Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen: Untersuchungen zu Einflüssen auf die Reproduktionsbiologie von Xenopus laevis

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Gregor Levy

geboren am 22. April 1973 in Rastatt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Werner Kloas
2. Prof. Dr. Andreas Elepfandt
3. Prof. Dr. Jörg Oehlmann

Tag der mündlichen Prüfung:14.01.2005


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Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit die Reproduktionsbiologie von aquatischen Lebewesen durch die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen (endocrine disruptors, ED) beeinflusst wird. Mit dem Amphib Xenopus laevis steht ein etabliertes Studienmodell zur Untersuchung der Wirkungen von ED auf die Reproduktionsbiologie zur Verfügung, das für die vorliegenden Studien modifiziert und erweitert sowie mit gewässeranalytischen Methoden verknüpft wurde.

Die Gefährdung wasserlebender Tiere durch Gewässerbelastung mit ED kann erfasst werden, indem die Wirkung einer ausgewählten Einzelsubstanz auf die Reproduktionsbiologie untersucht wird. Anschließend erfolgt ein Nachweis der Substanz in Umweltproben. Durch Expositionsversuche, histologische Untersuchungen und Expressionsnachweis eines molekularen östrogenen Biomarkers konnte festgestellt werden, dass Bisphenol A (BPA) in Kaulquappen von Xenopus laevis verweiblichend wirkt und seine Effekte über eine Bindung an den Östrogenrezeptor vermittelt. Chemische Analysen während der Expositionsversuche zeigten, dass BPA von den Kaulquappen aufgenommen wird und dass eine geringe Abbaubarkeit der Substanz während eines Zeitraums von 48 Stunden besteht. Die Analyse von BPA in Wasserproben, die aus dem Fluss Alb oder aus Kläranlagenausläufen stammten, zeigte, dass BPA im Gewässer in relevanten Konzentrationen vorhanden ist und hauptsächlich durch eine Kläranlage in den Fluss eingeleitet wird.

In einem Gewässer liegt allerdings ein Gemisch aus unterschiedlichen ED mit verschiedenen Wirkmechanismen vor. Die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen kann weiterhin untersucht werden, indem Gewässerextrakte fraktioniert und in in vitro-Screeningmethoden getestet werden. Als Screeningmethoden dienten Rezeptorbindungsstudien an Östrogen- und Androgenrezeptoren sowie die Behandlung von Leberzellkulturen mit den Gewässerextrakten aus der Alb, um eine Regulation der Expression bestimmter Biomarkergene durch potenzielle ED nachzuweisen. Dazu wurde als neuer (anti)androgener und (anti)östrogener Biomarker das Retinol-binding Protein eingeführt. Die Untersuchung der Gewässerextrakte mit diesen Methoden zeigte, dass die Alb eine Belastung mit endokrin wirksamen Substanzen aufweist und dass hauptsächlich östrogen wirksame Substanzen vorkommen. Die Proben aus den Kläranlagenausläufen weisen die höchste endokrine Aktivität auf.

Eigene Schlagworte: Gewässerbelastung, endocrine disruptors, Xenopus laevis, Bisphenol A, Retinol-binding Protein


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Abstract

The present study examined the influence of endocrine active compounds (endocrine disruptors, ED), which are present in surface waters, on reproductive biology of aquatic organisms. The amphibian Xenopus laevis is a well-established model organism for the study of effects of ED on reproduction. It has been modified and broadened for the purpose of this study, and it was combined with chemical methods for water analyses.

It is possible to assess water pollution with ED by detecting effects on reproductive biology of one particular substance, and then by looking for this substance in environmental water samples. We showed the feminizing potency of Bisphenol A (BPA) in conducting exposure experiments with tadpoles, in examining histological samples of gonads and in detecting the induction of the expression of a molecular estrogenic biomarker. BPA was recognized to mediate its effects via binding to the estrogen receptor. Moreover, analysis of BPA during exposure experiments revealed that BPA is taken up by tadpoles and is not readily degradable during a time period of 48 hours. Chemical analyses of environmental water samples from the river Alb or samples from sewage treatment works (STW) showed that BPA is released into the environment by STW effluents.

In surface waters, there are different kinds of ED with different modes of action. Thus, it is another possibility to assess water pollution with ED by fractionating environmental water samples and by testing these fractions in rapid in vitro-screening methods. In the present work, receptor binding assays were carried out, both examining the binding to estrogen and androgen receptors. Furthermore, Xenopus laevis hepatocyte cultures were treated with fractions of environmental samples and biomarker expression was detected. A new biomarker to assess (anti)androgenic or (anti)estrogenic modes of action, respectively, was established. This new biomarker was the Retinol-binding Protein. The results obtained by these methods revealed that the river Alb is mainly polluted with estrogenic ED. Samples from STW effluents possessed the highest endocrine activity.

Keywords: water pollution, endocrine disruptors, Xenopus laevis, Bisphenol A, Retinol-binding Protein

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21.04.2005