Leuthold, Jan: Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion

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Kapitel 1. Einleitung und Problemstellung

Seit 1951 ist bekannt, dass bei Mäusen die Gabe von autologen Knochenmarkzellen einen Schutzfaktor nach ansonsten letalen Strahlendosen darstellt [Lorenz, 1951]. Die Erkenntnis, dass mit zugeführten Knochenmarkzellen die radiogene Zerstörung des Knochenmarkes erfolgreich behandelt werden konnte, war ein bedeutender Entwicklungsschritt auf dem Weg zur heute etablierten Stammzelltransplantation. Bereits 1959 wird über autologe Knochenmarktransplantationen beim Menschen berichtet [McCovern, 1959], wobei seinerzeit nur einer von drei Patienten erfolgreich behandelt werden konnte. Die Entdeckung und Beschreibung von Blutstammzellen, die sich offenbar nicht nur im Knochenmark, sondern auch im peripheren Blut aufhalten [Goodman, 1962], gilt als ein weiterer entscheidender Schritt in der Etablierung der heutigen Transplantationstechnik. Problematisch war über längere Zeit, Zellen für eine erfolgreiche Behandlung in ausreichender Menge sammeln zu können. Erst 1986 gelang es nach entsprechender Zellanreicherung autologe Blutstammzellen erfolgreich zu transplantieren [Körbling, 1986].

Die seit ca. 10 Jahren als klinische Behandlungsmethode durchgeführte Hochdosischemotherapie mit Blutstammzelltransplantation stellt heute eine Variante der Krebsbehandlung dar, mit der bei einigen malignen Geschwulsterkrankungen mit bislang infauster Prognose vielversprechende Erfolge erreicht werden konnten. So sind rezidivierte hochmaligne Non-Hodgkin-Lymphome [Philip, 1995] und das multiple Myelom [Attal, 1996] Beispiele dafür, dass durch eine hochdosierte Zytostatikatherapie in Kombination mit Blutstammzelltransplantation ein deutlicher Vorteil in den Heilungs- bzw. 5-Jahres-Überlebensraten gegenüber konventioneller Chemotherapie möglich ist. Aus den Zahlen der EBMT geht hervor, dass für eine Vielzahl von onkologischen Erkrankungen Stammzelltransplantationen nach erfolgter Hochdosischemotherapie durchgeführt werden. Beispielhaft seien an dieser Stelle die Indikationen Ovarialkarzinom, Keimdrüsentumoren, akute myeloische und lymphatische Leukämien und Neuroblastome zitiert [Gratwohl, 2001] [Link, 1997].


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Die Beeinträchtigung des blutbildenden Knochenmarkes und die damit hervorgerufene Verringerung an weißen und roten Blutzellen bei mit Zytostatika behandelten Patienten stellt oft die dosislimitierende Nebenwirkung der Therapie dar. Bei der Hochdosischemotherapie werden die für die konventionelle Tumorchemotherapie geltenden Maximaldosierungen bewusst überschritten, da von höheren Plasmakonzentrationen der Wirkstoffe eine effektivere Zerstörung der Tumorzellen zu erwarten ist. Bei den im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie eingesetzten 5-10fach erhöhten Dosen wird das Knochenmark jedoch so irreversibel geschädigt, dass nur eine Retransplantation von vorher gewonnenen Blut- oder Knochenmarkstammzellen für den Patienten lebenserhaltend ist. Die autologen (vom Patienten selbst stammenden) oder heterologen (von einem anderen Spender stammenden) Blutstammzellen, welche aus dem Knochenmark oder aus dem peripheren Blut gewonnen werden können, müssen im Vorfeld der Chemo- oder Strahlentherapie entnommen und als Transplantat aufgearbeitet werden. Der Zeitraum bis zur Wiederherstellung des blutbildenden Systems nach Retransplantation von autologen oder heterologen Blutstammzellen beträgt 2-3 Wochen [Davis, 1990] [Galmes, 1995] [Beaujean, 1998]. Da das Überleben des Patienten von der Menge und der Qualität des Transplantates abhängt, stellt die Separation und Lagerung der Blutstammzellen einen wichtigen Schritt in der Hochdosischemotherapie dar. Durch verbesserte räumliche, organisatorische und medikamentöse Maßnahmen konnten die Komplikationsraten nach Stammzelltransplantation in den letzten Jahren deutlich gesenkt werden [Gahrton, 2001].

Heute sind zwei Varianten zur Gewinnung von körpereigenen Blutstammzellen im Einsatz. Die erste Möglichkeit liegt in der Gewinnung von Knochenmarkstammzellen. Diese Methode ist mit multiplen bilateralen Stanzbiopsien am Beckenknochenskelett verbunden und stellt für den Patienten einen belastenden stationären Eingriff unter Vollnarkose oder Spinalanästhesie dar.

Die zweite Variante, Blutstammzellen von einem Patienten zu gewinnen, besteht in der Sammlung von im Blut zirkulierenden peripheren Zellen. Nach einer medikamentösen Vorbehandlung, die eine forcierte Mobilisierung und Ausschwemmung von Stammzellen hervorruft, können diese Zellen extrakorporal mit Hilfe von Zellseparatoren angereichert werden. Dieser Prozess wird an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt, solange, bis die zur Transplantation


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erforderliche Zahl an Blutstammzellen erreicht ist. Meist werden 1-2 Separationen benötigt [Anderlini, 2001]. Die Sammlung und Transplantation peripherer Blutstammzellen hat sich in den letzten Jahren zur Standardmethode entwickelt. So wurden 1996 in Europa 90% aller von der EBMT registrierten autologen Blutstammzelltransplantationen mit peripher gewonnenen Blutstammzellen durchgeführt [Werner, 1999], 1999 waren es schon 95 % [Gratwohl, 2001]. Gegenüber der früher dominierenden Knochenmarktransplantation [Gorin, 1997] ist die Dauer der neutropenischen Phase bei der Transplantation von peripheren Blutstammzellen verkürzt [Fliedner, 1988] [Lopez, 1997] und lässt damit eine frühere Rekonstitution der Hämatopoese erwarten.

Hämatopoetische Blutstammzellen sind bei Raumtemperatur nur begrenzte Zeit lagerbar. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil der lebensfähigen mononukleären Zellen bei einer Lagerung von 4 oC über eine Woche konstant blieb [Kohsaki, 1981]. Die Proliferationsfähigkeit der Zellen nahm im Gegensatz dazu rasch ab. Nach zwei Tagen waren 84 %, am vierten Tag nur noch rund 40 % der ursprünglichen Zellen in der Lage, Kolonien zu bilden. In einer fünf Jahre später veröffentlichten Arbeit wurde ein Lagerungszeitraum von 72 Stunden und 4 oC Lagerungstemperatur beschrieben, wobei es bereits innerhalb dieser Zeit zu einem deutlichen Abfall der vitalen Blutstammzellen kam [Lasky, 1986]. Lagerungstemperaturen von 22 oC und 37 oC verschlechterten das Ergebnis weiter. Die Richtlinie zur Transplantation peripherer Blutstammzellen gibt eine maximale Lagerungsdauer ohne Einfrieren von 72 Stunden an [Richtlinie zur Transplantation peripherer Blutstammzellen, 1997]. Der Zeitraum der notwendigen Aufbewahrung des Transplantates beträgt mindestens 14 Tage. Diese Zeitspanne enthält die Dauer der hämatogenen Rekonstitution nach erfolgter Transplantatgewinnung, den Aufenthalt des Patienten im Bereich der Hochdosischemotherapieabteilung, die Hochdosischemotherapie selbst und den Auswaschprozess der verabreichten Zytostatika. Das uneingefrorene Lagern des Transplantates während dieses Zeitraumes ist somit irrelevant.

Das Einfrieren von Zellen kann nur mit Zusätzen geschehen, die eine Bildung von Eiskristallen und die daraus resultierende Zellzerstörung verhindern. Dazu werden


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den Transplantaten kryoprotektive Lösungen zugesetzt, deren Zusammensetzung zumeist empirisch ermittelt wurde. Das Ergebnis des Einfrierprozesses und dessen Auswirkungen auf die Vitalität der hämatopoetischen Zellen kann im Anschluss an das Auftauen der Präparate durch mikroskopische, zellbiologische oder immunhistochemische Verfahren bewertet werden. Bei Akzeptanz eines methodisch bedingten Zellverlustes hat sich eine notwendige Zellzahl des Transplantates von 2 x 106 Stammzellen je Kilogramm Körpermasse [Richtlinie zur Transplantation peripherer Blutstammzellen, 1997] als ausreichend für die Regeneration des blutbildenden Systems erwiesen. Bei geringeren Zellzahlen kann der Erfolg der Transplantation in Frage gestellt sein. Ein Sammeln von höheren Zellzahlen würde zwar eine schnellere Regeneration des blutbildenden Systems bewirken, geht aber mit einer verstärkten Belastung des Patienten und mit einem deutlich höheren zeitlichem und finanziellem Aufwand einher.

Überlebensraten von 50-90 % der gewonnenen Zellen nach Einfrieren und Auftauen zeigen, dass es heute noch nicht vollständig gelungen ist, einen optimalen kryoprotektiven Zusatz zu entwickeln. Die Substanzen sollten die Verluste an Zellen so gering wie möglich halten, Schäden verhindern und die Teilungsfähigkeit der Blutstammzellen in vollem Umfang über die Zeit der Tieftemperaturlagerung bewahren. Die Entwicklung eines solchen optimalen Kryoprotektors bedarf jedoch der genauen Kenntnis der Schädigungsmuster und exakter Methoden zur Quantifizierung des protektiven Erfolges. Die heute angewandten Methoden zur Bestimmung der Überlebensrate von gefrorenen und wieder aufgetauten Zellen sind nicht unumstritten [Jetter, 1998]. Die ermittelten Werte unterscheiden sich zum Teil beträchtlich bei der Untersuchung ein und desselben Transplantates. Die unterschiedlichen und nicht standardisierten Verfahren berücksichtigen nicht alle Fehlermöglichkeiten. Die zum Teil subjektive Bewertung der Ergebnisse schränkt die Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten ein. Oft verwendete Techniken zur Bestimmung der Qualität eines Transplantates sind die Trypanblau-Ausschlussmethode, die Anzüchtung von Blutstammzellen und Progenitoren, automatische Zellzählungen wie der Coulter-Counter-Test [Lionetti, 1975] [Gao, 1998], lichtmikroskopische Untersuchungen [Cavins, 1965] oder die Durchflusszytometrie. Mit diesen Methoden sind zwar quantitative Aussagen über die Qualität des Blutes möglich, die morphologischen Details der Schädigung sind jedoch nicht oder


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nur sehr begrenzt erkennbar.

Spezielle ultrastrukturelle Untersuchungen über die Schädigungsmuster bei Tieftemperaturlagerung von Blutstammzellen sind in der Literatur nicht zu finden. Studien, die sich mit dem Überleben von Granulozyten [Boonlayangoor, 1980] und Thrombozyten [Spector, 1979] [Böck, 1991] [Böck, 1996] nach Einfrierprozessen beschäftigen, können allerdings Hinweise auf zu erwartende Veränderungen in der Zelle geben.

Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, auf ultrastruktureller Ebene die Art und das Ausmaß von Zellschädigungen an Blutstammzellen und Vorläuferzellen der roten und weißen Reihe nach einer Tieftemperaturlagerung zu erkennen und zu dokumentieren. Damit konnte zugleich eine Voraussetzung zur Qualitätsverbesserung dieser biogenen Arzneimittel geschaffen werden. Als notwendige Bedingung für diese Untersuchungen sollte dazu zunächst eine Methode zur elektronenmikroskopischen Präparation von kleinen Blutmengen erarbeitet werden.

In der verfügbaren Literatur (Abschnitt 2.2.) sind keine eindeutigen ultrastrukturellen Merkmale für die Identifikation von Blutstammzellen zu finden. Elektronenmikroskopische Bilder dieser Zelle sind selten publiziert worden. Da eine weitere wesentliche Voraussetzung der Arbeit das sichere Erkennen der gesuchten Zellen ist, sollen aus den Angaben der verfügbaren Literatur und eigenen Voruntersuchungen morphologische Auswahlkriterien für Blutstammzellen oder hämatogene Vorläuferzellen ermittelt werden.

Die Auswertung der zu dokumentierenden ultrastrukturellen Veränderungen sollte in größerem als bisher in der Literatur gefundenem Umfang erfolgen. Bewusst wurden die Bedingungen der Versuche sehr eng an die klinischen Gegebenheiten angelehnt, um so ein möglichst genaues morphologisches Bild des Zustandes der Stammzelltransplantate zu erhalten. Es wurde jeweils die Blutprobe eines Patienten vor und nach dem Einfrieren elektronenmikroskopisch untersucht, die Ergebnisse wurden


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deskriptiv verglichen und mit Hilfe einer halbautomatischen Bildanalyse bewertet.

Nach Entwicklung einer Methode zur Bewertung ultrastruktureller Schädigungsmuster an Blutstammzellen und Vorläuferzellen sollte das Verfahren mit einer Reihe unterschiedlich eingefrorener Blutproben überprüft werden. Das Ziel des direkten Vergleiches der gefrorenen Zellen untereinander war es, mögliche Qualitätsunterschiede der verwendeten zwei Kryoprotektiva aufzudecken oder auszuschließen. Die Ergebnisse der ultrastrukturellen Gegenüberstellung wurden mit den Ergebnissen der bereits etablierten und klinisch routinemäßig eingesetzten Verfahren zur Qualitätssicherung von Stammzelltransplantaten verglichen und bewertet.


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Mon Apr 28 16:16:11 2003