Leuthold, Jan: Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion

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Kapitel 3. Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methode

3.1.1 Patienten

Insgesamt konnte Blut von 29 Patienten für die elektronenmikroskopische Auswertung aufgearbeitet werden (Tab. 2). Von zwei Patienten gelang es, vor und nach dem Purgen Blut zu erhalten. Damit bestand die Möglichkeit, je zwei Probenpaare vor und nach dem Einfrieren zu untersuchen (Tab. 2). Alle Patienten sind mit einer Hochdosischemotherapie und anschließender autologer peripherer Stammzelltransplantation behandelt worden oder sollten behandelt werden. Die Patienten litten an unterschiedlichen malignen Tumorerkrankungen, die eine Hochdosischemotherapiebehandlung gerechtfertigt erscheinen ließen (Tab. 3). Bei den Patienten handelte es sich um 19 Frauen und 10 Männer mit einem Durchschnittsalter von 50,1 Jahren. Die jüngste Patientin war zum Zeitpunkt der Separation 21 Jahre, der älteste Patient 69 Jahre alt.


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Tabelle 2: Patientendaten und Art der gewonnenen Blutproben

Patient

Alter zum
Zeitpunkt
der Separation

Geschlecht
m/w

frisch

Friermedium I
(10%
DMSO)

Friermedium II
(5 % DMSO
6 % HAES
4 % HA)

gepurgt
frisch und
Friermedium I

HM

55

m

x

x

x

 

HH

52

m

x

x

x

 

KH

60

w

x

x

x

 

LA

44

w

x

x

x

 

LK

43

m

x

x

x

 

SF

40

m

x

x

x

 

SH

69

m

x

x

x

 

BW

60

w

x

x

 

 

BC

56

w

x

x

 

 

BR

48

w

x

x

 

 

EG

64

m

x

x

 

 

FA

64

w

x

x

 

 

FW

48

m

x

x

 

 

GB

49

w

x

x

 

 

GM

55

w

x

x

 

 

HV

57

w

x

x

 

 

HM

50

w

x

x

 

 

JS

57

w

x

x

 

 

KM

21

w

x

x

 

 

NH

62

m

x

x

 

 

PD

44

w

x

x

 

 

PK

56

w

x

x

 

 

RB

57

w

x

x

 

x x

SA

29

w

x

x

 

 

SS

22

w

x

x

 

 

TD

52

m

x

x

 

 

VE

52

w

x

x

 

 

VN

40

m

x

x

 

x x

 

 

 

 

 

 

 


55

Tabelle 3: Diagnosen der Patienten, deren periphere Blutstammzellpräparate elektronenmikroskopisch untersucht wurden

Hämatologische Erkrankungen

 

 

 

 

Non-Hodgkin-Lymphome

 

 

6 x Plasmozytom (multiples Myelom)

 

 

4 x Follikelzentrumslymphom

 

 

2 x Mantelzellymphom

 

 

1 x Leichtketten-Plasmozytom

 

 

1 x Lymphoplasmozytoides Lymphom

 

 

2 x Chronische lymphatische Leukämie vom B-Zell-Typ

 

 

3 x diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom

 

 

 

 

Akute Leukämien

 

 

1 x Akute lymphatische Leukämie, T-Zell-Typ

 

 

2 x Akute myeloische Leukämie

 

 

 

 

Morbus Hodgkin

 

 

3 x Morbus Hodgkin

 

 

 

Solide Tumoren

 

 

3 x Mammakarzinom

 

 

1 x Ovarialkarzinom


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3.1.2 Chemikalien und Reagenzien

Aqua dest.: Krankenhausapotheke, Humaine Klinikum Bad Saarow

Bleicitratlösung nach Reynolds:

1,33 g Pb(NO3)2 p.a.
1,76 g Na3C6H5O7 x 2 H2O
30 sek kräftig schütteln + 8 ml 1 n NaOH
ad 50 ml Aqua bidest, pH 9,5-9,8 (mit Natriumcitrat einstellen)

Cacodylsäure- Natriumsalz 3 x H20: Serva Heidelberg, Deutschland

0,4 M Cacodylatpuffer: 24,4 g Cacodylsäure- Natriumsalz auf 250 ml Aqua dest.

0,1 M Cacodylatpuffer pH 7,4:

25 ml 0,4 M Cacodylatpuffer + 10 ml 0,1 M HCl, Aqua ad 100 ml, pH mit HCl
( sauerer) oder 0,4 M Puffer ( basischer ) auf pH 7,4 einstellen

DMSO: Synopharm GmbH, Qualität nach Ph. Eur. 2000 und USP 24

Epon ®-Harzgemische:

Stammlösung A:
62 ml Epon ® 812 (C3H4O2)
131 ml DDSA ( 2-Dodecenylbernsteinsäureanhydrid ) (C16H26O3)

Stammlösung B:
100 ml Epon ® 812 (C3H4O2)
95,5 ml MNA (Methylendomethylentetrahydrophthalsäureanhydrid) (C10H10O3)

Beschleuniger:
DMP 30 ( 2,4,6 Tris(dimethylaminomethyl)phenol ) ( C15H27N3O )

Fertige Mischung:

A : B = 1 : 1 + 2 % DMP 30, tiefgefroren haltbar

Alle Bestandteile des Harzes stammen von Serva Heidelberg, Deutschland

Gelatine: Merck, Darmstadt, Deutschland

Gelatine-Saccharose-Mischung:

1,00 g Saccharose; 0,30 g Gelatine; ad 10,0 g Aqua dest.,

unter vorsichtigem Erwärmen lösen, abkühlen

Glutaraldehyd 70%: Serva Heidelberg, Deutschland

Glutaraldehyd 2% in Cacodylatpuffer 0,1 M (pH 7,4):
25%ige Stammlösung: 10 ml 70%iges Glutaraldehyd tropfenweise mit 18 ml Aqua dest. versetzen, davon 8 ml mit 0,1 M Cacodylatpuffer pH 7,4 auf 100 ml auffüllen, berechnete Osmolarität: ca. 300 mmol/l


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HA 20%: Grifols, Deutschland, 50 ml, Ch.B.: IAAB0CI001

HAES 200/0,5: Fresenius, Deutschland

HCl für Puffer: Krankenhausapotheke, Humaine Klinikum Bad Saarow /Fürstenwalde

Kryo II Lösung:

5 % DMSO
6 % HAES
4 % Humanalbumin in PBS-Puffer

MethoCult GF H4434 Kulturmedium: StemCell Technologies Inc., Kanada
1%iges Methylcellulose in Iscove´s MDM
30%iges fetales Rinderserum
1%iges Rinderserumalbumin
10-4 M 2- Mercaptoethanol
2 mM L- Glutamin
50 ng/ml rh Stammzellfaktor
10 ng/ml rh GM-CSF
10 ng/ml rh IL-3
3 Einheiten/ml rh Erythropoietin

Osmiumtertaoxid: Serva Heidelberg, Deutschland

Osmiumlösung 2%: 1 g Osmiumtetraoxid auf 50 ml Aqua bidest

Osmiumlösung 1%: 1 VT 2%ige Osmiumlösung, 1 VT 0,2 M Cacodylatpuffer, pH 7,4

PBS-Puffer: Biochrom KG Berlin, Deutschland

NaCl

8000 mg

KCl

200 mg

Na2HPO4

1150 mg

Aqua dest.

ad 1000 ml,

Saccharose: Riedel de Haën, Deutschland

Alle weiteren Substanzen wurden in pharmazeutischer Qualität von Caesar Lorenz (Hilden), Bombastus (Freital) sowie von Serva Feinbiochemika (Heidelberg) in analytischer Qualität bezogen.


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3.1.3 Separation der peripheren Blutstammzellen

Alle untersuchten Patienten wurden mit der Gabe von Filgrastim (Neupogen®, Amgen, Deutschland) auf die Separation der peripheren Blutstammzellen vorbereitet. Je nach Art der Tumorerkrankung kam es bei einigen Patienten zu einer gekoppelten Vorbehandlung mit zytostatischen Substanzen und Filgrastim.

Nach dem erwarteten Anstieg der Hämatopoese wurde das Blut mit Hilfe eines Zellseparators (Spectra®, Cobe, USA) einer Apherese unterworfen. Das Aphereseprodukt zeichnete sich durch eine hohe Zahl an mononukleären Zellen aus, die Zahlenwerte der Separationen sind in Tabelle 4 ersichtlich.

Tabelle 4: Auszug aus den routinemäßig ermittelten Werten aller untersuchter
Proben (n=29)

 

x mittel

x max - x min

Separation nach Beginn der Mobilisation (d)

13,7

5-40

Anzahl der notwendigen Apheresen

2,3

1-4

Prozessiertes Blutvolumen aller Apheresen je Patient (l)

13,40

7,48-22,10

Dauer der einzelnen Apherese (min)

142

70-190

Produktvolumen (ml)

138

63-277

Anteil der MNC nach Separation an allen weißen Zellen

87,9%

38,0%-99,0%

MNC nach Separation (1 x 106 /ml)

166,8

45,6-343,2

CD-34 Zellen nach Separation (1 x 106 /ml)

2,85

0,18-20,2

Anteil der CD-34 Zellen an den MNC nach Separation

1,90%

0,11%-12,08%

Da es sich um einen rein physikalischen Separationsprozess handelt, wurden die Zellen nur aufgrund von Zentrifugationskräften, Zellgrößen, Zellbeschaffenheiten und Dichtedifferenzen getrennt. Neben verschiedenen Reifungs- und Funktionsstufen der Granulopoese werden viele Lymphozyten, Monozyten, wenige Erythrozyten und


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Thrombozyten gesammelt. Um eine Aussage über den Gehalt an Blutstammzellen und damit über die Qualität des gewonnenen Transplantates zu erhalten, wurde die Durchflusszytometrie (Cytoron Absolute®, Ortho-Diagnostics, USA) eingesetzt
(Tab. 4).

Die in dieser Arbeit verwendeten gepurgten Präparate wurden nach den Angaben der Firma CellPro, München, Deutschland mit dem Gerät Ceprate® SC immunologisch gereinigt und angereichert.

Von den Apheresepräparaten wurden für die Qualitätskontrollen routinemäßig Proben von 1-2 ml Volumen entnommen. Mit diesen Aliquoten konnten die Zellzahlen und die Anzahl der einzelnen Zellarten im gesammelten Blut bestimmt werden. Die nach den Testungen verbliebenen Reste von ca. 0,5 ml konnte für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen weiterverwendet werden.

3.1.4 Einfrieren

Vor dem Einfrieren wurde die Zellzahl des Apheresepräparates auf 2 x 108 WBC/ml eingestellt. Präparate mit einer hohen Zellzahl wurden durch Verdünnen mit autologem Plasma auf die erforderliche Zellzahl eingestellt. Niedrigere Zellzahlen wurden durch Zentrifugation und Abpressen des Plasmas korrigiert (Beutel-Kühlzentrifuge K 80, Medizin-Labor-Gerätewerk Ilmenau, Deutschland).

Danach erfolgte über einen Zeitraum von 1 min die vorsichtige Zugabe von einem Teil 33,3 %iges DMSO (Krankenhausapotheke Humaine Klinikum Bad Saarow, Deutschland) zu zwei Teilen des Blutpräparates, um so eine Endkonzentration von 10 % zu erreichen. Nach diesem Schritt konnten die Zellsuspensionen in Etylenvinylacetatbeuteln (Cryocyte®, Baxter, Deutschland) mit einem Volumen von 100 ml und in 3-4 Kontrollröhrchen (Cryo Tubes® Vials, Nunc, Dänemark) mit einem Volumen von 1 ml gleichzeitig eingefroren werden. Das Einfrieren aller in dieser Arbeit untersuchten Blutproben erfolgte bis zum Erreichen von


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-40 oC unter kontrollierten Bedingungen (Nicool plus®, Air Liquid, Frankreich) mit einer Kühlrate von 1 K/min. Dem bei ca. -4 oC auftretenden Kristallisationspunkt und der damit freiwerdenden Kristallisationswärme wurde mit erhöhter Stickstoffzufuhr in die Frierkammer und damit erhöhter Kühlleistung entgegengewirkt. Ab -40 oC wurden die Beutel mit 10 K/min bis -150 oC gekühlt. Die weitere Lagerung erfolgte in einem Temperaturbereich von -150 bis -196 oC in flüssigem Stickstoff.

Von acht Proben konnte neben der mit 10%igem DMSO eingefrorenen Probe jeweils eine weitere Probe gewonnen werden, die mit einem anderen Kryoprotektivum eingefroren wurde.

Nach dem Studium der verfügbaren Literatur (Tab. 1) fiel die Wahl auf eine Mischung von 5 % DMSO, 6 % HAES 200/0,5 und 4 % Humanalbumin, welche im weiteren Text als Kryo II- Lösung bezeichnet wurde. Der Prozess des Einfrierens unterschied sich mit Ausnahme des Friermediums in keiner Hinsicht von dem oben beschriebenen Ablauf.

Für die ultrastrukturellen Untersuchungen wurden die mit dem Transplantat eingefrorenen, gesondert in Kontrollröhrchen gelagerten Blutproben verwendet. Die Lagerungszeiträume der ausgewerteten Proben betrugen durchschnittlich 4,7 Wochen (minimal 3 Wochen, maximal 7 Wochen).

3.1.5 Auftauen und Qualitätskontrolle

Alle peripheren Stammzelltransplantate wurden routinemäßig einer Durchflusszytometrie, der Trypanblau- Ausschlussmethode und einem Kultivierungsversuch unterzogen.


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Um die Untersuchungen durchführen zu können, wurde im Vorfeld eines der zu jedem Transplantat gehörenden eingefrorenen Kontrollröhrchen innerhalb einer Minute im 37 oC warmem Wasserbad getaut.

Für die Durchflusszytometrie erfolgte die Inkubation des Blutes mit fluoreszenzkonjugierten CD-34 und CD-45 Antikörpern für 15 min bei Raumtemperatur und Lichtausschluss. Nach einer Erythrozytenlyse (Auto-Lyse®, Ortho-Diagnostics, USA) konnte die Stammzellzahl gemessen werden (Cytoron Absolute®, Ortho-Diagnostics, USA).

Zur Bestimmung der Vitalität wurden 10 µl der Zellsuspension mit 190 µl Trypanblau-Lösung (Merck, Deutschland) versetzt. Die Auszählung der vitalen, hell erscheinenden Zellen erfolgte lichtmikroskopisch mit Hilfe einer Neubauer-Kammer.

Als dritter Test wurden die Proliferationsraten der Zellen nach Anzüchtung auf Methylcelluloseagar bestimmt. Die getaute Zellsuspension wurde mit Puffer (RPMI 1640 Medium®, Sigma Bio Sciences, Deutschland) versetzt und für 10 min bei 1000 U/min zentrifugiert (Kühlzentrifuge Rotina 48, Hettich, Deutschland). Nach Dekantierung konnte Ficoll (Ficoll Separating Solution®, Sigma Bio Sciences, Deutschland) unterschichtet werden. Die anschließende Zentrifugation erfolgte für 15 min bei 2500 U/min. Der Ring der mononukleären Zellen (MNC) wurde abpipettiert, zweimal mit Puffer versetzt und für 10 min bei 1000 U/min zentrifugiert. Nach der mikroskopischen Bestimmung der MNC-Zahl mit Hilfe einer Neubauer-Kammer wurde die Zellzahl auf 1 x 105 Zellen eingestellt. Zu diesem Blut wurden in folgenden Schritten hämatopoetische Wachstumsfaktoren (MethoCult GF H4434 Kulturmedium®, StemCell Technologies Inc., Kanada), antibiotische und antimykotische Substanzen (Antibiotic/Antimykotic Cell Solution®, Sigma Bio Sciences, Deutschland) gegeben. Die so entstandene Mischung wurde auf die Methylcelluloseplatte aufgebracht und im Anschluss 14 Tage lang bei 37 oC, einer 5%igen CO2-Atmosphäre und 90 % rel. Luftfeuchte angezüchtet. Alle Arbeitsschritte erfolgten unter streng aseptischen Bedingungen.

Die mikroskopische Auswertung der entstandenen roten, weißen und gemischten Kolonien erfolgte nach dieser zweiwöchigen Frist unter Auflichtbedingungen bei 200facher Vergrößerung (TMS, Nicon, Japan).


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3.1.6 Elektronenmikroskopische Präparation

Die Aufarbeitung der Blutproben für die elektronenmikroskopische Auswertung erfolgte in mehreren Schritten. Die Abbildung 10 zeigt eine schematische Übersicht der einzelnen Arbeitsschritte.

Abbildung 10: Schematischer Ablauf der elektronenmikroskopischen Proben-Präparation


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Auftauen der gefrorenen Proben

Nach Beendigung der routinemäßig durchgeführten Labordiagnostik wurde ein zu diesem Zeitpunkt nicht mehr benötigtes Kontrollröhrchen innerhalb einer Minute im 37 oC warmem Wasserbad getaut. Um die Dauer der Transplantation und den Einfluss der Friermedien zu simulieren, schloss sich eine Pause von 9 min und einer Lagerung der Proben bei Raumtemperatur an. Im Anschluss wurden die Friermedien durch Zugabe von PBS-Puffer (Biochrom KG Berlin, Deutschland) nach genau 10 min verdünnt. Die Zellen wurden für 10 min bei 1000 U/min zentrifugiert (Kühlzentrifuge Rotina 48, Hettich, Deutschland) und standen dann der weiteren elektronenmikroskopischen Präparation zur Verfügung.

Fixierung

Die erste Fixierung der frischen Proben erfolgte wenige Stunden nach der Separation des Blutes. Die eingefrorenen und wieder aufgetauten Vergleichsproben wurden nach dem oben genannten Auswaschen des Mediums nach 20 min fixiert. In allen Fällen diente 2%iger Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) als Fixativ. Je Milliliter Blut wurden 10 Milliliter Glutaraldehydlösung zugegeben. Die anschließende Lagerung von 4-24 h erfolgte bei 2-8 oC im Kühlschrank.

Gelatineeinbettung

Zum Auswaschen des Glutaraldehydes wurden die Zellen zweimal mit 5-10 ml 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) versetzt und für 10 min bei 1500 U/min zentrifugiert (Janetzki T32c, Engelsdorf, DDR). Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 2-5 Tropfen einer frisch hergestellten und wieder auf Raumtemperatur abgekühlten Gelatine-Saccharose-Mischung. Die anschließende Lagerung von 4-24 h erfolgte bei 2-8 oC.

Nachfixierung

Die im Kühlschrank verfestigten Blutproben wurden vorsichtig in Stücke mit einer Kantenlänge von ca. 4 mm zerschnitten und mit 5 ml 2%igem Glutaraldehyd in 0,1


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M Cacodylatpuffer (pH 7,4) versetzt. Es schloss sich eine Lagerung von 4-24 h bei 2-8 oC an. Die durch Glutaraldehyd gehärteten Blut-Gelatine-Proben wurden dann in Stücke von einer Kantenlänge von ca. 1,5 mm zerschnitten. Die Nachfixierung der Proben erfolgte für 15 min in 2%iger Osmiumtetraoxidlösung bei Raumtemperatur.

Entwässerung und Blockkontrastierung

In der folgenden Ethanol-Aceton Entwässerungsreihe konnte den Proben schrittweise das Wasser entzogen werden. Die Konzentrationen und die Zeiten der einzelnen Schritte sind der Abbildung 10 zu entnehmen. Dem 70%igem Ethanol wurden 0,5 % Uranlyacetat zugesetzt. Diese Zwischenstufe diente neben der Entwässerung auch einer Kontrastierung der Proben. Am Ende der Entwässerungsreihe erfolgte ein Wechsel des Mediums hin zu Aceton. In einer Aceton : Epon®-Harzmischung (1 : 1) lagerten die Proben für 3-24 h bei Raumtemperatur.

Einbettung

Die Proben wurden für 10 min bei Raumtemperatur in frisches Harz eingelegt. Es erfolgte im Anschluss eine Kunststoffeinbettung in eine Epon®-Harzmischung. Als Gefäße dienten bei 60 oC gelagerte Gelatinekapselhälften. Die Polymerisation fand bei konstant 60 oC statt, die Proben wurden für 48 h bei dieser Temperatur gelagert.

Anfertigen der Schnitte

Als letzte Schritte der elektronenmikroskopischen Präparation erfolgten das Trimmen der Harzblöcke (Fräse TM 60 der Firma G. Reichert, Österreich), das Herstellen ultradünner Schnitte auf dem Ultramikrotom (OM o3, G. Reichert, Österreich) und das Kontrastieren der Schnitte. Dazu wurden die Proben für 4 min mit einer 2%igen Uranylacetatlösung versetzt. Nach mehrmaligem Waschen der Schnitte mit Aqua dest. erfolgte die Zugabe einer 2,5%igen Bleiacetatlösung. Nach 2 min konnten die Schnitte erneut gewaschen werden und standen nach einer letzten Trocknungsphase der elektronenmikroskopischen Auswertung zur Verfügung.


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3.1.7 Elektronenmikroskopische Untersuchung

Alle untersuchten Proben wurden mit Hilfe eines Transmissionselektronenmikroskopes (Opton EM 109, Carl Zeiss Oberkochen, Deutschland) ausgewertet. Von jeder frischen und jeder gefrorenen und wieder aufgetauten Probe wurden mindestens 20 Zellen fotografiert. Hierbei wurde eine 3000 bis 7000-fache Vergrößerung gewählt, die später die gesamte Zelle erkennen ließ. Von den Fotonegativen wurden Positive mit einer Nachvergrößerung von
1 : 2,5 angefertigt (Abb. 11).

Abbildung 11: Schematische Darstellung der Vergrößerungsschritte


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3.1.8 Halbautomatische Bildanalyse

Die Auswertung der angefertigten Fotopositive erfolgte mit Hilfe des halbautomatischen Bildanalysesystems IBAS 2000 (Kontron, München, Deutschland). Dazu wurden die Zellen und die Kerne mit Hilfe eines Sensorstiftes auf einem Digitalisierungstablett umfahren. Das angeschlossene Bildanalysesystem ermittelte die Strecke und die Form des umfahrenen Objektes und berechnete entsprechend den Umfang des Kernes und der Zelle, den Flächeninhalt, die maximale x- und die maximale y-Ausdehnung und den maximalen Durchmesser.

Um die erhaltenen Messwerte mit der Nachvergrößerung und dem Fehler des Zeichenbrettes zu korrigieren, wurde als weiterer Parameter die Strecke von zwei auf jedem Foto vorhandenen, exakt definierten Markierungen abgenommen und in die Berechnungen einbezogen. Eine Kalibrierung des Digitalisierungstablettes erfolgte durch die Vermessung einer definierten Strecke. Die vom Computer ermittelten Strecken in Pixel konnten damit in Mikrometer zurückgerechnet werden.

Nach Berücksichtigung der elektronenmikroskopischen Vergrößerung und der fotografischen Nachvergrößerung konnten somit die realen Strecken- und Flächenangaben berechnet werden.


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3.2 Ergebnisse

3.2.1 Voruntersuchungen an gepurgten Zellen

Die in der Literatur (Abschn. 2.2.) beschriebenen morphologischen Merkmale von Blutstammzellen wurden vor Beginn der eigentlichen Untersuchung an gepurgtem Material überprüft. Dazu standen zwei frische und dazugehörige gefrorene Proben (Tab. 2) sowie drei gefrorene gepurgte Patientenproben ohne frisches Vergleichsmaterial zur Verfügung. Diese Proben zeichnen sich durch einen hohen Anteil an CD-34-positiven Zellen aus (Abb. 12), der in den vorliegenden Proben zwischen 95% und 99% lag.

Abbildung 12: Beispielhafte Abbildungen der Durchflusszytometrie einer Probe vor und nach dem Purgen. Vor der Reinigung sind neben den CD-34 positiven Zellen (Pfeil) noch viele monozytäre Zellen erkennbar (Dreiecke). Nach dem Purgen sind neben vielen CD-34 positiven Zellen (Pfeil) nur wenige Monozyten und Granulozyten nachweisbar (Dreiecke).


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Alle Proben wurden nach dem in Abschnitt 3.1.6. angegebenen Verfahren für die Elektronenmikroskopie präpariert und bei 3000-25000fachen Vergrößerungen ausgewertet.

Es zeigte sich, dass die in der Literatur beschriebenen elektronenmikroskopischen Merkmale der Stammzellen nicht vollständig in den gepurgten Proben wiedergefunden werden konnten.

Die erwartete Zellgröße von 7-10 µm konnte bestätigt werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass die CD-34-positive Zelle nicht zwangsläufig über eine runde Kernform und ein organellenarmes Zytoplasma verfügt. Häufig können im elektronenmikroskopischen Bild Zellkerne gesehen werden, die eine mehr oder weniger starke Buchtung aufwiesen (Abb. 13, 14).

Abbildung 13: Frische, gepurgte Zelle mit Ansammlung von zahlreichen Mitochondrien (M) in der ausgeprägten Kernbucht. Der Kern (K) dominiert die Zelle, es sind Kernporen (KP) und vereinzelt Vesikel (V) erkennbar. (FN 21)


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Abbildung 14: Frische, gepurgte Zelle mit typischen Größenverhältnissen, Organellenanzahl und Chromatinkondensation. Der dominante Zellkern (K) enthält nur eine geringe Menge randständig kondensiertes Chromatin (Ch). Die Cristae der Mitochondrien (M) sind deutlich erkennbar. (FN 22)

Das Chromatin ist in den CD-34-positiven Zellen nur schwach kondensiert. Es liegt als oftmals unterbrochener Ring eng an der Kernmembran an (Abb. 13, 14). Kernporen sind stets erkennbar. Die Anzahl der Kernporen scheint sich jedoch nicht von denen anderer kernhaltiger Blutzellen zu unterscheiden. Die Kernfläche nimmt einen großen Teil der Zellfläche ein, wobei jedoch erhebliche Schwankungen der Verhältnisse zueinander erkennbar sind. Nukleoli treten unregelmäßig auf, die Anzahl der erkennbaren Kernkörperchen schwankt zwischen 0-3. Im unmittelbaren oder weiteren Bereich der Kernbuchtung sind neben den erwarteten Mitochondrien auch Vesikel und wenig glattes sowie raues endoplasmatisches Retikulum anzutreffen.


70

Ribosomen kommen in allen Zellen sehr zahlreich vor. Sie sind einzeln oder in Form kleinerer Gruppen, den sogenannten Polysomen, nachweisbar.

Ausgeprägte Golgiapparate waren in den gepurgten Proben erwartungsgemäß nur in Ausnahmefällen zu finden. Die an dieser Organelle einhergehende erhöhte Zahl von Vesikeln ist als Zeichen einer voranschreitenden Differenzierung zu betrachten. Vesikel konnten in den meisten Zellen nachgewiesen werden. Es fiel jedoch auf, dass sich keine granulierten Vesikel im Zytoplasma befinden. Stets handelte es sich um kreisrunde, homogen gefüllte, membranbegrenzte Zellbestandteile, die dem ersten Stadium, den sogenannten primären Granula entsprechen [Erlandson, 1994]. Die Zellen erscheinen rund bis leicht deformiert, an der Zytoplasmamembran konnten nur in Ausnahmefällen Zytoplasmaausläufer festgestellt werden.

Mit den soeben beschriebenen elektronenmikroskopischen Merkmalen, die an gepurgten Proben genauer studiert werden konnten, gelang es in weiteren Untersuchungen an ungepurgten Blutproben Retikulozyten, Erythrozyten, Monozyten, Thrombozyten, neutrophile, basophile, eosinophile Granulozyten und Lymphozyten sicher zu erkennen. Megakaryoblasten, Promegakaryozyten und Megakaryozyten konnten in den peripheren Blutproben nicht nachgewiesen werden. Ihre Entstehung im Knochenmark und dortige weitere Differenzierung begründet diese Tatsache. Eine sichere Abgrenzung der Blutstammzellen von Proerythroblasten, Normoblasten, Monoblasten, Lymphoblasten und speziell Myeloblasten war nicht in jedem Fall aufgrund der morphologischen Kriterien möglich.


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3.2.2 Definition der Zielzellen

Für die umfassende Rekonstitution des blutbildenden Systems sind nur die Blutstammzellen von Interesse. Nur diese Zellart besitzt die uneingeschränkte Fähigkeit zur Reproduktion bei gleichzeitigem Vermögen, zu unterschiedlichen Zelllinien auszudifferenzieren. In dem gewonnenen peripheren Blutstammzelltransplantat liegt diese Zellart nur zu einem geringen Prozentsatz vor. Den größten Anteil des Transplantates machen verschiedene Reifungsstufen von Granulozyten und Lymphozyten aus. Zahlreiche Thrombozyten, Monozyten und Erythrozyten vervollständigen das Bild. Die Ursache für diese Zellverteilung ist in der rein physikalischen Sammlungsweise des Blutes zu sehen. Zelldurchmesser, Oberflächenstruktur und die Dichte der Zellen sind die Hauptkriterien, nach denen sich die Zellen während der kontinuierlichen Zentrifugation anordnen. Eine Entnahme der Schicht der mononukleären Zellen führt damit unweigerlich zu einer Mischung oben genannter Zellen.

Entsprechend den Literaturangaben (vgl. 2.2.) und den Ergebnissen der eigenen Voruntersuchungen an gepurgten Präparaten (vgl. 3.2.1.) wurden als „Zielzellen“ lediglich Zellen definiert, die folgende ultrastrukturelle Merkmale aufweisen:


72

Außerdem wurde von der Annahme ausgegangen, dass Blutstammzellen und Blasten einen ähnlichen ultrastrukturellen Aufbau besitzen und demzufolge ähnliche Schädigungsmuster nach Kryoprotektion, Einfrieren und Tauen aufweisen müssen. Die Zielzellen sollten somit als Blutstammzellen/hämatopoetische Vorläuferzellen bezeichnet werden.

Um eine sichere Zuordnung der Zellen zu gewährleisten, wurden keine stark zerstörten Zellen zur Auswertung herangezogen.

3.2.3 Auswahl geeigneter Parameter der ultrastrukturellen Gefrierschädigung

Arbeiten über gefrorene Thrombozyten [Spector, 1979] [Böck, 1991] [Böck, 1996] zeigten, dass es unter der Belastung des Frierens zu einer Reduktion der Vesikelanzahl und zu einer Verschiebung der Vesikel an den Randbereich der Zelle kommt. Die Zellen erscheinen im Transmissionselektronenmikroskop heller, der Zelldurchmesser der Zellen nahm zu. Diese Befunde wurden als Zeichen eines beginnenden nekrotischen Prozesses im Inneren der Zelle gewertet. Im gefrorenem Untersuchungsmaterial traten im Vergleich zu frischen Thrombozytenproben mehr Zelltrümmer auf, ein Befund, der bei den bekannten Zellverlusten zu erwarten war.

In einer Studie an eingefrorenen und wieder aufgetauten Granulozyten [Boonlayangoor, 1980] konnte demonstriert werden, dass es zu einem Anschwellen des Kernes kommt. Das Chromatin wird heller und lagert sich immer mehr an den Rand an, bis es nur noch als dünner Streifen in einem kugelförmig transformierten Kern erscheint. Die Zellen verlieren einen Teil ihrer äußerlichen Variabilität, sie werden runder und die ehemals gleichmäßig verteilten Mikrovilli verringern sich und sind schwächer ausgeprägt.

Die osmotischen Prozesse während des Einfrierens und die Diffusion des DMSO in die Zelle und den Kern führen zu Osmolaritätsveränderungen im Inneren der Zelle. Schwankungen des Kern- und Zelldurchmessers sind damit schon aus theoretischen


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Gründen Parameter, die bei der Auswertung der Zellen beachtet werden sollten. Das Verhältnis der Kern- und der Zellfläche zueinander, die Kern-Plasma-Relation, stellt einen in diesem Zusammenhang stehenden Wert dar, der in die Auswertung mit einfloss. Die von den oben zitierten Autoren beschriebene Aufhellung des Chromatins ist eine quantitativ schwer fassbare Größe, die jedoch deskriptiv ermittelt werden konnte.

Eine Reduktion der Vesikelanzahl kann als Zerstörungen der Membranstrukturen angesehen werden, ein Phänomen, welches bei der Beurteilung der Kryoprotektion ein wichtiges Merkmal darstellt. Alle weiteren membranummantelten Zellorganellen wie z.B. Mitochondrien, der Kern, das glatte und raue endoplasmatische Retikulum verdienten eine besonders aufmerksame Betrachtung, da Veränderungen an diesen Strukturen zu erwarten waren.

Um Formveränderungen der Zelle und des Kernes zu erfassen, sollte von diesen Fotos der Zell- und Kernumfang, der maximale Durchmesser, die maximale horizontale und vertikale Ausdehnung und die Fläche ermittelt werden. Mit Hilfe dieser Daten wurden Aussagen über das Anschwellen oder Schrumpfen der Zelle oder des Kernes erwartet. Die Kernfläche konnte aus den gewonnenen Daten leicht zur Zellfläche in ein Verhältnis gesetzt werden. Diese Kern-Plasma-Relation sollte sich bei einer ungeschädigten Zelle nicht ändern.

Ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung der fotografierten Zellen waren die Anzahl und die optisch erkennbare Struktur der Zellorganellen. Die Mitochondrien bildeten aufgrund ihrer gegenüber Schädigungsfaktoren empfindlichen Innenstruktur die wichtigste zu untersuchende Organelle. Die Anzahl und die Struktur der Vesikel waren weitere Parameter, die mit Hilfe der Fotografien erfasst werden sollten.

Aufgrund der Literaturangaben in Bezug auf ultrastrukturelle Veränderungen von Thrombozyten [Spector, 1979] [Böck, 1991] [Böck, 1996] und Granulozyten [Boonlayangoor, 1980] wurde auf zu erwartende intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen im Bereich der Mitochondrien, der Kernmembran und des glatten bzw. rauen endoplasmatischen Retikulum besondere Aufmerksamkeit gelegt.

In Tabelle 5 wurden diejenigen morphologischen Merkmale zusammengefasst, die


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anhand elektronenmikroskopischer Fotografien und unter Anwendung der halbautomatischen Zellauswertung Aussagen über grundlegende Schädigungsmuster der Zellen nach Kryokonservierung erwarten lassen.

Tabelle 5: Parameter der halbautomatischen Zellauswertung mit dem IBAS 2000

Messwerte

  • Zellumfang
  • maximale horizontale und vertikale Ausdehnung der Zelle
  • maximaler Zelldurchmesser
  • Kernumfang
  • maximale horizontale und vertikale Ausdehnung des Kernes
  • maximaler Kerndurchmesser
  • Anzahl der intrazytoplasmatischer Granula
  • Anzahl der Mitochondrien
  • Anzahl der durch intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen veränderten Bereiche

Berechnete Werte

  • Fläche der Zelle
  • Formfaktor der Zelle 1
  • Fläche des Kernes
  • Formfaktor des Kernes 1
  • Verhältnis Zellfläche zu Kernfläche (Kern-Plasma-Relation)

1 Formfaktor = 4 pi . Fläche / (Umfang) 2


75

3.2.4 Ungepurgte frische Zellen

Bei der Betrachtung der ungepurgten frischen Blutproben fanden sich alle Entwicklungsstufen der Hämatopoese. Den größten Teil der Zellen machten unterschiedlich weit differenzierte Zellen der Granulopoese aus, die aufgrund ihres typischen strukturierten Kernes und der reichlich vorhandenen Granula einfach identifiziert werden konnten. Erythrozyten, Lymphozyten und Thrombozyten vervollständigten das erste Bild der peripheren Stammzellpräparate. Die gesuchten CD-34-positiven Blutstammzellen und die ebenfalls CD-34-positiven Progenitoren machten im Durchschnitt 1,90 % aller Zellen aus (Tab. 4). Diese Zellen zeigten als charakteristisches Merkmal einen Kern, der über ein nur schwach kondensiertes Chromatin verfügt (Abb. 16, 17). Es konnte eine stark schwankende Anzahl von Mitochondrien und Vesikeln nachgewiesen werden (Tab. 6).

Die Mitochondrien wiesen eine normale Größenverteilung auf. Die Cristae waren in den meisten Fällen gut erkennbar. Der Raum zwischen den Membraneinlappungen war mit einer schwach elektronenabsorbierenden Substanz ausgefüllt. Nur in Einzelfällen konnten helle Flüssigkeitseinlagerungen im Inneren der Organelle gefunden werden. Anderweitige Einlagerungen waren nicht sichtbar.

Die Vesikel imponierten durch eine hohe Konstanz in Form und Größe. Sie zeigten sich als meist kreisrunde, homogen ausgefüllte Strukturen, die in vielen Fällen über eine gut erkennbare Membran als äußere Begrenzung verfügten (Abb. 15).


76

Abbildung 15: Ausschnitt einer frischen Zelle mit gut erhaltenen Mitochondrien (M) und mehreren Vesikeln (V), die eine homogene Struktur aufweisen. Raues endoplasmatisches Retikulum (rEPR) ist erkennbar. (FN 1619)

Strukturierte Granula war selten anzutreffen. Kristalle, wie sie in den Vesikeln von basophilen und eosinophilen Granulozyten anzutreffen sind, wurden nicht beobachtet. Strukturen, die auf das Vorhandensein eines Golgi-Apparates hinwiesen, konnten in weiter differenzierten Zellen regelmäßig nachgewiesen werden. Diese Zellen wurden aufgrund der definierten Einschlusskriterien nicht den Blutstammzellen/hämatopoetischen Vorläuferzellen zugeordnet. Der Kern der beobachteten Zellen nahm durchschnittlich mehr als die Hälfte der Zellfläche ein. Hierbei gab es in der Form und der Größe jedoch erhebliche Schwankungen. Allen ausgewerteten Zellen war die geringe Kondensation des Chromatins im Inneren des


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Zellkernes eigen. Die äußere Grenze des Kernes stellte eine meist gut erkennbare doppelte Membran dar, deren einzelne Schichten parallel zueinander verliefen und nur geringe Abstandsschwankungen aufwiesen. Im Kerninneren konnten regelmäßig Nukleoli nachgewiesen werden. Die Anzahl und das Erscheinen der Kernporen zeigten keine Auffälligkeiten. Die Zelle wurde durch eine einzelne Membran nach außen hin abgeschlossen, es konnten nur selten Zytoplasmaausläufer beobachtet werden. Die Zellen waren von runder bis ovaler Gestalt.

Die Abbildungen 16 und 17 zeigen zwei repräsentative ungepurgte frische Zellen. Die ermittelten Zahlen-, Größen- und Flächenangaben sind der Tabelle 6 zu entnehmen.

Abbildung 16: Frische ungepurgte Zellen mit repräsentativen Größenverhältnissen. Es sind ein großer Kern (K), eine geringe Chromatinkondensation, einige Mitochondrien (M) und zahlreichen Vesikeln (V) erkennbar. (FN 1125)


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Abbildung 17: siehe Abb. 16. (FN 1177)


79

3.2.5 Ungepurgte, mit 10%igem DMSO eingefrorene Zellen

Die elektronenmikroskopische Untersuchung der gefrorenen ungepurgten DMSO- Proben zeigte ein von den frischen ungepurgten Zellen abweichendes Bild. Auffällig war das Fehlen von Erythrozyten, die den Prozess des Einfrierens und Auftauens meist nicht überstanden. Es konnten stets Zellen mit erheblichen Zerstörungen ihrer inneren Struktur nachgewiesen werden (Abb. 18). Intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen, der Verlust von Zytoplasma, das Verschwinden von Zellorganellen und die kreisrunde Erscheinung des Zellkernes mit einem völligen Verlust der Chromatinkondensation kennzeichneten diese Zellen. Eine weitergehende Auswertung derartig stark zerstörter Zellen kam nicht in Frage.

Der größte Anteil der Zellen wurde von reifen Granulozyten und Lymphozyten gestellt. Die gesuchten Blutstammzellen und Vorläuferzellen zeigten ein Anschwellen des Kernes. Der in den ungepurgten frischen Präparaten unregelmäßig bis oval geformte Kern wurde geringfügig runder und größer. Der Anteil des Zytoplasmas an der Gesamtfläche der Zelle stellte sich unterschiedlich dar.

Ein Teil der beobachteten Zellen zeigte ein dem Kern analoges Anschwellen, wodurch es zu einer subjektiven Vergrößerung der Zelle und zu einer Verringerung der Kern-Plasma-Relation kam. Der andere Teil der beobachteten Blutstammzellen/hämatopoetischen Vorläuferzellen wies Abschnürungen im Bereich der Zellmembran auf. Bei diesen Zellen zeigte sich ein deutlicher Verlust an Zytoplasma. Die Folge war eine Verkleinerung der Zelle bei normalem Kerndurchmesser. Das Verhältnis der Kernfläche zur Gesamtzellfläche verschob sich bei diesen Zellen zugunsten des Kernes. Wenn man alle untersuchten Zellen eines Patienten betrachtet, so hoben sich diese Phänomene gegenseitig auf, es kam nur zu einer geringfügigen Abnahme der Zellfläche.


80

Abbildung 18: Ausschnitt einer gefrorenen, stark zerstörten und somit nicht auswertbaren Zelle. Einige Vesikel (V) sind erkennbar, der Kern (K) weist einen völligen Verlust der Chromatinstruktur auf. Ein wahrscheinliches Mitochondrium mit zerstörter Innenstruktur (M) ist nicht mehr sicher identifizierbar. (FN 1315)

Charakteristische Merkmale der gefrorenen gegenüber den frischen Zellen waren die Verkleinerung der Mitochondrien, die Kondensation ihrer inneren Struktur und die Flüssigkeitseinlagerung im Inneren der Organelle. Ein Ausdruck der Kondensation war die zunehmende Elektronendichte der Struktur unter dem Elektronenmikroskop und damit der stärkere Kontrast der Organelle. Es bildeten sich im Inneren randständige oder zentral gelegene völlig strukturlose Bereiche, die Cristae zogen sich zum Rand des Mitochondrium zurück und kondensierten (Abb. 19). Die Anzahl dieser Organelle blieb im Vergleich zu den frischen Proben konstant. Die Anzahl der Vesikel nahm in den gefrorenen Zellen ab. Es konnte nachgewiesen werden, dass es zu einer verstärkten Lokalisation der Granula im äußeren Bereich des Zytoplasmas kam.


81

Abbildung 19: Gefrorene Zelle mit mehreren zerstörten Mitochondrien (M), die Kernstruktur erscheint hier unverändert. (FN 1201)

Zwei besondere Merkmale der Kryokonservierung und des Auftauens zeigten sich im Bereich des Kernes. Zum einem kam es zu einer Aufhellung der Chromatinstruktur. Die ehemals randständige Anlagerung ging zurück, im Extremfall war der gesamte Kern mit einer homogenen, nur noch schwach erkennbaren Chromatinstruktur ausgefüllt. Die quantitative Bewertung dieser Beobachtung gelang nicht, da präparations- und fototechnisch bedingte Kontrastschwankungen nicht von den Änderungen in der Zelle getrennt werden konnten. Nukleoli und Kernporen waren weiterhin erkennbar. Ihre Anzahl und Struktur wiesen keine Unterschiede zu denen der frischen Zellen auf. Das zweite wesentliche Merkmal war die Verbreiterung des Abstandes der Kern-Doppelmembran. Diese Verbreiterung, ein Ausdruck der Flüssigkeitseinlagerung, zeigte sich bei einigen Zellen in einem beträchtlichen Ausmaß (Abb. 20, 21). Der Raum zwischen den Membranschichten war blasenartig umgewandelt und mit einer hellen homogenen Struktur ausgefüllt.


82

Abbildung 20: Detailaufnahme einer mit 10%igem DMSO gefrorenen Zelle. Erkennbar ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeile) im Bereich der Kerndoppelmembran. Das benachbarte Mitochondrium (M) zeigt beginnende Kondensationserscheinungen. Die Strukturen der Vesikel (V) und des Kernes (K) erscheinen normal. (FN 360)

Diese homogene Struktur zwischen den einzelnen Membranen diente als Ausschlusskriterium einer präparationsbedingten Schädigung dieser Doppelmembran, die sich in einem völlig strukturlosen hellen Riss, zumeist im rechten Winkel zur Schnittrichtung des Präparates zeigte.


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Abbildung 21: Ausschnitt einer stärker beeinträchtigten, mit 10%igem DMSO gefrorenen Zelle. Im Bereich der Kernmembran ist eine große Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeile) erkennbar. Mitochondrien sind nicht mehr sicher zu identifizieren. Beginnende Auflösung der Zelle mit Abschnürungen von zytoplasmatischem Material. Vereinzelt sind Vesikel nachweisbar. Die Struktur des Kernes (K) und die Chromatinkondensation erscheinen unauffällig. (FN 950)

Als weitere Veränderung im Inneren der Zelle konnten regelmäßig zisternenartige Erweiterungen des glatten und rauen endoplasmatischen Retikulum beobachtet werden. Diese Räume waren analog mit einer oben genannten homogenen hellen Struktur ausgefüllt.


84

Die Abbildungen 22 und 23 zeigen ungepurgte gefrorene Zellen mit repräsentativem morphologischem Erscheinungsbild und typischen Veränderungen nach dem Einfrier- und Auftauprozess. Aus Tabelle 6 sind die ermittelten Messwerte ersichtlich.

Abbildung 22: Ungepurgte, mit 10%igem DMSO gefrorene Zelle mit typischen Veränderungen. Zu beachten ist der runde Zellkern (K) und die teilweise veränderten Mitochondrien (M). Im Bereich der Kernmembran ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeil) zu erkennen. Ein Teil des rauen endoplasmatischen Retikulum erscheint zisternenartig erweitert (rEPR, Dreiecke). (FN 364)


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Abbildung 23: Ungepurgte, mit 10%igem DMSO gefrorene Zelle mit auffällig rundem Zellkern (K). Die Mitochondrien (M) erscheinen nur leicht geschädigt. Im Bereich des Zytoplasmas ist eine Flüssigkeitseinlagerung (Ö, Pfeil) mit unklarer Primärstruktur erkennbar. (FN 539)


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3.2.6 Ungepurgte, mit Kryo II eingefrorene Zellen

Ultrastrukturell konnten kaum Unterschiede zwischen den verschieden eingefrorenen Proben ermittelt werden (Abschn. 3.2.7., Abb. 24).

Abbildung 24: Ungepugte, mit Kryo II eingefrorene Zelle. Der Kern (K) ist erkennbar, er weist eine geringe randständige Chromatinkondensation auf. Neben den Mitochondrien (M) sind einzelne kleine Frierschäden (Dreiecke) erkennbar. (FN 2093)


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In Analogie zu den mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen wiesen sie eine gestiegene Anzahl von intrazellulären Flüssigkeitseinlagerungen auf. Die durchschnittliche Anzahl dieser Veränderungen war bei beiden Friermedien gleich, es fällt jedoch eine größere Streuung der Ergebnisse bei den mit der Kryo II-Lösung eingefrorenen Proben auf (Abb. 33, Tab. 6).

Ein weiterer Unterschied bestand im Parameter "Formfaktor Kern". Bei den mit Kryo II eingefrorenen Zellen liegen die ermittelten Werte fast auf dem Ausgangsniveau der frischen Zellkerne. Die Frierproben mit 10%igem DMSO wiesen ein Anschwellen des Kernes auf, welches sich in höheren Werten des Formfaktors wiederspiegelt (Abb. 31).

Ein letzter subjektiv ermittelter Aspekt bezieht sich auf die Anzahl der erkennbaren Erythrozyten. In der 10%igen DMSO-Reihe konnten nur selten Erythrozyten nachgewiesen werden, den Zustand des Einfrierens und Auftauens überleben diese Zellen nicht. In den mit Kryo II eingefrorenen Proben waren die roten Blutzellen dagegen regelmäßig in großer Zahl erkennbar. Dieser Befund korreliert mit der erfolgreichen Kryoprotektion von Erythrozyten mit HAES-haltigen Zusätzen [Thomas, 1996] [Sputtek, 2001]. Eine Überprüfung dieses subjektiven Befundes fand im Rahmen der weiteren Untersuchungen nicht statt.


88

3.2.7 Vergleich der morphometrischen Messwerte ungepurgter Zellen

In einem ersten Schritt wurden die ermittelten Zahlenwerte der ultrastrukturellen Untersuchungen (Tab. 6) grafisch in Form von Box-Whisker-Plots dargestellt
(Abb. 25-34)

Tabelle 6: Messergebnisse der untersuchten ungepurgten Zellen. Die Messwerte entsprechen den Medianen und den 25% - 75% Quantilen.

 

frisch

(n=635)

10 % DMSO

(n=606)

Kryo II

(n=175)

max. Zelldurchmesser (µm)

10,32 (9,44-11,28)

10,29 (9,41-11,38)

10,12 (9,09-11,15)

max. Kerndurchmesser (µm)

8,22 (7,49-8,95)

8,11 (7,47-8,82)

7,97 (7,28-8,74)

Zellfläche (µm2)

80,86 (69,09-96,27)

82,57 (68,51-98,59)

81,04 (65,03-95,96)

Kernfläche (µm2)

44,91 (39,40-52,50)

47,11 (39,42-53,52)

43,28 (37,03-49,72)

Kern-Plasma-Relation (%)

55,25 (49,82-60,85)

56,48 (50,06-63,87)

52,89 (48,11-59,77)

Formfaktor der Zelle

0,77 (0,63-0,86)

0,78 (0,64-0,88)

0,79 (0,76-0,92)

Formfaktor des Kernes 1

0,85 (0,78-0,90)

0,91 (0,83-0,94)

0,86 (0,76-0,92)

Vesikel (n) 1

21 (7-39)

12 (7-23)

17 (9-32)

Flüssigkeitseinlagerungen (n) 1,2

0 (0-1)

3 (1-6)

3 (0-7)

Mitochondrien (n)

5 (3-9)

5 (2-9)

6 (3-9)

1 = Signifikanz zwischen frischen und 10%igen DMSO-Proben nachweisbar (p<0,05)

2 = Signifikanz zwischen frischen und Kryo II-Proben nachweisbar (p<0,05)

Die dunkel hinterlegten Boxen umschließen mit der unteren Grenze die 25 % und mit der oberen Grenze die 75 % Quantile. In der Box ist der Medianwert aller Messwerte als durchgezogene Linie dargestellt. Die als Whiskers bezeichneten Grenzen umschließen jeweils den 1,5fachen Interquantilenabstand. Als Kreis dargestellte Werte liegen zwischen dem 1,5fachen und dem 3fachen Interquantilenabstand. Die


89

als Stern markierten Messwerte befinden sich außerhalb dieses 3fachen Bereiches. Alle in den Abbildungen 25-34 grafisch dargestellten Messergebnisse beziehen sich auf die ungepurgten frischen Blutproben und die nach Einfrieren und Auftauen gewonnenen Vergleichsproben. Es wurden alle ermittelten Werte in die grafische Auswertung einbezogen. Die Erstellung der Box-Whisker-Plots erfolgte mit dem Programm SPSS® für Windows® (SPSS Inc., Chicago, USA).

Die Darstellungen lassen erkennen, dass die gemessenen Änderungen der Zell- und Kernfläche, der maximalen Zell- und Kerndurchmesser, der Mitochondrienanzahl und der Kern-Plasma-Relation nicht signifikant sind. Die Anzahl der Vesikel, die Anzahl der Flüssigkeitseinlagerungen und der Formfaktor des Kernes bilden jedoch eine Ausnahme, hier sind Veränderungen sichtbar.


90

Abbildung 25: Maximaler Zelldurchmesser der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).

Abbildung 26: Maximaler Kerndurchmesser der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).


91

Abbildung 27: Zellfläche der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).

Abbildung 28: Kernfläche der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).


92

Abbildung 29: Kern-Plasma-Relation der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).

Abbildung 30: Formfaktor Zelle der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).


93

Abbildung 31: Formfaktor Kern der ungepurgten Zellen. Es ist ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der frischen und den mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.

Abbildung 32: Vesikelanzahl der ungepurgten Zellen. Es ist ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der frischen und den mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.


94

Abbildung 33: Durch intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen veränderte Bereiche der ungepurgten Zellen. Es sind signifikante Unterschiede zwischen den Messwerten der frischen versus DMSO 10% und frischen versus Kryo II Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05). Siehe dazu auch Tabelle 7.

Abbildung 34: Mitochondrienanzahl der ungepurgten Zellen. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Versuchsreihen nachweisbar (p<0,05).


95

In einem zweiten Auswertungsschritt wurden die Änderungen der vorher genannten Parametern mathematisch untersucht. Das Ziel war hierbei, signifikante Unterschiede auszuschließen oder nachzuweisen.

Zu Beginn erfolgte die Bewertung der Messwertverteilung grafisch mit Hilfe von Histogrammen (Abb. 35). Es stellte sich heraus, dass die gewonnenen Daten erwartungsgemäß einer Normalverteilung folgten.

Abbildung 35: Beispielhaftes Histogramm der ermittelten Messwerte des maximalen Kerndurchmessers der frischen ungepurgten Zellen (n= 635).

Aufgrund der hohen Schwankung der Messwerte wurde anstelle des Mittelwertes bei allen folgenden Berechnungen der Medianwert zugrundegelegt. Die Mediane wurden für jeden Patienten und jede Probe ermittelt und dienten dann zur Durchführung des F-Testes, der die Gleichheit zweier Varianzen als Voraussetzung für die Anwendung des t-Testes ermitteln sollte. Je nach Erfüllung des F-Testes konnten im Anschluss ein Zweistichproben t-Test für Stichproben mit gleicher oder unterschiedlicher Varianz berechnet werden. Dabei wurde ein Signifikanzniveau von 95 % gewählt.


96

Die Ergebnisse (Tab. 7) zeigen, dass die Anzahl der Flüssigkeitseinlagerungen bei gefrorenen Zellen unabhängig von der Art des Friermediums hochsignifikant zunimmt. Gleichzeitig lässt sich eine Reduktion der Vesikel beim Einsatz von 10%igem DMSO nachweisen. Ein weiterer Parameter, der eine nachweisliche Änderung erfährt, ist der Formfaktor des Kernes. Die Nutzung von DMSO führt zu einem runderen Kern, der sich in einem höheren Wert für den Formfaktor darstellt.

Beim Vergleich der acht Blutproben, die mit zwei verschiedenen Medien eingefroren wurden, zeigten sich zwischen den beiden Kryoprotektiva keine signifikanten Unterschiede (Tab. 7).

Tabelle 7: Statistische Auswertung der Messwerte

 

frisch vs.
DMSO 10%

frisch vs.
Kryo II

DMSO 10% vs.
Kryo II

Parameter

(29 Patienten)

(8 Patienten)

(8 Patienten)

(635 Messwerte)

(175 Messwerte)

(175 Messwerte)

max. Kerndurchmesser

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

max. Zelldurchmesser

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

Kernfläche

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

Zellfläche

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

Formfaktor Kern

signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

Formfaktor Zelle

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

Kern-Plasma-Relation

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

n Mitochondrien

nicht signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

n Flüssigkeitseinlagerung

signifikant

signifikant

nicht signifikant

n Vesikel

signifikant

nicht signifikant

nicht signifikant

(p<0,05)

(p<0,05)

(p<0,05)


97

3.2.8 Vergleich der Vitalitätstestungen

Von den mit der Kryo II-Lösung eingefrorenen Proben und den dazugehörigen 10%igen DMSO- Proben konnten Vitalitätsbestimmungen durchgeführt werden. Dazu wurden die Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen mittels der Trypanblau-Ausschlussmethode untersucht. Des weiteren fand eine Kultivierung der Zellen statt, um so die Proliferationsraten der hämatopoetischen Stammzellen bestimmen zu können. Beide Testungen erfolgten nach den in Abschnitt 2.8. beschriebenen Bedingungen. Die Ergebnisse der Versuche sind der Tabelle 8 zu entnehmen.

Die gemessenen Werte wurden mit Hilfe des nichtparametrischen Mann-Whitney-Wilcoxon-Testes auf signifikante Unterschiede untersucht. Trotz eines scheinbaren Vorteils der mit Kryo II eingefrorenen Zellen im Hinblick auf die Proliferationsraten der roten und weißen Kolonien folgen die ermittelten Zahlenwerte keiner unterschiedlichen Verteilung, es ist somit keine Signifikanz nachweisbar.

Tabelle 8: Ergebnisse der Vitalitätstestungen. Die Zahlenwerte entsprechen dem Mittelwert (Minimum- Maximum)

 

DMSO 10%

(n=8)

Kryo II

(n=8)

Vitalität (Trypanblau- Ausschluss)

84,8 (60-96)

85,9 (62-95)

BFU-E

133,5 (0-550)

148,3 (0-480)

CFU-GM

103,3 (35-260)

133,8 (27-250)

DMSO 10% vs. Kryo II: keine signifikanten Unterschiede feststellbar (p<0,05)


98

3.2.9 Gepurgte Zellen

In zwei Fällen war es möglich, gepurgte Zellen vor und nach dem Einfrieren mit 10%igem DMSO morphologisch zu vergleichen. Prinzipiell konnten ähnliche Veränderungen in der Zelle durch die Belastung des Einfrierens und Auftauens im Vergleich mit den ungepurgten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich eine Schwellung des Kernes mit einer Aufhellung des Chromatins (Abb. 36). Die Durchmesser und die Flächen der Zellen vergrößerten sich. Intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen konnten in Analogie zu den gefrorenen, nicht angereicherten Zellen in den Mitochondrien, den Kernmembranen und in den Strukturen des endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden.

Abbildung 36: Gefrorene, gepurgte Zelle mit mehreren Mitochondrien (M), von denen einige Kondensationserscheinungen zeigen (Pfeile). Der kreisrunde Kern (K) dominiert die Zelle. Die Chromatinkondensation ist bis auf einen schmalen Saum zurückgedrängt. Ein längeres Stück raues endoplasmatisches Retikulum (rEPR) ist erkennbar. (FN 170)


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3.2.10 Vergleich der morphometrischen Messwerte gepurgter Zellen

Die Tabelle 9 zeigt eine Zusammenfassung der Messergebnisse der gepurgten Zellen.

In den Abbildungen 37-42 sind die gemessenen Werte der gepurgten frischen und der gepurgten und mit 10%igem DMSO gefrorenen Zellen grafisch in Form der beschriebenen Box-Whisker-Plots (Abschn. 3.2.7.) dargestellt.

Aufgrund der geringen Anzahl von Patienten und der damit zu geringen Anzahl von Messwerten wurde an dieser Stelle bewusst auf Signifikanzberechnungen verzichtet.

Tabelle 9: Messergebnisse der untersuchten gepurgten Zellen. Die Messwerte entsprechen den Medianen und den 25% - 75% Quantilen.

 

frisch
(2 Patienten)
(44 Messwerte)

10 % DMSO
(2 Patienten)
(43 Messwerte)

max. Zelldurchmesser (µm)

8,7 (8,2-9,1)

10,2 (9,4-11,1)

max. Kerndurchmesser (µm)

7,5 (7,0-7,9)

8,4 (7,8-9,2)

Zellfläche (µm2)

57,3 (52,9-64,4)

81,0 (70,4-95,4)

Kernfläche (µm2)

36,9 (33,6-41,9)

53,0 (45,2-61,8)

Kern-Plasma-Relation (%)

63,0 (59,8-69,4)

66,7 (62,5-69,8)

Formfaktor der Zelle

0,84 (0,80-0,90)

0,93 (0,90-0,95)

Formfaktor des Kernes

0,76 (0,64-0,84)

0,94 (0,90-0,96)

Vesikel (n)

8 (5-10)

10 (7-14)

Flüssigkeitseinlagerungen (n)

0 (0-0)

1 (0-3)

Mitochondrien (n)

8 (3-11)

8 (3-12)


100

Abbildung 37: Maximaler Zelldurchmesser der gepurgten Zellen

Abbildung 38: Maximaler Kerndurchmesser der gepurgten Zellen


101

Abbildung 39: Zellfläche der gepurgten Zellen

Abbildung 40: Kernfläche der gepurgten Zellen


102

Abbildung 41: Formfaktor Zelle der gepurgten Zellen

Abbildung 42: Formfaktor Kern der gepurgten Zellen


103

3.3 Diskussion

3.3.1 Patientenauswahl

Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Blutproben stammen von Patienten, die sich einer Hochdosischemotherapie mit anschließender peripherer Blutstammzelltransplantation unterziehen sollten. Alle Patienten wurden durch die Gabe von G-CSF auf die Gewinnung peripherer Blutstammzellen vorbereitet. Bei einem Teil der Patienten wurde unter Berücksichtigung der Art ihrer Tumorerkrankung eine kombinierte Mobilisierung mit zytostatischen Medikamenten und G-CSF gewählt.

Die Art der Tumorerkrankungen der Patienten ist in Tabelle 3 dargestellt. Es überwiegen deutlich die hämatologischen Neoplasien. Dieses Ungleichgewicht ist verständlich, wenn man sich die etablierten Indikationen und die derzeit laufenden Studien für eine Hochdosischemotherapie vor Augen führt (Abschn. 1). Aus theoretischer Sicht wären Blutproben von Patienten mit soliden Tumoren zu bevorzugen, da bei bösartigen Neoplasien des hämatopoetischen Systems von einer Störung der Blutbildung und -differenzierung auszugehen ist. Es besteht somit die Gefahr, dass die untersuchten Zellen krankhaft verändert sind und die gemessenen Zahlenwerte einen Teil der Grunderkrankung widerspiegeln. Dieser Aspekt ist besonders bei akuten Leukämien zu beachten, bei denen das Auftreten von blastären Zellen im Blut ein wesentliches diagnostisches Merkmal ist. Wenn man jedoch von der Annahme ausgeht, dass die maligne entarteten blastären Zellen morphologisch den frühen Differenzierungsstufen der Blutstammzelle ähneln, so kann man auch von vergleichbaren Schädigungen nach Tieftemperaturlagerung und anschließendem Auftauen ausgehen. Unter diesem Gesichtspunkt kann die Heterogenität der Grunderkrankungen der Patienten akzeptiert werden.


104

3.3.2 Probengewinnung

Im Rahmen der Gewinnung der peripherer Blutstammzelltransplantate (Abschn. 3.1.3.) und der folgenden routinemäßigen Qualitätskontrolle (Abschn. 3.1.5.) konnten von 29 Patienten Blutprobenpaare untersucht werden. Jedes Blutprobenpaar bestand aus einer ungefrorenen und einer gefrorenen Probe eines Patienten. Von acht Patienten konnte eine dritte Probe gewonnen werden. Von zwei Patienten gelang es zusätzlich, Blutproben vor und nach dem Purgen zu erhalten. Die für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen benötigten Mengen an Blut lagen bei ca. 0,5 ml, einer Menge, die im Rahmen der Herstellung von autologen peripheren Blutstammzelltransplantaten problemlos gewonnen werden kann.

Die Kryokonservierung der peripheren Blutstammzellkonzentrate erfolgte mit einer 10%igen DMSO- Lösung und im Falle der acht zusätzlichen Proben mit einer Mischung aus 5 % DMSO, 6 % HAES 200/0,5 und 4 % Humanalbumin. Nach einem kontrollierten Einfrieren wurden die Transplantate bei -150 bis -196 oC in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Auftauen erfolgte rasch innerhalb einer Minute, die Wartezeit bis zum Herauswaschen der Friermedien und der anschließenden Fixierung betrug 9 min. Damit wurde die Transfusionsdauer der Transplantate simuliert. Für die untersuchten gefrorenen Blutproben wurden in Anlehnung an die klinischen Gegebenheiten (Abschn. 3.1.4.) durchschnittliche Lagerungszeiträume von 4,7 Wochen gewählt.

Damit sind die Modalitäten der Probengewinnung, des Einfrierens, des Lagerns und des Auftauens identisch mit denen der retransfundierten peripheren Blutstammzelltransplantate.


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3.3.3 Elektronenmikroskopischen Präparation

Die elektronenmikroskopische Präparation (Abb. 10) wurde durch eine Fixierung mittels 2%igem Glutaraldehyd eingeleitet. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf einen zügigen Beginn der Fixierung gelegt, da aus der Literatur bekannt ist, dass die hämatopoetische Blutstammzelle uneingefroren nur begrenzte Zeit lagerfähig ist [Kohsaki, 1981] [Lasky, 1986] [Richtlinie zur Transplantation peripherer Blutstammzellen, 1997]. An den ersten Fixierungsschritt mit 2%iger Glutaraldehylösung in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) schloss sich eine Entwässerung in einer steigende Ethanolreihe an. Nach Einbettung in Epon®-Harz und anschließender Polymerisation erfolgte eine doppelte Schnittkontrastierung der Ultradünnschnitte mit Uranylacetat- und Bleiacetatösung.

Die Einbettung des relativ geringen Probenvolumens von ca. 0,5 ml konnte durch eine Mischung der fixierten und sedimentierten Blutzellen mit einer isotonen Gelatine-Saccharose-Lösung und deren Nachfixierung sehr vereinfacht werden. Durch diesen Zwischenschritt war die Aufarbeitung fast verlustfrei durchführbar. Ohne diese Einbettung hätte nach jeder Ethanolstufe eine Zentrifugation erfolgen müssen. Dieser Vorgang hätte einen weiteren Stressfaktor für die Zelle dargestellt. Beim anschließenden Dekantieren wäre mit Zellverlusten zu rechnen gewesen.

Die Präparation kleiner Probenvolumina ist als besonders wichtig anzusehen, da die Gewinnung des Blutes mit einem hohen medizinischen sowie apparativen Aufwand verbunden ist. Zugleich orientieren sich die Zeitdauer und die Anzahl der Apheresen stark an der für die Transplantation erforderlichen Zellzahl. Für die elektronenmikroskopische Untersuchung sollte demnach so wenig wie möglich Blut erforderlich sein. Dieser Forderung entspricht die praktizierte Untersuchungsmethode.

Bei der lichtmikroskopischen und elektronenmikroskopischen Diagnostik ist stets die Frage nach der Originalität des gesehenen Bildes zu stellen. Sie schließt die möglichst zuverlässige Abgrenzung tatsächlicher morphologischer Befunde von artefiziellen Phänomenen ein. Die Präparation einer elektronenmikroskopischen


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Probe geht mit einer Vielzahl von Manipulationsschritten einher, bei denen in den Zellen Schäden gesetzt werden können, die in der lebenden Zelle nicht nachweisbar gewesen wären. Diese durch die Fixierung, Entwässerung, Einbettung, Kontrastierung und das Schneiden hervorgerufenen Schädigungen bezeichnet man als Artefakte. Das für die Elektronenmikroskopie typische, auch in dieser Arbeit verwandte Fixativ, eine 2% Glutaraldehydlösung, zeichnet sich durch eine schonende Fixierung des Gewebes bei geringer Schrumpfung bzw. Quellung aus [Mazur, 1968]. Entscheidend für die Qualität der Fixierung ist neben der Art des Fixatives [Takahashi, 1978] die Osmolarität der Lösung [Arborgh, 1976], die im isotonen oder leicht hypertonen Bereich liegen sollte.

Die Herauslösung von Zellbestandteilen während des Entwässerungsvorganges stellt ein weiteres mit der elektronenmikroskopischen Präparation verbundenes Problem dar. Der für die exakte Einbettung unabdingbare Wasserentzug kann mit steigenden Alkoholkonzentrationen oder mittels Gefriertrocknung [Mazur, 1968] durchgeführt werden. Die technisch unkomplizierte Variante der Alkoholentwässerung führt zu einer mehr oder weniger starken Extraktion an Zellbestandteilen. Diese Artefakte gilt es bei der Bewertung von Schäden zu beachten.

Eine in dieser Arbeit regelmäßig auftretende Präparationsschädigung war das Zerreißen der Kerndoppelmembran im rechten Winkel zur Schnittrichtung. Die Bewertung dieses Phänomens als Artefakt und die Abgrenzung zu den sehr ähnlich erscheinenden Flüssigkeitseinlagerungen in den Doppelmembranen der Kerne und dem endoplasmatischen Retikulum gelang durch eine Beobachtung des Raumes zwischen den einzelnen Membrangrenzen (Abb. 43, 44). Bei dem durch das Schneiden verursachten Riss kam es zu einer unregelmäßig begrenzten Spaltung der Doppelmembran des Zellkernes bzw. der benachbarten Bereiche. Der Raum in diesem Spalt war ohne jede erkennbare Struktur. Im Elektronenmikroskop erkannte man diesen Zustand am Fehlen des Einbettungsmediums analog zu beobachteten Löchern oder Rissen in zu dünn geschnittenen Objekten. Die intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerung zeichnete sich durch eine glatte Membran aus, der Spalt war mit einem homogenen, strukturlosen Material ausgefüllt.


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Abbildung 43: Mit 10%igem DMSO gefrorene ungepurgte Zelle mit Flüssigkeitseinlagerung in der Kernmembran (Ö, Pfeile) und starker Lysis im Bereich eines Mitochondrium (M). Der Bereich der Kernmembranerweiterung ist homogen gefüllt. Das erkennbare raue endoplasmatische Retikulum (rEPR, Dreiecke) erscheint geringfügig aufgeweitet. (FN 1451)


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Abbildung 44: Frische ungepurgte Zelle mit mehreren gut erhaltenen Mitochondrien (M). Zu beachten sind die strukturlosen Spalten im Zytoplasma, die als Artefakte gedeutet werden (A). Der Pfeil demonstriert die Schnittrichtung. Die Stauchung der Zelle ist in Schnittrichtung gut erkennbar. (FN 645)

Weitere relevante artefizielle Schädigungen konnten nicht beobachtet werden. Die Verfälschung der Ergebnisse durch Schrumpfungen, Quellungen oder das Herauslösen von Zellbestandteilen wurde durch die analoge Präparation der frischen und der gefrorenen Proben minimiert.

Die Methode und die Arbeitsweise zur Präparation und Auswertung von peripheren Blutstammzellen und Progenitoren haben sich als durchführbar erwiesen. Mit der in Abschnitt 3.1.6. beschriebenen Einbettung konnten elektronenmikroskopische Präparate von guter Qualität angefertigt werden.


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3.3.4 Zielzellenbestimmung

Der sensibelste Punkt der vorliegenden elektronenmikroskopischen Untersuchung ist die exakte Definition der gesuchten Zellen und deren zweifelsfreie Identifizierung.

Die Auswertung der Literaturangaben ergab ein differenziertes morphologisches Bild der Hämatopoese. Die Charakterisierung der peripheren Blutstammzellen gelang mit Hilfe der spärlichen Beschreibungen jedoch nicht. Diese Situation ist erklärbar, wenn man die oft nur minimalen Differenzen zu anderen Zellarten betrachtet, zumal beim derzeitigen Entwicklungsstand von Immunhistochemie und Durchflusszytometrie Blutstammzellen schneller und einfacher mit diesen Methoden identifiziert und quantifiziert werden können. Die Zahl der elektronenmikroskopischen Untersuchungen ist seitdem rückläufig.

Um dennoch eine homogene Zellfraktion zu betrachten, wurden in einer Voruntersuchung die Literaturangaben mit denen von gepurgten Zellen verglichen. Mit Hilfe der in Abschnitt 3.2.2. erarbeiteten Einschlusskriterien konnte der größte Teil der verschiedenen Differenzierungsstufen der Blutzellen sicher identifiziert werden. Keine eindeutige Zuordnung gelang bei den blastären Vorläuferzellen der Granulozyten, der Lymphozyten, der Erythrozyten und der Monozyten. Aufgrund der morphologischen Ähnlichkeiten der Blutstammzelle und der aus ihr entstehenden blastären Vorstufen der einzelnen hämatopoetischen Zelllinien wurden die zu untersuchenden Zielzellen „Blutstammzellen / hämatopoetische Vorläuferzellen“ genannt.

Ein in dieser Arbeit nicht verfolgter Ansatz zur sicheren Erkennung der Blutstammzellen/hämatopoetischen Vorläuferzellen wäre die Markierung der Zellen mit Hilfe der Immuno-Gold-Methode. Dabei reagieren an Antikörper gekoppelte Goldpartikel mit den CD-34-Bindungsstellen der Zellen. Derartig markierte blastäre Zellen zeichnen sich durch charakteristische Kontrastierungsfiguren aus, die aufgrund der starken Elektronenabsorbtion der Goldpartikel zur Identifizierung der Zellen genutzt werden können.


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Der Einsatz dieser markierten Proben würde das mitunter sehr zeitaufwendige elektronenmikroskopische Suchen und Erkennen der Blutstammzellen einerseits erleichtern und durch die Selektion nahezu immunophänotypisch identischer Zellen zu homogeneren Messwerten nach manueller oder automatischer Bildanalyse führen. Auf der anderen Seite ist wegen der hohen morphologischen Ähnlichkeit im Aufbau der Blutstammzelle und der Progenitoren davon auszugehen, dass immunophänotypisch identische Zellen nicht zwangsläufig auch einen identischen Differenzierungsgrad aufweisen. Insofern relativiert sich möglicherweise der methodische Vorteil immunelektronenmikroskopischer Techniken. Die Ergebnisse der Arbeit (Abschn. 3.2.) zeigen, dass die Schädigungsmuster keine qualitativen Unterschiede zwischen den wenigen gepurgten Zellen und der Masse der ungepurgten Zellen zeigen. Es scheint somit legitim, neben der Blutstammzelle die ihnen nahestehenden Progenitoren in die Auswertung einzubeziehen.

3.3.5 Fotografische Dokumentation

Neben dem Unsicherheitsfaktor in der Zuordnung der betrachteten Zelle ist eine weitere mögliche Ungenauigkeit in der geringen Schichtdicke der angefertigten Schnitte zu sehen. Was auf der einen Seite die Voraussetzung für scharfe Fotografien mit einer hohen Detailgenauigkeit und geringen Überlagerungserscheinungen darstellt, ist auf der anderen Seite ein räumliches Problem. Während in der Lichtmikroskopie meist mit 10 µm dicken Paraffinschnitten gearbeitet wird, betragen die Dicken der elektronenmikroskopischen Schnitte nur 20-100 nm. Dadurch wird aus einer meist runden weißen Blutzelle eine dünne Scheibe herausgeschnitten und betrachtet. Aufgrund eines einzelnen Fotos ist nicht festzustellen, in welcher Ebene der Zelle man sich befindet. Diese Frage kann nur mit Schnittfolgen zufriedenstellend geklärt werden. Es besteht also stets die Möglichkeit, dass eine scheinbar kleine Zelle tatsächlich eine große Zelle ist, die nur im oberen oder unteren Polbereich angeschnitten wurde. Die Vermessung des entstandenen Fotos führt unweigerlich zu einer Falschaussage. Ein weiterer Fehler wäre das „Übersehen“ von Ansammlungen einzelner Zellorganellen, die sich an einer anderen Stelle der Zelle häufen, und so erst in einer tieferen Schnittebene sichtbar wären. Es ist also davon


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auszugehen, dass im Mittel stets zu kleine Zellen betrachtet und ausgewertet wurden, da bei einer kugelförmigen Zelle nur eine in Äquatorialebene angesetzter Schnittscheibe den maximalen Durchmesser der Zelle zeigt und die Schnitte über und unter dieser Ebene zu kleiner erscheinenden Zellanschnitten führen. Da dieses Problem bei der frischen und bei der gefrorenen Probe gleichermaßen in Erscheinung tritt, sind die erhaltenen Ergebnisse miteinander vergleichbar. Zurückhaltung sollte jedoch geübt werden, wenn die ermittelten Werte auf lichtmikroskopische Arbeiten übertragen werden sollen. Die so gemessenen Werte werden größer erscheinende Zellen beschreiben.

Bei kritischer Betrachtung der in dieser Arbeit ultrastrukturell beurteilten Proben frischer und gefrorener Zellen erscheint der Anteil an Zellen, die so stark geschädigt sind, dass sie als avital gelten müssen, außerordentlich gering zu sein. In diesem Zusammenhang ist von einer Selektion der Bilder auszugehen, da bewusst nur Zellen mit einer eindeutigen Zuordnungsmöglichkeit zur vorher definierten Zielzelle für die fotografische Dokumentation und die anschließende Bildanalyse in Betracht kamen.

Quantitative Angaben zum Erhalt der Zellen und die Anzahl der geschädigten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl sind bei elektronenmikroskopischen Studien von vornherein nur sehr eingeschränkt möglich. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen bieten sich eher die Methoden der Kultivierung (Abschn. 2.8.2.), der Trypanblau- Ausschlussmethode (Abschn. 2.8.1.) und der antikörpermarkierten Durchflusszytometrie (Abschn. 2.8.3.) an, die jedoch keine morphologischen Aussagen zulassen.

3.3.6 Gepurgte Zellen

Es konnte gezeigt werden, dass die in der Literatur beschriebene Blutstammzelle [Bekkum, 1990] [Wickenhauser, 1995a] [Thiele, 1995] [Weiss, 1988] weitgehend mit der gefundenen Zelle in den gepurgten Präparaten übereinstimmt (Tab. 9, Abb. 37-42). Sie zeigt sich als durchschnittlich 8,7 µm große Zelle, die sich durch ein relativ organellenarmes Zytoplasma auszeichnet. Es sind stets mehrere


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Mitochondrien und glatt strukturierte runde Vesikel erkennbar, vereinzelt kann das Vorhandensein von glattem und rauem endoplasmatischem Retikulum beobachtet werden. Ein Golgifeld wurde in den gepurgten Zellen erwartungsgemäß nicht beobachtet. Ribosomen sind in großer Anzahl einzeln oder in aneinandergereihter Form, den Polysomen, im gesamten Zytoplasma erkennbar. Der runde bis ovale Kern der Blutstammzellen/hämatopoetische Vorläuferzellen dominiert, er nimmt mehr als die Hälfte der Zellfläche ein. Es konnte nur eine geringe Chromatinkondensation beobachtet werden, das genetische Material lag als schmaler Saum am inneren Rand des Kernes an. Der Formfaktor der Zelle und des Kernes nähert sich nach der Kryokonservierung dem des Kreises. Dieser Befund kann mit einer Flüssigkeitseinlagerung und einem damit verbundenem intrazellulärem Druckanstieg erklärt werden. Das Datenmaterial eignet sich aufgrund der geringen Zahl an untersuchten Zellen und der großen biologischen Variabilität jedoch nur zur tendenziellen Beurteilung. Valide Aussagen sind deshalb an dieser Stelle nicht möglich, es wird bewusst auf eine mathematische Auswertung der wenigen Messwerte verzichtet.

Ein interessantes, bisher noch nicht beschriebenes Phänomen ist die regelmäßige Ansammlung von Mitochondrien in der Kernbucht. Eine Erklärung für diesen Zustand konnte in der Literatur nicht gefunden werden. Wenn man bedenkt, dass in der elektronenmikroskopischen Präparation eine Zelle in viele dünne, nur 20-100 nm messende Scheiben zerschnitten wird, so wird deutlich, warum bei den meist lichtmikroskopischen Studien zu Blutstammzellen dieses Merkmal nicht ins Auge fiel. Die Dicke eines routinemäßig hergestellten Paraffin-Schnittes beträgt ungefähr 10 µm. Dabei wird die Zelle als Ganzes betrachtet und bestimmte Details, wie zum Beispiel die exakte räumliche Anordnung der Mitochondrien zum Zellkern, sind aufgrund von Überlagerungseffekten und der geringeren Tiefenschärfe lichtmikroskopisch nicht sicher einer bestimmte Zellebene zuzuordnen.


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3.3.7 Ungepurgte Zellen

Im Vergleich zu den gepurgten Zellen konnte eine weitaus größere Zellzahl von ungepurgten Proben vor und nach der Kryoprotektion bewertet werden (Tab. 6).

Die von den gepurgten Zellen gewonnenen Ergebnisse (Abschn. 3.2.9. und Tab. 9) zeigen, dass es trotz gleicher Einschlusskriterien bei den ungepurgten Proben zu einer verstärkten Berücksichtigung weiter differenzierter Zellen kam. Die größeren Durchmesser und Flächen des Kernes und der Zelle sowie die erhöhte Anzahl von Vesikeln im Inneren der Zelle sprechen für eine schon weiter fortgeschrittene Differenzierung der Blutstammzellen/ hämatopoetischen Vorläuferzellen in Richtung voll ausgebildeter roter oder weißer Blutzellen. Die Subjektivität in der fotografischen Auswahl der Zellen wird während der mikroskopischen Betrachtung der Proben nicht auszuschalten sein. Eine höhere Wahrscheinlichkeit, Blutstammzellen zu selektionieren, ist bei der ausschließlichen Verwendung von gepurgten Präparaten zu erwarten, ein Weg der bei einer höheren Anzahl von Patienten und bei geringster benötigter Probenmenge beschritten werden kann.

Es konnte gezeigt werden, dass die ungepurgten Zellen während des Einfrierens und Auftauens unabhängig vom untersuchten Einfriermedium mit keiner statistisch signifikanten Größenänderung reagierten. Eine Ausnahme bildete dabei der Kern der mit 10%igem DMSO eingefrorenen Zellen, welcher geringfügig runder erscheint. Dieser signifikante Effekt beruht auf einem Druckanstieg im Inneren des Zellkernes.

Einige Zellen wurden in Analogie zum Kern runder, der Durchmesser erhöhte sich etwas. Ein anderer Teil der Zellen reagierte mit einer Abschnürung von Zytoplasma, so dass es zu unregelmäßig strukturierten Zellkonfigurationen kam, bei denen sich das Verhältnis der Kern- zur Zellfläche zugunsten der Kernfläche verschob.

Diese Beobachtungen konnten durch die halbautomatische Bildanalyse nicht bestätigt werden, es kam zu einer Nivellierung der Ergebnisse durch diese gegenläufigen Effekte.


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Unter der Belastung des Einfrierens und Auftauens kommt es zu einer Reduktion der Vesikel und einer randständigen Konzentration der Organelle. Dieser Effekt ist bei den 10%igen DMSO-Proben im Vergleich zu den frischen Proben signifikant. Das Untersuchungsergebnis ist als eine unmittelbare Auswirkung der Kryokonservierung, der Tieftemperaturlagerung und des Auftauens zu interpretieren. Gleichartige Befunde wurden bereits an Thrombozyten in der Literatur dokumentiert [Spector, 1979] [Böck, 1991] [Böck, 1996].

Eine weitere erkennbare Veränderung bestand in einer Kondensation der Mitochondrien. Im elektronenmikroskopischen Bild zeigten sich diese gegenüber äußeren Einflüssen empfindlichen Organellen nach dem Einfrieren kleiner und dunkler als im frischen Zustand. Es kam häufig zu einem Zerreißen der inneren Struktur des einzelnen Mitochondrium. Die Membranen der Cristae lagerten sich im äußeren Bereich der Organelle an und es entstand im Inneren ein Raum, der auf Flüssigkeitseinlagerungen schließen lässt. Dieses Phänomen trat häufiger bei gefrorenen Zellen auf, es waren jedoch auch in stärker geschädigten Zellen stets normal erscheinende Mitochondrien erkennbar. Das spätere Überleben der Zelle lässt sich aufgrund ausschließlicher optischer Beobachtung nicht sicher vorhersagen. Aus theoretischen Überlegungen könnte jedoch der Anteil an nicht oder nur gering geschädigten Mitochondrien die Zellatmung durch Leistungssteigerung und verstärkte Mitochondrienneubildung aufrechterhalten. Das Absterben und die Neubildung von Zellorganellen [David, 1978] ist ein fester Bestandteil des Lebens, so dass die Bewertung der Zellschädigung nicht losgelöst von diesen wiederkehrenden Prozessen betrachtet werden kann.

Neben den Mitochondrien konnten in den Strukturen des glatten und des rauen endoplasmatischen Retikulum Flüssigkeitseinlagerungen beobachtet werden. In mehreren Fällen kam es zu einer zisternenartigen Aufweitung der Membranen. Diese Zisternen waren mit einem hellen, sehr homogenen, fein granulierten Material ausgefüllt. In den Zellen der frischen Proben waren diese erweiterten Bereiche nicht zu beobachten, die damit als Hinweis auf einen Prozess in der Zelle während des Einfrierens und Auftauens gedeutet werden können.


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Als dritte, durch die Tieftemperatur veränderte Membranstruktur, konnte die Doppelmembran des Kernes erkannt werden. Zwischen den einzelnen Membranen bildeten sich in einigen Fälle eindrucksvolle intrazelluläre Flüssigkeitseinlagerungen (Abb. 20, 21, 43), die mit dem bereits beschriebenen homogenen Material ausgefüllt waren. Die Masse der Veränderungen im Bereich der Kernmembranen wies jedoch keine derart imponierenden Ausmaße auf.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass speziell die Zwischenräume von Doppelmembranen einen Raum darstellen, der für Wasseransammlungen sensibel ist. Die Flüssigkeitseinlagerungen in der Kernmembran, im glatten und rauen endoplasmatischen Retikulum und im Bereich der Mitochondrien können als ein und dieselbe Art der Schädigung an verschiedenen Organellen interpretiert werden. Die Anzahl der intrazellulären Flüssigkeitseinlagerungen in den genannten Organellen hat sich als der entscheidende Parameter in der ultrastrukturellen Bewertung der Kryoprotektion herausgestellt. Es konnten signifikante Unterschiede in der Anzahl der Flüssigkeitseinlagerungen zwischen frischen Zellen und den variabel kryokonservierten Proben ermittelt werden. Keine Signifikanz war beim Vergleich der 10%igen DMSO-Lösung und der Mischung von 5 % DMSO, 6 % HAES und 4 % HA erkennbar.

Welche Ursache ist für die intrazellulären Flüssigkeitseinlagerungen und die anderen beobachteten Strukturveränderungen zu diskutieren? War es die hohe Osmolarität des Kryoprotektors DMSO, die beim Mischen der Lösungen frei werdende Wärme oder sind die grundlegenden Prozesse beim Einfrieren von biologischen Materialien dafür verantwortlich zu machen?

Aufgrund theoretischer Überlegungen und Literaturangaben dürften alle drei Aspekte eine Rolle spielen. Die Osmolarität einer 10%igen DMSO-Lösung liegt bei 1280 mmol/l, einem Wert, der das Vierfache der physiologischen Verhältnisse darstellt. In der klinischen Praxis werden periphere Infusionen bis 800 mmol/l appliziert. Höhere Osmolaritäten sollten nur zentralvenös über entsprechende Katheter verabreicht


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werden, um den Verdünnungseffekt des schnell fließenden Blutes auszunutzen, hämolytische Erscheinungen zu vermeiden und die Endothelzellen der Gefäße nicht zu schädigen. Noch höhere Konzentration von gelösten Teilchen im Blut lassen also osmotische Schäden erwarten. Da Dimethylsulfoxid zu den rasch penetrierenden Substanzen zählt und sich innerhalb kurzer Zeit intra- und extrazellulär verteilt, wird dieser Effekt nur zu Beginn des Zusatzes des Kryoprotektivum von Interesse sein. Die mögliche osmotische Schädigung wird durch pharmakologische Wirkungen ergänzt.

Durch DMSO-Zusatz zu in-vitro-Kulturen von Blutstammzellen oder hämatogenen Progenitoren kommt es zu einer Reduktion der Überlebensrate, die Proliferationsfähigkeit ist bereits bei geringen Konzentrationen eingeschränkt [Douay, 1982] [Rowley, 1993]. Die Phagozytoserate von Granulozyten, ein wesentlicher Bestandteil der zellulären Immunantwort des Menschen, wird durch den Kryoprotektor unter in-vitro-Bedingungen reduziert [Cavins, 1965] [Boonlayangoor, 1980]. Parenteral verabreicht kann es Schwindel und Erbrechen, Hautrötungen, abdominale Krämpfe und asthmatische Beschwerden verursachen [Davis, 1990]. Hypotone Reaktionen und bradykarde Zustände [Zambelli, 1998] vervollständigen das Nebenwirkungsspektrum von Dimethylsulfoxid.

Somit scheint es angebracht zu sein, die Konzentration der pharmakologisch nicht indifferenten Substanz auf ein notwendiges Mindestmaß zu beschränken. Die Entwicklung von anderen kryoprotektiven Gemischen stellt hier einen Weg dar [Makino, 1991] [Donaldson, 1996] [Jetter, 1998] [Eroglu, 2000], der in Zukunft weiter vorangetrieben werden sollte. Wünschenswert wäre auch die Definition eines Standards zum Einfrieren von Blutstammzellen, der neben dem optimalen kryoprotektiven Zusatz die Art des Einfrierens (Abschn. 2.4.) und die weitere Lagerung (Abschn. 2.5.) beschreibt.

Der wichtigste Grund der Frierschädigung von Zellen ist jedoch in der physikalischen Belastung der Zellen während des Frierens und Auftauens zu sehen. Die komplexen Prozesse von Diffusion, extra- und intrazellulärer Eisbildung, Elektrolytverschiebungen, Permeabilitätsveränderungen und Versprödungen der Zellmembranen sowie die freiwerdende Kristallisationswärme gilt es zu beachten.


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Zusammenfassend kann den Proben ein guter ultrastruktureller Erhaltungszustand bescheinigt werden. Die beobachteten Schäden an den Zellen sind hauptsächlich auf Verschiebungen von Flüssigkeiten in der Zelle und der Umgebung zu begründen. Intrazelluläre Druckerhöhungen bewirken einen Anstieg des Kern- und Zelldurchmessers, Zelle und Kern werden runder. Kommt es zu einer übermäßigen Druckbelastung, beginnt die Zelle Teile des Zytoplasmas zu verlieren. Dieser Vorgang kann als eine Vorstufe des Platzens der Zelle angesehen werden. Die Ruptur der Kernmembran wird deutlich seltener beobachtet, ein Effekt, der mit der erhöhten Stabilität der Doppelmembran des Kernes erklärt werden kann.

Bislang liegen in der Literatur keine Untersuchungen zur Qualität von Transplantaten peripherer Blutstammzellen vor, die eine Beurteilung ultrastruktureller Prozesse zum Gegenstand haben. Die eigenen Untersuchungen zeigen eine Reihe beschriebener qualitativer und quantitativer Veränderungen in der Zelle und ihrer Organellen. Der Grad der ultrastrukturell erfassbaren Schädigungen ist als gering einzuschätzen. Nachteilig erscheinen beim heutigen Einsatz des DMSO als Kryoprotektor dessen pharmakologische Nebenwirkungen. Eine Reduktion des nicht unbedenklichen DMSO-Zusatzes sollte angestrebt werden. Der Einsatz der in der Literatur (Tab. 1) beschriebenen und in dieser Arbeit untersuchten Mischung von 5 % DMSO, 6 % HAES und 4 % HA ist ein Schritt in diese Richtung. Die Literaturangaben (Tab. 1) und die Ergebnisse der ultrastrukturellen Untersuchungen (Abschn. 3.2.7.-3.2.8.) lassen keinen Zweifel an der Gleichwertigkeit der beiden Friermedien aufkommen.

Neben der Gegenüberstellung der ultrastrukturellen Merkmale gelang der Vergleich der Vitalitätsbestimmungen der unterschiedlich eingefrorenen Proben. Es konnten die Überlebensraten der Zellen mittels der Typanblau-Ausschlussmethode und die Zahl der gewachsenen Kolonien nach Kultivierung ermittelt werden. Es zeigte sich in Korrelation zu den ultrastrukturellen Befunden eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse des Trypanblau-Ausschlusstestes (Abschn. 2.8.1.) beider Einfriermedien. Die Zahl der gebildeten Kolonien an roten und weißen Zellen zeigte einen Vorteil in der Vitalität der mit Kryo II eingefrorenen Blutproben gegenüber den mit 10%iger DMSO Lösung kryokonservierter Stammzelltransplantate. Die ermittelten Werte


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wiesen keine signifikanten Unterschiede auf. Dieses Ergebnis sollte in weiterreichenden Untersuchungen an einer größeren Probenanzahl überprüft werden.

Aus ultrastruktureller Sicht kann den hergestellten Transplantaten eine gute Qualität bescheinigt werden. Diese Aussage entspricht den durch etablierte Qualitätsuntersuchungen erhaltenen Daten (Abschn. 3.1.5. und Abschn. 3.2.8.). Die zur Transplantation gelangten peripheren Blutstammzellpräparate bewirkten bei den Patienten eine vollständige und zeitgerechte Rekonstitution der Hämatopoese.


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3.3.8 Ausblick

Zukünftig sollte es gelingen, die Methodik der Separation, der Konservierung und der begleitenden Qualitätssicherung von Blutstammzellen weiter zu verbessern. Damit wäre es möglich, die Patientenbelastungen zu verringern, Nebenwirkungen zu reduzieren und eine hohe Sicherheit in der Transplantation der lebensnotwendigen Blutstammzellen nach vorangegangener Hochdosischemotherapie zu ermöglichen. Eine Verbesserung der Kryoprotektion kann ein Schritt in diese Richtung sein. Die elektronenmikroskopische Bewertung der Qualität des Stammzellpräparates ist als ergänzendes Verfahren auf dem Weg dorthin zu sehen.

Das Ausmaß der zellulären Veränderungen kann als ein Kriterium für die Qualität einer Kryokonservierung von Stammzellpräparaten angesehen werden. Wenn es gelingt, das Schädigungsmuster in ausreichendem Umfang zu dokumentieren, Proben mit einer hohen Reinheit der untersuchten Zelle wären hier eine Voraussetzung, könnte ein morphologischer Bewertungsmaßstab für den Erhaltungszustand der Blutstammzellen erstellt werden. Eine Scoureermittlung der elektronenmikroskopisch erkennbaren Schäden könnte in diesem Zusammenhang als ergänzende Untersuchung zu den bereits etablierten Verfahren zur Vitalitätstestung dienen. Gleichzeitig kann dieser als zusätzliches Bewertungskriterium beim Vergleich unterschiedlicher kryoprotektiver Mischungen zum Einsatz kommen.

Die Wertung und Wichtung der erkannten Schädigungsmuster eröffnet neben der Beurteilung von Stammzellpräparaten auch weiteren Gebieten der Pharmakologie, Pharmazie und Medizin die Tür zur Testung von substanzspezifischen Schädigungs- oder Protektionsmustern. Voraussetzung für valide Aussagen ist jedoch eine hohe Homogenität des Untersuchungsmaterials, die rasche, möglichst automatisierte Auswertung der Zellen und natürlich die Kenntnis von zu erwartenden Effekten der untersuchten Behandlung. In diesem Zusammenhang sollte bei weiterführenden Untersuchungen die Immuno-Gold-Methode eingesetzt werden.


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Mon Apr 28 16:16:11 2003