiedenen Antikörperkonzentrationen keine detaillierte Beurteilung eventueller Expressionsveränderungen durch Hypertonie oder Stimulierung.

Einfluß von Stimulation auf die Expression von Monozytenadhäsionsmolekülen

Um die Adhäsionsmolekül-Veränderungen isolierter Monozyten bei LPS, AT und AT1-AK Stimulation zu untersuchen, wurde die Expression auf in Puffer inkubierten Monozyten mit der Expression auf mit Stimulanzien inkubierten Monozyten verglichen. Die Stimulationsversuche erfolgten überwiegend bei Normalprobanden. Bei beobachteter Empfindlichkeit wurde die Stimulierbarkeit der Monozyten von Hypertonikern verglichen. Zur statistischen Auswertung wurde der T-Test für gepaarte Stichproben verwendet.

Auf die Angabe der Daten für durch Stimulation unveränderte Adhäsionsmoleküle wird aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet. CD11a ist sehr stabil in seiner Expression. Es verändert sich weder durch Inkubation noch durch die verschiedensten Stimulanzien (AT, AT1Antikörper, LPS, TNF sowie Losartan). AT und AT1-Antikörper haben auch in höheren Konzentrationen keine nachweisbare Wirkung auf die Expression von CD31 und CD44. AT verändert die Expression von CD49d nicht. CD29 verhält sich sehr labil. Es ist unabhängig von der Höhe der Ausgangsexpression, dem Blutdruck oder von der Inkubationsdauer, ob ein Anstieg oder ein Abfall der CD29 Expression zu verzeichnen ist. CD62L wird nach Isolierung und Inkubation so niedrig exprimiert, das der statistisch signifikante Nachweis einer weiteren Expressionserniedrigung durch Stimulation mit Angiotensin II, AT1-Antikörper und LPS nicht möglich ist. LPS führt nicht zu einer signifikanten Veränderung der CD44 und CD49d Expression.

Veränderungen durch Inkubation

Die Inkubation in Suspension bewirkt bereits spezifische Veränderungen der untersuchten Adhäsionsmoleküle auf Monozyten. CD54 steigt signifikant bei Inkubation (Tab. 9).

Versuche zum Einfluß von

N

CD54 bei

Mittelwert

Standard-abweichung

MW -Diff.

Sig. (2-seitig)

Zeit

18

T0

88,00

32,05

-195,67

,000

18

T1

283,67

196,03

Tab. 9: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD54 (angegeben als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach
Inkubation für 7h (T1) verglichen.

CD11b sinkt signifikant bei Inkubation (Tab.10).

Versuche zum Einfluß von

N

CD11B

für

Mittelwert

Standardab-weichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

Zeit

13

T0

334,54

141,80

102,00

,000

13

T1

232,54

129,60

Tab. 10: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD11b (in MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation
für 7h (T1) verglichen.

Inkubation erniedrigt CD31 signifikant (Tab.11).

Vers. zum Einfluß von

N

CD31

für

Mittelwert

Standard-abweichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

Zeit

20

T0

61,65

17,82

11,40

,006

20

T1

50,25

21,32

Tab. 11: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD31 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation
(T1) verglichen.

CD44 steigt signifikant mit der Inkubation (Tab.12).

Vers. zum Einfluß von

N

CD44

für

Mittelwert

Standard-abweichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

Zeit

20

T0

128,85

49,97

-78,55

,014

20

T1

207,40

152,70

Tab. 12: T-Test für CD44 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD44 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation
(T1) verglichen.

CD11a verändert sich durch Inkubation nicht. Die CD49d- und CD62L-Expression sinken durch die Inkubation, eine Signifikanz ist auf Grund geringer Versuchsanzahl nicht belegbar. CD29 verhält sich sehr labil. Inkubation bewirkt in 12 Versuchen einen Anstieg und in 12 weiteren Versuchen ein Abfall der CD29 Expression.

Stimulation mit LPS Adhäsionsmolekühl-Veränderungen durch LPS

LPS-Stimulation erhöht die CD54-Expression signifikant (Tab.13). Dabei ist die Stimulierbarkeit durch LPS sowohl für Hypertoniker als auch Normalkontrollen gegeben und bei Konzentrationen von 10 ng/ml als auch von 100 ng/ml zu beobachten. Nach 7 h weisen die meisten Probanden eine Expressionserhöhung von CD54 durch LPS auf (6 von 12 Normalkontrollen und 4 von 5 Hypertonikern). Die Sensibilität bezüglich LPS-Stimulation ist eventuell bei Hypertonie erhöht.

Versuche zum Einfluß von

N

CD54 bei

Mittelwert

Standard-abweichung

MW -Diff.

Sig. (2-seitig)

LPS

17

T1

280,71

180,88

-62,18

,020

17

LPS

342,88

207,25

Tab. 13: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD54 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach Stimulation mit LPS verglichen.

LPS-Stimulation erhöht auch die CD11b Expression signifikant (Tab.14). Die Expressionserhöhung ist nach Stimulation mit 10 ng/ml und 100 ng/ml bereits nach 7 h deutlich. LPS bewirkt eine CD11b-Erhöhung bei allen Hypertonikern und 5 von 7 Normalkontrollen.

Versuche zum Einfluß von

N

CD11B

für

Mittelwert

Standardab-weichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

LPS

12

T1

291,75

180,70

-59,33

,041

12

LPS

351,08

231,03

Tab. 14: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.

LPS bewirkt eine geringfügig erniedrigte Expression von CD31 (Tab. 15).

Vers. zum Einfluß von

N

CD31

für

Mittelwert

Standard-abweichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

LPS

16

T1

47,06

22,51

5,63

,041

16

LPS

41,44

22,26

Tab. 15: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD31 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.

Einfluß von Abciximab auf LPS stimulierte Monozyten

Vorinkubation mit Abciximab (ReoPro) führt bei LPS stimulierten Monozyten zu einer leicht erhöhten CD54 Expression. Während Inkubation mit Abciximab (ReoPro) bei unstimulierten Zellen die CD11b Expression erhöht (Abb.35), wird der durch LPS Stimulation bedingte Anstieg der CD11b Expression durch Abciximab deutlich vermindert (Abb.34).

Abbildung 34: Wirkung von Abciximab (Reo) auf LPS stimulierte CD11b Expression
(angegeben als MFI) in den Versuchen 60, 62, 63. Expression nach 7h Inkubation, nach LPS
Stimulation (100ng/ml) und nach Inkubation mit ReoPro und LPS.

Abbildung 35: Abciximab erhöht die unstimulierte CD11b Expression (angegeben als MFI) in
den Versuchen 60, 62, 63. Vergleich der Expression nach 7h Inkubation mit und ohne Abciximab
(Reo).

Stimulation mit Angiotensin II und AT1-AK Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch Angiotensin II

Der Vergleich von ohne und mit AT inkubierten Monozyten zeigt einen signifikanten Expressionsanstieg von CD11b durch AT (Tab.16).

Versuche zum Einfluß von

N

CD11B

für

Mittelwert

Standardab-weichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

AT

7

T1

233,71

99,55

-47,00

,036

7

AT

280,71

114,69

Tab. 16: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach
Stimulation mit AT verglichen.

AT Stimulation bewirkt ein geringfügiges Absinken der Expression von CD54 ohne statistische Signifikanz. Dabei ist die vermutliche Wirkung von AT anscheinend erst bei hohen Konzentrationen und längerer Inkubationsdauer ausgeprägt. So reagieren bei einer ATKonzentration von 10-6 M nach 14 h alle untersuchten Probanden (3 Versuche, Normalkontrollen) mit einer geringen Expressionserniedrigung, während bei Konzentrationen von 10-8 M in 3 Versuchen (Normalkontrollen) keine Änderung zu beobachten ist. Bei ATKonzentrationen von 10 –6 M reagieren nach 7 h Inkubation 4 von 5 Hypertonikern mit leichter Expressionserniedrigung, während Normalkontrollen noch keine Empfindlichkeit aufweisen.

Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch AT1-Rezeptor Antikörper

23 Versuche belegen einen statistisch hoch signifikanten Anstieg von CD11b nach Inkubation mit AT1-Antikörper (Tab.17).

Versuche zum Einfluß von

N

CD11B

für

Mittelwert

Standardab-weichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

AT1-AK

23

T1

162,96

118,13

-177,04

,000

23

AT1-AK

340,00

104,53

Tab. 17: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach
Stimulation mit AT1-AK verglichen.

Die CD54 Expression steigt signifikant durch AT1-Antikörper Stimulation (Tab.18). Bei höheren Antikörperkonzentrationen reagieren sowohl Hypertoniker als auch Normalkontrollen mit einer deutlichen Expressionserhöhung (4 Versuche, davon 2 Hypertoniker, 2 Normalkontrollen). Bei niedrigen Antikörperkonzentrationen gibt es Unterschiede in der individuellen Empfindlichkeit, nur zwei von 5 Hypertonikern und drei von 10 Normalkontrollen reagieren mit leichter Expressionserhöhung.

Versuche zum Einfluß von

N

CD54 bei

Mittelwert

Standard-abweichung

MW -Diff.

Sig. (2-seitig)

AT1-AK

15

T1

263,20

177,02

-64,73

,034

15

AT1AK

327,93

197,27

hohe AT1-AK Konzentration

4

T1

261,50

202,03

-166,25

,076

4

AT1-AK hoch

427,75

196,51

Tab. 18: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD54 (angegeben als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach
Stimulation mit AT1-AK und AT1-AK in doppelter Konzentration (1:50) verglichen.

AT1-Antikörper-Stimulation bewirkt eine signifikante Erhöhung der CD49d Expression geringer Amplitude (Tab. 19). Die Expressionserhöhung ist bei höherer Antikörperkonzentration nicht deutlicher.

Vers. zum Einfluß von

N

CD49d

für

Mittelwert

Standard-abweichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

AT1-AK

11

T1

29,82

18,15

-3,64

,030

11

AT1-AK

33,45

18,23

Tab. 19: T-Test für CD49d bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD49d (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach
Stimulation mit AT1-AK verglichen

Einfluß von Losartan auf AT bzw. AT1-AK stimulierte Monozyten

Der AT1-Rezeptorantagonist Losartan verringert die Stimulierbarkeit von CD11b durch AT als auch durch AT1-Antikörper. Durch Inkubation mit Losartan sind die Mittelwerte der CD11b Expression AT bzw. AT1-AK stimulierter Monozyten tendenziell erniedrigt (Tab.20). Die Versuchsanzahl ist zu gering und die AT1-Antikörper-Konzentration in den durchgeführten Versuchen zu niedrig, um die CD11b Expression signifikant zu erhöhen. Somit ist keine statistisch relevante Aussage zur Wirkung von Losartan auf stärker stimulierte Monozyten möglich. Eine Veränderung der CD54-Expression bei AT1–Antikörper-Stimulation durch Losartan ist nicht belegbar (9 Versuche, Signifikanz 0.36).

Versuche zum Einfluß von

N

CD11B

für

Mittelwert

Standardab-weichung

MW-Diff.

Sig. (2seitig)

Losartan bei AT

7

AT+L

1283,71

496,15

-55,86

,520

7

AT

1339,57

559,99

Losartan bei AT1-AK

7

AT1-AK+L

1380,57

572,24

-65,71

,302

7

AT1-AK

1446,29

643,37

Tab. 20: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die
Expression von CD11b (als MFI) nach Stimulation mit AT bzw. AT1-AK mit der Expression
nach Stimulation mit Losartan und AT ( AT+L) bzw. AT1-AK verglichen ( Versuche ohne ISO
-AK, deshalb MW erhöht).

Die Expressionserhöhung von CD49d durch den AT1-AK ist von so geringer Amplitude, daß ein Einfluß von Losartan nicht nachweisbar ist. Bei fehlender Stimulierbarkeit durch AT und AT1Antikörper hat Losartan wie erwartet keinen nachweisbaren Einfluß auf die Expression von CD31, CD49, CD44, CD62L und CD11a.

Unterschiede der Stimulation bei Hypertonie versus Normalkontrollen

Für die bei Hypertonie verändert exprimierten Adhäsionsmoleküle CD11a, CD11b und CD54 ergibt sich die Frage, ob Hypertonie nicht nur ein erhöhte Grundexpression, sondern auch ein verändertes Verhalten bei Stimulation bedingt. Die CD11a Expression ist unabhängig von den untersuchten Stimulanzien. Für CD11b und CD54 wurde das Stimulationsverhalten von Monozyten bei Hypertonie mit dem Stimulationsverhalten von Monozyten normotoner Probanden verglichen.

Abbildung 36: Veränderte CD54 Expression nach Inkubation. MW der CD54-Fluoreszenz
(angegeben als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung
(T0) bzw. Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und
Normalkontrollen

Abb.36 und Abb.37 belegen anhand der Mittelwerte der CD54- bzw. CD11b-Expression, das alle untersuchten Stimulanzien bei Monozyten von Hypertoniker und Normalkontrollen qualitativ gleichartige Expressionsveränderungen bewirken. Die Inkubation ist für CD11b expressionserniedrigend und bewirkt ausgehend von einer erhöhten CD54-Grundexposition bei Hypertonie eine größere Amplitude der CD54-Expressionserhöhung bei Normalkontrollen. AT erniedrigt CD54 und erhöht CD11b. AT1-Antikörper- und LPS–Stimulation bewirken sowohl bei Hypertonikern als auch bei Normalkontrollen eine erhöhte Expression von CD54 und CD11b. Tendenziell reagiert bei Hypertonie ein höherer Anteil der Probanden auf LPSStimulation mit Expressionserhöhung von CD54 bzw. CD11b. Für die Stimulation mit AT- und AT1-AK sind keine Unterschiede bei Hypertonie feststellbar. Allerdings ist die Aussagekraft auf Grund der geringen Versuchsanzahl pro Gruppe bei sehr hoher Standardabweichung und heterogener Empfindlichkeit auf AT Stimulation (lt. Luft 2002) eingeschränkt. Quantitative Aussagen sind auf Grund der nicht identischen Versuchsanzahlen pro Gruppe nicht möglich.

Abbildung 37: Veränderte CD11b -Expression nach Inkubation. MW der CD11b-Fluoreszenz
(als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung (T0) bzw.
Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und
Normalkontrollen

Zur AT1-AK-Stimulation von CD11b wurden 13 weitere Versuche mit einem neu isolierten AT1-Autoantikörper höherer Reinheit durchgeführt. Da die Messungen bei veränderter Verstärkung durchgeführt wurden, konnten die Versuche nicht in den Vergleich HypertonieNormalkontrollen einbezogen werden, belegen jedoch ebenfalls eine signifikant erhöhte CD11bBasis-Expression (p=0.08) bei Bluthochdruck sowie eine signifikante Expressionserhöhung von CD11b (p=0.000) bei AT1-AK-Stimulation isolierter Monozyten (Abb.38). Der verwendete AT1-AK bewirkt bei Normalkontrollen und Hypertonikern eine Expressionserhöhung von CD11b auf 4-5fache Werte der Basalexpression.

Abbildung 38: Häufigkeitsverteilung der CD11b-Expressionshöhe (angegeben als MFI) bei AT1-
AK Stimulation, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und NK. Die unteren Diagramme stellen die
Verteilung bei unstimulierten, inkubierten Monozyten (T1) dar, jeweils darüber die CD11b-
Expression nach AT1-AK Stimulation.