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2.  Material und Methoden

2.1. Grundlagen des Phosphorescence Quenching

2.1.1. Begriffsklärungen

Zunächst sollen die für das Verständnis der physikalischen Grundlagen der hier verwendeten Methode des Phosphorescence Quenching wichtigen physikalischen Begriffe erläutert werden. Die Reihenfolge wurde dabei so gewählt, dass die Erläuterungen der Begriffe aufeinander aufbauen können.

Quantenausbeute: Die Quantenausbeute (Φ) eines photophysikalischen Prozesses ist definiert als Verhältnis aus Anzahl der Umwandlungen (nu) zur Anzahl der absorbierten Photonen (np).

Spin: Jedes Elektron eines Atoms besitzt einen Eigendrehimpuls, der Spin genannt wird. Mit diesem Eigendrehimpuls ist ein magnetisches Moment verbunden.

Spinquantenzahl: Man unterscheidet zwei Arten des Spins (anschaulich: Drehrichtungen des Elektrons), die Elektronen erhalten so die Spinquantenzahl +1/2 oder -1/2. Die Spinquantenzahlen aller Elektronen addieren sich zur Gesamtspinquantenzahl S, meist ist S=0 (gleichviele Elektronen mit S= +1/2 und S= -1/2), existiert ein ungepaartes Elektron so ist S=1/2 (selten, da solche Elemente meist Verbindungen eingehen und die Elektronen anschließend gepaart vorliegen), manchmal liegen zwei Elektronen mehr mit dem Spin +1/2 vor als Elektronen mit dem Spin -1/2 (z.B. beim O2), dann ist S=1.

Multiplizität: Die Multiplizität M des elektronischen Zustandes eines Moleküls oder Atoms ergibt sich aus M = 2*S+1 (S ist die Spinquantenzahl).

Singulett-Zustand: Im Singulett-Zustand eines Atoms oder Moleküls ist die totale Elektronenspin-Quantenzahl S = 0 (also M=1, daher der Name Singulett-Zustand).


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Triplett-Zustand: Im Triplett-Zustand eines Atoms oder Moleküls ist die totale Elektronenspin-Quantenzahl S=1 (also M=3, daher der Name Triplett-Zustand).

Spinauswahlregel: (Multiplizitätsauswahlregel) Diese Regel verbietet Energieübergänge innerhalb eines Atoms oder Moleküls, bei denen sich die totale Elektronenspin-Quantenzahl ändert. Spinverboten sind also Übergänge vom Triplett in den Singulett-Zustand und umgekehrt. Das bedeutet, dass solche Übergänge sehr unwahrscheinlich sind, oder, anders formuliert, dass die Halbwertszeiten dieser Übergänge sehr groß sind.

Internal Conversion: (innere Umwandlung) Als Internal Conversion bezeichnet man die strahlungslose Umwandlung eines elektronischen Zustands eines Moleküls in einen anderen.

Intersystem Crossing: Beim Intersystem Crossing erfolgt ein eigentlich spinverbotener (nach der Spinauswahlregel) Übergang zwischen Zuständen unterschiedlicher Multiplizität (also von einem Singulett in einen Triplett-Zustand oder umgekehrt). Dass der Übergang spinverboten ist, bedeutet, dass die Lebensdauer des Ausgangszustandes besonders lang ist.

Jablonski-Diagramm: Das Jablonski-Diagramm stellt die elektronischen Zustände eines Moleküls sowie die Umwandlung dieser Zustände dar.

Intermolekularer Energietransfer: Nähern sich Moleküle oder Atome bis auf einen sehr geringen Abstand aneinander an, so besteht die Möglichkeit, dass die Energie des einen, zuvor (z.B. durch Lichtabsorption) angeregten, Atoms oder Moleküls an das andere abgegeben wird:

D, A: zwei verschiedene Teilchen

hν: Lichtquant, das vom Teilchen D absorbiert wird

D*, A*: angeregter Zustand der Teilchen

Absorption von Licht: Atome und Moleküle sind in der Lage Licht zu absorbieren. Dabei wird das Atom oder Molekül in einen angeregten Zustand versetzt, indem es die mit dem Lichtquant aufgenommene Energie dazu benutzt, einen höheren elektronischen Zustand [Seite 33↓]einzunehmen. Dieser angeregte Zustand ist instabil, das Teilchen hat nun verschiedene Möglichkeiten, in den Grundzustand zurückzukehren:

  1. Die Energie kann in Schwingungsenergie des Teilchens umgewandelt werden (internal conversion (s.o.))
  2. Die Energie kann in Form von Strahlung wieder abgegeben werden. Geht das Teilchen dabei von einem angeregten Singulett-Zustand in einen Singulett-Grundzustand oder von einem angeregten Triplett-Zustand in einen Triplett-Grundzustand über, so spricht man von Fluoreszenz . Dieser Übergang ist spinerlaubt nach der Spinauswahlregel (die Gesamtspinquantenzahl ändert sich nicht) und hat daher eine sehr kurze Lebensdauer (im Bereich von 10-8 bis 10-9 s). Zur Phosphoreszenz s.u..
  3. Die Energie kann an ein anderes Teilchen abgegeben werden: intermolekularer Energietransfer (s.o.)
  4. Die Energie kann für chemische Reaktionen genutzt werden. Man unterscheidet primäre und sekundäre photochemische Reaktionen: Zu den primären photochemischen Reaktionen zählen: Die Spaltung in freie Radikale , die Dissoziation der Moleküle , die Umlagerung , Isomerisierung , die Abspaltung eines H-Atoms , die Dimerisierung und die Wirkung als Sensibilisator (s.u.). Ist das Produkt eines photochemischen Primärprozesses instabil, so folgt ein Sekundärprozess.

2.1.2. Phosphoreszenz

Auch Phosphoreszenz beginnt zunächst damit, dass ein Teilchen (Atom oder Molekül) ein Lichtquant absorbiert. Das Teilchen geht dabei durch Intersystem Crossing (s.o.) vom Singulett- in den Triplett-Zustand über (oder umgekehrt ). Auch dann kann es seinen Grundzustand wieder über die Abgabe eines Lichtquants erreichen, man spricht von Phosphoreszenz. Bei der Phosphoreszenz ändert das Teilchen also im Gegensatz zur Fluoreszenz bei der Emission des Lichtquants seine Multiplizität. Da dieser Übergang zwischen Zuständen unterschiedlicher Multiplizität eigentlich nach der Spinauswahlregel verboten ist, ist die Lebensdauer dieses Prozesses wesentlich größer als bei der Fluoreszenz.


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Abb. 4 : Jablonski-Diagramm der Teilprozesse bei der Phosphoreszenz. Durch Absorption eines Photons (1) geht des absorbierende Molekül vom Singulett-Grundzustand S0 in einen angeregten Singulett-Zustand über (hier S2). Durch (2) Internal Conversion (strahlungslos) relaxiert das Molekül in den angeregten Singulett-Zustand S1. Durch Intersystem Crossing (3) und Internal Conversion (4) geht es in den ersten angeregten Triplett-Zustand T1 über. Der Übergang von hier aus in den Singulett-Grundzustand S0 ist eigentlich spinverboten und hat deshalb eine lange Lebensdauer, diesen Übergang (5) bezeichnet man als Phosphoreszenz, hierbei wird ein Lichtquant emittiert.

2.1.3. Phosphorescence Quenching

Manche phosphoreszierenden Substanzen können die mit einem Lichtquant aufgenommene Energie, durch die sie zunächst selbst in den Triplett-Zustand versetzt werden, an andere Moleküle abgeben: Dabei geht das aufnehmende Molekül in einen angeregten Zustand über, das abgebende in den Grundzustand (diesen Prozess bezeichnet man als intermolekularen Energietransfer, s.o.). Dieser intermolekulare Energietransfer ist z.B. möglich zwischen bestimmten Porphyrinen und Sauerstoff: Das durch Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge in den Triplett-Zustand versetzte Porphyrin gibt die Energie bei einer Kollision mit einem Sauerstoff-Molekül an dieses ab und geht dabei strahlungslos selbst wieder in den Grundzustand über. Der Sauerstoff geht vom Triplett- in den Singlett-Zustand über („intersystem crossing“) und hat nun unterschiedliche Möglichkeiten, die [Seite 35↓] aufgenommene Energie abzugeben: Internal Conversion, Phosphoreszenz ( dies geschieht mit sehr geringer Quantenausbeute) oder chemische Reaktionen (Photosensibilisierung, s.u.). Für das angeregte Porphyrin gibt es demnach im wesentlichen zwei Möglichkeiten, seine Energie abzugeben:

  1. Phosphoreszenz
  2. intermolekularer Energietransfer auf den Sauerstoff. Da bei der Übertragung der Energie auf den Sauerstoff normalerweise kein Licht emittiert wird (es sei denn, der dann angeregte Sauerstoff geht durch Phosphoreszenz in den Grundzustand über, was aber mit sehr geringer Quantenausbeute geschieht), spricht man bei diesem Vorgang von „Phosphorescence Quenching“: Löschung der Phosphoreszenz.

Dabei ändert sich die Lebensdauer der Phosphoreszenz des Porphyrins in Abhängigkeit von der Anzahl der Kollisionen des Sauerstoffs mit dem Porphyrin. Diese Anzahl wiederum ist abhängig von der Konzentration des Sauerstoffs, der Temperatur (je höher die Temperatur desto mehr Kollisionen), im Blut von der Bindung des Porphyrins an Albumin (dort gebunden ist das Porphyrin teilweise vor der Kollision mit Sauerstoff geschützt), also der Albuminkonzentration, der NaCl-Konzentration, dem pH-Wert usw..

Die Lebensdauer der Phosphoreszenz ist nicht abhängig von der Konzentration des Porphyrins . Mit der Konzentration des Porphyrins ändert sich lediglich die Intensität des emittierten Lichts, die Lebensdauer der Emission bleibt konstant. Die genannten Abhängigkeiten werden durch die Stern-Volmer-Gleichung mathematisch beschrieben.


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Abb. 5 : Jablonski-Diagramm der Teilprozesse des Phosphorescence Quenching. Zunächst laufen beim Phosphorescence Quenching die gleichen Prozesse wie bei der Phosphoreszenz ab: Nach Absorption des Photons (1) und Internal Conversion (2 und 4) sowie Intersystem Crossing (3) befindet sich das Molekül ( hier der für die Versuche verwendete Farbstoff Oxy-Phor-R2) im angeregten Triplett-Zustand. Von hier aus sind nun zwei Prozesse möglich: Phosphoreszenz des Farbstoffs (5) oder intermolekularer Energietransfer auf den Sauerstoff (6). Sauerstoff hat einen Triplett-Zustand als Grundzustand (zwei ungepaarte Elektronen mit dem Spin +1/2, folglich die Gesamtspinquantenzahl S=1, damit die Multiplizität M=3), geht daher bei diesem Energietransfer, der während einer Kollision der Moleküle stattfindet (und dessen Häufigkeit damit von der Sauerstoffkonzentration abhängt ), in einen angeregten Singulett-Zustand über. Von hier aus hat wiederum das angeregte Sauerstoffmolekül mehrere Möglichkeiten: Rückkehr in den Grundzustand (über strahlungsloses Intersystem Crossing (8)), Phosphoreszenz, oder Eingehen einer chemischen Reaktion (Photosensibilisierung, s.u.)

2.1.4. Stern-Volmer-Gleichung

Die Stern-Volmer-Gleichung bietet die Möglichkeit, durch Bestimmung der Lebensdauer der Phosphoreszenz bestimmter Substanzen den Sauerstoffpartialdruck in ihrer unmittelbaren Umgebung zu errechnen. Vorraussetzung dafür ist die Kenntnis der Lebensdauer bei pO2 = 0 mmHg (T0 ) und einer substanzspezifischen Konstanten kq , die Konzentration der Substanz selbst hingegen muss nicht bekannt sein (sie hat keinen Einfluss auf die pO2 -Berechnung). Die experimentelle Bestimmung von T(pO2 ) wird später [Seite 37↓] ausführlich beschrieben. T0 und kq müssen dazu nicht bestimmt werden, sondern können der Literatur entnommen werden (s.u.):

dabei ist

T0 die Lebensdauer der Phosphoreszenz bei pO2 =0.

T(pO2 ) die Lebensdauer der Phosphoreszenz bei gegebenem pO2

kq eine Konstante, die Temperatur, pH, Eigenschaften der phosphoreszierenden Substanz usw. zusammenfasst

pO2 der gegebene Sauerstoffpartialdruck

2.1.5. pO2 -Messung mittels Phosphorescence Quenching

Steht eine geeignete Substanz zur Verfügung, für die die Stern-Volmer-Gleichung zutrifft, so bietet die Messung der Lebensdauer der Phosphoreszenz dieser Substanz eine attraktive Möglichkeit für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration (die dann über die Stern-Volmer-Gleichung errechnet werden kann). Der Vorteil dieser Methode für Messungen des pO2 in Geweben besteht insbesondere darin, dass sie nichtinvasiv ist (abgesehen von der Injektion der Substanz), folglich insbesondere für Messungen in vivo und in empfindlichen Geweben eine wichtige Alternative darstellt. Zudem bietet sie eine exzellente Zeitauflösung (im Bereich von mehreren Millisekunden). Etliche Substanzen sind für die Anwendung entwickelt worden. Für unsere Messungen erschien eine von Lo et al. (Lo 1997) entwickelte Substanz, ein modifiziertes Pd-meso-tetra-(4-carboxyphenyl)-Porphyrin am geeignetsten:

2.1.6. Oxy-Phor-R2 (Pd-meso-tetra -(4-Carboxyphenyl)-Porphyrin)

Im Gegensatz zum einfachen Pd-meso-tetra-(4-Carboxyphenyl)-Porphyrin, das nur schlecht in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst werden kann und daher vor der Injektion an Albumin gebunden werden musste (so dass eine große Menge fremden Proteins mit injiziert wurde), ist Oxy-Phor R2 leicht in NaCl löslich. Die Löslichkeit wir durch 16 an das Porphyrin gebundene Carboxyl-Gruppen erreicht (Lo, 1997). Die Bindung an Albumin [Seite 38↓] erfolgt nach der Injektion im Blutgefäßsystem und bietet zwei wichtige Vorteile: Zum einen verbleibt die Substanz im Blutgefäßsystem. Diese Eigenschaft ist besonders dann wichtig (wie im Fall der vorliegenden Arbeit), wenn Aussagen über den dort herrschenden pO2 , nicht über den des Gewebes gemacht werden sollen. Zum anderen schützt die Bindung an Albumin teilweise vor Kollisionen mit Sauerstoff, so dass die zu erwartenden Lebensdauern der Phosphoreszenz in einem gut messbaren Bereich liegen (von ca. 16 μ s bei pO2 =150 mmHg bis etwa 600 μ s bei pO2 = 0 mmHg). Die Toxizität der Substanz, die z.B. aufgrund der Photosensibilisierungsreaktionen (s.u.) bestehen könnte, wurde an Mäusen mit Konzentrationen von 77 mg/kg KG und 231 mg /kg KG von Oxy-Phor R2 (als Bolus injiziert) getestet: Histophatologisch ließen sich auch bei 231 mg/kg KG keine Gewebsschädigungen nachweisen, weder 1 noch 5 noch 10 Tage nach der Injektion (Lo, 1997). Da bei diesen Versuchen allerdings die Auswirkung der Einstrahlung definierter Lichtmengen nicht getestet wurde, bleibt offen, inwieweit es bei durch Lichteinstrahlung gesteigerter Radikalproduktion nicht doch zu Schädigungen des Gewebes kommen kann. Oxy-Phor R2 wird mit einer Halbwertszeit von 2-3 h über die Nieren ausgeschieden. Da die Sauerstoffmessung aber nicht von der Konzentration des Porphyrins abhängig ist (lediglich die Intensität, nicht die Lebensdauer der Phosphoreszenz ändert sich, s.o.), beeinträchtigt diese Tatsache die Messungen nicht (erforderlich ist höchstens ein nachinjizieren der Substanz bei sehr langen Messungen). Für Oxy-Phor R2 geben die Hersteller folgende Kalibrationswerte an (Lo, 1997):

Bei pH = 7.4 und Temp.= 38°C, bei physiologischer Albumin- und (NaCl)-Konzentration ist

kq = 409 *1/(torr*sec)

T0 = 601 μ sec

Absorptionsmaximum für die Anregung der Phosphoreszenz: 524 nm

Emissionsmaximum der Phosphoreszenz: 695 nm


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Abb. 6 : Absorptionsspektrum von Oxy-Phor R2 (eigene Messung). Das in physiologischer NaCl-Lösung gemessene Spektrum zeigt die maximale Absorption von Oxy-Phor R2 bei ca. 520nm (Herstellerangaben: 524 nm). Der Filter für das Anregungslicht wurde daher als Bandpassfilter 520 ± 10nm gewählt.

2.1.7. Photosensibilisierung

Die verwendete Substanz, Oxy-Phor R2, gehört der Substanzklasse der Porphyrine an, ubstanzen, die in der photodynamischen Therapie (z.B. bestimmter Hauterkrankungen) Verwendung finden. Der dabei genutzte Mechanismus wird als Photosensibilisierung bezeichnet. Die ersten Schritte dieser Reaktionen sind die oben genannten: Nach Absorption eines Photons, Internal Conversion und Intersystem Crossing befindet sich das Porphyrin im ersten angeregten Triplett-Zustand. Durch intermolekularen Energietransfer wird die Energie auf ein Sauerstoffmolekül übertragen, wodurch dieses in den ersten angeregten Singulett-Zustand übergeht. Das Porphyrin geht dabei in den Grundzustand über und kann erneut ein Lichtquant absorbieren, wirkt in dieser Reaktion also als Katalysator:

  1. S0(Sen) + hν→ S1(Sen)
  2. S1(Sen) → T1(Sen)
  3. T1(Sen) + O2→ S0(Sen) + 1 O2


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Sen: Sensibilisator, S0: Singulett-Grundzustand, S1: erster angeregter Singulett-Zustand, T1: erster angeregter Triplett-Zustand, 1O2: Sauerstoffmolekül im ersten angeregten Singulett-Zustand.

Das sich im angeregten Singulett-Zustand befindende Sauerstoffmolekül hat dann verschiedene Möglichkeiten, die Energie abzugeben: Mit geringer Quantenausbeute erfolgt ein strahlender Übergang in den Triplett-Grundzustand (Phosphoreszenz, s.o.), wahrscheinlicher erfolgt dieser Übergang jedoch strahlenlos (Internal Conversion). Neben diesen beiden Prozessen kann der Sauerstoff die aufgenommene Energie auch in chemische Reaktionen investieren, diese Reaktionen bezeichnet man als Photooxidationen. Solche Reaktionen sind in der Lage Veränderungen im Gewebe hervorzurufen, bei der photodynamischen Therapie ist die erwünschte Veränderung das Absterben von neoplastischen Zellen. Es soll an dieser Stelle deshalb darauf hingewiesen werden, dass unter den Bedingungen des Experimentes durch das injizierte Porphyrin und die von diesem induzierten photochemischen Reaktionen möglicherweise Veränderungen im Gehirngewebe hervorgerufen wurden. Da allerdings die verwendete Substanz Oxy-Phor R2 im Blut an Albumin bindet kann davon ausgegangen werden, dass auch der größte Teil des entstandenen Singulett-Sauerstoffs (aufgrund der extrem geringen Lebensdauer dieses Singulett-Zustands im Bereich von Nano- bis Mikrosekunden) den Blutgefäßraum nicht verlassen hat. Für die zytotoxische Wirksamkeit des Singulett-Sauerstoffs in der photodynamischen Therapie ist die Verteilung des Sensibilisators in den Zellen besonders wichtig. Somit ist anzunehmen, dass während der Experimente nur geringste, die Messung nicht beeinträchtigende, Gewebsveränderungen aufgetreten sind. Die oben genannten Untersuchungen über die Toxizität von Oxy-Phor R2 deuten in die gleiche Richtung.


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2.2.  Versuchsaufbau und Versuchsdurchführung

2.2.1. Liste der verwendeten Materialien

  1. Versuchstiere: männliche Wistar-Ratten (Charles River, Deutschland), 250-350g Körpergewicht.

  1. Material für Präparation, Narkose, Physiologie:
    Respirator: Effenberger, Pfaffing/Attel, Deutschland
    Blutdruckmonitor: RFT Biomonitor, Zwönitz, Deutschland
    Atemgasmonitor: Heyer Artema MM 200, Bad Ems, Deutschland, (endexspiratorische Messung von CO2 und N2O sowie Atemfrequenz)
    Blutgasanalyse: AVL Compact 3 Blood Gas Analyzer, (Analyse von Blut aus der A. femoralis. Gemessen wurden pO2 , pCO2 , pH, Bikarbonat und BE)
    Narkose: Isofluran (Vapor 19.3, Drägerwerk, Deutschland), N2 O, α -Chloralose und Urethan über Perfusorsystem
    Heizplatte: Eigenbau, Labor für experimentelle Neurologie der Charite, Berlin, Deutschland
    Temperaturmonitor: RFT Biomonitor, Zwönitz, Deutschland

  1. Material für den Aufbau Optical Imaging
    Objektive: Nikkor 50mm, 1:1,2 (2 Stück)
    Camera: analoge CCD-Kamera
    Imaging-System: Imager 2001, Optical Imaging Inc., Germantown, USA
    Filter: Bandpassfilter 570nm

  1. Material für den Aufbau Phosphorescence Quenching
    Objektive: s.o. + Nikkor 135mm, 1:2,8
    Flash-Lamp: LS-1130 Flashpac
    Photomultiplier: Hamamatsu H5702-50, Hamamatsu Photonics, Herrsching, Deutschland
    [Seite 42↓]Lichtleiter: Eigenbau
    Filter: cut-off 590 nm
    Dichroitischer Spiegel: cut-off bei 600 nm
    Oxy-Phor R2: Oxygen Enterprises Ltd., Philadelphia, PA, USA

  1. Computerprogramme
    LabView, Version 4.1
    MatLab, Version 5.0.0

2.2.2. Präparation der Versuchstiere

Die Tiere wurden zunächst mit Isofluran 4% in 100% Sauerstoff für ca. 60 sec betäubt, anschließend über eine Maske mit 3% Isofluran in 70% N2 0 und 30% Sauerstoff in Allgemeinnarkose gehalten. Über eine rektal eingeführte Sonde wurde die Körpertemperatur kontinuierlich gemessen und über eine Heizplatte konstant bei 38 ± 0.5° C gehalten. Die Trachea wurde freipräpariert und eingeschnitten, ein kleiner Plastikschlauch eingeführt, an der Trachea fixiert und das Tier über den Respirator mit einer Frequenz von ca. 60/min und einem Volumen von (je nach Gewicht) ca. 4 ml mit 0.8-1.5% Isofluran in 70% N2 O und 30% Sauerstoff beatmet. Die endexspiratorische Konzentration von CO2 und N2 O sowie die Atemfrequenz wurden über einen Atemgasmonitor kontinuierlich gemessen. Anschließend wurden die A. femoralis und V. femoralis dargestellt und kannüliert, über die Arterie wurde kontinuierlich der mittlere arterielle Druck gemessen, in Intervallen wurde zur Blutgasanalyse aus der A. femoralis Blut entnommen und pO2 , pCO2 , pH und Bikarbonat bestimmt. Die Vene wurde zunächst mit physiologischer Kochsalzlösung (1ml/h) perfundiert, nach dem Ende der Präparation wurde über diesen venösen Zugang α -Chloralose und Urethan (als Bolus 40mg α -Chloralose pro kg Körpergewicht und 400mg Urethan pro kg Körpergewicht, anschließend die gleiche Menge als kontinuierliche Infusion pro Stunde) gegeben.

Die Tiere wurden dann in einen stereotaktischen Rahmen eingespannt und der Kopf auf beiden Seiten über Metallstifte, die in den äußeren Gehörgang eingeführt wurden, fixiert. Nach einer medianen Hautinzision wurde der rechte M. temporalis nach lateral abpräpariert und der Schädelknochen dargestellt. Mit Hilfe eines Bohrers wurde unter ständiger Kühlung mit NaCl-Lösung ein Rechteck aus dem Schädelknochen herausgelöst. Der Mittelpunkt des [Seite 43↓] Rechtecks lag dabei ca. 7mm lateral und 3 mm kaudal zum Bregma. Um dieses "Fenster" wurde ein Wachswall am Schädelknochen so befestigt, das kein Blut am Schädelknochen entlang in das Fenster eindringen konnte. Die meningealen Gefäße (A. meningea media) wurden vorsichtig (ohne das darunter liegende Gehirngewebe zu schädigen) verödet (Microcautery), das Fenster wurde mit NaCl-Lösung aufgefüllt und mit einem feinen Deckglas verschlossen.

Da aufgrund der Inzisionen beim Kannülieren der Gefäße und der Trachea sowie bei der Präparation des Fensters erhebliche Schmerzreize gesetzt werden, musste die Anästhesie eine analgetische Komponente enthalten. Zusätzlich sollte das verwendete Anästhetikum jedoch einen möglichst geringen Einfluss auf die neurovaskuläre Kopplung und die im somatosensorischen Kortex evozierten Potenziale haben.

Bei der Wahl des Anästhetikums während der Durchführung der Versuche bestanden im wesentlichen drei Möglichkeiten (Lindauer 1993):

  1. Das Fortführen der Isofluran/Lachgas-Narkose: Da Isofluran (oder Halothan) zu deutlichen Schwankungen des Ruheflusses im Gehirn führt, ist diese Narkoseform für Messungen der Blutflussantworten schlecht geeignet
  2. Narkose mit Barbituraten: Diese reduzieren den kortikalen Metabolismus und vermindern die Blutflussantwort, auch diese Narkoseform scheint für Messungen der Blutflussantwort auf funktionelle Stimulation ungeeignet
  3. α -Chloralose und Urethan: Dabei bleiben evozierte Potenziale und Blutflussantwort weitgehend erhalten. Diese Narkoseform erscheint daher für Messungen der Blutflussantwort am besten geeignet

Nach Ende der Präparation wurde daher die Anästhesie auf α -Chloralose und Urethan (α -Chloralose 40 mg / kg KG als Bolus, anschließend die gleiche Menge pro Stunde i.v., Urethan 400 mg /kg KG als Bolus und anschließend die gleiche Menge pro Stunde i.v.) umgestellt und frühestens 30 min. nach Narkoseumstellung mit den Messungen begonnen.


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2.2.3.  Ziel der Versuche

Das Ziel der nun folgenden Versuche war zunächst die Darstellung desjenigen Areals von Nervenzellen im Kortex, die bei der Stimulation eines Barthaares (Single-Whisker-Stimulation) aktiviert sind. Diese Darstellung erfolgte über das unten beschriebene Imaging-System, das Absorptionskarten des im freipräparierten Fenster sichtbaren Kortex erstellt. Die Absorption (gemessen bei 570nm, einem der isosbestischen Punkte des Hämoglobins) nimmt stimuluskorreliert mit dem aufgrund der neurovaskulären Kopplung steigenden Blutvolumen zu, zu sehen sind dann Areale erhöhten Blutvolumens während der Stimulation, die gut mit den Arealen der neuronalen Aktivität korrelieren. Anhand der Lokalisation über das Imaging-System konnte dann der Lichtfleck des Anregungslichtes für die Messung der Sauerstoffkonzentrationsänderungen mittels Phosphorescence Quenching an der richtigen Stelle (Stelle der neuronalen Aktivierung während der Stimulation des Barthaares) fokussiert werden, die Messung der Sauerstoffkonzentrationsänderungen in Abhängigkeit von der neuronalen Aktivität waren dann das Ziel dieser Arbeit.

2.2.4. Aufbau des Optical Imaging

Abb. 7 : Aufbau des Optical Imaging. Das kranielle Fenster wird mit Licht von 570 nm (einer der isosbestischen Punkte des Hämoglobins) beleuchtet. Das reflektierte Licht wird über ein Makroskop (bestehend aus zwei 50 mm Objektiven) auf den Chip einer CCD-Kamera fokussiert. Die gemessenen Intensitätswerte werden über das Imager 2001 Video-System verarbeitet, gespeichert und auf dem Bildschirm als Absorptionsbild des Kortex dargestellt. Das Imager 2001-System kontrolliert gleichzeitig über den Master-8 die mechanische Stimulation des ausgewählten Barthaares.

2.2.5. Versuchsdurchführung des Optical Imaging

Über das oben dargestellte Imaging-System wurden mit dem Ziel der Lokalisation des zum stimulierten Barthaar gehörenden Barrels Absorptionsbilder des Kortex bei 570nm Wellenlänge aufgenommen. Da 570nm ein isosbestischer Punkt des Hämoglobins ist (die Absorption von oxy- und deoxy-Hb ist hier gleich groß), lassen sich somit Blutvolumenveränderungen nachweisen, die mit der vaskulären Antwort auf eine neuronale Aktivierung einhergehen. Es wurden Bilder mit einer Frequenz von ca. 1,7 Hz aufgenommen, pro Block zwei Baselines und zwei Stimulationen, die Gesamtdauer der Bildaufzeichnung pro Baseline bzw. Stimulation betrug 7s, die Stimulation des Barthaares (meist B1 oder B2) erfolgte 2s nach Beginn der Aufzeichnung für 4s bei 4Hz (mechanische Auslenkung des Barthaares um ca. 5-10° ). Auf dem Bildschirm stellt das System (Imager 2001) zwei unterschiedliche Bilder dar: Das erste Bild zeigt die gemittelten ersten Baselines der Blöcke geteilt durch die gemittelten zweiten Baselines der Blöcke (zu sehen ist also das Rauschen). Angegeben werden dazu die mittlere Absorption und die Standardabweichung der mittleren Absorption der Baselines. Das zweite Bild zeigt die gemittelten Stimulationsbilder geteilt durch die gemittelten Baselines. Auch hierfür werden Mittelwert und Standardabweichung angegeben. Auf diesem zweiten Bild ist folglich der durch die Stimulation zur Baseline hervorgerufene Unterschied der Absorption zu sehen. Dieser Unterschied ist besonders deutlich im Bereich der durch die Stimulation hervorgerufenen neuronalen Aktivierung (die mit einer Blutvolumenzunahme einhergeht). Mit Hilfe dieses Bildes kann das zum Haar gehörende Barrel lokalisiert werden. Zur Kontrolle, dass die dargestellte Region mit verstärkter Absorption nicht durch zufällige Veränderungen des Blutvolumens (z.B. im Rahmen von spontanen Vasomotionen) zustande kam, wurden die Standardabweichungen der Absorptionen zwischen Baselines und Stimulationen verglichen. Zusätzlich wurde die Möglichkeit des Imager 2001-Systems genutzt, den Zeitverlauf der Absorption für eine bestimmte, vorher auszuwählende Region des Bildes (das sogenannte Superpixel) anzeigen zu lassen. Dieser Zeitverlauf musste der bei einer Stimulation erwartete sein (Absorptionszunahme ein bis zwei Sekunden nach Stimulationsbeginn).[Seite 46↓] Da die Messung der Sauerstoffkonzentrationsveränderungen mit dem Phosphorescence Quenching in der Mikrozirkulation erfolgen sollten, wurde das zunächst ausgewählte Haar gewechselt, falls das zugehörige Barrel in unmittelbarer Nähe oder unter einem größeren pialen Blutgefäß lag.

2.2.6. Aufbau des Phosphorescence Quenching

Abb. 8 : Darstellung des Versuchsaufbaus für das Phosphorescence Quenching: Der Computer gibt das Trigger-Signal für die flash lamp und den Stimulator über den Master 8 aus. Das weiße Licht der flash lamp passiert den Bandpassfilter und wird dadurch auf die Wellenlängen 510-530 nm eingeengt. Durch das 135 mm und das 50 mm-Objektiv wird ein kreisrunder Lichtfleck (ca. 1,3 mm Durchmesser) auf den Kortex des Versuchstieres fokussiert. Das auf den Kortex treffende Licht regt den in den Blutgefäßen befindlichen Farbstoff zur Phosphoreszenz an. Das Phosphoreszenz-Licht ist Licht einer wesentlich höheren Wellenlänge (ca. 695nm). Vom direkt reflektierten Anregungslicht wird es durch den dichroischen Spiegel (dieser reflektiert Licht über 590 nm und lässt Licht unter 590nm passieren) und den 590nm cut-off Filter getrennt. Das Phosphoreszenz-Licht wird durch die Optik (zwei 50mm Objektive) auf den Lichtleiter des Photomultipliers fokussiert, die Intensitätswerte werden im Photomultiplier gemessen, die Daten an den Computer weitergegeben und dort für die spätere Analyse gespeichert.

2.2.7. Versuchsdurchführung des Phosphorescence Quenching

  1. Single-Whisker-Versuche

Nach Ende der Präparation wurde den Versuchstieren über den venösen Zugang Oxy-Phor R2 (40 mg /kg Körpergewicht) in ca. 1ml physiologischer NaCl-Lösung gelöst injiziert. Da Oxy-Phor-R2 im Blut an Albumin bindet, verbleibt es im Blutgefäßsystem (Lo, 1997). Nachdem mit Hilfe des Optical Imaging (s.o.) die Lokalisation des zum stimulierten Haar (meist B1 oder B2) gehörenden Whisker-Barrels identifiziert wurde, wurde zunächst der Lichtfleck des Anregungslichts auf diese Stelle fokussiert. Dieser Lichtfleck hatte einen Durchmesser von etwa 1,3 mm. Das vom Kortex emittierte Licht wurde anschließend auf den zum Photomultiplier führenden Lichtleiter fokussiert.

Die Anregung der Phosphoreszenz erfolgte mit Hilfe einer flash-lamp, das Licht wurde durch einen Bandpassfilter (520 ± 10nm) auf die erwünschte Anregungswellenlänge eingeengt. Die Intensität der durch dieses Anregungslicht hervorgerufenen Phosphoreszenz (ca. 695 nm Wellenlänge) wurde mit Hilfe des Photomultipliers gemessen, die Daten an den Computer weitergegeben und gespeichert.

Es wurden pro Stimulation 15s oder 20s lang mit einer Frequenz von 100Hz Lichtblitze erzeugt und mit der gleichen Frequenz und Dauer Phosphoreszenzkurven gemessen. Pro Phosphoreszenzkurve wurden mit einer Frequenz von 1Mhz 500 Intensitätswerte gespeichert, der erste 20 μ s vor dem Intensitätsmaximum, der letzte 480 μ s danach. Zwei bzw. vier Sekunden nach Beginn der Datenaufzeichnung (also nach 200 bzw. 400 Lichtblitzen) wurde das ausgewählte Haar mit Hilfe des mechanischen Stimulators vier Sekunden lang bewegt (Auslenkung etwa 5-10° , Frequenz 4Hz). Die Intensitätswerte wurden später mit Hilfe des unten beschriebenen Programms analysiert. Dabei wurde zunächst mittels eines monoexponentiellen Fits die Lebensdauer und daraus über die Stern-Volmer-Gleichung der pO2 berechnet.

Es wurden in zufälliger Reihenfolge 15 bzw. 20s -Blöcke von Daten mit Stimulation des Barthaares (Stimulations-Blöcke) und ohne Stimulation des Barthaares (Baseline-Blöcke) [Seite 48↓] aufgenommen. Es wurden unterschiedlich viele Stimulationen pro Tier durchgeführt, je nachdem wie lange die systemphysiologischen Daten (Blutdruck, endexspiratorischer pCO2 , Blutgase) im erwünschten Rahmen blieben.

  1. Whole-Pad Versuche

Die Stimulation aller Barthaare gemeinsam (Whole-pad Stimulation) wurde im Prinzip genauso wie die Single-Whisker Stimulationen durchgeführt. Da das Areal der aktivierten Neurone hierbei wesentlich größer ist als bei der Stimulation eines einzelnen Whiskers konnte auf das vorausgehende Optical Imaging verzichtet werden. Die Lokalisation des Areals wurde anhand der Architektur der pialen und meningealen Gefäße (s.o.) festgelegt. Die Stimulation (auch hier Beginn nach 2s, 4s Dauer mit 4Hz) der zusammengeklebten Whisker wurde mit kurzen Druckluftstößen (air-puff, etwa 10° Auslenkung der Haare) erreicht. Auch hier wurden Stimulations- und Baseline-Blöcke in zufälliger Reihenfolge aufgenommen.

2.2.8. Statistische Auswertung

Hier sollte die Frage untersucht werden, ob sich die gemessenen Sauerstoffkonzentrationswerte nach Stimulation signifikant von denen der Baselines unterschieden.

Für die Gruppe der Single-Whisker-Tiere (n=6) wurden initiale Antwort, Hyperoxygenierung und Undershoot mit Hilfe eines gepaarten t-Tests untersucht. Dem Test liegt die Annahme zugrunde, dass die Messwerte einer normalverteilten Grundgesamtheit entstammen. In der Gruppe mit whole-pad Stimulation war die Anzahl der Tiere für eine statistische Auswertung zu gering (n=3).

Für die Gruppe (n=6) der Single-Whisker Tiere wurden die gemittelten Werte (für jedes Tier wurden die gemittelten Baselines von den gemittelten Stimulationen abgezogen) des Zeitraums von -0.5 - 0 s (unmittelbar vor Beginn der Stimulation) mit denjenigen 0.5-1 s (Zeitraum der initialen Antwort), 4.5-5 s (Zeitraum der maximalen Hyperoxygenierung) und 9.5-10 s nach Beginn der Stimulation (Zeitraum des undershoots) mit Hilfe eines gepaarten t-Test verglichen. Eine Trennschärfe (Power) des Tests von 0.7 und ein p-Wert von 0.05 wurden zum Verwerfen der Nullhypothese vorrausgesetzt.


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2.3.  Kurze Beschreibung der Computerprogramme

Zur Verwirklichung der Messungen mussten technische Vorraussetzungen geschaffen werden, die es ermöglichten, folgende Aufgaben zu erfüllen:

  1. Die Stimulation der Barthaare musste zu einem exakt bestimmbaren Zeitpunkt mit vorgegebener Dauer und Frequenz erfolgen.
  2. Mit hoher Frequenz (100 Hz) und exakt zeitlich bestimmbar mussten kurze Lichtblitze auf den Kortex der Ratte fokussiert werden, um die Phosphoreszenz der injizierten Substanz anzuregen.
  3. Die Intensität des Phosphoreszenzlichtes musste gemessen werden (ein Million Intensitätswerte pro Sekunde um eine genaue Berechnung der Lebensdauer der Phosphoreszenz zuzulassen), dabei musste die zeitliche Beziehung der gemessenen Werte zur Stimulation exakt bestimmbar sein.
  4. Aus der immensen Menge an Intensitätswerten mussten diejenigen isoliert werden, die bis 500 Mikrosekunden nach dem Lichtblitz gemessen worden waren (also die einzelnen, durch einen Lichtblitz erzeugten Phosphoreszenzkurven).
  5. Für jede einzelne Phosphoreszenzkurve musste durch mathematische Annäherung (monoexponentieller Fit) die Lebensdauer berechnet werden.
  6. Über die Stern-Volmer-Gleichung mussten aus den einzelnen Lebensdauern die Sauerstoffkonzentrationen berechnet werden.
  7. Die berechneten Sauerstoffkonzentrationen mussten im zeitlichen Verlauf dargestellt werden.

Hierzu wurden von mir zwei Computer-Programme erstellt:

2.3.1. Programm zur Datenaufnahme: phosphorescence16.vi (LabView)

Für die unter 1) bis 4) genannten Aufgaben, also Triggerung der Stimulation, Datenaufnahme und Isolieren der einzelnen Phosphoreszenzkurven wurde ein Programm in LabView geschrieben (phosphorescence16.vi). LabView ist eine graphische Programmiersprache, d.h., einzelne Befehle sind durch graphische Symbole repräsentiert, diese können in einem sogenannten Diagramm zu einem Programm verknüpft werden. Dies [Seite 50↓] bietet den Vorteil, dass man den Fluss der Daten anschaulich darstellen und verfolgen kann. Eingabe und teilweise auch Ausgabe von Daten erfolgen über eine graphische Benutzer-oberfläche:

Abb. 9 : Benutzeroberfläche von phosphorescence16.vi. Wählbar sind die trigger rate (Frequenz der Triggerung der flash-lamp, in den Versuchen 100 Hz), die scan rate (Frequenz der Speicherung der Lichtintensitätswerte, in den Versuchen 1 Mhz), die Zeit der Datenaufnahme (in den Versuchen 15 bzw. 20 s), die Anzahl der zu speichernden Werte pro Lichtblitz (data per cycle) sowie der Name unter dem die Daten gespeichert werden (filename).

Abb. 10 : Diagramm des Programmes phosphorescence16.vi. Das Programm zur Steuerung des Versuchsablaufs und zur ersten Datenanalyse und Speicherung (phosphorescence16.vi): Es gibt zu einer vorgebbaren Zeit Signale an den Master-8 zur Triggerung der Stimulation aus, liest die vom Photomultiplier kommenden Intensitätswerte, analysiert diese und speichert die einzelnen Phosphoreszenzkurven.

2.3.2. Programm zur Auswertung: phos_auswert15x.m (MatLab)

Das Programm ist in MatLab (Version 4) geschrieben. Es dient dazu, die oben unter 5) bis 7) genannten Aufgaben, die Berechnung der Sauerstoffkonzentration aus den [Seite 52↓] Phosphoreszenzkurven der mit Hilfe des LabView-Programms aufgenommenen Daten, durchzuführen. Die mit phosphorescence16.vi gespeicherten Daten enthalten die Intensitätswerte des Phosphoreszenzlichts, diese werden nun von MatLab gelesen, die einzelnen Datenblöcke von 500 μ s Länge, die pro Lichtblitz gespeichert wurden, werden einzeln analysiert: Der Fit-Bereich (von 100μ s - 480μ s nach dem Lichtblitz) wird herausgeschnitten, die erhaltene Phosphoreszenzkurve (Annahme: eine von Rauschen überlagerte Exponentialfunktion) wird logarithmiert, die erhaltene Kurve (Annahme: eine durch Rauschen überlagerte Gerade) wird "gefittet" (linear angepasst), das Programm gibt die "Fit-Parameter" (Steigung und Achsenabschnitt) an, aus diesen wird dann die Lebensdauer der Phosphoreszenz berechnet, in die Stern-Volmer-Gleichung eingesetzt und die erhaltenen Werte für die Lebensdauer und den pO2 gespeichert und dargestellt.

(Da laut Promotionsordung kein Anhang erstellt werden soll, wird das Programmlisting an dieser Stelle aufgeführt).

Programmlisting phos_auswert15x.m

clear

num_stims=59;

for o=1:num_stims;

% Parameter ...

trigger_rate=100;

data_per_cycle=500;

scans_per_second=1000000;

fit_begin=120;

fit_end=500;

quenching_constant=409; % 1/(torr*sec)

tau_zero=601; % usec

num_to_average=10;%Zahl der Cycles, die gemittelt werden ... die Zeitauflösung sinkt

num_to_average2=2; % Anzahl der aufeinanderfolgenden Datenpunkte, die gemittelt werden

time_unit=(10^-3)*num_to_average2;

bad_cycle_limit=1000;

background=-25;

% Laden der Daten und erstellen der Datenmatrix

filename=(['1701_ba',num2str(o),'.bin']);

fid=fopen(filename);

data_read=(fread(fid,inf,'int16')-background);

status=fclose(fid);

num_complete_cycles=fix(length(data_read)/data_per_cycle);

num_complete_cycles=(fix(num_complete_cycles/num_to_average))*num_to_average;


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data_read2=data_read(1:(num_complete_cycles*data_per_cycle));

datamatrix2a=reshape(data_read2,data_per_cycle,num_complete_cycles);

clear background

% Mitteln der Daten (Parameter dazu s.o.)

figure(2)

datamatrix2=datamatrix2a';

for i=1:(num_complete_cycles/num_to_average);

datamatrix_av1(i,1:data_per_cycle)= mean(datamatrix2((i-1)*num_to_average+(1:num_to_average),:));

end

for i=1:(data_per_cycle/num_to_average2);

k=((i-1)*num_to_average2+1:i*num_to_average2);

datamatrix_av2=datamatrix_av1';

datamatrix_av(i,:)= mean(datamatrix_av2(k,:));

end

datamatrix2=datamatrix_av;

data_average_plot=reshape(datamatrix2,1,(num_complete_cycles/num_to_average)*…

(data_per_cycle/num_to_average2));

num_complete_cycles=(num_complete_cycles/num_to_average);

plot(1:length(data_average_plot),data_average_plot,'r')

grid on; zoom on; xlabel('time');ylabel('intesity, a.u.');title('Averaged Data');

hold off

clear datamatrix_av2 datamatrix_av1

% Vektor für die x-Achse der graphischen Darstellung

time=(1:(length(data_read2)));

% Darstellung der Originaldaten

figure(1)

data_read2=reshape(datamatrix2a,1,num_complete_cycles*num_to_average*…

data_per_cycle);

plot(time,data_read2)

grid on; zoom on; xlabel('time');ylabel('intesity, a.u.');title('Original Data');

hold off

clear peak_indices peak_indices2 data_read data_read2 time datamatrix2a

% Darstellen der Originaldaten, eingeschränkt auf den Fit-Bereich.

figure(3)

fit_begin=fit_begin/num_to_average2;

fit_end=fit_end/num_to_average2;

datamatrix3=datamatrix2(fit_begin:fit_end,:);

clear datamatrix2

data_to_fit=reshape(datamatrix3,1,((fit_end-fit_begin)+1)*num_complete_cycles);

time3=(1:((fit_end-fit_begin)+1)*num_complete_cycles);

plot(time3,data_to_fit)


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grid on; zoom on; xlabel('time');ylabel('intesity, a.u.')

% Darstellen der Daten im Fit-Bereich, logarithmiert

figure(4)

semilogy(time3,data_to_fit)

grid on; zoom on; xlabel('time');ylabel('ln(intesity), a.u.')

% Monoexponentieller Fit und Darstellung des Fits mit Fehlerbalken

figure(5)

for i=1:num_complete_cycles

data_to_fitr=log(datamatrix3(:,i));

data_to_fit2=data_to_fitr';

time_to_fit2=((i-1)*(fit_end-fit_begin+1)+1:i*(fit_end-fit_begin+1));

time_to_fit3=time_to_fit2*time_unit;

[p,s]=polyfit(time_to_fit3,data_to_fit2,1);

[z,delta]=polyval(p,time_to_fit3,s);

plot(time_to_fit3,data_to_fit2,time_to_fit3,z,'r',time_to_fit3,z+delta,'r:',time_to_fit3,z-delta,'r:')

hold on;grid on;zoom on;xlabel('time'),ylabel('ln(intensity), a.u.')

% tau(i) ordnet jeder Phosphoreszenzkurve die durch den fit berechnete Lebensdauer zu

p1=p(1,1);

tau(i)=(-1/p1)*1000; % tau = decay constant in usec

% pO2(i) entsprechend den mittels Stern-Volmer-Gleichung berechneten pO 2

pO2(i)=(1/quenching_constant*(1/tau(i)-1/tau_zero))*10^6; % pO 2 in torr (= mmHg)

end

clear quenching_constant tau_zero data_to_fitr data_to_fit2 time_to_fit3 time_to_fit2 p1 fit_end fit_begin

clear z delta p s datamatrix3

% Darstellung des Zeitverlaufs der Lebensdauer und des pO 2

hold off

figure(6)

time_pO2_plot=(1:num_complete_cycles)*(1/trigger_rate)*num_to_average;

plot(time_pO2_plot,tau);hold on;

grid on;zoom on; ylabel('decay time/usec');xlabel('time/seconds');axis([0 max(time_pO2_plot) 0 750]);

STD_tau=std(tau);

Mittelwert_tau=mean(tau);

figure(7)

plot(time_pO2_plot,pO2);hold on;

grid on;zoom on; ylabel('pO2/mmHg');xlabel('time/seconds')

hold off

STD_pO2=std(pO2);

Mittelwert_pO2=mean(pO2);

clear Mittelwert_pO2 STD_pO2 Mittelwert_tau STD_tau time_pO2_plot num_to_average num_complete_cycles

clear data_average_plot data_per_cycle data_to_fit datamatrix_av fid i num_bad_cycles num_to_average2


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clear scans_per_second status time3 time_unit trigger_rate

% Speichern des Zeitverlaufs der Lebensdauer und des pO 2

xfile=(['m'num2str(o)]);

save ([xfile])

clear

end


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01.03.2004