Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen: Untersuchungen zu Einflüssen auf die Reproduktionsbiologie von Xenopus laevis

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Gregor Levy

geboren am 22. April 1973 in Rastatt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Werner Kloas
2. Prof. Dr. Andreas Elepfandt
3. Prof. Dr. Jörg Oehlmann

Tag der mündlichen Prüfung:14.01.2005

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit die Reproduktionsbiologie von aquatischen Lebewesen durch die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen (endocrine disruptors, ED) beeinflusst wird. Mit dem Amphib Xenopus laevis steht ein etabliertes Studienmodell zur Untersuchung der Wirkungen von ED auf die Reproduktionsbiologie zur Verfügung, das für die vorliegenden Studien modifiziert und erweitert sowie mit gewässeranalytischen Methoden verknüpft wurde.

Die Gefährdung wasserlebender Tiere durch Gewässerbelastung mit ED kann erfasst werden, indem die Wirkung einer ausgewählten Einzelsubstanz auf die Reproduktionsbiologie untersucht wird. Anschließend erfolgt ein Nachweis der Substanz in Umweltproben. Durch Expositionsversuche, histologische Untersuchungen und Expressionsnachweis eines molekularen östrogenen Biomarkers konnte festgestellt werden, dass Bisphenol A (BPA) in Kaulquappen von Xenopus laevis verweiblichend wirkt und seine Effekte über eine Bindung an den Östrogenrezeptor vermittelt. Chemische Analysen während der Expositionsversuche zeigten, dass BPA von den Kaulquappen aufgenommen wird und dass eine geringe Abbaubarkeit der Substanz während eines Zeitraums von 48 Stunden besteht. Die Analyse von BPA in Wasserproben, die aus dem Fluss Alb oder aus Kläranlagenausläufen stammten, zeigte, dass BPA im Gewässer in relevanten Konzentrationen vorhanden ist und hauptsächlich durch eine Kläranlage in den Fluss eingeleitet wird.

In einem Gewässer liegt allerdings ein Gemisch aus unterschiedlichen ED mit verschiedenen Wirkmechanismen vor. Die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen kann weiterhin untersucht werden, indem Gewässerextrakte fraktioniert und in in vitro-Screeningmethoden getestet werden. Als Screeningmethoden dienten Rezeptorbindungsstudien an Östrogen- und Androgenrezeptoren sowie die Behandlung von Leberzellkulturen mit den Gewässerextrakten aus der Alb, um eine Regulation der Expression bestimmter Biomarkergene durch potenzielle ED nachzuweisen. Dazu wurde als neuer (anti)androgener und (anti)östrogener Biomarker das Retinol-binding Protein eingeführt. Die Untersuchung der Gewässerextrakte mit diesen Methoden zeigte, dass die Alb eine Belastung mit endokrin wirksamen Substanzen aufweist und dass hauptsächlich östrogen wirksame Substanzen vorkommen. Die Proben aus den Kläranlagenausläufen weisen die höchste endokrine Aktivität auf.

Eigene Schlagworte: Gewässerbelastung, endocrine disruptors, Xenopus laevis, Bisphenol A, Retinol-binding Protein

Abstract

The present study examined the influence of endocrine active compounds (endocrine disruptors, ED), which are present in surface waters, on reproductive biology of aquatic organisms. The amphibian Xenopus laevis is a well-established model organism for the study of effects of ED on reproduction. It has been modified and broadened for the purpose of this study, and it was combined with chemical methods for water analyses.

It is possible to assess water pollution with ED by detecting effects on reproductive biology of one particular substance, and then by looking for this substance in environmental water samples. We showed the feminizing potency of Bisphenol A (BPA) in conducting exposure experiments with tadpoles, in examining histological samples of gonads and in detecting the induction of the expression of a molecular estrogenic biomarker. BPA was recognized to mediate its effects via binding to the estrogen receptor. Moreover, analysis of BPA during exposure experiments revealed that BPA is taken up by tadpoles and is not readily degradable during a time period of 48 hours. Chemical analyses of environmental water samples from the river Alb or samples from sewage treatment works (STW) showed that BPA is released into the environment by STW effluents.

In surface waters, there are different kinds of ED with different modes of action. Thus, it is another possibility to assess water pollution with ED by fractionating environmental water samples and by testing these fractions in rapid in vitro-screening methods. In the present work, receptor binding assays were carried out, both examining the binding to estrogen and androgen receptors. Furthermore, Xenopus laevis hepatocyte cultures were treated with fractions of environmental samples and biomarker expression was detected. A new biomarker to assess (anti)androgenic or (anti)estrogenic modes of action, respectively, was established. This new biomarker was the Retinol-binding Protein. The results obtained by these methods revealed that the river Alb is mainly polluted with estrogenic ED. Samples from STW effluents possessed the highest endocrine activity.

Keywords: water pollution, endocrine disruptors, Xenopus laevis, Bisphenol A, Retinol-binding Protein

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1.  Endocrine disruptors (ED)
  • 1.2.  Störungen des endokrinen Systems durch ED
  • 1.3.  Endokrin wirksame Substanzen in der Umwelt
  • 1.4.  Amphibien als Studienmodelle
  • 1.5.  Ziele der Arbeit
• 2.  Material & Methoden
  • 2.1.  Versuchstiere
    • 2.1.1.  Herkunft und Haltung der Versuchstiere
    • 2.1.2.  Zucht der Versuchstiere
  • 2.2.  Charakterisierung der östrogenen Wirkung von Bisphenol A in vivo
    • 2.2.1.  Exposition von Kaulquappen während der Larvalentwicklung
    • 2.2.2.  Geschlechtsbestimmung der juvenilen Frösche
    • 2.2.3.  Histologische Untersuchung der Gonaden
    • 2.2.4.  Kurzzeitige Kaulquappenexposition mit BPA und Bestimmung der ER-mRNA-Expression
      • 1. Kurzzeitige Exposition der Kaulquappen mit BPA
      • 2.  RNA-Isolierung
      • 3. Reverse Transkription (RT)
      • 4.  Polymerase Chain Reaction (PCR)
      • 5.  Darstellung der PCR-Produkte
    • 2.2.5.  Chemische Analyse von BPA in den Expositionsversuchen
  • 2.3.  Gewässeruntersuchungen
    • 2.3.1.  Charakterisierung des Untersuchungsflusses
    • 2.3.2.  Entnahme der Gewässerproben
    • 2.3.3.  Extraktion der Gewässerproben
    • 2.3.4.  Fraktionierung der Gewässerextrakte
    • 2.3.5.  Analyse der Gewässerproben
  • 2.4.  Bioassays zur Untersuchung der Gewässerextrakte
    • 2.4.1.  Rezeptorbindungsstudien
    • 2.4.2.  Induktion der Expression von Biomarkergenen durch Behandlung von primären Hepatocytenkulturen
      • 1.  Herstellung der Zellkulturen
      • 2.  Behandlung der Zellkulturen
      • 3.  Aufarbeitung der behandelten Hepatocyten
  • 2.5.  Statistik
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1.  In vivo-Exposition von Kaulquappen
    • 3.1.1.  Wirkungen von BPA auf die Sexualdifferenzierung von Xenopus laevis
    • 3.1.2.  Wirkungen von BPA auf die Gonadenentwicklung
    • 3.1.3.  Nachweis der ER-mRNA-Expression in Kaulquappen nach kurzzeitiger Behandlung mit BPA
    • 3.1.4.  Nachweis von BPA in den Expositionsversuchen
    • 3.1.5.  Nachweis von BPA in Umweltproben
  • 3.2.  endokrin wirksame Substanzen in Gewässerproben
    • 3.2.1.  Rezeptorbindungsstudien mit Gewässerextrakten
    • 3.2.2.  Behandlung von Leberzellkulturen mit Gewässerextrakten
    • 3.2.3.  Das Retinol-binding Protein als Biomarker
    • 3.2.4.  Biomarkerexpression in Leberzellkulturen nach Behandlung mit Gewässerproben
  • 3.3.  Nachweis ausgewählter endokrin wirksamer Stoffe in der Alb
• 4.  Diskussion
  • 4.1.  Umweltbelastung mit ED – Einzelstoffansatz
    • 4.1.1.  In vivo-Labormethoden zur Untersuchung der Wirkungen von ED
    • 4.1.2.  Amphibien als Modellorganismen zur Untersuchung von ED
    • 4.1.3.  Einfluss von BPA auf die Sexualentwicklung von Xenopus laevis
    • 4.1.4.  Chemische Analyse von BPA in den Ex-positionsversuchen und in Gewässerproben
  • 4.2.  Umweltbelastung mit ED – Gemischansatz
    • 4.2.1.  ED in der Umwelt als komplexes Gemisch von Stoffen mit verschiedenen Wirkmechanismen
    • 4.2.2.  Untersuchungen der Gewässerproben mit ausgewählten Bioassays
      • 1.  Rezeptorbindungsstudien mit Albextrakten
      • 2.  Etablierung von RBP-mRNA als Biomarker
      • 3.  Biomarkerexpression in Leberzellkulturen nach Behandlung mit Gewässerextrakten der Alb
  • 4.3.  Bewertung der ED-Belastung der Alb
  • 4.4.  Vergleich der Untersuchungen von Einzelstoff- und Gemischansatz
  • 4.5.  Zusammenfassung und Ausblick
• Literatur
• Danksagung
• Anhang
  • Liste der Veröffentlichungen
    • Begutachtete Veröffentlichungen:
    • Weitere Veröffentlichungen:
    • Abstracts / Poster:
• Selbstständigkeitserklärung

Bilder

• Abb. 1-1: Schematische Darstellung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse und der möglichen Angriffspunkte für ED. GnRH: Gonadotropin-releasing Hormon, LH: Luteinisierendes Hormon, FSH: Follikel-stimulierendes Hormon, SHBG: Sexualhormon-bindendes Globulin, E2: 17β-Östradiol, T: Testosteron, 1-6: mögliche Angriffspunkte der ED, Erläuterungen im Text.
• Abb. 1-2: Schematische Darstellung der hormoninduzierten genomischen Zellantwort. Die Zahlen 1-3 dokumentieren die möglichen Nachweisebenen bei der Untersuchung potenzieller ED. 1. Nachweis der Bindung von ED an Hormonrezeptoren. 2. Nachweis der durch ED induzierten oder gehemmten mRNA-Synthese. 3. Nachweis der veränderten Merkmalsausprägung durch ED. DNA: Desoxyribonukleinsäure, HRE: hormonresponsives Element, mRNA: messenger Ribonukleinsäure.
• Abb. 2-1: Strukturformeln der in den Expositionsversuchen eingesetzten Substanzen E2 (links) und BPA (rechts).
• Abb. 2-2: Geographische Lage des Modellgewässers (links) und schematische Darstellung der Probennahmestellen im Flussverlauf (rechts). KA: Kläranlagenauslauf.
• Abb. 2-3: Strukturformeln der in die Zellkulturen eingesetzten Testsubstanzen. EE: 17α-Ethinylöstradiol, TAM: Tamoxifen, T: Testosteron, DHT: Dihydrotestosteron, MT: Methyltestosteron, VC: Vinclozolin.
• Abb. 3-1: Prozentuale Verteilung der Geschlechter in den unterschiedlichen Kontroll- und Behandlungsgruppen (17β-Östradiol (E2) und Bisphenol A (BPA) jeweils 10^-7 M und 10^-8 M). Die schwarze Linie unterteilt die Graphik in die Anteile der Männchen und Weibchen der Kontrollgruppe. Die Sterne bezeichnen statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle (***: p < 0,001; *: p < 0,05). Die Stichprobenanzahl (n) ist angezeigt.
• Abb. 3-2: Prozentuale Verteilung der Geschlechter in den unterschiedlichen Kontroll- und Behandlungsgruppen (17β-Östradiol (E2) 10^-7 M und Bisphenol A (BPA) 10^-6 M, 10^-7 M und 10^-8 M). Die schwarze Linie unterteilt die Graphik in die Anteile der Männchen und Weibchen der Kontrollgruppe. Die Sterne bezeichnen statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle (***: p < 0,001; *: p < 0,05). Die Stichprobenanzahl (n) ist angezeigt.
• Abb. 3-3: Mittleres Körpergewicht der juvenilen Frösche unmittelbar nach Abschluss der Metamorphose. Die unterschiedliche Anzahl der Stichproben (n) erklärt sich aus der unterschiedlich hohen Sterbe- und Entwicklungsrate in den einzelnen Becken. Das Körpergewicht wurde als Lebendgewicht gemessen, die Standardabweichungen sind angezeigt.
• Abb. 3-4: Morphologie von Gonaden der juvenilen Frösche. Bild A zeigt ein typisches Beispiel eines Ovarien-Nieren-Kompexes, Bild B stellt einen typischen Hoden-Nieren-Komplex dar. Die Fixierung erfolgte mit Bouin-Lösung, die Vergrößerung ist 60 x.
• Abb. 3-5: Drei histologische Präparate unterschiedlicher Gonaden. A: Schnitt durch ein Ovar. Die unterschiedlichen Reifestadien der Follikel sind zu erkennen. B: Schnitt durch eine Zwittergonade. Im Hodengewebe liegen deutlich sichtbar zwei Oocyten. C: Schnitt durch einen Hoden. Tubuli seminferi sowie Muskel- und Leydigsche Zellen sind erkennbar. Die Färbung erfolgte mit Mayers Hämatoxylin-Eosin, die Vergrößerung ist 200 x.
• Abb. 3-6: ER-mRNA-Expression in Kaulquappen nach kurzzeitiger Behandlung (14 Tage) mit BPA und E2 (jeweils 10^-7 M). Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05), Standardabweichungen sind angezeigt.
• Abb. 3-7: Ausgewählter BPA-Peak als Ergebnis einer BPA-Analyse mittels HPLC (A) und eine Kalibrierkurve für die BPA-Quantifizierung (B). Kalibrierungsfunktion und Korrelationskoeffizient (R²) sind angegeben. Die Angabe der BPA-Konzentration ist als mg / L des Lösungsmittels zu verstehen.
• Abb. 3-8: Analyse der BPA-Konzentration zu Beginn der Behandlung und nach 48 h. Zum Vergleich ist die Nominalkonzentration dargestellt. BPA 1 = 10^‑8 M (= 2,23 µg / L) , BPA 2 = 10^-7 M (= 22,3 µg / L), BPA 3 = 10^-6 M (= 223 µg / L). Stichprobenanzahl (n) und Standardabweichungen sind angegeben.
• Abb. 3-9: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10^-6 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.
• Abb. 3-10: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10^-7 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.
• Abb. 3-11: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10^-8 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.
• Abb. 3-12: Massenspektrum von Bisphenol A (A) und Kalibrierkurve für die BPA-Quantifizierung mittels GC / MS (B). Kalibrierungsfunktion und Korrelationskoeffizient (R²) sind angegeben. Die Angabe der BPA-Konzentration ist als mg / L des Lösungsmittels zu verstehen.
• Abb. 3-13: BPA-Nachweis und -Quantifizierung im Flussverlauf der Alb. Die einzelnen Probennahmestellen sind in Kapitel 2.3.1 beschrieben. Die Werte stammen aus einer Einzelbestimmung eines Probennahmezeitraumes (Juli 2001). Die Linie stellt den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar.
• Abb. 3-14: Beispielkurven der kompetitiven Verdrängung von [³H]-E2 bzw. [³H]-T vom ER durch E2 bzw. T (A) sowie Verdrängungskurven eines Alb-Extraktes (B, Mittelwerte, n = 2). Die entsprechenden Geraden nach logit / log -Umformung zeigen die Teilabbildungen C und D. Durch diese Umformung lässt sich das Bindungspotenzial der Alb- und Kläranlagenauslaufextrakte in E2- bzw. T-Äquivalenten berechnen.
• Abb. 3-15: Summenkurven der E2- bzw. T-Äquivalente im Albverlauf (als gleitender Durchschnitt). Die Werte setzen sich aus den Einzelwerten der drei Fraktionen jeder Probennahmenstelle zusammen.
• Abb. 3-16: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die jeweils mit 4 Konzentrationen der Östrogene E2 und EE behandelt wurden (10^-9 bis 10^-6 M). Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne weisen auf signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle hin (p < 0,05).
• Abb. 3-17: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit jeweils 4 Konzentrationen (10^-9  bis 10^-6 M) dreier verschiedener Androgene (T, DHT, MT) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben.
• Abb. 3-18: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit jeweils 4 Konzentrationen (10^-9  bis 10^-6 M) des Antiöstrogens TAM und des Antiandrogens VC behandelt wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben.
• Abb. 3-19: Relative RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit 4 Konzentrationen (10^-9 bis 10^-6 M) T, DHT und MT in Kombination mit einer wirksamen Konzentration EE (10^-6 M) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in Relation zu den Lösungsmittelkontrollwerten dargestellt. EE 10^-6 M dient als Positivkontrolle. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Positivkontrolle (p < 0,05).
• Abb. 3-20: Relative RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit 4 Konzentrationen (10^-9 bis 10^-6 M) TAM und VC in Kombination mit einer wirksamen Konzentration EE bzw. DHT (10^-6 M) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in Relation zu den Lösungsmittelkontrollwerten (Ko) dargestellt. EE bzw. DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur entsprechenden Positivkontrolle (p < 0,05).
• Abb. 3-21: Ein typisches Bild eines Agarosegels, das die RT-PCR-Produkte des RBP (323 bp) und des EF (285 bp) wiedergibt. T: Testosteron, DHT: Dihydrotestosteron, VC: Vinclozolin, TAM: Tamoxifen, F1 – F3: Fraktion 1 – 3 der Gewässerextrakte, Ko: Kontrolle, EE: Ethinylöstradiol, E2: 17β-Östradiol.
• Abb. 3-22: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 0. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-23: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 1. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-24: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 2. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-25: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 3. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-26: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 4. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-27: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 5. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-28: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 6. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10^-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.
• Abb. 3-29: Nachweis und Quantifizierung von EE, Campesterol, β-Sitosterol und o,p’-DDE im Flussverlauf der Alb (Linien = gleitender Durchschnitt). Die einzelnen Probennahmestellen sind in Kapitel 2.3.1 beschrieben. Die Werte stammen wie die BPA-Nachweise (Abb. 3-13) aus einer Einzelbestimmung eines Probennahmezeitraumes (Juli 2001).