Leuthold, Jan: Untersuchungen zur Qualität von peripheren Blutstammzellpräparaten - ultrastrukturelle Studien zur Beurteilung der Kryoprotektion

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Kapitel 4. Zusammenfassung

Die vorrangige Zielstellung dieser Arbeit war die Erkennung und Dokumentation von Zellschädigungen an Blutstammzellen und Vorläuferzellen der roten und weißen Reihe nach einer Tieftemperaturlagerung. Dazu sollte eine Methode zur elektronenmikroskopischen Präparation von kleinen Blutmengen erarbeitet werden. Ein weiterer Teilaspekt der Arbeit bestand in der sicheren Erkennung der Blutstammzelle und der aus ihr entstehenden hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Die elektronenmikroskopische Präparation erfolgte nach einer modifizierten Fixierungs- und Entwässerungsmethode (Abschn. 3.1.6.). In Abwandlung der etablierten Verfahren konnte durch eine Einbettung der Blutzellen in eine isotone Gelatinemasse die Aufarbeitung von kleinen Probenmengen gewährleistet werden. Damit war die Möglichkeit geschaffen, Probenvolumina von ca. 0,5 ml in die Untersuchung einzubeziehen.

Die Auswertung der verfügbaren elektronenmikroskopischen Literatur ergab keine eindeutigen Anhaltspunkte für eine sichere morphologische Identifizierung der gesuchten peripheren Blutstammzelle. Der Vergleich der Literaturangaben (Abschn. 2.2.) und der Ergebnisse einer Voruntersuchung an immunologisch hoch angereicherten Blutstammzellkonzentraten (Abschn. 3.2.1.) führte zu Einschlusskriterien, die es in der folgenden Bearbeitung der Blutproben gestatteten, die Blutstammzellen/hämatopoetischen Vorläuferzellen sicher zu identifizieren (Abschn. 3.2.2.)

Im weiteren Verlauf konnten 29 Paare peripherer Blutstammzelltransplantate ultrastrukturell ausgewertet werden. Es erfolgte in 21 Fällen eine Gegenüberstellung von je einer uneingefrorenen Probe und der entsprechenden, mit 10%iger DMSO-Lösung eingefrorenen und wieder aufgetauten Vergleichsprobe ein und desselben Patienten. Zusätzlich gelang es von acht Patienten so viel Blut zu gewinnen, dass neben der frischen Probe zwei unterschiedlich eingefrorenen Aliquote in die Untersuchungen einbezogen werden konnte. In Anlehnung an die Angaben in der verfügbaren Literatur (Tab. 1) wurde neben der bereits beschriebenen 10%igen


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DMSO-Lösung eine Mischung von 5 % DMSO, 6 % HAES 200/0,5 und 4 % HA genutzt.

Die visuelle Auswertung der elektronenmikroskopisch untersuchten peripheren Blutstammzellen und hämatopoetischer Vorläuferzellen ergab keine gravierenden Zellschädigungen (Abschn. 3.2.4.-3.2.7.) durch die Belastung des Einfrierens und Auftauens, unabhängig vom eingesetzten Kryoprotektivum.

Die Ursachen für diese Schädigungsmuster können sowohl in den zugesetzten Kryoprotektiva als auch in der Kryoprotektion, der Tieftemperaturlagerung und dem Auftauprozess liegen. Eine klare Trennung der Faktoren ist mit der hier angegebenen Untersuchungsmethode nicht möglich.

Zur Quantifizierung der subjektiv gewonnenen Ergebnisse erfolgte eine halbautomatische Bildanalyse der elektronenmikroskopischen Fotografien der untersuchten Zellen. Die Messwerte wiesen eine bei biologischen Proben zu erwartende große Streuung auf (Tab. 6, 9). Statistisch signifikante Unterschiede konnten bei den Parametern "Formfaktor Kern" und "Vesikelanzahl" zwischen den frischen Proben und den mit 10%igem DMSO gefrorenen und wieder aufgetauten Zellen ermittelt werden. Signifikanzen ließen sich ebenfalls im Hinblick auf die entstandenen Flüssigkeitseinlagerungen in membranumhüllten Zellorganellen bei beiden kryoprotektiven Mischungen im Vergleich zu den nicht eingefrorenen Proben


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errechnen. Diese Flüssigkeitseinlagerungen in Mitochondrien, in Doppelmembranen der Zellkerne und in den Systemen des endoplasmatischen Retikulum stellen die wichtigste ultrastrukturelle Schädigung dar. Die beiden untersuchten Friermedien werden hinsichtlich ihres Vermögens, Zellen vor den ultrastrukturell erkennbaren Schäden einer Tieftemperaturlagerung zu schützen, als gleichwertig eingestuft.

Unter den bewerteten Probenpaaren befanden sich zwei gepurgte periphere Blutstammzelltransplantate. Die morphologische Auswertung dieser hochangereicherten, CD-34-positiven peripheren Blutstammzellproben führte im Vergleich mit den ungepurgten Zellen zu abweichenden Ergebnissen (Tab. 9). Es konnte deutlicher nachgewiesen werden, dass es bei gepurgten Zellen nach einer Tieftemperaturlagerung zu einer stärkeren Annäherung der Kernform an die eines Kreises kommt. Der Beweis eines signifikanten Unterschiedes zwischen den gepurgten und den ungepurgten Proben war aufgrund der geringen Anzahl an untersuchten gepurgten Zellen nicht möglich.

Von dem Blut der acht Patienten, deren Proben mit zwei verschiedenen Methoden eingefroren wurden, konnten je zwei vergleichende Vitabilitätstestungen durchgeführt werden. Die ermittelten Werte des Trypanblau-Ausschlusstestes und die Anzahl der gebildeten roten und weißen Kolonien nach Kultivierung ließen in Analogie zu den ultrastrukturellen Befunden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Friermedien erkennen.

Die in dieser Arbeit untersuchten Mischungen (Abschn. 3.1.4.) führen beide zu einer zuverlässigen Protektion der Transplantatzellen vor den Auswirkungen einer Tieftemperaturlagerung. Die dokumentierten ultrastrukturellen Zellveränderungen sind Folge komplexer Wechselwirkungen von Einfrieren, Auftauen und den Bestandteilen der kryoprotektiven Lösungen auf die zu lagernden Zellen. Der potentiell zelltoxische Bestandteil DMSO muss gegenwärtig in Ermangelung einer weniger toxischen Kryoprotektion akzeptiert werden. Die zukunftsorientierte Reduktion des DMSO- Anteiles in Friermedien kann durch die entwickelte Methode der ultrastrukturellen Untersuchungen ergänzend zu den etablierten Verfahren bewertet werden. Die erarbeitete Methode gestattet es, relevante morphologische Details zu erfassen und in die Beurteilung der pharmazeutischen Qualität von Transplantaten peripherer menschlicher Blutstammzellen einzubeziehen.


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Mon Apr 28 16:16:11 2003