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1.  Einleitung

1.1.  Endocrine disruptors (ED)

Es gibt Substanzen natürlichen und anthropogenen Ursprungs, die über das endokrine System unerwünschte hormonphysiologische Folgereaktionen in Lebewesen auslösen können. Diese Substanzen werden unter anderem als „endocrine disruptors“ (ED) bezeichnet. ED sind nach der beim Weybridge Workshop der EU 1996 gefassten Definition „exogene Substanzen, die als Folge der Veränderung der endokrinen Funktionen entgegengesetzte (adverse) Gesundheitseffekte in einem intakten Organismus oder seiner Nachkommenschaft verursachen“ (European Comission 1996).

Die größte Aufmerksamkeit erlangten diejenigen Chemikalien, die in die hormonelle Steuerung der Fortpflanzung eingreifen können, denn die meisten dieser Substanzen vermitteln oder blockieren die Wirkungen der Sexualsteroide. Es handelt sich zumeist um lipophile Chemikalien, die ähnliche Wirkungen wie die natürlichen weiblichen Sexualhormone induzieren können und die deswegen als Xenoöstrogene bezeichnet werden (Colborn & Clement 1992; Colborn et al. 1993). Die auftretenden Phänomene, die ursächlich mit den Xenoöstrogenen zusammenhängen, werden unter dem Begriff „Verweiblichung“ zusammengefasst.

Die Erforschung der Wirkungen von exogenen (Xeno)östrogenen ließ synthetische oder natürliche Substanzen unberücksichtigt, die als Antiöstrogene, Androgene oder Antiandrogene wirken können (Sonnenschein & Soto 1998; Vos et al. 2000). Dabei können antiandrogene ED ebenfalls zur Verweiblichung, antiöstrogene zur Entweiblichung bzw. Neutralisierung und androgene zur Vermännlichung führen (Kloas 2002). Wie ED mit dem endokrinen System interagieren, zeigt das folgende Kapitel.

1.2.  Störungen des endokrinen Systems durch ED

Das endokrine System gehört neben dem Immunsystem und dem Nervensystem zu den Kommunikationssystemen des Körpers. Seine Aufgabe besteht darin, durch Regulierung bestimmter physiologischer Vorgänge (z.B. Osmoregulation, Entwicklung oder Reproduktion) die Körperhomöostase ei[Seite 10↓]nes Organismus aufrecht zu halten. Dazu verwendet es chemische Botenstoffe, die Hormone. Diese lassen sich grundsätzlich in zwei Klassen einteilen, nämlich in lipophile und in hydrophile Hormone. Zu den lipophilen Hormonen zählen Steroide und Schilddrüsenhormone, zu den hydrophilen Catecholamine und Peptidhormone (Norris 1997). Beide Gruppen unterscheiden sich grundsätzlich in der Art der Vermittlung ihrer Wirkung: Hydrophile Hormone binden an Rezeptoren auf der Zelloberfläche der Zielzelle und setzen damit eine Signaltransduktionskette in Gang, die in relativ kurzfristigen Zustandsänderungen der Zelle mündet (z.B. Beeinflussung von Ionenkanälen, Aktivierung intrazellulärer Enzyme, etc.). Die lipophilen Hormone vermitteln ihre Wirkung über eine Bindung an intrazelluläre Rezeptoren, wodurch eine differenzierte Beeinflussung der Genexpression stattfindet. Viele der bekannten ED, die einen Einfluss auf die Reproduktionsbiologie haben, wirken auf eine ähnliche Weise wie die Sexualsteroide. Deswegen wird auf die Regulierungs- und Wirkmechanismen der Steroidhormone im Folgenden näher eingegangen.

Die Bildung und Ausschüttung der Sexualsteroide unterliegen den negativen Rückkopplungsmechanismen (Feedback-Regulation) eines hierarchisch gegliederten Systems. Ein typisches Beispiel dafür ist die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (Abb. 1-1). Im Zentralnervensystem wird in den Zellen des Hypothalamus das Gonadotropin-releasing Hormon (GnRH) gebildet. GnRH regt bestimmte Zellen der Hypophyse zur Abgabe der Gonadotropine (Luteinisierendes Hormon (LH) bzw. Follikel-stimulierendes Hormon (FSH)) an. Diese werden in den Blutkreislauf abgegeben. Bei weiblichen Tieren induzieren sie in den Follikelzellen des Ovars die Bildung von 17β-Östradiol (E2). Zu diesem Zweck wird hauptsächlich in den Thekazellen gebildetes Testosteron (T) in den benachbarten Granulosazellen durch das Enzym Aromatase in E2 umgewandelt. E2 wird freigesetzt und die erhöhte E2-Konzentration im Blut bewirkt im Hypothalamus und in der Hypophyse über eine negative Rückkopplung, dass die Sekretion von GnRH und LH bzw. FSH vermindert wird. Im Blutkreislauf wird E2 auf Grund seiner Lipophilie zu 90 – 95 % an Sexualhormon-bindendes Globulin (SHBG) gebunden und zu den Zielorganen transportiert. Bei den Wirbeltieren ist ein Hauptzielorgan von E2 die Leber. E2 dissoziiert vom SHBG ab und diffundiert durch die Zellmembran der Hepatocyte. Im Cytoplasma bindet E2 an den Östrogenrezeptor (ER). In der Leber kann E2 auch durch Metabolisierungsprozesse in eine wasserlösliche Form überführt und dann über die Niere als Glukuronid oder Sulfatester ausgeschieden werden.

Bei männlichen Tieren führen FSH und LH in den interstitiellen (Leydigschen) Zellen der Hoden zur Produktion der Androgene. Die Androgene binden an das gleiche SHBG wie E2 und auch die Vermittlung der Androgenwir[Seite 11↓]kung in den Zielzellen erfolgt analog den Östrogenen über cytosolische Rezeptoren und entsprechende Beeinflussung der Genexpression.

Abb. 1-1: Schematische Darstellung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse und der möglichen Angriffspunkte für ED. GnRH: Gonadotropin-releasing Hormon, LH: Luteinisierendes Hormon, FSH: Follikel-stimulierendes Hormon, SHBG: Sexualhormon-bindendes Globulin, E2: 17β-Östradiol, T: Testosteron, 1-6: mögliche Angriffspunkte der ED, Erläuterungen im Text.

Die beschriebenen Zusammenhänge verdeutlichen die vielfältigen Möglichkeiten der körperfremden endokrin wirksamen Substanzen, in die hormonelle Regulation einzugreifen. In Abb. 1-1 sind die wichtigsten Angriffspunkte dargestellt: Es besteht zum Beispiel die Möglichkeit, die Regulation über Beeinflussung der Hypothalamus-Hypophysen-Achse zu stören (1). Änderungen der Aktivität steroidproduzierender Enzyme in den Gonaden (2) und Störungen der Funktion der steroidbindenden Moleküle (3) stellen weitere Eingriffsmöglichkeiten für ED dar. Es können weiterhin Veränderungen der Aktivität der Hormonrezeptoren durch agonistische oder antagonistische Bindung der ED verursacht werden (4) und schließlich können die hormonabbauende Leberaktivität (5) und die Ausscheidungsprozesse über die Niere (6) beeinflusst werden (Gunderson et al. 2001).


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Die Bindung an den Hormonrezeptor führt dazu, dass ED die Gen-expression beeinflussen können. Damit ist dieser Vorgang derjenige, der die unmittelbarste Wirkung im Organismus hervorruft, indem bestimmte Merkmalsausprägungen verstärkt oder gehemmt werden. Die molekularen Prozesse in der Zielzelle, die bei einer Bindung von Hormonen oder von ED an die entsprechenden Hormonrezeptoren stattfinden, werden im Folgenden beschrieben.

Der ER und der Androgenrezeptor (AR) gehören zur Superfamilie der Kernrezeptoren. Kernrezeptoren sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren mit charakteristischen Strukturen. Sie besitzen eine variable N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine konservative DNA-Bindungsdomäne und eine variable C-terminale Ligandenbindungsdomäne. Diese generelle Struktur entwickelte sich in verschiedenen Kernrezeptorfamilien, die sich mit unterschiedlichen Liganden, wie z.B. Vitamin A (Retinol), Steroid- und Schilddrüsenhormonen, verbinden können. Zusätzlich sind eine Fülle von Wechselwirkungen zwischen den Liganden, den Rezeptoren und anderen zellspezifischen Faktoren (sogenannte Kofaktoren) bekannt (Harris et al. 2002). Inzwischen wurden neue Rezeptor-Unterformen und Isorezeptoren gefunden. Ein prominentes Beispiel sind die beiden Unterformen des ER, ER α und ER β. Offensichtlich reicht eine einzige Hormonrezeptorform nicht aus, die ganze Bandbreite hormonphysiologischer Antworten alleine zu vermitteln. Die unterschiedliche Verteilung und Aktivität der Rezeptor-Unterformen in einem Organismus erlauben es bestimmten Liganden, gewebs- oder zellspezifische Wirkungen zu entfalten. Zusätzlich zeigen einige Rezeptor-Unterformen unterschiedliche Bindungseigenschaften gegenüber dem spezifischen Hormon. Diese Beobachtung gibt Anlass zu der Vermutung, dass ligandenbedingte Selektivität zur Kontrolle der Hormonantworten durch die Kernrezeptoren beiträgt (Sperry & Thomas 1999).

Im inaktiven Ausgangszustand bilden ER und AR mit Heat-Shock-Proteinen einen Komplex. Die Bindung von E2 an den ER bzw. von T an den AR führt zum Abdissoziieren dieser Proteine. Dadurch werden die Rezeptoren aktiviert und der Hormon-Rezeptor-Komplex wird in den Zellkern transportiert. Bevor die Bindung an die entsprechenden DNA-Bindungsstellen stattfindet, erfolgt eine Homodimerisierung zweier Rezeptorproteine. Das Rezeptor-Homodimer bindet an ein hormonresponsives Element (HRE), das üblicherweise aus zwei palindromischen Sequenzen innerhalb der Promotorregion steroidhormonregulierter Gene besteht. Der Hormon-Rezeptor-Komplex geht dann mit weiteren Transkriptionsfaktoren eine Verbindung ein und reguliert dadurch die Aktivität der RNA-Polymerase (Abb. 1-2). Als Folge lassen sich Hemmungen oder Verstärkungen der Expression von Genen be[Seite 13↓]obachten, die bestimmte biologische Wirkungen hervorrufen (Hiort & Holterhus 2000).

Abb. 1-2: Schematische Darstellung der hormoninduzierten genomischen Zellantwort. Die Zahlen 1-3 dokumentieren die möglichen Nachweisebenen bei der Untersuchung potenzieller ED. 1. Nachweis der Bindung von ED an Hormonrezeptoren. 2. Nachweis der durch ED induzierten oder gehemmten mRNA-Synthese. 3. Nachweis der veränderten Merkmalsausprägung durch ED. DNA: Desoxyribonukleinsäure, HRE: hormonresponsives Element, mRNA: messenger Ribonukleinsäure.

1.3.  Endokrin wirksame Substanzen in der Umwelt

Laborstudien mit Einzelsubstanzen in standardisierten Bioassays geben Hinweise darauf, ob diese Substanzen als ED wirken können bzw. welche der im vorherigen Kapitel genannten Möglichkeiten der Störung des endokrinen Systems vorliegen. Aber weder die Untersuchung von Einzelsubstanzen noch die Verwendung einzelner Testorganismen repräsentieren die tatsächliche Situation in der Umwelt. Dort liegt immer ein Gemisch hormonaktiver [Seite 14↓]Substanzen vor und unterschiedliche Organismen können betroffen sein. Diese haben bestimmte Voraussetzungen, um auf die Belastung zu reagieren, da sie über verschiedene Abbau- oder Ausscheidungsmechanismen verfügen, mit denen sie die potenziellen ED unwirksam machen können. Infolgedessen ist die tatsächliche Gefährdung für Menschen und Ökosysteme durch ED erst abschätzbar, wenn sowohl die Wirkmechanismen des Stressors als auch seine entsprechenden Einflüsse auf Organismen und Populationen bekannt sind (Kloas 2002).

Anthropogen bedingte Umweltverschmutzung beeinträchtigt die Lebensvorgänge und kann im extremsten Fall zum Tod von Lebewesen führen. Eine Kategorie umweltbelastender Stoffe umfasst die bereits eingeführten endokrin wirksamen Substanzen. ED wurden in den entferntesten Gegenden der Erde gefunden. Aufgrund ihrer geringen Größe (nm bis µm) und ihrer relativen Persistenz gelangen sie mit Hilfe von Wind- und Meeresströmungen an entlegenste Orte wie Arktis oder Antarktis. Dort können sie sich ansammeln, obwohl der Ort ihrer Freisetzung weit entfernt liegt. Außerdem wurden ED in sämtlichen Komponenten der Biosphäre gefunden, nämlich im Boden, im Wasser, in der Luft und in den Lebewesen selbst (Colborn et al. 1996). Im Rahmen dieser Arbeit war es erforderlich, sich auf die Betrachtung der Situation in Oberflächengewässern zu beschränken.

Oberflächengewässer dienen als Stoffsenke für ED (Jobling & Sumpter 1993; Kloas et al. 2000). Kommunales und industrielles Kläranlagenauslaufwasser kann den Vorfluter mit zahlreichen Schadstoffen verunreinigen. Dazu gehören Xenoöstrogene und natürliche Östrogene, pharmazeutische Wirkstoffkomponenten, polyaromatische Kohlenwasserstoffe, Pestizide und Schwermetalle. Diese Verunreinigungen stammen aus Haushaltschemikalien, Medikamenten sowie Industriechemikalien und deren Abbauprodukten. Weiterhin werden ED von landwirtschaftlichen Nutzflächen (z.B. Herbizidwirkstoffe) und aus Industrieanlagen ausgewaschen und in die Oberflächengewässer gespült. Diese Eintragsquellen sind flächenmäßig nicht klar abgrenzbar und somit quantitativ nur unzureichend zu erfassen. Anders verhält es sich mit den zuerst genannten Verunreinigungen durch Kläranlagenauslaufwasser, die als punktuelle Eintragsquellen bekannt, leicht zugänglich und quantifizierbar sind (Sumpter 1997).

Der Abbau der ED in den Kläranlagen ist zumeist unvollständig und unzureichend, so dass sich bestimmte Substanzen im Auslaufwasser der Kläranlage in relevanten Konzentrationen feststellen lassen. So wiesen beispielsweise Toft & Baatrup (2001) im Auslaufwasser von Kläranlagen in Dänemark E2, das synthetische Östrogen Ethinylöstradiol (EE) und die östrogen wirksame Chemikalie Bisphenol A (BPA) jeweils in Konzentrationen von 0,2 – 0,6 ng / L, 0,4 – 2 ng / L und 20 – 700 ng / L nach. Diese Werte [Seite 15↓]lassen erkennen, dass die Leistungsfähigkeit der spurenanalytischen Methoden gestiegen ist. Dadurch erhöht sich auch die Zahl der entdeckten organischen Verbindungen in Oberflächengewässern und Kläranlagenausläufen. Die meisten Schadstoffe kommen in Konzentrationsbereichen von ng / L bis µg / L vor. Diese Konzentrationsbereiche liegen außerhalb der für aquatische Organismen akuten toxischen Konzentrationen, aber innerhalb der wirksamen Konzentrationen für Störungen ihres endokrinen Systems.

Die meisten Lebewesen in Gewässern sind wirbellose Tiere, bei denen ab dem Stamm der Coelenteraten schon Hormonsysteme vorhanden sind. Dennoch fokussiert sich die Forschung auf die Wirkungen von ED in Wirbeltieren und vernachlässigt die Wirbellosen, obwohl deren Lebenszyklen zum Teil intensiv der hormonellen Regulation unterliegen (z.B. Larvalstadien, Verpuppung, Metamorphose, Diapause, etc.). Ein Beispiel zur Schädigung von Wirbellosen in Oberflächengewässern ist die Süßwassermuschel Elliptio complanata. Es wurde gezeigt, dass Muscheln im Flusswasser unterhalb eines Kläranlagenauslaufs überdurchschnittlich viel Vitellogenin (Vg) produzierten (Gagné et al. 2001). Vg ist ein Vorstufenprotein der Eidotterbildung in oviparen Lebewesen und wird häufig als östrogener Biomarker verwendet, da seine Biosynthese durch weibliche Sexualhormone reguliert wird. Süßwassermuscheln und andere Invertebraten (z.B. Schnecken, vgl. Oehlmann et al. 2000) stellen eine besondere Risikogruppe dar, da sie stationär leben bzw. geringe Mobilität zeigen und sich somit der Belastungssituation nicht entziehen können.

Niedere Wirbeltiere, die ihr Leben vollständig oder teilweise im Wasser verbringen, sind Fische und Amphibien. Aus beiden Wirbeltierklassen liegen Untersuchungen vor, die Wirkungen von ED auf die Reproduktionsbiologie sowohl in Laborversuchen als auch im Freiland zeigten (Kime 1998; Opitz et al. 2002). In einem klassischen Experiment konnten Purdom et al. (1994) nachweisen, dass männliche Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss), die im Auslaufwasser britischer Kläranlagen in Käfigen gehalten wurden, Verweiblichungserscheinugen aufwiesen. Diese äußerten sich in signifikant erhöhter Vg-Synthese in den männlichen Tieren. Seither wurden viele weitere Beispiele gefunden, die einen Einfluss verschiedener Einleiter in Oberflächengewässer auf die Reproduktionsbiologie vor allem von Fischen zeigten (zur Übersicht: Tyler et al. 1998; Kloas 2002).

Bei im Meerwasser lebenden Säugetieren wurden Schädigungen entdeckt, die ebenfalls als Auswirkungen einer Belastung mit ED interpretiert wurden. Reduzierter Fortpflanzungserfolg, Tumorbildung in den Gonaden oder zwittrige Gonadenentwicklung wurden zum Beispiel bei Walen oder Seehunden gefunden (De Guise et al. 1995). Schädigungen von im Süßwasser lebenden Säugetieren wie Biber oder Otter durch ED sind nicht be[Seite 16↓]kannt. Selbst Menschen können von der Belastung der Gewässer mit ED betroffen sein. Die Gefährdung besteht darin, dass Oberflächenwasser als Rohwasser zur Trinkwassergewinnung benutzt wird. Die Trinkwasseraufbereitung findet ohne Kontrolle des Wassers auf dessen Gehalt an ED statt.

1.4.  Amphibien als Studienmodelle

Amphibien sind aufgrund ihrer zumindest zum Teil aquatischen Lebensweise dazu geeignet, als Testorganismen zur Untersuchung der Gewässerbelastung mit ED zu dienen. Amphibien stellen bevorzugte Studienmodelle in der Endokrinologie und der Entwicklungsbiologie dar, sind in der ED-Forschung aber nicht weit verbreitet, obwohl auch Amphibien von den Umweltverschmutzungen mit ED betroffen sind. In den vergangenen Jahrzehnten wurde weltweit ein Rückgang der Amphibienpopulationen beobachtet (Blaustein & Wake 1990). Neben zunehmender Belastung durch UV-Strahlung (Blaustein et al. 1994), Kontaminationen mit toxischen Stoffen und Habitatszerstörungen (Carey 2000) stehen ED im Verdacht, einen Beitrag zum Amphibiensterben zu leisten (Carey & Bryant 1995).

Amphibien leben während der Larvalentwicklung aquatisch. Dadurch sind sie Schadstoffen im Gewässer kontinuierlich ausgesetzt. Der Laich weist, im Gegensatz zu allen anderen Anamniota, weder eine Schale noch eine Membran auf und die Kaulquappen besitzen eine hochpermeable Haut, so dass exogene Substanzen während der gesamten Embryonal- und Larvalentwicklung nahezu ungehindert in den Organismus gelangen können. Der Zeitraum bis zum Abschluss der Metamorphose stellt somit die sensitivste Phase gegenüber dem Einfluss exogener Faktoren und damit auch gegenüber dem Einfluss von ED bei Amphibien dar.

Die Geschlechtsdifferenzierung bei Amphibien unterliegt bei einigen Arten der Kontrolle der Geschlechtshormone. Die Verteilung der Geschlechter kann sich unabhängig vom Genotyp ändern, wenn während des Zeitraumes der Keimzellendifferenzierung eine Behandlung mit Sexualsteroiden erfolgt. Eine Behandlung mit Östrogenen erzeugt vermehrt weibliche Phänotypen, während die Gegenwart von Androgenen im Umgebungsmedium in dieser Entwicklungsphase zu mehr männlichen Phänotypen führen kann (Witschi & Allison 1950; Witschi 1971; Gallien 1974; Hayes 1998; Wallace et al. 1999; Bögi et al. 2002). Damit bieten Amphibien die Möglichkeit, den Einfluss von exogenen Substanzen auf die Sexualdifferenzierung in vivo zu untersuchen.


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Als Studienmodell diente in der vorliegenden Arbeit der Südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis (Daudin). In unserer Arbeitsgruppe ist Xenopus laevis als Studienobjekt zur Untersuchung der Wirkungen von ED auf das Hormonsystem etabliert (Kloas et al. 1999; Lutz & Kloas 1999; Kloas 2002; Opitz et al. 2002; Bögi et al. 2002, 2003). Zum einen ermöglichen Rezeptorbindungsstudien die Untersuchung der Bindungsaffinität von ED an die cytosolischen Hormonrezeptoren von X. laevis. Zum anderen lässt sich die biologische Wirkung von ED durch Behandlung von primären Hepatocytenkulturen nachweisen, indem die ED-induzierte Transkription bestimmter Biomarkergene gemessen wird. Außerdem wurde ein in vivo-Testsystem entwickelt, das die Untersuchung der Wirkung von ED auf die Sexualdifferenzierung und der Metamorphose während der Larvalentwicklung ermöglicht (vgl. Abb. 1-2).

Xenopus laevis ist ein geeigneter Testorganismus sowohl für in vitro- als auch für in vivo-Experimente zur Detektion hormonähnlicher Wirkungen. Zusätzlich können die Tiere einfach gehalten werden und ganzjährig reproduzieren (Deuchar 1975; Hilken et al. 1995). Die Entwicklung des Krallenfrosches vom befruchteten Ei bis zum juvenilen Frosch wurde mit Hilfe einer Normentafel in 66 Stadien unterteilt (Nieuwkoop & Faber 1994). Die Angaben zu den Entwicklungsphasen in dieser Arbeit beziehen sich auf diese Stadieneinteilung.

1.5.  Ziele der Arbeit

Mit der vorliegenden Arbeit sollten die bisherigen Möglichkeiten der Untersuchung von ED mit dem Modellorganismus Xenopus laevis erweitert werden. Ein Schwerpunkt lag auf der Frage nach der Möglichkeit, durch eine Verbindung von Bioassays und Gewässeranalytik die Belastung eines Modellgewässers mit ED überprüfen zu können. Für dieses Vorhaben gibt es zwei prinzipielle Ansatzmöglichkeiten: Zum einen kann die gezielte gewässeranalytische Suche nach einer Einzelsubstanz in Kombination mit einer umfassenden Charakterisierung der Wirkungen dieser Substanz auf die Fortpflanzungsbiologie erfolgen. Zum anderen kann ein unbekanntes Stoffgemisch aus einer Umweltprobe in geeigneten Bioassays auf potenziell endokrin wirksame Inhaltsstoffe untersucht werden, um Wirkmechanismen und letztlich die dafür verantwortlichen Substanzen zu identifizieren. Beide Ansätze wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit verfolgt und diskutiert.


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Der sogenannte Einzelstoffansatz befasste sich ausführlich mit der bekannten östrogen wirksamen Chemikalie Bisphenol A. BPA dient als Monomer zur Herstellung von Polycarbonaten und Epoxidharzen. Weiterhin wird es als Stabilisator in Polymerprodukten, als Antioxidans in der Reifenproduktion, als eine Basischemikalie für das übliche Löschmittel Tetrabromobisphenol A, als Zusatz in Thermopapier und Papierbeschichtungen und nicht zuletzt als Bestandteil von Kunststoffzahnfüllungen verwendet. Die Produktion betrug 1995 in Deutschland 210 000 t, was der Hälfte des jährlichen Bedarfs in Westeuropa entspricht (Heemken et al. 2001).

Die Wirkungen von BPA auf die Reproduktionsbiologie von Xenopus laevis wurden intensiv untersucht. Dabei wurden sämtliche Organisationsebenen berücksichtigt, indem Effekte auf den sich entwickelnden Gesamtorganismus, Wirkungen auf die reproduktiven Organe, Effekte auf die Zellen der Gonaden und Wirkungen auf molekularer Ebene durch die in vivo-Induktion des Biomarkers ER untersucht wurden. Parallel wurde eine analytische Methode für einen quantitativen BPA-Nachweis entwickelt.

Zum anderen wurde die Frage gestellt, ob BPA in einem durchschnittlich anthropogen belasteten Gewässer nachweisbar ist und ob Gewässerextrakte entsprechende östrogene Wirkungen induzieren können. Als Untersuchungsgewässer wurde die Alb gewählt, ein Nebenfluss des Rheins bei Karlsruhe in Baden-Württemberg. Es musste zunächst die Methodik zur Extraktion und weitergehenden Fraktionierung der Wasserproben entwickelt werden, so dass schließlich ein BPA-Nachweis versucht werden konnte.

Die bisher überwiegend einseitige Erforschung der östrogenen Wirkungen von Umweltchemikalien berücksichtigt nicht die Tatsache, dass anthropogen belastete Oberflächengewässer immer eine Mischung verschiedenster Substanzen enthalten, die alle vier für die Reproduktionsbiologie relevanten Wirkmechanismen ((anti)östrogen, (anti)androgen) umfassen können. Diese Gegebenheit wurde im sogenannten Gemischansatz beachtet. Dabei muss berücksichtigt werden, dass die Belastungssituation eines Gewässers dann eindeutig erfasst ist, wenn Identität, Quantität und Wirkung aller Wasserinhaltsstoffe ermittelt werden. Dies ist aufgrund der Vielfalt der Substanzen, möglichen Wirkungen und gewässerspezifischen Belastungssituationen praktisch nicht durchzuführen. Deswegen sollte mit der vorliegenden Arbeit ein Biomarker eingeführt werden, der als Summenparameter Hinweise auf mögliche (anti)androgene sowie (anti)östrogene Wirkungen geben kann. Dafür eignet sich das Retinol-bindende Protein (RBP), denn seine Synthese unterliegt der Regulation durch die männlichen und weiblichen Sexualsteroide (McKearin et al. 1987).

Im Allgemeinen erfordert eine Untersuchung von Umweltbelastungen mit ED eine gewässeranalytische Begleituntersuchung des Studiengewäs[Seite 19↓]sers. Dadurch lassen sich jedoch keine Aussagen über die biologische Wirksamkeit der analysierten Substanzen treffen. Dagegen erfassen Bioassays die Wirkungen, sind aber meist nicht in der Lage, Substanzidentifizierung und -quantifizierung zu gewährleisten. Eine Lösung des Problems besteht darin, eine Kombination analytischer und biologischer Testverfahren anzustreben (Burnison et al. 1996; Sumpter 1997). So kann zuerst eine Fraktionierung der Probe stattfindeen und anschließend können Wirkungsstudien und chemische Analysen der bioaktiven Fraktionen durchgeführt werden. Dieser Ansatz wird TRE / TIE-Verfahren (Toxicity reduction evaluation / toxicity identification evaluation) genannt. Die Vorgehensweise zeichnet sich dadurch aus, dass aus einer heterogenen Ausgangsprobe Fraktionen hergestellt werden, die weniger heterogen zusammengesetzt sind. Dadurch werden nachfolgende analytische und biologische Verfahren vereinfacht.

Da, wie oben erwähnt, in Gewässern ein Gemisch von unterschiedlich wirksamen ED vorliegt, erfolgte die Etablierung eines weiteren Biomarkers, des RBP. Durch Behandlung von Zellkulturen mit Gewässerextrakten und anschließender RBP-mRNA- und ER-mRNA-Bestimmung konnten Aussagen zur Gesamtbelastung bestimmter Gewässerabschnitte gewonnen werden. Zusätzlich wurden die Gewässerextrakte in Rezeptorbindungsstudien mit dem ER und dem AR eingesetzt, um Rezeptorbindungsaffinitäten von Extraktinhaltsstoffen nachzuweisen.

Die aufgeführten Ziele, die mit vorliegender Arbeit erreicht werden sollten, lassen sich folgendermaßen zusammenfassen:

  1. Charakterisierung der östrogenen Wirkung von BPA in vivo;
  2. Entwicklung einer analytischen Methode zum BPA-Nachweis;
  3. Entwicklung gewässeranalytischer Trennungs- und Nachweismethoden für Umweltproben;
  4. Untersuchung der Bindung von Gewässerproben an den ER bzw. AR;
  5. Untersuchung der östrogenen Wirkung von Gewässerproben in Zellkulturen durch Verwendung des ER als östrogenen Biomarker;
  6. Einführung des RBP als Biomarker und Summenparameter für (anti)östrogene und (anti)androgene Wirkungen;
  7. Untersuchungen zu möglichen Belastungen eines Gewässers mit (anti)östrogenen und / oder (anti)androgenen Substanzen;
  8. Beispielhafte Analyse von verschiedenen ED in einem Oberflächengewässer.


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21.04.2005