Leuthold, Jan: Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion

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Kapitel 2. Theoretischer Teil

2.1 Blutbildung

Die für die vollständige Entwicklung des Blutes notwendigen Blutstammzellen werden im fetalen Zustand in der Leber gebildet. Während der Embryonalphase wandern die Zellen von dort in das Knochenmark ein und bilden von dieser Stelle aus zeitlebens neue Zellen. Ein kleiner Anteil dieser Knochenmarkstammzellen gelangt durch die Kapillarwände in das periphere Blut und bildet dort einen Reservepool an peripheren Blutstammzellen. Zwischen den Knochenmarkstammzellen und den peripheren Blutstammzellen bildet sich ein hämodynamisches Gleichgewicht aus, welches jedoch sehr stark zugunsten der Knochenmarkstammzellen verschoben ist.

Aus pluripotenten Knochenmarkblutstammzellen entwickeln sich über verschiedene Stufen alle roten und weißen Blutzellen, Thrombozyten und Makrophagen [Eaves, 1992] [Brunning, 1994] [Terstappen, 1994] (Abb. 1), die im lebenden Organismus eine Vielzahl von Aufgaben erfüllen. Junge, aber schon entwickelte Zellen werden nach einem kurzen Reifungsprozess im Knochenmark in das periphere Blut ausgeschleust, wo ihre endgültige Differenzierung und Entwicklung stattfindet. Im Blut des gesunden Menschen finden sich verschiedene Altersstufen der Granulozyten, der Lymphozyten, der Monozyten, der Thrombozyten und der anteilig größten Gruppe, der Erythrozyten. Die Verteilung dieser Zellen unterliegt erheblichen Schwankungen. Die quantitativen Verhältnisse der einzelnen Entwicklungsstufen und der einzelnen Zellarten untereinander können jedoch Anhaltspunkte für krankhafte Prozesse geben. So kann zum Beispiel ein gehäuftes Vorkommen von jungen, unreifen Leukozyten im peripheren Blut, die sogenannte Linksverschiebung, ein Zeichen für reaktive entzündliche Prozesse darstellen. Für das Erkennen leukämischer Erkrankungen spielt das Verhältnis der Zellarten untereinander eine wichtige diagnostische Rolle.


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Abbildung 1: Vereinfachtes Schema der Blutbildung und der steuernden Wachstumsfaktoren


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Normalerweise können im peripheren Blut nur ca. 0,1 % Blutstammzellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl des Blutes, nachgewiesen werden [Weißinger, 1999]. Die geringe Zahl der im peripheren Blut kreisenden Blutstammzellen reicht unter normalen Bedingungen nicht aus, um für Transplantationszwecke eine genügend große Anzahl an teilungsfähigen Blutstammzellen mittels Zellseparatoren zu gewinnen.

Durch Vorbehandlung mit Zytostatika [Richman, 1976] und/oder hämatogenen Wachstumsfaktoren [Gianni, 1989] [Pönisch, 2000] [Lipp, 2002] kann die Anzahl der zirkulierenden Blutstammzellen so stark erhöht werden, dass es möglich ist, mit Zellseparatoren im extrakorporalen Kreislauf die benötigte Zahl an Zellen zu gewinnen.

Die vorbereitende Chemotherapie nutzt die verstärkte Neubildung von Zellen nach einer temporären Reduktion der weißen Blutzellen aus. Das Knochenmark reagiert auf die zytotoxischen Arzneimittel mit einer verstärkten Proliferation und Ausschwemmung von neu gebildeten Blutzellen. Gleichzeitig erhöht sich der Anteil peripherer Blutstammzellen, die damit für nachfolgende Sammlungsprozesse zur Verfügung stehen.

Die kontinuierliche Gabe von Wachstumsfaktoren bewirkt eine Stimulation der Blutneubildung auf der Ebene der Blutstammzellen und der Vorläuferzellen. Durch eine erhöhte Teilungsrate steigt deren Anteil im Knochenmark so stark an, dass aufgrund des hämodynamischen Gleichgewichtes eine größere Anzahl dieser Zellen in das Blut gelangt.

Die Kombination von Chemotherapie und Wachstumsfaktoren führt durch additive Effekte zu einer besonders hohen Zahl von peripheren Blutstammzellen [To, 1997].

Bereits 1979 konnte in einem in-vitro-Experiment gezeigt werden, dass periphere mononukleäre Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen in der Lage waren, Knochenmarkstammzellen zur Proliferation zu befähigen [Odavic, 1979]. Die von den peripheren mononukleären Zellen gebildeten Zytokine sind heute besser als hämatogene Wachstumsfaktoren bekannt. Wachstumsfaktoren sind N- und O-glykosylierte Proteine [Ibelgaufts, 1992], die von verschiedenen Zellen gebildet


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werden können. Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen sowie B- und T- Lymphozyten gehören zu diesen körpereigenen Produzenten. Erst durch den Einsatz von molekularbiologischen und gentechnologischen Methoden gelang es, die für den therapeutischen Einsatz erforderlichen Mengen dieser Substanzen zu produzieren. Durch Zugabe der reinen Faktoren in Kulturmedien gelingt es heute, die Blutstammzellen in vitro am Leben zu halten und zur Proliferation anzuregen [Fietz, 2000]. Je nach Art des zugesetzten Wachstumsfaktors erhält man Kolonien unterschiedlicher Zelllinien [Broxmeyer, 1992]. So wird heute das Zytokin, welches hämatopoetische Blutstammzellen zur Bildung von Granulozyten anregt, als „Granulocyten-colony-stimulating-factor“ (G-CSF) bezeichnet. M-CSF fördert die Bildung von Makrophagen, GM-CSF stellt ein multifaktorielles Zytokin mit einer Stimulation der Granulozyten- und Makrophagenbildung dar. Erythropoetin fördert die Differenzierung von Blutstammzellen in Richtung der Erythrozyten. Aus der Reihe der Interleukine ist das Interleukin-3 (IL-3) hervorzuheben, welches als unspezifischer Wachstumsfaktor die gesamte Hämatopoese stimuliert und so die Entstehung von Erythrozyten, Thrombozyten, Makrophagen, Granulozyten und Lymphozyten gleichermaßen positiv beeinflusst [Ogawa, 1993] [Baron, 1995].

Die einzelnen Wachstumsfaktoren besitzen heute als Arzneimittel einen hohen Stellenwert in der unterstützenden Behandlung vor einer autologen peripheren Stammzellseparation. Sie werden zur Reduktion des Infektionsrisikos bei chemotherapierten Patienten mit Neutropenien eingesetzt und verkürzen die Dauer eines auftretenden neutropenischen Fiebers. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet der Wachstumsfaktoren ist die in-vitro-Kultivierung von Blutstammzellen [Fietz, 2000], ohne die die Bewertung der Proliferationskapazität eines Stammzelltransplantates nur schwer möglich wäre.


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2.2 Literaturangaben zur Ultrastruktur der Blutzellen

Um eine optische Vorstellung von der Blutstammzelle und den hämatopoetischen Vorläuferzellen zu erhalten, wurde im Vorfeld der eigentlichen Arbeit die verfügbare Literatur, insbesondere Atlanten der Ultrastruktur menschlicher Zellen und Gewebe, unter dem Gesichtspunkt recherchiert, Aussagen und bildliche Darstellungen zu Blutstammzellen zu erhalten.

In der Literatur wird die hämatopoetische Blutstammzelle aus ultrastruktureller Sicht als runde Zelle mit einem Durchmesser von 7-10 µm [Weiss, 1988] [Bekkum, 1990], einem großen Kern, vereinzelten Mitochondrien und zahlreichen, nicht kondensierten Ribosomen beschrieben [Wickenhauser, 1995a]. Das Verhältnis der Kern-Zytoplasma-Fläche ist deutlich zugunsten der Kernfläche verschoben [Bekkum, 1990] [Thiele, 1995] [Wickenhauser, 1995b]. Morphologisch ähnelt die Blutstammzelle den blastären Vorläuferzellen der myeloischen und der lymphatischen Reihe, die sich oftmals nur durch einen etwas größeren Durchmesser auszeichnen.

Proerythroblasten sind 20-25 µm große Zellen, welche die erste Entwicklungsstufe der Erythrozyten darstellen [Ruzika, 1976] [Zucker-Franklin, 1988]. Der dominante Kern der Zelle beansprucht 4/5 der Zellfläche. Diese Zellen treten unter normalen Bedingungen nicht aus dem Knochenmark in die Peripherie aus. Die nächsten Stufen der Entwicklung der roten Blutzellen stellen die Erythroblasten und Normoblasten dar. Mit einer Zellgröße von 10-15 µm Durchmesser sind sie deutlich kleiner als der Proerythroblast. In der Phase des Erythroblasten erfolgt das Abschnüren des Kernes [Kleinig, 1986], die Anzahl der Mitochondrien nimmt ab, die Zelle enthält einzelne Ribosomen, Polysomen [Weiss, 1988] und Siderosomen [Ruzika, 1976]. Vesikel sind nur noch sehr selten nachweisbar [Weiss, 1988]. Die sich anschließende


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Entwicklungsstufe des Retikulozyten ist als Vorstufe des Erythrozyten zu verstehen und durch das Fehlen des Zellkernes und durch die organellenarme Struktur des Zytoplasmas leicht von den gesuchten Blutstammzellen zu unterscheiden.

Myeloblasten sind die früheste Form in der Entwicklung der Granulozyten. Sie weisen einen Zelldurchmesser von 25 µm auf, enthalten keine [Ruzika, 1976] oder nur wenige Granula [Weiss, 1988] und verfügen über einen Kern mit einer geringen Chromatinkondensation.

Promyelozyten unterscheiden sich als nächste Entwicklungsstufe der Granulopoese durch einen kleineren Zelldurchmesser, der je nach Autor mit 15-20 µm [Ruzika, 1976] [Weiss, 1988] angegeben wird, und das Vorhandensein von Golgi-Apparaten und zahlreicher Vesikel. Die Zellen sind rund bis oval. Der ebenfalls runde bis ovale Kern nimmt einen Großteil des Zellvolumens ein. Die auf den Promyelozyten folgenden Myelozyten enthalten im Zytoplasma primäre, runde, elektronendichte Granula sowie strukturierte Vesikel [Erlandson, 1994], die bereits auf phagozytierende Zellprozesse hinweisen. Die Kondensation des Chromatins verdichtet sich [Weiss, 1988], bis es beim Metamyelozyten zu einer nur noch teilweise unterbrochenen Anlagerung des dunklen, elektronendichten genetischen Materials an die Innenwand des Kernes kommt. Nukleoli und Kernporen sind in diesem Stadium deutlich erkennbar [Ruzika, 1976]. In den folgenden Entwicklungsstufen der Granulopoese nimmt der bisher runde bis ovale Kern verschiedene Formen an. Man unterscheidet stabkernige, segmentkernige und übersegmentierte Zellen. Die Anzahl und Flächen der Granula nehmen in diesen Stadien zu. Es kommt zu strukturierten Einschlüssen, die als Zeichen der Phagozytose und der Speicherung von Feststoffen und Flüssigkeiten zu verstehen sind. Als Endstufe der Granulopoese sind die häufig vorkommenden neutrophilen und die selteneren basophilen und eosinophilen Granulozyten im Blut nachweisbar.

Die im Blut und speziell in der Lymphflüssigkeit vorhandenen Lymphozyten unterscheiden sich in kleine 4-8 µm messende [Olah, 1975] [Ruzika, 1976] und große bis zu 15 µm messende [Bucher, 1992] Zellen. Die Zuordnung zu den B- oder T-Lymphozyten erfolgt durch Nachweis der Oberflächenmarker mit Hilfe spezieller Antikörper. Visuell ist die Unterscheidung nicht möglich. Lymphozyten weisen


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einen meist kugeligen Kern auf. Oft ist nur ein schmaler Zytoplasmasaum zu erkennen. Geringe Kernbuchtungen sind möglich, es wird jedoch im Gegensatz zu Granulozyten niemals ein gelappter Kern beobachtet [Bucher, 1992]. Das augenscheinlichste Merkmal der Lymphozyten ist ein stark kondensiertes, scholliges Chromatin, welches einen Großteil des Kernes einnimmt und als elektronendichte Struktur im Transmissionselektronenmikroskop auffällt. Die Vorstufe der Lymphozyten stellt der Lymphoblast dar. Morphologische Beschreibungen oder Bilder dieser Zelle konnten in der verfügbaren Literatur nicht gefunden werden, es ist aber aufgrund der Theorie der Blutbildung von einer großen Ähnlichkeit zur gesuchten Blutstammzelle auszugehen.


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2.3 Friervorgänge in Zellen

Das Gefrieren von Wasser geht mit der Bildung von Eiskristallen einher. Dabei lassen sich zwei Grundprobleme der Kryokonservierung von lebenden biologischen Materialien erkennen. Neben den mechanischen Schäden durch die Bildung von Eiskristallen können beim Einfrieren von Zellen osmotisch bedingte Defekte entstehen.

Reines Wasser gefriert unter Normaldruck bei 273,16 Kelvin oder 0 oC. Komplizierter stellen sich die Vorgänge in Zellen dar. Hier finden sich neben dem Hauptbestandteil Wasser noch diverse gelöste Stoffe. Jede gelöste Substanz verändert das Frierverhalten der Flüssigkeit. Aufgrund der Vielzahl an gelösten Stoffen ist eine exakte Betrachtung aller Vorgänge in einer Zelle nicht möglich. Das Verständnis über die Abläufe beim Einfrieren und Auftauen einer Lösung lässt sich jedoch an Gedankenmodellen nachvollziehen. Ein einfaches und gut untersuchtes Modell für Körperflüssigkeiten ist die isotone Kochsalzlösung.

Das binäre System einer 0,9%igen Natriumchloridlösung beginnt erst bei -0,56 oC zu gefrieren (Abb. 2). Es bilden sich Eiskristalle aus reinem Wasser. Ein weiteres Abkühlen der Lösung lässt mehr Eis entstehen, es kommt zu einer Konzentrationserhöhung der Restlösung durch eine Verringerung des Volumens der Flüssigphase bei gleichbleibender Anzahl von Natrium- und Chlorid-Ionen. Bis zum eutektischem Punkt bei -21,3 oC [Voigt, 1993] wird bei stetiger Abkühlung reines Wasser zu Eis kristallisieren. Die Salzkonzentration wird von 0,9 bis auf 23,3 Gew.% Natriumchlorid ansteigen. Bei weiterer Abkühlung unterhalb des eutektischen Punktes bildet sich eine zweite feste Eisphase, die neben Wasser nun 23,3 Gew.% Natriumchlorid enthält. Es liegt somit ein eutektisches Gemisch von reinem Wassereis und kristalliner Sole vor.

Unterhalb der Kristallisationstemperatur der Sole ist keine flüssige Phase nachweisbar. Es kann jedoch über den Dampfweg zu Umkristallisationen kommen. Diese Umkristallisation kann bei längeren Lagerungszeiten von biologischen Materialien zu Qualitätsverlusten führen und stellt ein zu berücksichtigendes


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Problem dar.

Die Forderung nach möglichst tiefen Lagerungstemperaturen trägt diesem Gesichtspunkt Rechnung und wird in der Praxis durch Langzeitlagerungen in der Gas- bzw. Flüssigphase von tiefgekühltem Stickstoff gewährleistet.

Abbildung 2: Phasenzustandsdiagramm einer 0,9%igen Natriumchlorid-Wasser-Mischung

Jede Kristallisation geht mit einer Erhöhung der Ordnung in der Molekularstruktur einher. Diese Entropieerniedrigung ist bei Wasser mit dem Gewinn von Energie verbunden. Um eine konstante Kühlrate zu gewährleisten, muss dem Wasser zum Zeitpunkt der Kristallisation mehr Wärme pro Zeit entzogen werden, als im normalen Abkühlprozess der Flüssigkeit bzw. im normalen Abkühlprozess der entstandenen festen Eisphase. Dem Abfangen dieser Kristallisationswärme muss bei gewünschter konstanter Kühlgeschwindigkeit Beachtung geschenkt werden.


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Wie stellen sich die Verhältnisse in der Zelle dar?

Beim langsamen Abkühlen kommt es extrazellulär zum Beginn der Eisbildung [Körber, 1995]. Durch die semipermeable Zellmembran wird Wasser aufgrund des Konzentrationsgradienten vom Intra- in den Extrazellularraum gezogen. Dieser Wasseraustausch erfolgt asymptotisch bis zu einem inaktiven Restvolumen [Sputtek, 1996b], welches durch das Volumen der dehydrierten Zellorganellen und der minimal erreichbaren Wasserkonzentration des eutektischen Gemisches vorgegeben ist. Bei humanen hämatopoetischen Zellen beträgt dieses Restvolumen 20,5 % [Gao, 1998]. Demzufolge ist 79,5 % osmotisch aktives Wasser in der Zelle vorhanden, welches sich an Diffusionsprozessen während des Einfriervorganges beteiligen kann.

Die Osmolarität steigt im Verlauf der Abkühlungsphase, in Analogie zum Gedankenmodell der Natriumchlorid-Wasser-Mischung, im Inneren der Zelle so dramatisch an, dass Zellschäden und damit der Verlust der Überlebensfähigkeit die Folge wären.

Ein Experiment, welches die These der Diffusion des Wassers durch die Zellmembran und die auftretenden Schäden durch hypertone Salzkonzentrationen bestätigt, wurde bereits 1953 an Erythrozyten durchgeführt [Lovelock, 1953].

Wasser kann durch die Zellmembran jedoch nicht mit beliebiger Geschwindigkeit diffundieren [Gao, 1998]. Die Art der Zelle und damit die Oberflächen-Volumen-Relation spielt hier eine wichtige Rolle. So haben Erythrozyten aufgrund ihrer meist bikonkaven Form eine deutlich größere Oberflächen-Volumen-Relation als zum Beispiel kugelförmig erscheinende Lymphozyten [Sputtek, 1996a].

Als Konsequenz aus diesen Unterschieden werden menschliche Erythrozyten heute mit 4600-4900 K/min [Scheiwe, 1982], Lymphozyten mit optimal 30 K/min [Scheiwe, 1983] und hämatopoetischen Vorläuferzellen mit 1-5 K/min [Cavins, 1965] [Boonlayangoor, 1980] abgekühlt und eingefroren. Die Anzahl und die Beschaffenheit der Zellorganellen, die Größe der Zellen, die Menge des freien Wassers, die Art und Konzentration der Salze sind die Variablen in dieser Betrachtung. Die optimale Kühlrate, welche durch die gemessene Temperatursenkung innerhalb einer bestimmten Zeit charakterisiert wird, kann nur empirisch in aufwendigen experimentellen Reihen ermittelt werden.


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Versucht man die dramatischen und meist letalen Zellschäden aufgrund der Osmolaritätserhöhung beim langsamen Einfrieren durch ein schnelleres Abkühlen und somit eine schnellere Eisbildung zu verhindern, so wird man Schäden durch intrazellulär gebildete Eiskristalle beobachten. Durch Versuche, Hefezellen optimal einzufrieren und wieder aufzutauen, gelangte man zu der Erkenntnis, dass die Kühlraten beim Frieren und die Heizraten beim Tauen die wesentlichsten Faktoren des Vitalitätserhaltes darstellen [Mazur, 1968]. Eine niedrige Kühlrate, kombiniert mit einem anschließenden schnellen Tauprozess, zeigte die höchste Überlebensrate der untersuchten Zellen. Zu niedrige, wie auch zu hohe Kühlraten verschlechtern das Ergebnis. Dieser Zusammenhang ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Von analogen Ergebnissen konnte nach Experimenten an Lymphozyten berichtet werden [Scheiwe, 1983].

Abbildung 3: Vereinfachtes Schema der Zusammenhänge von Kühlrate und Überlebensraten der Zellen (nach [Mazur,1968])


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Die Eisbildung beginnt auch bei raschem Abkühlen extrazellulär. Da jedoch die eutektische Temperatur schneller erreicht wird und die Zellmembran nicht unendlich schnell die Intrazellulärflüssigkeit diffundieren lassen kann, befindet sich zu diesem Zeitpunkt noch ausreichend Wasser in der Zelle. Die Folge wäre die Bildung von Eiskristallen im Inneren der Zelle und die Gefahr von mechanischen Schäden an den Zellorganellen. Es gilt also bei Einfriervorgängen von Zellen die Kühlrate zu finden, bei der es zu keiner übermäßigen Dehydrierung und damit Osmolaritätssteigerung im Inneren der Zelle kommt, bei der aber gleichzeitig keine gesteigerte intrazelluläre Eisbildung zu befürchten ist [Sputtek, 1997] [Jetter, 1998].

2.4 Technik des Einfrierens

Die technisch aufwendigste Methode ist das kontrollierte Einfrieren der Zellsuspensionen. Dazu werden die aufgearbeiteten Blutproben in spezielle Kryo-Beutel gefüllt, zwischen Metallplatten gespannt und in einen abgeschlossenen Luftraum des entsprechenden Gerätes gebracht. Der Abstand der Metallplatten zueinander gewährleistet eine gleichmäßige Gefrierschichtdicke und trägt so zur Vergleichbarkeit der Friervorgänge bei. Die Abkühlung erfolgt durch kalkulierte Zugabe von verdampfendem flüssigem Stickstoff. Die Temperatur der Blutproben wird in Abhängigkeit von der Zeit durch Messung mit einer Sonde in einem Referenzbeutel aufgezeichnet und dient so gleichzeitig der Prozesssteuerung und der Dokumentation. Durch eine mehr oder minder schnelle Zugabe von Stickstoff können unterschiedliche Kühlraten eingehalten werden und es besteht die Möglichkeit, die am Gefrierpunkt freiwerdende Kristallisationswärme rasch abzufangen und so einem Temperaturanstieg im Beutel entgegenzuwirken. Die Kühlraten können durch diese Geräte in einem weiten Bereich vorgewählt werden. Beim Einfrieren von peripheren Blutstammzellkonzentraten sind Werte von 1-5 K/min gebräuchlich [Makino, 1991] [Branch, 1994] [Harris, 1994]. Die Methode des kontrollierten Einfrierens kann als „Goldstandard“ angesehen werden. Sie hat sich sowohl in der klinischen Transplantationspraxis als auch in der experimentellen Medizin bewährt.


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Neben dem kontrollierten ist heute das unkontrollierte Einfrieren peripherer Blutstammzellkonzentrate eine, meist aus Kostengründen gewählte, oft beschriebene Technik. Dazu werden die analog aufgearbeiteten und in Beutel gefüllten Blutzellen in den Luftraum von elektrisch betriebenen Tiefkühlern gebracht.

Die Abkühlung der Beutel erfolgt in Abhängigkeit von der Ausgangstemperatur der Beutel, des Volumens und der Temperatur des Tiefkühlers. Letztere liegt zwischen -80 und -90 oC [Makino, 1991] [Katayama, 1997] [Ayello, 1998] [Galmes, 1999]. Die Ausgangstemperatur kann relativ leicht standardisiert werden, indem man vorgekühlte Materialien einsetzt. Das Volumen des Beutels ist die größte Variable in diesem Prozess. Je nach Separationserfolg und Ausbeute kann das Volumen von wenigen Millilitern bis zu mehreren 100 Millilitern schwanken. Ein Weg, eine validierbare Kühlrate von 1-5 K/min zu erreichen, ist das Lagern der Beutel zwischen Metallplatten [Rubinstein, 1995]. Aufgrund ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit kommt es zum raschen Wärmeaustausch. Eine weitere Variante ist das Einbringen der einzufrierenden Beutel in ein zweites größeres, methanolgefülltes Gefäß [Hernandez-Navarro, 1998]. Durch das 2-3 Liter messende Volumen ist die Geschwindigkeit der Abkühlung von ca. 1 K/min besser kalkulierbar. Ein weiterer und entscheidender Vorteil dieser Methode ist in der Tatsache zu sehen, dass mehrere Blutbeutel mit unterschiedlichsten Volumina unter identischen Bedingungen eingefroren werden können, solange das Volumen des Methanolgefäßes konstant gehalten wird. In diesem Fall ist mit gleichbleibenden Kühlraten zu rechnen. Aufgrund des niedrigen Gefrierpunktes des Methanols von unter -97 oC [Kaltofen, 1980] ist eine Kristallisation der Badflüssigkeit nicht zu befürchten.

Das unkontrollierte Einfrieren von Blutzellen kann unter oben genannten Bedingungen ausreichend standardisiert werden. Für die Entwicklung neuer Methoden ist jedoch das kontrollierte Einfrieren vorzuziehen, da hier in einem größeren Rahmen die entscheidenden Parameter variiert und gesteuert werden können.


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2.5 Lagerung der gefrorenen Transplantate

Neben der Methode des Einfrierens kommt der Art der Lagerung der gefrorenen Blutzellen eine besondere Bedeutung zu. Die Aufbewahrung sollte sicher die notwendigen niedrigen Temperaturen einhalten können. Sie sollte ferner gewährleisten, dass es zu keinen fortschreitenden Zellschäden kommt, alle biochemischen Prozesse müssen während der Lagerung zum Stillstand kommen und eine Kontamination der Transplantate mit Bakterien, Pilzen und Viren muss vermieden werden. Letztendlich muss die Lagerung kostengünstig sein.

Heute haben sich in Analogie zum Einfrierprozess zwei Varianten durchgesetzt. Die Lagerung bei -150 bis -196 oC in der Dampf- oder Flüssigphase von Stickstoff bzw. die Lagerung bei -80 bis -90 oC in elektrisch betriebenen Tiefkühlschränken.

Die Lagerung in elektrischen Kühlschränken scheint die einfachere und kostengünstigere Variante zu sein, da sich entsprechende Geräte einfach aufstellen lassen und außer einem elektrischen Anschluss für den Betrieb und einem zweiten Gerät im Falle eines technischen Defektes keine weiteren Voraussetzungen notwendig sind.

In einer bereits 1987 veröffentlichten Arbeit [Wang, 1987] sollte an Mäuseblutstammzellen die Gleichwertigkeit der beiden Lagerungsmethoden bewertet werden. Es zeigte sich, dass es direkt nach dem kontrollierten Einfrieren zu einem 25%igem Verlust an lebensfähigen Zellen kam. Während einer Lagerung von 12 Monaten konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Überlebensrate der Zellen zwischen der Aufbewahrung bei -80 oC im Kühlschrank und -196 oC im Stickstoff ermittelt werden. Das Einfrieren ist also die größte Belastung für die Zelle, die weitere Lagerung stellt ein geringeres Problem dar.

Eine japanische Gruppe von Wissenschaftlern ermittelte nach einer bis zu 5 Jahre dauernden Lagerung in einem elektrischen Tiefkühler bei -80 oC nur einen geringfügigen Abfall der Vitalität der Zellen [Katayama, 1997]. Nach vier Jahren waren noch über 80 % der Zellen lebensfähig.


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Die Ergebnisse konnten in einer 1998 veröffentlichten Arbeit bestätigt werden [Ayello, 1998]. Die Lagerung des gefrorenen Blutes erfolgte bei -90 oC für durchschnittlich drei Jahre. Es wurden sowohl Knochenmarkstammzellen als auch periphere Blutstammzellen in die Untersuchung eingeschlossen. Nach dem unkontrollierten Einfrieren wurde nach 2 Tagen von einem Teil des Blutes die Vitalität am Anfang der Lagerung bestimmt. Nach 26-78 Monaten Lagerungsdauer konnten noch 93 % der zuvor ermittelten Zellzahlen als lebensfähig eingestuft werden.

Im Gegensatz zu diesen hohen Überlebensraten konnte in einer weiteren Untersuchung gezeigt werden, dass die Langzeitlagerung in diesen Kühlschränken mit Nachteilen behaftet ist [Galmes, 1999]. Nach einer anfänglichen Vitalität von 80 % konnten nach 31 Monaten Lagerung nur noch 33 % der mononukleären Zellen als lebensfähig identifiziert werden. Bereits nach einem Jahr war es nicht mehr möglich, diese Zellen in-vitro anzuzüchten. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass eine Lagerung bei -80 oC für maximal 6 Monate erfolgen sollte. Ob die durch die mechanische Kühlung hervorgerufenen Vibrationen oder andere Erschütterungen für diese Ergebnisse als Ursache in Frage kommen, ist ungeklärt.

Ein Nachteil haftet der Lagerung in elektrisch betriebenen Tiefkühlern jedoch an - die totale Abhängigkeit von elektrischer Energie. Im Moment eines Stromausfalles und dem Versagen der Notstromaggregate wären alle eingefrorenen Blutzellen nach kurzer Zeit verloren. Für den Patienten kann dies unter Umständen dramatische Folgen haben, da im Falle einer bereits durchgeführten Hochdosischemotherapie und einer damit verbundenen Zerstörung des blutbildenden Systems die Gabe von genetisch kompatiblen Blutstammzellen seine einzige Überlebenschance darstellen würde. Sollte die Hochdosischemotherapie noch nicht durchgeführt worden sein, bedeutet der Verlust des Transplantates für den Patienten eine erneute Mobilisierung, Separation und Qualitätskontrolle, die mit einem Verlust an Zeit einhergeht.

Die zweite Variante der Lagerung nutzt die niedrige Temperatur von flüssigem Stickstoff. Diese Lagerungsart ist technisch, finanziell und räumlich aufwendiger und mit erhöhten Sicherheitsvorkehrungen verbunden. Bei Langzeitaufbewahrung scheinen jedoch höhere Lagerungszeiträume erreichbar zu sein. Noch nach 11 Jahren Lagerung im flüssigen Stickstoff waren die Ergebnisse der Transplantation mit


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diesen Zellen zufriedenstellend [Aird, 1992]. Drei bis vier Wochen nach der Transplantation waren die gemessenen Leukozyten- und die Thrombozytenwerte in den Bereich der vollständigen Rekonstitution der Hämatopoese angestiegen.

Eine abschließende Bewertung der Frage einer optimalen Lagerung ist an dieser Stelle nicht möglich. Aus theoretischen Gründen und praktischen Erwägungen sollte eine möglichst niedrige Temperatur gewählt werden, da es oberhalb der Glasübergangstemperatur von ca. -130 oC zu geringen, aber doch messbaren Umkristallisationserscheinungen kommt [Körber, 1982], die die dauerhafte Qualität des Blutes beeinflussen können. Der Vorschlag einer Trennung zwischen kurzfristiger Lagerung von wenigen Wochen bei -80 oC und einer Dauerlagerung über Jahre in flüssigem Stickstoff [Sputtek, 1996a] scheint ein Lösungsansatz zu sein.

2.6 DMSO

2.6.1 Kryoprotektion mit DMSO

Einfrieren und Auftauen von lebenden Zellen ohne die Zugabe eines Gefrierschutzmittels sind aus den in Abschnitt 2.3. genannten Gründen kaum möglich. Die Zellen würden durch Eiskristalle zerstört werden oder osmotische Schädigungen davontragen. In der Fachliteratur stößt man erstmals Ende der fünfziger Jahre auf DMSO als Kryoprotektor. Die Veterinärmedizin benutzte DMSO-Lösungen schon 1959 [Lovelock, 1959] zum Einfrieren von Bullensamen. Sechs Jahre später wurde über Versuche an humanen Granulozyten [Cavins, 1965] berichtet und im Laufe der folgenden Jahre nahm die Anzahl der Untersuchungen und Veröffentlichungen stark zu. Empirisch wurden und werden verschiedene Konzentrationen (Tab. 1), Kühlraten, Frier- und Lagerungsmethoden untersucht. Beim Studium der Literatur fällt auf, dass die Formulierungen eingesetzter kryoprotektiver Lösungen zum Einfrieren von Granulozyten, Knochenmark-, Nabelschnurblut- bzw. peripherer Blutstammzellen hinsichtlich ihrer Zusammensetzung stark variieren. DMSO ist jedoch stets ein fester Bestandteil dieser Mischungen (Tab. 1).


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Tabelle 1: Einsatz kryoprotektiver Lösungen zum Einfrieren von Blutstammzellen (Auswahl nach Literaturangaben)

DMSO in %

HAES in %

HA in %

Andere

Literaturquelle

 

 

 

 

 

10

 

 

 

[Cavins, 1965]

10

 

 

10 % fetales Kälberserum

[Cavins, 1965]

10

 

 

5 % fetales Kälberserum

[Cavins, 1965]

15

 

 

 

[Cavins, 1965]

8

 

 

10 % autologes Plasma

[Dankberg, 1978]

10

 

 

 

[Fliedner, 1979]

5

 

 

 

[Boonlayangoor, 1980]

10

 

 

 

[Boonlayangoor, 1980]

10

 

 

 

[Wang, 1987]

5

6

 

 

[Wang, 1987]

10

 

 

 

[Davis, 1990]

10

 

 

 

[Magrin, 1991]

5-15

4-8

4

 

[Makino, 1991]

10

 

 

 

[Branch, 1994]

10

 

 

 

[Rubinstein, 1995]

5

6

 

 

[Rubinstein, 1995]

10

 

 

 

[Galmes, 1995]

10

 

 

 

[Gorlin, 1996]

5

4

4

 

[Gorlin, 1996]

5

6

5,5

 

[Di Nicola, 1996]

5

6

 

5,5 % Oxypolygelatine

[Di Nicola, 1996]

0-7,5

 

 

 

[Donaldson, 1996]

5

4

 

 

[Donaldson, 1996]

7,5

4

 

 

[Donaldson, 1996]

5

0-4

 

 

[Donaldson, 1996]

5

6

4

 

[Katayama, 1997]

10

 

 

 

[Egorin, 1998]

10

 

 

1 % Dextran

[Rubinstein, 1998]

10

 

 

 

[Hernandez-Navarro, 1998]

5

6

4

 

[Ayello, 1998]

5

6

4

 

[Re, 1998]

0-20

0-20

8

 

[Jetter, 1998]

5+10

 

 

 

[Galmes, 1999]

10

 

10

 

[Cilloni, 1999]


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Ziel dieser Studien war und ist das Finden einer einfachen Methode, Zellen optimal vor den Belastungen des Einfrierens zu schützen, diese Zellen dann möglichst lange zu lagern und mit einem Minimum an Verlusten aufzutauen, um sie wieder im Organismus zur Anwendung zu bringen.

Die zur Kryopreservation einsetzbaren Konzentrationen an DMSO bewegen sich zwischen 5 und 20 Vol%. Niedrigere Konzentrationen reichen für einen effizienten Schutz nicht aus [Donaldson, 1996]. Bei höheren Konzentrationen kam es zu einer Schädigung der mononukleären Zellen [Rowley, 1993]. Heute zeichnet sich eine Reduktion des DMSO-Anteiles in den zugesetzten Lösungen auf eine Endkonzentration von 5 Vol% ab. Zum einen ist DMSO pharmakologisch nicht völlig indifferent, zum anderen ist die hohe Osmolarität einer 10%igen DMSO-Lösung von 1280 mmol/l zu beachten, die bereits im Vorfeld des Einfrierens zu Schäden an den Zellen führen kann. DMSO diffundiert sehr schnell zwischen intra- und extrazellulärem Raum hin und her und kann so den anfangs starken Gradienten zwischen intra- und extrazellulärer Osmolarität reduzieren [Gorlin, 1996].

Neben Hydroxyethylstärke (Abschn. 2.7.) werden Humanalbumin, körpereigenes Plasma, fetales Kälberserum, Dextrane, Oxypolygelatine, Zucker und verschiedene Puffer als Zusätze zu kryoprotektiv wirksamen Mischungen eingesetzt.


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2.6.2 Wirkungen von DMSO auf Blutzellen

Beim Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum stellen sich zwei Fragen:

Zur Beantwortung der ersten Frage wurden mit DMSO versetzte Zellen bei verschiedenen Lagerungstemperaturen beobachtet.

Die Inkubation von normalen und leukämischen Blutzellen mit DMSO zeigt eine temperatur- und zeitabhängige Toxizität des Kryoprotektors [Bouroncle, 1967]. Mit steigender Kontaktzeit nahm die Vitalität der Zellen ab, eine erniedrigte Temperatur reduzierte die Toxizität. Eine 1982 veröffentlichte Untersuchung beschrieb ebenfalls eine schlechte Toleranz von Progenitorzellen gegenüber 10%igem DMSO [Douay, 1982]. Eine Lagerung bei 4 oC reduzierte die Überlebensrate der Zellen nach 5 Minuten um 24 %. Nach einer halben Stunde waren nur noch 24 % der Zellen in der Lage, in-vitro Zellkolonien zu bilden und nach zwei Stunden betrug die Zahl der proliferativen Zellen nur noch 15 %.

Die hohen Verlustraten und die damit verbundenen hohen Toxizitäten des DMSO gegenüber Blutzellen konnten in nachfolgenden Untersuchungen nicht bestätigt werden [Takahashi, 1985] [Fahy, 1990]. In einer Studie zur Wirkung von DMSO auf hämatogene Vorläuferzellen zeigte es sich, dass Konzentrationen von über 10 % DMSO im Medium zu einem geringen Absinken der Zellzahlen führen [Rowley, 1993]. Unterschiedliche Lagerungstemperaturen von 4 oC und 37 oC belasteten die Zellen in ähnlichem Maße. Geringere Konzentrationen an DMSO verringerten die Anzahl der mononukleären Zellen nicht. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die kurzzeitige Lagerung von Blutzellen in DMSO-haltigen Lösungen keine


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Probleme aufwirft. Ganz anders stellte sich die DMSO-Empfindlichkeit der Zellen während der Proliferation dar. Bereits geringe Konzentrationen von 1 % des Kryoprotektors DMSO im Kulturmedium reduzierten das Wachstum der Zellen unter in-vitro-Kulturbedingungen stark. Es kam zu einem 50%igen Verlust der Proliferationskapazität. Eine Konzentration von 10 % stoppte jedes Wachstum.

Die Anzahl der veröffentlichten Arbeiten zu qualitativen und quantitativen Fragen der DMSO-Toxizität nach dem Einfrieren der Zellen übersteigt die Zahl der Arbeiten, die sich mit der DMSO-Wirkung auf Zellen ohne Einfrieren beschäftigen, um ein Vielfaches.

Bei der Bewertung von DMSO als Kryoprotektor muss stets bedacht werden, dass die Zellschädigung durch das Einfrieren nicht losgelöst von der Toxizität der Substanz DMSO betrachtet werden kann. Eine klare Trennung zwischen Frierschäden und Substanzschäden ist nicht möglich, da ein Einfrieren ohne ein Kryoprotektivum zu keinem vitalen Ergebnis führt. Die Summe der Schäden stellt jedoch einen wichtigen Aspekt für die Lagerung von Blutzellen dar.

Es konnte gezeigt werden, dass Proben hämatopoetischer Vorläuferzellen nach dem Einfrieren mit 10%igem DMSO, dem Auftauen und Belassen in der kryoprotektiven, DMSO-haltigen Lösung innerhalb von 30 Minuten einer Reduktion der Zellzahlen von ca. 55 % unterliegen [Branch, 1994]. In einer weiteren Arbeit über das Einfrieren und Auftauen von plazentarem bzw. Nabelschnurblut [Rubinstein, 1995] wurde demonstriert, dass das schnelle Verdünnen der aufgetauten Präparate mit Pufferlösungen zu einer verbesserten Überlebensfähigkeit der Zellen führt. Die zwanzigfache Verdünnung, wie sie in der genannten Arbeit zur Anwendung kam, senkt die Konzentration des DMSO von 10 % auf 0,5 %. Da eine 10 %ige DMSO-Lösung eine vierfach höhere Osmolarität gegenüber dem normalen Blut aufweist, ist anzunehmen, dass diese hohe Abweichung von der Isotonie bereits zur Beeinträchtigung der Zellen und damit zu einer Verringerung der Proliferationsrate führt. Andere Arbeitsgruppen konnten Überlebensraten von 95 % [Di Nicola, 1996] [Hernandez-Navarro, 1998], 86% [Richter, 1998], 82 % [Arseniev, 1995], 74 % [Katayama, 1997] [Ayello, 1998], 66 % [Re, 1998] oder 55-70 % [Magrin, 1991] ermitteln. Die Schwankungen dieser Werte sind durch die verschiedenen Varianten des Einfrierens, die Konzentration des DMSO als Kryoprotektor und die Art der


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Vitalitätsbestimmung bedingt. Speziell die unterschiedlichen Methoden der Vitalitätsbestimmungen scheinen einen großen Einfluss auf das Ergebnis zu haben. So konnten in einer Untersuchung durch Anzüchtungsversuche 13,8-81,5 % überlebensfähige Zellen ermittelt werden [Magrin, 1991]. Die Werte für die durch die Trypanblau-Ausschlussmethode (Abschn. 2.8.1.) bestimmten Vitalitäten lagen dagegen zwischen 55 und 70 %.

Als zusätzlicher DMSO-Effekt konnte durch in-vitro-Versuche ermittelt werden, dass sich die Phagozytoserate von Granulozyten reduzierte [Cavins, 1965] [Boonlayangoor, 1980]. Die Beeinträchtigungen der Myeloperoxidaseleistung von humanen Granulozyten [Lionetti, 1975] erweitert die biochemischen Reaktionen des Kryoprotektors auf zellulärer Ebene. Die Relevanz dieser in-vitro beobachteten Wirkungen auf die Proliferationsfähigkeit der Zellen im Organismus nach Transfusion ist ungeklärt.

Die in der Literatur anzutreffenden Befunde sind wie folgt zusammenzufassen:

Eine ausreichend hohe, jedoch so gering wie möglich gehaltene Konzentration an DMSO und anderen Kryoprotektiva stellt die Voraussetzung für ein optimales Einfrieren dar. Das langsame Einfrieren mit 1-5 K/min und die Lagerung bei möglichst tiefen Temperaturen scheint aus heutiger Sicht die schonendste Art einer dauerhaften Aufbewahrung von Stammzellpräparaten zu sein. Ein rasches Auftauen und eine zügige Transfusion sollen den Kontakt der Zellen zum DMSO möglichst kurz gestalten.


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2.6.3 Pharmakokinetik und Pharmakologie von parenteral verabreichtem DMSO

DMSO ist ein bipolares Molekül (Abb. 4), welches bei Raumtemperatur in flüssiger Form vorliegt. Die molare Masse der Substanz beträgt 78,1 g/mol. Die Verbindung besitzt gute wasser- und fettlösende Eigenschaften, sie bietet sich als aprotisches Lösungsmittel für viele chemische Reaktionen an. DMSO verteilt sich schnell und vollständig in allen Geweben. Nach dermaler Applikation kann es bereits nach 5 Minuten im Blut nachgewiesen werden, nach einer Stunde hat es das tiefe Kompartiment des Knochens erreicht [Kolb, 1965]. Die Metabolisierung erfolgt in der Leber über das Cytochrom-P450-Enzymsystem. Die Elimination erfolgt renal in Form der Metaboliten Dimethylsulfon [(CH3)2SO2] und Dimethylsulfid [(CH3)2S] [Egorin, 1998].

Abbildung 4: Strukturformel von DMSO

Ein kleiner Anteil des DMSO wird als Dimethylsulfid über die Lunge des Patienten ausgeschieden [Kolb, 1965].

Die Wirkungen von parenteral appliziertem DMSO wurden in einer 1990 veröffentlichten Arbeit an 82 Patienten nach einer Knochenmarktransplantation untersucht [Davis, 1990]. Das Knochenmark war mit Hilfe einer 10%igen DMSO-/Pufferlösung eingefroren worden. Es zeigte sich, dass die aufgetretenen Nebenwirkungen meist leichter bis mittlerer Stärke waren. Am häufigsten traten Schwindel und Erbrechen, Rötungen der Haut, abdominale Krämpfe und Atemnot


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auf. Es bestand ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem verabreichten Volumen des Transplantates und der Schwere der Reaktionen. Die Nebenwirkungen waren durch eine prophylaktische antihistaminerge Medikation gut steuerbar.

Acht Jahre später konnten in einer ähnlich aufgebauten Studie die Nebenwirkungen bestätigt werden [Zambelli, 1998]. In 50 % der Fälle traten Schwindel und Erbrechen auf. Hypotensive Reaktionen und eine Verlangsamung der Herzschlagfrequenz wurden ebenfalls beobachtet. Auch hier gab es einen klaren Zusammenhang zwischen der Menge des transfundierten DMSO und der Stärke der Nebenwirkungen.

Eine exakte Trennung und Wichtung der Nebenwirkungen zu Lasten oder zu Gunsten des DMSO in Bezug auf die durch die Kryokonservierung entstandenen Zellfragmente konnte von den Autoren nicht vorgenommen werden. Arbeiten, die sich mit diesem Problem beschäftigen, wurden nicht gefunden.

Durch einen nach dem Tauen stattfindenden Waschschritt kann der im Transplantat enthaltene DMSO-Anteil reduziert werden. Dadurch ist es weiterhin möglich, Zelltrümmer, Fragmente oder Zellorganellen zu entfernen, die beim Einfrieren und Auftauen entstanden sind. Diese Zelltrümmer rufen einen Teil der histaminbedingten Nebenwirkungen während der Transfusion hervor. Die Reduktion dieser Patientenbelastung kann als eine Qualitätssteigerung des Transplantates gesehen werden [Zambelli, 1998]. Kritisch zu bewerten wären die dem Tauen folgenden Waschprozesse hinsichtlich der Zellbelastung durch Zentrifugationsschritte. Der dabei stets eintretende Zellverlust und die Gefahr der mikrobiellen Kontamination sind weitere Risiken. Zu bedenken ist auch die Gefahr eines platzenden Beutels, welche in einer Zentrifuge nie ganz ausgeschlossen werden kann. Viele Transplantationszentren verzichten daher auf einen vorgeschalteten Waschschritt.


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2.6.4 Weitere Verwendung von DMSO

Das heutige Einsatzgebiet von DMSO erstreckt sich auf zwei Gebiete:

Die ABDA-Datenbank führte im September 2002 vier Arzneimittel zur Anwendung am Menschen mit dem Inhaltsstoff DMSO. Dabei handelt es sich um zwei antirheumatische Gele, die für sich die Indikationen der stumpfen Traumen, der Blutergüsse, der Sehnenzerrungen und das Gebiet der rheumatischen Beschwerden beanspruchen. Das dritte Arzneimittel ist eine Mischung zweier Lokalanästhetika und DMSO, es kann zur Oberflächenanästhesie eingesetzt werden. Die vierte Rezeptur stellt eine Lösung zur Behandlung von Warzen dar. Hier ist das DMSO mit der keratolytisch wirksamen Salicylsäure und dem 5-Fluorouracil, einem DNS-Antimetaboliten, kombiniert.

Das Vermögen, Hautschichten zu durchdringen, prädestiniert DMSO geradezu, als Schleppersubstanz für andere Wirkstoffe untersucht und eingesetzt zu werden. Aus der Vielzahl der Veröffentlichungen sei an dieser Stelle nur auf zwei Übersichtsarbeiten hingewiesen [Wood, 1975] [Jacob, 1986]. Man erreicht hohe Konzentrationen von Farbstoffen, antiviralen Substanzen, Antibiotika, Antimykotika und Kortikosteroiden in den oberen Schichten der Haut, wenn man diese Stoffe in DMSO gelöst auf die Haut aufträgt.

Reines DMSO wird heute zur Behandlung von Zytostatika-Paravasaten eingesetzt [Krämer, 1992] [Gemmern, 1996] [Krämer, 2002]. Viele Zytostatika weisen ein ausgesprochen hohes gewebetoxisches Potential auf. Die mehrmalige tägliche dermale Applikation von 70-100%igem DMSO soll im Falle der Paravasation die


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Verteilung und Resorption der fehlinfundierten Arzneistoffe beschleunigen und damit der Gefahr einer für den Patienten sehr schmerzhaften Gewebsnekrose entgegenwirken.

Eine weitere Möglichkeit, die hohe Penetrationsfähigkeit von DMSO therapeutisch zu nutzen, ist die Behandlung von Nagelmykosen. Durch partielle Eluierung des Nagelmateriales gelangen lokal aufgetragene Antimykotika in tiefere Gewebsschichten und verbessern so die Wirksamkeit der Therapie [Mertin, 1996].

Neben der Anwendung als Penetrationsbeschleuniger sind für DMSO eine Reihe weiterer Einsatzgebiete bekannt.

DMSO verbessert - perkutan verabreicht - entzündliche Beschwerden. Es wirkt antiödematös, kann Nervenblockaden und damit Analgesie auslösen [Jacob, 1986]. Konzentrationen von 8-40 % sind bakteriostatisch und virusstatisch wirksam, ein Effekt, der sicherlich vorwiegend auf die hohe Osmolarität einer solchen Lösung zurückgeführt werden kann [Basch, 1968]. Chemotherapeutisch resistente Tbc-Bakterien können durch Zugabe deutlich geringerer Konzentrationen von 0,5-5 % DMSO in-vitro wieder für Antibiotika sensibel gemacht werden [Wood, 1975].

Ein Teil der in der Literatur veröffentlichten Ergebnisse ist diskussionswürdig, da die Untersuchungen unter in-vitro-Bedingungen durchgeführt wurden. Die für die angegebenen Wirkungen notwendigen hohen Plasmaspiegel sind in-vivo nicht erreichbar, so dass eine klinische Relevanz der Untersuchungen fraglich erscheint.

Ein Aspekt einer Therapie mit dem Wirkstoff DMSO darf in diesen Zusammenhang nicht unerwähnt bleiben. Durch die rasche Verteilung im Organismus, den Metabolismus und die Ausscheidung über die Lunge und die Haut ist die Patientenbelastung durch den ausgesprochen unangenehmen knoblauchartigen Geruch und Geschmack des Dimethylsulfids so hoch, dass mit einer ausreichenden Compliance nicht gerechnet werden kann. Von Hochdosischemotherapiepatienten ist bekannt, dass der Geschmack des kryoprotektiven Zusatzes DMSO fast unmittelbar nach Anlegen der Transfusion bemerkt wird. Die Geruchsbelästigung ist über


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Stunden vorhanden. Die geringe Anzahl an auf dem Markt befindlichen DMSO-haltigen Arzneimitteln ist sicher ein Indiz für die schlechte Akzeptanz der genannten Nebenwirkungen.

2.7 Hydroxyethylstärke

2.7.1 Herstellung von Hydroxyethylstärke

Die Hydroxyethylstärken (HAES) im medizinischen Einsatz unterscheiden sich durch verschiedene Einsatzgebiete und chemische Modifikationen. Die Herstellung aller HAES-Präparate erfolgt in mehreren Schritten.

Rohstoff für alle HAES-Präparate ist Amylopektin aus Wachsmais oder Kartoffeln. Amylopektin besteht aus alpha-1,4 glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen. An etwa jeder 17. Glucoseeinheit befinden sich alpha-1,6 glycosidisch verknüpfte Glucoseketten, so dass ein mehrfach verzweigtes Makromolekül entsteht. Natives Amylopektin zeichnet sich durch eine schlechte Wasserlöslichkeit aus. In einem ersten Schritt erfolgt die Spaltung der langen Ketten des Rohstoffes durch Säurehydrolyse auf ein mittleres Molekulargewicht von 450000 bis 200000 Dalton. Anschließend werden in alkalischer Lösung mit Ethylenoxid Hydroxyethylgruppen eingeführt, um so zu sehr gut wasserlöslichen Verbindungen zu gelangen (Abb. 5).

Durch die zufällige Kettenspaltung entstehen Substanzen, die Molmassen in einem bestimmten Bereich aufweisen. Die zweite Variable in der Herstellung der Hydroxyethylstärken ist der Grad und das Muster der Substitution der Hydroxylgruppen an den Glucosemolekülen.


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Abbildung 5: Ausschnitt der chemische Struktur von Hydroxyethylstärke mit variablem Substutionsmuster

Die Modifikation der natürlichen Stärke erzeugt somit Produkte, die nicht aus identischen Molekülen bestehen, sondern in einem begrenzten Bereich variieren. Die Kenngrößen einer Hydroxyethylstärke sind somit die Kettenlänge und der Substitutionsgrad. Eine HAES 200/0,5 entspricht einer Molekularmasse von durchschnittlich 200000 Dalton und einer 50% Substitution der Hydroxylgruppen der Glucose.

2.7.2 Kryoprotektion mit Hydroxyethylstärke

Neben DMSO hat Hydroxyethylstärke als weiterer kryoprotektiver Zusatz heute einen festen Platz in der Kryopreservation von Zellen erlangt (Tab. 1). Die hochmolekulare Verbindung kann aufgrund ihrer Molekülmasse und ihrer hohen Hydrophilie nicht in die Zelle diffundieren. HAES verringert so die Belastungen durch extrazelluläre Eisbildung. Als Wirkmechanismen werden ein Umschließen der Zelle mit einer glasartig erstarrten Schicht aus HAES [Gorlin, 1996] oder eine


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Verringerung des für die Kristallisation verfügbaren Wassers durch die hohe Wasserbindungsfähigkeit der hydrophilen Hydroxyethylstärke diskutiert [Körber, 1982]. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für den kryoprotektiven Effekt der zugesetzten HAES könnte eine Erhöhung der extrazellulären Viskosität und damit eine Verringerung der Diffusionsgeschwindigkeit des intrazellulären Wassers in den Extrazellularraum sein [Takahashi, 1998]. Im Prozess des Auftauens kann der HAES-Zusatz das Verklumpen und Verkleben der Zellen nach dem Auftauprozess minimieren [Makino, 1991]. Die in der Literatur beschriebenen Konzentrationen für das Einfrieren von Blutstammzellen (Tab. 1) bewegen sich für HAES zwischen 4-20 %.

In der Kryopreservation von Erythrozyten ist es heute möglich, durch den Einsatz von Hydroxyethylstärke DMSO-freie Einfriermedien einzusetzen [Thomas, 1996] [Sputtek, 2001].

2.7.3 Weitere Verwendung von Hydroxyethylstärke

Hydroxyethylstärke wird bei Volumenmangelschock, Hämodilution, zerebralen, peripheren, otogenen, retinalen und plazentären Durchblutungsstörungen eingesetzt [Schulze, 1991]. Als wichtigste Indikationsgruppe ist hierbei die Substitution von Blutverlusten nach größeren Blutungen zu sehen. Als Anforderungen an einen optimalen Plasmaersatz sind eine ausreichend lange Zirkulation im Gefäßsystem und eine hohe Bindungskapazität für Wasser zu nennen. Des weiteren sollte sich das Arzneimittel durch eine sichere Ausscheidung der Substanz unabhängig von anderen Begleiterkrankungen, fehlende Antigenität und eine gute Lagerfähigkeit verbunden mit geringen Herstellungskosten auszeichnen.

Hydroxyethylstärke kann aufgrund der Molekülgröße nach intravenöser Applikation den Intravasalraum nicht verlassen. Durch den Angriff der Serumamylase wird die Kettenlänge reduziert und ab einer Molekülarmasse von ca. 70000 Dalton werden die Abbauprodukte und Restmoleküle aufgrund des Erreichens der Nierenschwelle rasch renal eliminiert. Je höher die Ausgangskettenlänge der Hydroxyethylstärke war,


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desto länger wird das Molekül im Gefäßsystem verweilen und den therapeutischen Effekt ausüben. Ein weiterer Aspekt ist die sterische Hinderung der Substitution am C2-Atom der Glucose, die den Abbau des Moleküls durch die Serumamylase stärker behindert als die Substitution am C6-Atom. Neben der renalen Ausscheidung werden HAES-Moleküle durch das retikulo-endothelialen System aus dem Intravasalraum entfernt [Kiesewetter, 1994]. Es kommt zu einer nachweislichen Einlagerung der Stärke in der Leber, der Lunge, der Niere, der Milz, dem Pankreas, den Lymphknoten, dem Darm und der Haut [Weidhase, 1998]. Diese Inkorporation kann in Abhängigkeit der Molekülgröße noch Monate nach einer Applikation nachgewiesen werden.

Je nach Kettenlänge und Substitutionsmuster sind intravasale Verweildauern von 2-3 h (HAES 200/0,5) bis hin zu 6 h (HAES 450/0,7) erreichbar. Einer beliebigen Verlängerung der Verweildauer durch eine immer größere Kettenlänge sind Grenzen durch die immer schlechter werdende Wasserlöslichkeit und geringer werdende Wasserbindungskapazität gesetzt. Die Wasserbindungskapazität der heute verwendeten HAES-Produkte ist beträchtlich und liegt zwischen 10-14 Gramm Wasser je Gramm Hydroxyethylstärke [Plasmaersatzmittel, Arzneimittelbrief, 1990].

Nach Applikation von HAES-Präperaten kommt es zu einer kurzfristigen Diuresesteigerung, die durch das schnelle renale Ausscheiden der Stärkemoleküle mit geringer Kettenlänge initiiert wird. Im weiteren Verlauf steigt die Aktivität der Serumamylase stark an, ein Zustand der für die Pankreatitis-Diagnostik bedeutsam sein kann. Klinische Symptome werden durch den Enzymanstieg nicht ausgelöst.

Eine weitere Nebenwirkung einer Therapie mit Hydroxyethylstärken besteht in der möglichen Beeinflussung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes, die über einen Verdünnungseffekt hinausgeht. Durch eine Verringerung der Faktor VIII-Aktivität kann es bei Verwendung hochsubstituierter Hydroxyethylstärke zu Blutungskomplikationen kommen. Niedrig substituierte Stärke mit einer Molmasse von ca. 200000 D beeinflusst die Gerinnung in geringerem Maße [Kiesewetter, 1994].

Ein wichtiger Aspekt beim Einsatz von Plasmaersatzflüssigkeiten ist in der Fließfähigkeit des Blutes zu sehen [Boldt, 1990]. Die Mikrozirkulation des Blutes in


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den Endstrombahnen wird durch HAES-Derivate verbessert, so dass sich aus dieser Eigenschaft die Verwendung der Substanzen bei peripheren, otogenen, retinalen und plazentären Durchblutungsstörungen ergibt [Schulze, 1991].

Durch die überwiegend renale Ausscheidung ist Hydroxyethylstärke ein Arzneimittel, bei dem der Funktionsfähigkeit der Niere eine große Bedeutung zugemessen werden muss. Patienten mit Nierenversagen müssen von der Therapie ausgeschlossen werden.

Eine häufig beschriebene Nebenwirkung einer Hydroxyethylstärke-Applikation besteht in einem lang anhaltendem Juckreiz. Als Ursache wäre die Einlagerung der HAES-Moleküle in der Haut durch das retikulo-endotheliale System denkbar. Je höher die kumulative Dosis der verabreichten Stärke ist, desto intensiver kann diese Nebenwirkung ausgeprägt sein. Der möglicherweise Monate anhaltende Juckreiz stellt keine vitale Komplikation dar, beeinträchtigt aber die Lebensqualität der Patienten beträchtlich.

Als letzte und wichtigste Nebenwirkung soll an dieser Stelle die Gefahr von allergischen bis hin zu anaphylaktischen Reaktionen genannt werden. Diese Reaktionen können lebensbedrohlichen Charakter annehmen, besonders vor dem Hintergrund, dass häufig Patienten mit Blutverlusten und damit verringerter Hämodynamik mit Plasmaersatzmitteln behandelt werden. Ein histaminbedingter Blutdruckabfall verschlechtert die oft labile Kreislaufsituation des Patienten erheblich. Beim Vergleich mit anderen Plasmaersatzmitteln fällt bei Hydroxyethylstärken jedoch die geringer Rate von ca. 0,1 % an anaphylaktischen Reaktionen auf [Plasmaersatzmittel, Arzneimittelbrief, 1990]. Dextrane und Gelatinepräparate fallen durch häufigere Anaphylaxie auf und sind so nicht in jedem Fall alternativ einsetzbar.


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2.8 Vitalitätstestungen

2.8.1 Trypanblau- Ausschlussmethode

Eine einfache Methode zur Feststellung der Qualität eines Einfrierprozesses stellt die Trypanblau-Ausschlussmethode dar. Trypanblau (Abb. 6) ist ein schwach basischer Farbstoff mit der Summenformel C34H24N6Na4O14S4 und einer molaren Masse von 960,8 g/mol.

Abbildung 6: Strukturformel von Trypanblau

Die Substanz tritt durch die gesunde Zellmembran nur sehr langsam hindurch und färbt den Zellkern der Zelle blau an. Man geht bei diesem Verfahren davon aus, dass eine intakte Zellmembran den Farbstoff vom Zellinneren fernhält. Es wird also nicht die innere Struktur und die Funktionstüchtigkeit der Zelle als Bewertungsmaßstab angelegt, sondern nur aufgrund der Membranbeschaffenheit auf den Zustand der Zelle geschlussfolgert. Unter Benutzung einer mit Natriumchlorid isotonisierten
0,4 %igen Trypanblau-Lösung wird nach einer festgelegten Zeit unter einem Mikroskop ein definiertes Volumen an Blutzellen oder eine bestimmte Zellzahl ausgezählt. Die Vitalität einer Zellsuspension errechnet sich aus dem Anteil der ungefärbten Zellen gegen den Anteil der gefärbten Zellen. Eine hohe Vitalität wird durch eine hohe Anzahl ungefärbter und eine kleine Anzahl gefärbter Zellen charakterisiert.


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Diese einfache Versuchsanordnung, die geringen technischen Anforderungen und die universelle Einsetzbarkeit für verschiedene Arten von Zellen haben diese Methode zu einem Standard in der Analyse von gefrorenen Zellen gemacht. Die Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode kann zahlreichen Veröffentlichungen entnommen werden [Handgretinger, 1994] [Nicol, 1995] [Di Nicola, 1996] [Katayama, 1997] [Galmes, 1999].

Der häufige Einsatz dieser Vitalitätsbestimmung darf jedoch nicht über einige kritische Aspekte hinwegtäuschen. So können durch das Anfärben von Zellen keine Aussagen über die Art der Zelle gemacht werden. Im ungünstigsten Fall überleben eine große Anzahl von ausdifferenzierten Zellen das Einfrieren und Auftauen, die Blutstammzellen könnten aber zu der stark geschädigten Zellpopulation gehören. Das Ergebnis der Trypanblau- Ausschlussmethode ließe in diesem Fall keine Rückschlüsse auf die Reproduktions- bzw. Proliferationsfähigkeit der Zellen zu. Die Transfusion eines solchen Blutes würde zu keiner oder einer stark verlangsamten Rekonstitution des Knochenmarkes führen, da nur die hämatopoetische Blutstammzelle über die Fähigkeit der Selbsterneuerung verfügt.

Ein zweites Problem ist in der großen Streuung der ermittelten Ergebnisse zu sehen. So fällt in zahlreichen der oben genannten Arbeiten auf, dass ähnliche Friermethoden zu unterschiedlichen Ergebnissen hinsichtlich der Trypanblau- Ausschlussmethode führen. Die Zeit bis zur Auszählung sowie die Dauer der Auszählung, die Temperatur und die Bewertungskriterien des Untersuchenden haben großen Einfluss auf das Ergebnis. Die Frage, wann eine Zelle nicht, nur leicht oder stark angefärbt ist, liegt im subjektiven Ermessen des Untersuchenden.

Je länger gesunde Zellen mit dem Farbstoff in Berührung kommen, desto höher wird der Anteil an gefärbten Zellen ausfallen. Zeitfenster, die für die Bestimmung der Vitalität mittels Trypanblau- Ausschlussmethode eingehalten werden sollten, sind der einschlägigen Literatur nicht zu entnehmen.

Neben Trypanblau kann die Unversehrtheit der Zellmembran mit den analog eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen Fluoresceindiacetat und Ethidiumbromid [Dankberg, 1978] [Rubinstein, 1995] bewertet werden, bei denen man jedoch ein Fluoreszenz-Mikroskop zur Auswertung benötigt.


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Als alleinige Methode, die Qualität von Stammzelltransplantaten zu bewerten, darf die Methode der Membranintegritätstestung mit Hilfe der Trypanblau- Ausschlussmethode nicht angesehen werden. Sie liefert allenfalls einen schnellen Hinweis auf die Überlebensrate der Zellen [Jones, 1995]. Exakter für die Bewertung des Blutstammzelltransplantates ist die Kultivierung [Jetter, 1998].

2.8.2 Kultivierung

Die entscheidenden Zellen für die erfolgreiche Transplantation nach einer Hochdosischemotherapie sind die Knochenmarks- bzw. Blutstammzellen. Aus ihnen entwickeln sich im Organismus alle Zelllinien durch Teilung und Reifung. Sie wandern nach Transplantation vom Blut in den Knochen ein und bilden an den ihr angestammten Plätzen neues Knochenmark. Die Anzahl und die Teilungsfähigkeit dieser Zellen sind also ein direktes Maß für die Qualität eines Transplantates. Eine in-vitro-Anzüchtung der Blutstammzellen ist erst seit Bekanntwerden des komplizierten Wechselspieles der hämatologischen Wachstumsfaktoren auf die Proliferation und Differenzierung der Blutzellen möglich geworden. Erst die richtige Kombination der einzelnen Faktoren untereinander in der richtigen Konzentration unter optimalen äußeren Bedingungen verspricht eine sichere und andauernde Kultivierung der Blutstammzellen in-vitro.

Die Anzüchtung der Zellen erfolgt heute in Brutschränken auf Methylcelluloseagar bei einer Kohlendioxidkonzentration von 5 %, einer Temperatur von 37 oC und einer relativen Luftfeuchte von 90 %. Die Angaben in der Literatur sind in Bezug auf die Anteile der einzelnen Zytokine oft unvollständig. Die Art der Wachstumsfaktoren ist in der Regel beschrieben, die Mengen der einzelnen Bestandteile sind oft jedoch nicht nachvollziehbar [Harris, 1994] [Ayello, 1998] [Galmes, 1999]. Eine Standardisierung der Faktorenmischung wäre wünschenswert, um die Ergebnisse reproduzierbar zu gestalten.

Nach 3-5 Tagen kann die Entstehung von Zellhaufen beobachtet werden, die sich aus im Blut befindlichen teilungsfähigen blastären Vorläuferzellen ableiten. Diese Zellhaufen sind jedoch noch kein Ausdruck der Proliferationsfähigkeit der gesuchten


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Blutstammzellen, da die Blasten nicht mehr die Möglichkeit zur beliebigen Vervielfältigung besitzen. Nach 10-14 Tagen können dann die aus den Blutstammzellen entstandenen Kolonien ausgezählt werden. Dabei unterscheidet man weiße, rote und gemischte Kolonien, die Auskunft über die Proliferationsfähigkeit der Blutstammzelle geben. Die Anzahl und die Art der Kolonien korrelieren mit der Anzahl der lebensfähigen Blutstammzellen und lassen damit eine Prognose über das Anwachsen der Zellen in lebenden Organismen und die Geschwindigkeit der Rekonstitution des Blutsystems zu.

2.8.3 Antikörpermarkierte Durchflusszytometrie

Neben der zwei Wochen dauernden Anzüchtung der Blutstammzellen bedient man sich heute zusätzlich eines opto-elektronischen Messverfahrens - der Durchflusszytometrie. Diese hat den Vorteil, innerhalb von Minuten aussagekräftige Ergebnisse zur Zusammensetzung einer Blutprobe zu ermöglichen. Dabei wird die Streuung eines Lichtstrahles durch verschiedene Zellen ausgewertet. Der grundlegende Aufbau eines solchen Gerätes ist bei allen Herstellern gleich (Abb. 7). Ein Laser oder eine Quecksilber- bzw. Xenonlampe erzeugt einen stark gebündelten Lichtstrahl mit einer möglichst geringen Streuung. Dieser Strahl wird durch eine optisch durchlässige Kapillare geführt, in der die zu untersuchenden Zellen einzeln vorbeiströmen. Die exakte Ausrichtung der Blutkörperchen wird durch eine schnell strömende Pufferlösung erreicht, die von einer Düse die Zellen einzeln abreißt und weitertransportiert. Ein Detektor misst das Streulicht hinter der untersuchten Zelle auf der Achse des einfallenden Lichtstrahles (Vorwärtsstreulicht = FS = Forward Scatter). Ein zweiter Detektor erkennt die Lichtstreuung im Winkel von 90o (Seitwärtsstreulicht = SS = Site Scatter).


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Abbildung 7: Schematischer Aufbau einer durchflusszytometrischen Apparatur mit drei Fluoreszenzdetektoren

Die Stärke der Lichtstreuung des Forward Scatters ist ein Hinweis auf die Größe der untersuchten Zelle. Die Lichtstreuung des Site Scatters sagt etwas über die Granularität der Zelle aus. Bereits mit diesen beiden Daten kann man die korpuskulären Anteile des Blutes in die Klasse der Erythrozyten, der Lymphozyten, der Monozyten und der Granulozyten einteilen (Abb. 8).


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Abbildung 8: Schematische Darstellung der durchflusszytometrischen Ergebnisses einer unfixierten frischen Blutprobe ohne Lysierung der Erythrozyten

Durch die hohe Messgeschwindigkeit von einigen tausend Zellen pro Sekunde kann man in vertretbarer Zeit statistisch sichere Daten gewinnen. Die Durchflusszytometrie eignet sich damit hervorragend als Routinemethode zur Bestimmung der Blutzellverhältnisse.

Zur Subdifferenzierung von Blutzellen nutzt man die unterschiedlichen Antigenstrukturen auf den Zelloberflächen. Humane Leukozyten weisen eine Vielzahl von Antigenstrukturen auf, die sich im Laufe der Zellentwicklung verändern und so eine genaue Aussage über die Art, den Reifungsgrad und den Aktivierungszustand der Zelle gestatten.


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Zur exakten Differenzierung bedient man sich monoklonaler Antikörper, die mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelt wurden. Zellen, die über eine entsprechende Antigenstruktur verfügen, werden mit dem Antikörper einen Komplex eingehen. Die so mit den entsprechenden Fluorochromen markierten Zellen geben jetzt im Durchflusszytometer neben dem Wert für das Vorwärtsstreulicht und dem Wert für das Seitwärtsstreulicht noch ein Signal für erfolgte Fluoreszenzfärbung (Abb. 9). Dazu ist jedoch ein Durchflusszytometer notwendig, welches mit einem Farbfiltersystem ausgestattet ist, um die durch den Lichtstrahl induzierten Fluoreszenzen erkennen zu können. Moderne Geräte weisen mehrere Detektoren für Fluoreszenzen bei unterschiedlichen Wellenlängen auf (Abb. 7). Damit ist es möglich, mehrere Antigenstrukturen auf einer Zelle parallel zu erkennen und so eine weitere Differenzierung der korpuskulären Blutbestandteile zu erreichen.

Abbildung 9: Beispiel einer Analyse von CD-34 markiertem Blut. Es wurde das Seitwärtsstreulicht (SSC-H) gegen die Signale der CD-34 markierten Zellen aufgetragen (Pfeil). Der Bereich der monozytären Zellen ist ebenfalls erkennbar (Dreiecke).

Gebräuchliche Fluoreszenzfarbstoffe sind u.a. Fluorescein (FITC) und R-Phycoerythrin (PE) [Thews, 1993].

Das für die Stammzelldiagnostik wichtigste Oberflächenprotein ist der „Cluster of


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Differentiation Nr. 34“. CD-34 ist ein 115 kD schweres Glykoprotein, welches sich nur auf Blutstammzellen, hämatopoetischen Vorläuferzellen - den sogenannten Progenitoren - sowie auf Endothel- und Epithelzellen nachweisen lässt. Im Knochenmark des Menschen weisen ca. 1,5 % der Zellen diese Oberflächenstruktur auf [Civin, 1990]. Mit voranschreitender Entwicklung und Differenzierung der Zelle nimmt die Dichte dieses Oberflächenproteins ab, bis es bei reifen Zellen nicht mehr nachweisbar ist. Die Funktion des Antigens ist bisher un-bekannt geblieben. Der genetische Code für seine Expression konnte auf dem Chromosom 1 nachgewiesen werden [Erber, 1990].

Eine weitere Oberflächenstruktur, welche Bedeutung in der Blutstammzelldiagnostik erlangt hat, ist das Oberflächenprotein CD-45. Es hat ein Molekulargewicht von 180 kD und kommt auf den meisten Leukozyten vor.

Die Durchflusszytometrie erlaubt damit eine schnelle Aussage über den prozentualen Anteil einer zu betrachtenden Zellpopulation im untersuchten Blut. Eine qualitative Aussage über das Proliferationsverhalten der Zellen ist von dieser Untersuchungsmethode jedoch gegenwärtig nicht zu erwarten.

2.9 Purging

Die Antigenstruktur der Blutstammzellen kann nicht nur zu diagnostischen Zwecken benutzt werden. Ein Meilenstein in der Entwicklung der Stammzelltransplantation ist die immunologische Konzentrierung der CD-34-positiven Zellen im Transplantat. Diese, auch im deutschen Sprachraum meist als „Purging“ bezeichnete Reinigung des Blutes, erfolgt heute mit magnetischen [Burgess, 1994] [Miltenyi, 1994] oder immunoadhäsiven [Shpall, 1994] Verfahren.

Die Kopplung von CD-34-Antikörpern mit Eisenpartikeln, sogenannten „beads“, gestattet es, hochreine Stammzellkonzentrate zu gewinnen, in denen kaum noch Lymphozyten, ausdifferenzierte Granulozyten, Erythrozyten oder Thrombozyten zu finden sind. Neben den verschiedenen Entwicklungsstufen des Blutes kann durch die immunologische Anreicherung und Reinigung des gewonnenen Blutes auch der Anteil der durch die Apherese in das Transplantat gelangten Krebszellen verringert


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werden [Rowley, 1992].

Zu Beginn der Reinigung werden eisengekoppelte Antikörper mit den Zellen inkubiert. Nach Bindung des Antikörpers an die Antigenstruktur auf der Oberfläche der Blutstammzelle wird das Blut in ein starkes Magnetfeld gebracht. Es folgt ein Spülvorgang, bei dem die nicht markierten Zellen ausgewaschen werden. Die Eisenpartikel halten die Blutstammzellen im Magnetfeld zurück. Der nächste Schritt besteht in einer Entfernung der Zellen aus dem Magnetfeld und einem Waschvorgang. In dem anschließendem Prozess können die eisengekoppelte Antikörper von der Zelle abgespalten werden und es resultiert ein hochreines Konzentrat an CD-34-positiven Zellen.

Ein analoges Vorgehen liegt bei einer immunoadhäsiven Methode vor, bei der biotinylierte CD-34-Antikörper mit Avidin gekoppelt werden. Die markierten Blutstammzellen können dann in einer Säule von den unmarkierten Zellen durch vorsichtiges Auswaschen getrennt werden. Bei dieser Trennung nutzt man die Bindungsfähigkeit des Avidins mit dem Säulenmaterial aus. Da die Avidin-Säulenbindung stabiler ist als die Stammzell-Antikörperbindung kann man in einem letzten Schritt durch Schwenken und Rühren die Zellen auswaschen. Die Avidin-gekoppelten Antikörper bleiben in der Säule zurück.

Die verschiedenen verfügbaren magnetischen Verfahren unterscheiden sich in Bezug auf die Reinheit und die Wiederfindungsrate nicht [Paulus, 1997]. So konnte gezeigt werden, dass nach dem Purging durchschnittlich 96,6 % CD-34-positive Zellen im Blut enthalten waren. Die hohen Reinheitsgrade von über 96 % konnten in einer zwei Jahre zuvor veröffentlichten Arbeit nicht gefunden werden [Wynter, 1995]. Dabei wurden fünf verschiedene Techniken miteinander verglichen, wobei die höchsten Anreicherungen mit 72-73 % gemessen werden konnten.

Ein Ergebnis ist unabhängig vom divergierenden Reinheitsgrad in beiden Arbeiten feststellbar: Jedes Purgen von Zellen bedeutet einen deutlichen Verlust von Blutstammzellen, da die Markierung der Zellen nicht vollständig erfolgt, das Auswaschen nicht so schonend ist wie gewünscht und jeder Waschschritt mit einem Verlust von Zellen einhergeht. Dieser Aspekt und die hohen Kosten des Antikörpers sind als Ursache zu sehen, dass die immunologische Reinigung in der


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Blutstammzelltransplantation noch nicht zum Standard erhoben wurde.

Die Qualität des gepurgten Transplantates ist im Vergleich zum normalen, nicht immunologisch angereicherten Transplantat höher einzustufen, da keine für die Neubildung des Blutes ungeeigneten Zellen transfundiert werden. Die Menge des infundierten DMSO kann durch die geringeren Volumina der gereinigten Präparate reduziert werden, der Platzbedarf während der Lagerung ist deutlich geringer. Durch die geringere Gesamtzellzahl ist mit einer geringeren Menge an Zellfragmenten aus zerstörten Zellen zu rechnen. Die histaminbedingten Nebenwirkungen der Transfusion dürften somit milder ausfallen. Klinisch gibt es keine Unterschiede bei der Verwendung von gepurgten und ungepurgten Stammzelltransplantaten. Die Krankenhausverweildauer der Patienten und die Zahl der benötigten Erythrozyten- und Thrombozytentransfusionen unterscheiden sich in einer Studie mit 15 Patienten nicht signifikant [Höcker, 1995]. Es konnte die bessere Verträglichkeit des gepurgten Blutes gezeigt werden, wobei keine behandlungspflichtigen Nebenwirkungen auftraten.


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Mon Apr 28 16:16:11 2003