Leuthold, Jan: Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion
Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion
D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Pharm. Jan Leuthold,
geboren am 01.02.1972 in Bad Saarow-Pieskow

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. M. Melzig
2. Priv.-Doz. Dr. med. habil. St. Koch

Tag der mündlichen Prüfung: 16.01.2003

Abstract

The modern therapeutic concept of high-dose chemotherapy of solid tumors and hematologic neoplasias demands a pretherapeutic harvest, an extracorporal purification and an consecutive deep temperature storage of human blood stem cells which will be retransplanted later. Stem cell preparates (transplants) of 22 patients were produced by extracorporal separation of peripheral blood. From each patient a stem cell specimen was mixed with dimethylsulfoxide (DMSO), storaged at - 196 °C and thawed after about 21 days. A corresponding specimen of each patients material was investigated without DMSO addition and without freezing under native conditions. The DMSO exposed, frozed and again defrosted cells showed a mild increase of total cell and nucleus diameters, a constant number of mitochondrias and a reduction of vesicles. A markedly feature of deep temperature damage was the occurance of liquide storages in the nucleus double membrane and the forming of cisterne-like enlargement of the endoplasmatic reticulum. Persistantly we found mitochondrias with reduced size and marginal condensed cristae. Alltogether there were no severe cellular damages in the comparative investigated overlifed specimen cells of the same patient with and without DMSO and deep temperature storage. The morphological results correspond with clinical investigations of a sufficient restitution of all hematopoietic cell lineages in transplanted patients.

Keywords:
Blood stem cells, high-dose chemotherapy, dimethylsulfoxid (DMSO), freezing, electron microscopy

Zusammenfassung

Das moderne Therapiekonzept der Hochdosischemotherapie von soliden Tumoren und hämatologischen Neoplasien erfordert die prätherapeutische Sammlung, die extrakorporale Reinigung und die nachfolgende Tieftemperaturlagerung von menschlichen Blutstammzellen zur späteren Retransplantation. Stammzellpräparate (Transplantate) von 22 Patienten wurden durch extrakorporale Trennung von peripheren Blut hergestellt. Von jedem Patienten wurde eine Probe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt, bei - 196 oC gelagert und nach ca. 3 Wochen aufgetaut. Eine Vergleichsprobe jedes Patienten wurde ohne den Zusatz von DMSO und ohne einen Einfrierschritt untersucht. Die Exposition von DMSO, das Frieren und Auftauen der Zellen zeigte eine geringfügige des Zell- und Kerndurchmessers, eine konstante Anzahl an Mitochondrien und eine Reduktion der Vesikel. Ein markantes Merkmal der Schädigung nach Tieftemperaturlagerung war das Auftreten von Flüssigkeitseinlagerungen in die Kerndoppelmembran und die Ausbildung von zisternenartigen Erweiterungen des endoplasmatischen Retikulums. Regelmäßig konnten Mitochondrien von verringerter Größe und randständig kondensierter Cristae gefunden werden. Insgesamt konnten keine schwerwiegenden zellulären Schäden beim Vergleich der unbehandelten und der DMSO-versetzten , eingefrorenen und wieder aufgetauten Proben festgestellt werden. Die morphologischen Ergebnisse korrespondieren mit der vollständigen Restitution aller hämatopoetischer Zelllinien nach Transplantation.

Schlagwörter:
hämatopoetische Stammzellen, Hochdosischemotherapie, Dimethylsulfoxid (DMSO), Frieren, Elektronenmikroskopie


Seiten: [4] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48 ] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung und Problemstellung
2 Theoretischer Teil
2.1Blutbildung
2.2Literaturangaben zur Ultrastruktur der Blutzellen
2.3Friervorgänge in Zellen
2.4Technik des Einfrierens
2.5Lagerung der gefrorenen Transplantate
2.6DMSO
2.6.1Kryoprotektion mit DMSO
2.6.2Wirkungen von DMSO auf Blutzellen
2.6.3Pharmakokinetik und Pharmakologie von parenteral verabreichtem DMSO
2.6.4Weitere Verwendung von DMSO
2.7Hydroxyethylstärke
2.7.1Herstellung von Hydroxyethylstärke
2.7.2Kryoprotektion mit Hydroxyethylstärke
2.7.3Weitere Verwendung von Hydroxyethylstärke
2.8Vitalitätstestungen
2.8.1Trypanblau- Ausschlussmethode
2.8.2Kultivierung
2.8.3Antikörpermarkierte Durchflusszytometrie
2.9Purging
3 Eigene Untersuchungen
3.1Material und Methode
3.1.1Patienten
3.1.2Chemikalien und Reagenzien
3.1.3Separation der peripheren Blutstammzellen
3.1.4Einfrieren
3.1.5Auftauen und Qualitätskontrolle
3.1.6Elektronenmikroskopische Präparation
3.1.7Elektronenmikroskopische Untersuchung
3.1.8Halbautomatische Bildanalyse
3.2Ergebnisse
3.2.1Voruntersuchungen an gepurgten Zellen
3.2.2Definition der Zielzellen
3.2.3Auswahl geeigneter Parameter der ultrastrukturellen Gefrierschädigung
3.2.4Ungepurgte frische Zellen
3.2.5Ungepurgte, mit 10%igem DMSO eingefrorene Zellen
3.2.6Ungepurgte, mit Kryo II eingefrorene Zellen
3.2.7Vergleich der morphometrischen Messwerte ungepurgter Zellen
3.2.8Vergleich der Vitalitätstestungen
3.2.9Gepurgte Zellen
3.2.10Vergleich der morphometrischen Messwerte gepurgter Zellen
3.3Diskussion
3.3.1Patientenauswahl
3.3.2Probengewinnung
3.3.3Elektronenmikroskopischen Präparation
3.3.4Zielzellenbestimmung
3.3.5Fotografische Dokumentation
3.3.6Gepurgte Zellen
3.3.7Ungepurgte Zellen
3.3.8Ausblick
4 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Einsatz kryoprotektiver Lösungen zum Einfrieren von Blutstammzellen (Auswahl nach Literaturangaben)
Tabelle 2: Patientendaten und Art der gewonnenen Blutproben
Tabelle 3: Diagnosen der Patienten, deren periphere Blutstammzellpräparate elektronenmikroskopisch untersucht wurden
Tabelle 4: Auszug aus den routinemäßig ermittelten Werten aller untersuchter
Proben (n=29)
Tabelle 5: Parameter der halbautomatischen Zellauswertung mit dem IBAS 2000
Tabelle 6: Messergebnisse der untersuchten ungepurgten Zellen. Die Messwerte entsprechen den Medianen und den 25% - 75% Quantilen.
Tabelle 7: Statistische Auswertung der Messwerte
Tabelle 8: Ergebnisse der Vitalitätstestungen. Die Zahlenwerte entsprechen dem Mittelwert (Minimum- Maximum)
Tabelle 9: Messergebnisse der untersuchten gepurgten Zellen. Die Messwerte entsprechen den Medianen und den 25% - 75% Quantilen.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Vereinfachtes Schema der Blutbildung und der steuernden Wachstumsfaktoren
Abbildung 2: Phasenzustandsdiagramm einer 0,9%igen Natriumchlorid-Wasser-Mischung
Abbildung 3: Vereinfachtes Schema der Zusammenhänge von Kühlrate und Überlebensraten der Zellen (nach [Mazur,1968])
Abbildung 4: Strukturformel von DMSO
Abbildung 5: Ausschnitt der chemische Struktur von Hydroxyethylstärke mit variablem Substutionsmuster
Abbildung 6: Strukturformel von Trypanblau
Abbildung 7: Schematischer Aufbau einer durchflusszytometrischen Apparatur mit drei Fluoreszenzdetektoren
Abbildung 8: Schematische Darstellung der durchflusszytometrischen Ergebnisses einer unfixierten frischen Blutprobe ohne Lysierung der Erythrozyten
Abbildung 9: Beispiel einer Analyse von CD-34 markiertem Blut. Es wurde das Seitwärtsstreulicht (SSC-H) gegen die Signale der CD-34 markierten Zellen aufgetragen (Pfeil). Der Bereich der monozytären Zellen ist ebenfalls erkennbar (Dreiecke).
Abbildung 10: Schematischer Ablauf der elektronenmikroskopischen Proben-Präparation
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Vergrößerungsschritte
Abbildung 12: Beispielhafte Abbildungen der Durchflusszytometrie einer Probe vor und nach dem Purgen. Vor der Reinigung sind neben den CD-34 positiven Zellen (Pfeil) noch viele monozytäre Zellen erkennbar (Dreiecke). Nach dem Purgen sind neben vielen CD-34 positiven Zellen (Pfeil) nur wenige Monozyten und Granulozyten nachweisbar (Dreiecke).
Abbildung 13: Frische, gepurgte Zelle mit Ansammlung von zahlreichen Mitochondrien (M) in der ausgeprägten Kernbucht. Der Kern (K) dominiert die Zelle, es sind Kernporen (KP) und vereinzelt Vesikel (V) erkennbar. (FN 21)
Abbildung 14: Frische, gepurgte Zelle mit typischen Größenverhältnissen, Organellenanzahl und Chromatinkondensation. Der dominante Zellkern (K) enthält nur eine geringe Menge randständig kondensiertes Chromatin (Ch). Die Cristae der Mitochondrien (M) sind deutlich erkennbar. (FN 22)
Abbildung 15: Ausschnitt einer frischen Zelle mit gut erhaltenen Mitochondrien (M) und mehreren Vesikeln (V), die eine homogene Struktur aufweisen. Raues endoplasmatisches Retikulum (rEPR) ist erkennbar. (FN 1619)
Abbildung 16: Frische ungepurgte Zellen mit repräsentativen Größenverhältnissen. Es sind ein großer Kern (K), eine geringe Chromatinkondensation, einige Mitochondrien (M) und zahlreichen Vesikeln (V) erkennbar. (FN 1125)
Abbildung 17: siehe Abb. 16. (FN 1177)
Abbildung 18: Ausschnitt einer gefrorenen, stark zerstörten und somit nicht auswertbaren Zelle. Einige Vesikel (V) sind erkennbar, der Kern (K) weist einen völligen Verlust der Chromatinstruktur auf. Ein wahrscheinliches Mitochondrium mit zerstörter Innenstruktur (M) ist nicht mehr sicher identifizierbar. (FN 1315)
Abbildung 19: Gefrorene Zelle mit mehreren zerstörten Mitochondrien (M), die Kernstruktur erscheint hier unverändert. (FN 1201)
Abbildung 20: Detailaufnahme einer mit 10%igem DMSO gefrorenen Zelle. Erkennbar ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeile) im Bereich der Kerndoppelmembran. Das benachbarte Mitochondrium (M) zeigt beginnende Kondensationserscheinungen. Die Strukturen der Vesikel (V) und des Kernes (K) erscheinen normal. (FN 360)
Abbildung 21: Ausschnitt einer stärker beeinträchtigten, mit 10%igem DMSO gefrorenen Zelle. Im Bereich der Kernmembran ist eine große Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeile) erkennbar. Mitochondrien sind nicht mehr sicher zu identifizieren. Beginnende Auflösung der Zelle mit Abschnürungen von zytoplasmatischem Material. Vereinzelt sind Vesikel nachweisbar. Die Struktur des Kernes (K) und die Chromatinkondensation erscheinen unauffällig. (FN 950)
Abbildung 22: Ungepurgte, mit 10%igem DMSO gefrorene Zelle mit typischen Veränderungen. Zu beachten ist der runde Zellkern (K) und die teilweise veränderten Mitochondrien (M). Im Bereich der Kernmembran ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeil) zu erkennen. Ein Teil des rauen endoplasmatischen Retikulum erscheint zisternenartig erweitert (rEPR, Dreiecke). (FN 364)
Abbildung 23: Ungepurgte, mit 10%igem DMSO gefrorene Zelle mit auffällig rundem Zellkern (K). Die Mitochondrien (M) erscheinen nur leicht geschädigt. Im Bereich des Zytoplasmas ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeil) mit unklarer Primärstruktur erkennbar. (FN 539)
Abbildung 24: Ungepugte, mit Kryo II eingefrorene Zelle. Der Kern (K) ist erkennbar, er weist eine geringe randständige Chromatinkondensation auf. Neben den Mitochondrien (M) sind einzelne kleine Frierschäden (Dreiecke) erkennbar. (FN 2093)
Abbildung 25: Maximaler Zelldurchmesser der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 26: Maximaler Kerndurchmesser der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 27: Zellfläche der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 28: Kernfläche der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 29: Kern-Plasma-Relation der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 30: Formfaktor Zelle der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 31: Formfaktor Kern der ungepurgten Zellen. Es ist ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der frischen und den mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.
Abbildung 32: Vesikelanzahl der ungepurgten Zellen. Es ist ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der frischen und den mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.
Abbildung 33: Durch intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen veränderte Bereiche der ungepurgten Zellen. Es sind signifikante Unterschiede zwischen den Messwerten der frischen versus DMSO 10% und frischen versus Kryo II Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.
Abbildung 34: Mitochondrienanzahl der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).
Abbildung 35: Beispielhaftes Histogramm der ermittelten Messwerte des maximalen Kerndurchmessers der frischen ungepurgten Zellen (n= 635).
Abbildung 36: Gefrorene, gepurgte Zelle mit mehreren Mitochondrien (M), von denen einige Kondensationserscheinungen zeigen (Pfeile). Der kreisrunde Kern (K) dominiert die Zelle. Die Chromatinkondensation ist bis auf einen schmalen Saum zurückgedrängt. Ein längeres Stück raues endoplasmatisches Retikulum (rEPR) ist erkennbar. (FN 170)
Abbildung 37: Maximaler Zelldurchmesser der gepurgten Zellen
Abbildung 38: Maximaler Kerndurchmesser der gepurgten Zellen
Abbildung 39: Zellfläche der gepurgten Zellen
Abbildung 40: Kernfläche der gepurgten Zellen
Abbildung 41: Formfaktor Zelle der gepurgten Zellen
Abbildung 42: Formfaktor Kern der gepurgten Zellen
Abbildung 43: Mit 10%igem DMSO gefrorene ungepurgte Zelle mit Flüssigkeitseinlagerung in der Kernmembran (Ö, Pfeile) und starker Lysis im Bereich eines Mitochondrium (M). Der Bereich der Kernmembranerweiterung ist homogen gefüllt. Das erkennbare raue endoplasmatische Retikulum (rEPR, Dreiecke) erscheint geringfügig aufgeweitet. (FN 1451)
Abbildung 44: Frische ungepurgte Zelle mit mehreren gut erhaltenen Mitochondrien (M). Zu beachten sind die strukturlosen Spalten im Zytoplasma, die als Artefakte gedeutet werden (A). Der Pfeil demonstriert die Schnittrichtung. Die Stauchung der Zelle ist in Schnittrichtung gut erkennbar. (FN 645)

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Apr 28 16:16:11 2003