1.  Einleitung

• 1.1. Die essentielle Hypertonie

• 1.2. Die Immunpathologie der essentiellen Hypertonie

• 1.3. Das Renin- Angiotensin- System in der Pathologie der Hypertonie

• 1.4. Periphere Monozyten

  • 1.4.1. Aktivierung peripherer Monozyten

• 1.5.  Adhäsionsmoleküle auf Monozyten

  • 1.5.1. Familien von Adhäsionsmolekülen

  • 1.5.2.  Adhäsionskaskade der Monozyten

  • 1.5.3. Pathologische Expression

• 1.6.  Hypertonie und Arteriosklerose

  • 1.6.1. Definition und Bedeutung von Arteriosklerose

  • 1.6.2. Entwicklung arteriosklerotischer Läsionen

  • 1.6.3. Ätiologie der Arteriosklerose

• 1.7.  Mögliche neue therapeutische Ansätze

  • 1.7.1. Beeinflussung des RAS durch AT-1-Rezeptor Antagonisten

  • 1.7.2.  Der Glykoprotein IIb/IIIa-Rezeptor Antikörper Abciximab

2.  Aufgabenstellung

3.  Methoden

• 3.1. Chemikalien

• 3.2. Einschlußkriterien der Studie

• 3.3.  Methoden der Monozytenisolierung

  • 3.3.1. Dichte-Gradienten-Zentrifugation

  • 3.3.2. Negativ-Isolierung mittels Dynabeads

  • 3.3.3. Isolierung mittels Adhäsion an Plastik

  • 3.3.4. Monozyten im Vollblut nach Erythrolyse

• 3.4.  Monozyten-Stimulation

• 3.5.  Bestimmung der Expression von Oberflächenmolekülen mittels FACS

  • 3.5.1. Meßprinzip

  • 3.5.2. Direkte und indirekte Membranimmunfluoreszenz

  • 3.5.3. Messung der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten

• 3.6.  Vitalitätsbestimmung

  • 3.6.1. Ausschlußfärbung mit Trypanblau

  • 3.6.2. Durchflußzytometrische Bestimmung der Vitalität

• 3.7.  Methode der mikroskopischen Immunfluoreszenz

• 3.8.  Datenanalyse

4. Ergebnisse

• 4.1. Methodenevaluation

  • 4.1.1. Reinheit und Vitalität der Monozyten nach Isolierung

  • 4.1.2.  Monozyten im Vollblut

  • 4.1.3. Monozyten nach Dichtegradientenzentrifugation

  • 4.1.4.  Einflußfaktoren auf die FACS Messung

• 4.2.  Adhäsionsmoleküle auf Monozyten bei Hypertonie

  • 4.2.1. CD54

  • 4.2.2.  CD11b

  • 4.2.3. CD11a

  • 4.2.4.  CD29

  • 4.2.5. CD31

  • 4.2.6.  CD44

  • 4.2.7. CD49d

  • 4.2.8.  CD62L

  • 4.2.9. 9eg7

• 4.3.  Einfluß von Stimulation auf die Expression von Monozytenadhäsionsmolekülen

  • 4.3.1. Veränderungen durch Inkubation

  • 4.3.2.  Stimulation mit LPS

    • 4.3.2.1. Adhäsionsmolekühl-Veränderungen durch LPS

    • 4.3.2.2.  Einfluß von Abciximab auf LPS stimulierte Monozyten

  • 4.3.3.  Stimulation mit Angiotensin II und AT1-AK

    • 4.3.3.1. Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch Angiotensin II

    • 4.3.3.2. Adhäsionsmolekül-Veränderungen durch AT1-Rezeptor Antikörper

    • 4.3.3.3.  Einfluß von Losartan auf AT bzw. AT1-AK stimulierte Monozyten

  • 4.3.4.  Unterschiede der Stimulation bei Hypertonie versus Normalkontrollen

5. Diskussion

• 5.1. Effekte von Monozytenisolierung und Inkubation auf die Adhäsionsmoleküle

• 5.2. Analyse möglicher Einflußfaktoren

• 5.3. Veränderte Adhäsionsmoleküle bei Hypertonie

• 5.4. Einfluß von Aktivatoren auf die Expression von Monozytenadhäsionsmolekülen

  • 5.4.1. LPS

  • 5.4.2. Angiotensin II

  • 5.4.3. Autoantikörper gegen den AT1-Rezeptor

• 5.5. Bedeutung von Tissue Faktor in der Angiotensin-induzierten Adhäsion

• 5.6. Wirkung von Abciximab auf MAC-1 isolierter Monozyten

6.  Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Danksagung

Eidesstattliche Versicherung

Tab. 1: Klassifikation des Blutdrucks für Erwachsene nach JNC-VI (Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure, 1997)

Tab. 2: Integrine, zusammengehörige α und β Einheit, von Monozyten exprimiert bei M=Ja

Tab. 3: Selektine und Immunglobuline zur Adhäsion auf Monozyten

Tab. 4: Klinische Parameter von Hypertonie- und Normalkontroll-Kollektiv zum Zeitpunkt der Blutentnahme

Tab. 5: Laborwerte und Normbereiche der Hypertonie-Patienten

Tab. 6: Aufstellung der zum Vergleich Normalkontrollen-Hypertonie gewerteten Versuche mit Angabe von Versuchsnummern, Geschlecht (m/f), Alter, systolischem Blutdruck (RRsys), diastolischem Blutdruck (RRdia) bei Probenentnahme

Tab. 7: Expression der Adhäsionsmoleküle nach Erythrolyse, Ficollzentrifugation und Bead- Isolierung (angegeben als MFI) für Versuch 28, 29 und 30

Tab. 8: Rang (U-Test) und Mittelwerte der CD54 Expression bei Hypertonie im Vergleich  zur Kontrolle (NK) (angegeben als MFI=Mittlere Fluoreszenz Intensität)

Tab. 9: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (angegeben als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation für 7h (T1) verglichen.

Tab. 10: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (in MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation für 7h (T1) verglichen.

Tab. 11: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD31 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation (T1) verglichen.

Tab. 12: T-Test für CD44 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD44 (als MFI) direkt nach Isolierung (T0) mit der Expression nach Inkubation (T1) verglichen.

Tab. 13: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach Stimulation mit LPS verglichen.

Tab. 14: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.

Tab. 15: T-Test für CD31 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD31 (als MFI) nach Inkubation (T1) und nach LPS-Stimulation verglichen.

Tab. 16: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT verglichen.

Tab. 17: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK verglichen.

Tab. 18: T-Test für CD54 bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD54 (angegeben als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK und AT1-AK in doppelter Konzentration (1:50) verglichen.

Tab. 19: T-Test für CD49d bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD49d (als MFI) nach Inkubation für 7h (T1) mit der Expression nach Stimulation mit AT1-AK verglichen

Tab. 20: T-Test für CD11b bei gepaarten Stichproben. In jeweils N Versuchen wurde die Expression von CD11b (als MFI) nach Stimulation mit AT bzw. AT1-AK mit der Expression nach Stimulation mit Losartan und AT ( AT+L) bzw. AT1-AK verglichen ( Versuche ohne ISO -AK, deshalb MW erhöht).

Tab. 21: Änderung der Adhäsionsmolekülexpression auf Monozyten durch Hypertonie, Inkubation, Stimulantion mit AT, AT1-AK, LPS:

Abbildung 1: Monozyt im Blutausstrich

Abbildung 2: Adhäsionskaskade (nach BD Katalog)

Abbildung 3: Dichte Gradienten-Zentrifugation zur Isolierung mononukleärer Zellen (MNZ)

Abbildung 4: Von Dyna-Beads isolierte T Lymphozyten (aus Dynal Produktinformation)

Abbildung 5: Negativisolierung von Monozyten

Abbildung 6: Aufbau eines dualen Durchflußzytometers mit sechs Detektionsparametern (aus Pharmingen Technical Protocols, S.887)

Abbildung 7: Färbung mit direkt fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur FACS Auswertung

Abbildung 8: Monozytendifferenzierung im Dot-Plot FSC-SSC-Bild durch Wahl von R1

Abbildung 9: Monozytendifferenzierung im CD14-APC-Histogramm durch Wahl von R2

Abbildung 10: Abgrenzung unspezifisch gefärbter PE-Isotyp-Kontrollen durch Wahl von M1

Abbildung 11: CD11b-PE Expression auf Monozyten (in G3=R1 und R2 und M1) im Histogramm, Auswertung des Mittelwertes ( in MFI)

Abbildung 12: Isolierte Monozyten im Phasenkontrast-Mikroskop

Abbildung 13: CD11a –FITC gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop

Abbildung 14:PI gefärbte Monozyten im Fluoreszenzmikroskop, Darstellung der Kerne

Abbildung 15: Zellen nach Erythrolyse im FACS als Dot-Plot

Abbildung 16: Zellen nach Ficoll-Zentrifugation a) Dot-Plot und b) zugehöriges FACS Histogramm der CD19 positiven B- Lymphozyten sowie c) der CD3 positiven T Lymphozytenpopulation in R1

Abbildung 18: CD54–PE Expression im FACS-Histogramm (in MFI)

Abbildung 19: Häufigkeitsverteilung der CD54-Expression in MFI bei NK und Hypertonie

Abbildung 20: Korrelation von CD54 Expression (in MFI) und diastolischem Blutdruck

Abbildung 21: CD11b Expression (angegeben als MFI) im FACS-Histogramm

Abbildung 22: Häufigkeitsverteilung der CD11b Expression(angegeben als MFI)  bei Kontrollen (MW=417) und Hypertonikern (MW=275)

Abbildung 23: Korrelation von CD11b-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck

Abbildung 24: Häufigkeitsverteilung der Expressionshöhe von CD11a für NK und Hypertonie

Abbildung 25: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und diastolischem Blutdruck

Abbildung 26: Korrelation von CD11a-Expression (als MFI) und Alter

Abbildung 27: Expression von CD29 (als MFI) auf Monozyten im FACS Histogramm

Abbildung 28: Häufigkeitsverteilung der CD29-Expression (als MFI) bei Hypertonie und NK

Abbildung 29: FACS Histogramm CD31(als MFI)

Abbildung 30: CD44-Expression im FACS Histogramm

Abbildung 31: FACS Histogramm CD49-PE

Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der CD49d-Expression in MFI bei Hypertonie und NK

Abbildung 33: FACS Histogramm CD62L

Abbildung 34: Wirkung von Abciximab (Reo) auf LPS stimulierte CD11b Expression (angegeben als MFI) in den Versuchen 60, 62, 63. Expression nach 7h Inkubation, nach LPS Stimulation (100ng/ml) und nach Inkubation mit ReoPro und LPS.

Abbildung 35: Abciximab erhöht die unstimulierte CD11b Expression (angegeben als MFI) in den Versuchen 60, 62, 63. Vergleich der Expression nach 7h Inkubation mit und ohne Abciximab (Reo).

Abbildung 36: Veränderte CD54 Expression nach Inkubation. MW der CD54-Fluoreszenz (angegeben als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung (T0) bzw. Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und Normalkontrollen

Abbildung 37: Veränderte CD11b -Expression nach Inkubation. MW der CD11b-Fluoreszenz (als MFI) nach Inkubation(T1) im Vergleich zur Expression direkt nach Isolierung (T0) bzw. Stimulation mit AT, AT1-AK (AK) und LPS, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und Normalkontrollen

Abbildung 38: Häufigkeitsverteilung der CD11b-Expressionshöhe (angegeben als MFI) bei AT1- AK Stimulation, aufgeschlüsselt für Hypertoniker und NK. Die unteren Diagramme stellen die Verteilung bei unstimulierten, inkubierten Monozyten (T1) dar, jeweils darüber die CD11b- Expression nach AT1-AK Stimulation.