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2.  Material & Methoden

2.1.  Versuchstiere

2.1.1.  Herkunft und Haltung der Versuchstiere

Alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Krallenfrösche bzw. Kaulquappen entstammten der Amphibienhaltung der Abteilung Binnenfischerei des Instituts für Gewässerökologie und Binnenfischerei in Berlin. Sie wurden ursprünglich von der African Xenopus Facility (Knysna, Republic of South Africa) geliefert. Die adulten Krallenfrösche wurden in Kunststoffbehältern (Fassungsvermögen 50 L) gehalten, in die 30 L Leitungswasser gegeben wurden. Der Raum für die Froschhaltung hatte ausschließlich künstliche Lichtquellen, die eine regelmäßige Hell- und Dunkelphase von jeweils 12 Stunden Dauer gewährleisteten. Die Fütterung erfolgte zweimal wöchentlich, zum einen mit Fischfutter (fisch-fit, Alleinfutter für Forellen, Interquell, Wehringen) und zum anderen mit Chironomiden-Larven (G. Scheudienst Zierfischfutter, Berlin). Ebenfalls zweimal wöchentlich erfolgte ein Wasserwechsel und die Reinigung der Behälter.

Die Versuche mit X. laevis wurden vom Berliner Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit (LAGetSi) gemäß § 4,3 und § 6,1 Tierschutzgesetz Berlin unter der Antragsnummer G0141/00 genehmigt. Nicht genehmigungspflichtige Arbeiten mit den Tieren wurden bei der Behörde angezeigt.

2.1.2.  Zucht der Versuchstiere

Chemikalien und Lösungen


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HCG (Human Chorionic Gonadotropin)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Meersalz Tropic Marin®

Dr. Biener GmbH, Aquarientechnik, Wartenberg

H2O entionisiert:
Leitfähigkeit < 18 µS / cm


RiOs 16, Millipore, Eschborn

Injektionslösung:
200 Units HCG / 100 µL H2O entionisiert

Standardmedium:
2,5 g Meersalz / L H2O entionisiert

Durchführung der Nachzucht

Geschlechtsreifen männlichen Fröschen wurden morgens 150 µL HCG-Lösung in den Rückenlymphsack gespritzt. Am Abend des gleichen Tages bekamen die Männchen erneut 150 µL Injektionslösung verabreicht und den Weibchen wurden 500 µL HCG-Lösung injiziert. Über Nacht wurden je ein Weibchen und ein Männchen in ein abgedunkeltes Plastikbecken gesetzt, in das 40 L Standardmedium gefüllt wurden. Dieses hatte eine dem Trinkwasser entsprechende Osmolarität. Mit einem Heizstab wurde das Wasser auf 21 °C erwärmt und über Sprudelsteine mit Sauerstoff belüftet. Am darauf folgenden Morgen wurden die erwachsenen Tiere aus den Becken entfernt. Bei erfolgreichem Laichvorgang befanden sich 1 000 bis 2 000 Eier in den Behältern. Aus durchschnittlich 75 % der Eier entwickelten sich Kaulquappen, denen sofort nach dem Schlüpfen das Futter verabreicht wurde. Als Futter wurde kommerziell erhältliches Jungfischaufzuchtfutter verwendet (Sera micron, Sera, Heinsberg).

2.2.  Charakterisierung der östrogenen Wirkung von Bisphenol A in vivo

2.2.1.  Exposition von Kaulquappen während der
Larvalentwicklung

Mit Expositionsversuchen kann bei X. laevis getestet werden, ob bestimmte Substanzen einen Einfluss auf die Sexualdifferenzierung bei den Tieren haben. Dazu wurden die Substanzen, in der vorliegenden Arbeit BPA und als Positivkontrolle E2 (Abb. 2-1), in gelöster Form dem Standardmedium zugegeben. Die Methode wurde angewandt, um einen bestimmten Endpunkt, nämlich die Ausdifferenzierung der Gonaden zu Hoden oder Ovarien unter dem Einfluss von BPA, zu bestimmen und damit Aussagen über den Einfluss der getesteten Substanz zu treffen. Die zu Grunde liegenden Wirkmechanismen blieben bei diesem Versuchsansatz unberücksichtigt.

Es wurden zwei Expositionsversuche durchgeführt. Der erste Expositionsansatz diente dazu, die Auswirkungen der Behandlung auf die Sexualentwicklung der Tiere zu untersuchen. Der zweite Ansatz verfolgte das Ziel, [Seite 22↓]zusätzliche Daten über die wirksamen Konzentrationen, die Wirkungen auf die Gonadenentwicklung und das Abbauverhalten von BPA zu gewinnen.

Abb. 2-1: Strukturformeln der in den Expositionsversuchen eingesetzten Substanzen E2 (links) und BPA (rechts).

Chemikalien und Lösungen

17β-Östradiol (E2)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Bisphenol A (BPA)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Ethanol 99 % p.a.

Roth, Karlsruhe

Standardmedium:
2,5 g Meersalz / L H2O entionisiert

Durchführung des ersten Expositionsansatzes

5 – 7 Tage nach der induzierten Laichabgabe und -befruchtung hatten die geschlüpften Kaulquappen das Entwicklungsstadium 42 – 43 erreicht und wurden in die Versuchsbecken eingesetzt. Dazu wurden 12,5 L fassende Glasbecken mit 10 L Standardmedium befüllt und in eine Brutrinne gestellt. Diese wurde mit destilliertem Wasser (23 °C) gefüllt, das um die Glasbecken zirkulierte, um eine konstante Temperatur in allen Becken zu gewährleisten. Das Standardmedium in den Glasbecken wurde durch Sprudelsteine mit Sauerstoff belüftet und in jedes Becken wurden 40 Kaulquappen des Stadiums 42 gegeben. Am Abend erfolgte eine erste Futterzugabe. Am nächsten Morgen wurde überprüft, ob die Kaulquappen ohne Schädigung das Umsetzen in die Versuchsbecken überstanden hatten, um eventuell geschädigte Tiere austauschen zu können. Danach erfolgte die erste Zugabe der Testsubstanzen. Der erste Versuchsansatz umfasste 10 Becken, davon 2 Lösungsmittelkontrollbecken (Ethanol 99 % p.a.). Kaulquappen in 4 Becken wurden als Positivkontrollen verwendet (E2 10-7 M und E2 10-8 M, je zwei Mal) und 4 Becken waren BPA-Testbecken (je zwei Mal BPA 10-7 M und BPA 10-8 M). Aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit der Testsubstanzen wurden diese in Ethanol 99 % p.a. gelöst. Die Chemikalien bzw. das Lösungsmittel wurden jeweils in einem Volumen von 100 µL zugegeben. Che[Seite 23↓]mikalienlösungen wurden ein Mal wöchentlich neu angesetzt und drei Mal in der Woche wurde das Wasser komplett gewechselt (montags, mittwochs, freitags). An diesen Tagen erfolgte jeweils eine erneute Testsubstanzen- und Futterzugabe, so dass sich ein semistatisches Expositionsregime ergab. Das Futter bestand im ersten Expositionsversuch aus einem Gemisch von 60 % Trockeneipulver, 30 % Brennnesselpulver und 10 % Bierhefe, wovon anfangs 200 mg und ab Stadium 54 300 mg zugeben wurden. Dieses Futtergemisch wurde verwendet, um den ersten Expositionsansatz entsprechend den Bedingungen bei Kloas et al. (1999) durchzuführen. Veränderungen im Tierbestand und die Wassertemperatur im Umgebungsbecken wurden notiert.

Durchführung des zweiten Expositionsansatzes

Dieser Ansatz unterschied sich im Vergleich zum ersten in der Art des Futters. Hierbei wurde kommerziell erhältliches Jungfischaufzuchtfutter verwendet (Sera micron, Sera, Heinsberg). Für die Behandlung der Tiere im Positivkontrollbecken wurde im zweiten Ansatz nur 10-7 M E2 eingesetzt, dafür wurde BPA in drei Konzentrationen zugegeben (10-6 M, 10-7 M und 10-8 M). Wiederum wurden für alle Behandlungsbecken und das Becken der Lösungsmittelkontrolle Vergleichsbecken mitgeführt.

2.2.2.  Geschlechtsbestimmung der juvenilen Frösche

Chemikalien und Lösungen

Aminobenzoesäureethylmethansulfonat

(MS-222)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Betäubungslösung:
3 g MS-222 / L Leitungswasser

Fixiermedium:

Bouin-Fertiglösung

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Durchführung der Geschlechtsbestimmung

6 Wochen nach dem Schlüpfen hatten die ersten Kaulquappen die Metamorphose vollendet. Eine sofortige Entnahme der kleinen Frösche war erforderlich, weil diese zu Kannibalismus neigen und eine Gefahr für weniger weit entwickelte Kaulquappen in ihrem Becken sein können. Dann wurde das jeweilige Geschlecht identifiziert. Dazu wurden die Tiere in Betäubungslösung gelegt und durch einen Genickschnitt sowie durch Zerstörung des Rückenmarks mit einer Präpariernadel getötet. Daraufhin wurde die Bauchdecke [Seite 24↓]aufgeschnitten und die Gonaden freigelegt. Das Geschlecht der Tiere wurde mit Hilfe eines Binokulars (Zoom 2000, Leica Microsystems, Heidelberg) bestimmt, notiert und später der Gesamtauswertung zugeführt.

Nach 120 Behandlungstagen wurden die Versuche aufgelöst, die noch in der Metamorphose befindlichen Tiere wurden abgetötet und ihr Geschlecht bestimmt. Eine Geschlechtsbestimmung lässt sich ab Stadium 56 problemlos durchführen, da zu diesem Zeitpunkt eine morphologische Unterscheidung der Gonaden in Hoden und Ovarien möglich ist. Die Gonaden wurden direkt nach der Freilegung mit Bouin-Lösung fixiert, um die Gonadenstrukturen besser sichtbar zu machen. Die Geschlechtsbestimmungen wurden immer von zwei Personen unabhängig voneinander durchgeführt.

Alle aufgeführten Vorgehensweisen wurden bei beiden Expositionsversuchen angewandt. Es gab jedoch zwei Änderungen des Ablaufs der Geschlechtsbestimmung während des zweiten Expositionsansatzes. Zum einen wurden die juvenilen Frösche vor der Geschlechtsuntersuchung gewogen und damit ihr Körpergewicht bestimmt. Zum anderen wurden nach der Geschlechtsbestimmung die fixierten Nieren-Gonaden-Komplexe herauspräpariert und in 70 % Ethanol für weitere histologische Untersuchungen aufbewahrt.

2.2.3.  Histologische Untersuchung der Gonaden

Alle Hoden aus dem zweiten Versuchsansatz wurden histologisch untersucht, um mögliche zelluläre Veränderungen in den Geweben durch die BPA-Behandlung zu entdecken. Schnitte von Ovarien wurden nur stichprobenartig ausgewertet, da eine Veränderung der weiblichen Gonaden als unwahrscheinlich angenommen wurde.

Chemikalien und Lösungen


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Chloroform

Roth, Karlsruhe

Ethanol 99 % p.a.

Roth, Karlsruhe

Einbettungsmedium:

Rotiplast

Roth, Karlsruhe

Färbelösung:

Eosin-Stammlösung

Hämalaun-Stammlösung nach Mayer


Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt

Fixiermedium:

Bouin-Fertiglösung

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Schnelleindeckmedium:

Entellan

Merck, Darmstadt

Durchführung der histologischen Untersuchungen

Die herauspräparierten Hoden-Nieren-Komplexe wurden in Bouin-Lösung drei Stunden fixiert und danach zwei Mal mit 70 % Ethanol gewaschen. Vor dem Anfertigen der mikroskopischen Schnitte erfolgte eine Überführung der Gewebe in Einbettkassetten und deren Entwässerung in einem Gewebeeinbettautomaten (Barimed, Kuno Vieth Mikrotome GmbH, Wiesmoor). Die Entwässerung der fixierten Gonaden erfolgte mit Hilfe einer Ethanolkonzentrationsreihe (80 % – 2 h, 95 % – 2 h, 95 % – 2 h, 95 % – 2 h, 99 % – 1 h, 99 % – 2 h). Danach wurden die Gewebe mit Chloroform behandelt (insgesamt 3 Stunden) und schließlich in einer automatischen Gewebe-Ausblock-Station (DDM-P066/II, Roth, Karlsruhe) in Paraffin eingebettet (insgesamt 8 Stunden). Die Gewebeschnitte wurden mit einem Rotationsmikrotom (2065 Supercut, Leica Mircrosystems, Heidelberg) in einer Schnittdicke von 8 µm angefertigt. Nach dem Herstellen der Schnitte wurden diese auf Objektträger aufgezogen und durch leichte Erwärmung geglättet. Die Anfärbung der Präparate erfolgte in einem Färbeautomaten (HMS, Carl-Zeiss Inc., Jena) mit Hämatoxylin-Eosin-Lösung. Dazu wurde 1 %ige wässrige Eosinlösung mit Hämalaun-Fertiglösung nach Mayer im Verhältnis 8 : 1 gemischt und in den Färbeautomaten gefüllt. Nach der Färbung zeigten sich die Zellkerne blau und das Cytoplasma rot gefärbt. Schließlich wurden die Schnitte mit Schnelleindeckmedium eingedeckelt.

Die Analyse der histologischen Präparate wurde mit Hilfe eines Lichtmikroskopes (Olympus BX50, Olympus Optical Europe, Hamburg) durchgeführt. Schließlich wurden die Objekte mit einer Digitalkamera fotografiert und die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware gespeichert (ColorView 12 und analySIS 3.1, Soft Imaging System, Münster).

2.2.4.  Kurzzeitige Kaulquappenexposition mit BPA und Bestimmung der ER-mRNA-Expression

Dieser Versuch diente dazu, die östrogene Wirkungsweise von BPA in den Kaulquappen näher zu bestimmen. Dabei sollte gezeigt werden, dass eine kurzzeitige Exposition der Tiere mit BPA die Expression eines typischen östrogenen Biomarkers induzieren konnte. Ein geeigneter östrogener Biomarker ist der ER (Bögi et al. 2002), dessen mRNA-Expression in Kaulquappen [Seite 26↓]in diesem Versuchsansatz nachgewiesen wurde. Der Nachweis erfolgte durch die Reverse Transcriptase - Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR). Die RT-PCR ist eine Methode, welche die reverse Transkription (RT) der mRNA mit der Amplifizierung der daraus erhaltenen komplementären DNA (cDNA) durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) verbindet (Byrne et al. 1988; Wang et al. 1989).

1. Kurzzeitige Exposition der Kaulquappen mit BPA

Die Kaulquappen wurden wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben gezüchtet und aufgezogen. Es wurden jeweils 10 Kaulquappen im Entwicklungsstadium 50 in Glasbecken gegeben und mit Ethanol 99 % p.a., 10-7 M E2 und 10-7 M BPA zwei Wochen lang behandelt. Die Versuchsdurchführung glich derjenigen in Kapitel 2.2.1.

2.  RNA-Isolierung

Chemikalien und Lösungen

Chloroform

Roth, Karlsruhe

Diethylpyrocarbonat (DEPC)

Roth, Karlsruhe

Ethanol 70 %

Roth, Karlsruhe

Isopropanol

Roth, Karlsruhe

Trizol

Invitrogen, Karlsruhe

Durchführung der RNA-Isolierung

Nach zwei Wochen wurden die Kaulquappen aus den Glasbecken genommen und mit 500 µL Trizol bei -70 °C bis zur weiteren Aufarbeitung tiefgefroren. Die Gesamt-RNA wurde aus Ganzkörperhomogenaten der einzelnen Tiere gewonnen. Die RNA-Isolierung fand in verschiedenen RNAse-freien Eppendorfgefäßen statt, um einen schnellen Abbau der RNA zu verhindern. Die aufgetauten Kaulquappen wurden mit einem Ultra Turrax Homogenisator (T8, IKA Labortechnik, Staufen) homogenisiert. Danach wurden die Proben 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe von 150 µL Chloroform wurde die lipophile von der hydrophilen Phase getrennt. Die Proben wurden geschüttelt, bei Raumtemperatur 3 min inkubiert und bei 12 000 g und 4 °C 15 min zentrifugiert (Biofuge fresco, Heraeus Instruments GmbH, [Seite 27↓]Hanau). 300 µL des RNA-haltigen Überstandes wurden abgenommen und die RNA wurde durch Zugabe von 375 µL Isopropanol ausgefällt. In einem weiteren Schritt wurden die Proben gründlich geschüttelt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet wurde mit eiskaltem Ethanol 70 % gewaschen und anschließend 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die RNA wurde in 100 µL sterilisiertem, bidestilliertem Wasser resuspendiert, das 0,01 % DEPC enthielt. Der RNA-Gehalt wurde bei einer Absorptionswellenlänge von 260 nm in einem Mikroplattenreader (Spectraflour Plus, Tecan, Crailsheim) gemessen. Zusätzlich wurden Extinktionswerte bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt. Der Quotient aus den Extinktionswerten (260 nm / 280 nm) einer Probe stellt ein Maß für die Reinheit der RNA-Extraktion dar. Diese Extraktionsmethode ergab eine durchschnittliche RNA-Ausbeute zwischen 100 und 250 µg RNA pro Kaulquappe und die Reinheit der Extraktionen lag zwischen 1,8 und 2.

3. Reverse Transkription (RT)

Chemikalien und Lösungen

AMV-Reverse Transcriptase

(RT, 20 Units / µL)

Biometra, Göttingen

AMV-RT-Puffer

Zusammensetzung:

Tris-HCl (pH 8,3)

MgCl2
KCl

Dithiothreitol (DTT)

Biometra, Göttingen

500 mM

60 mM

400 mM

40 mM

DNTP Mix

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP jeweils 10 mM)

Finnzymes, Espoo, Finnland

PolydT-Primer

Biometra, Göttingen

Sequenz: 5’-CCT GAA TTC TAG AGC TCA TTT TTT TTT TTT TTT TT-3’

PCR-Wasser:
H2O bidestilliert, autoklaviert

 

RNA-Lösung:

0,125 µg RNA / µL

 

Durchführung der RT

Das Umschreiben der RNA in cDNA wurde mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) vorgenommen. Jede Probe wurde in zwei separaten An[Seite 28↓]sätzen umgeschrieben. 8 µL RNA-Lösung wurden zusammen mit 12 µL eines 4 µM PolydT-Primers 3 min in einem Thermocycler (T1, Biometra, Göttingen) auf 70 °C erhitzt und danach auf Eis gestellt. Anschließend wurde ein Gemisch aus 4,5 µL PCR-Wasser, 3 µL RT-Puffer, 2 µL dNTP Mix und 0,5 µL RT zu jeder Probe gegeben. Es folgte eine einstündige Inkubation bei 37 °C im Thermocycler, die mit einer zweiminütigen Erhitzung auf 90 °C beendet wurde. Wenn die cDNA nicht unmittelbar für die PCR benutzt wurde, konnten die cDNA-Proben bei -20 °C gelagert werden.

4.  Polymerase Chain Reaction (PCR)

Eine Quantifizierung von mRNA ist unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion möglich, da über eine bestimmte Anzahl von Zyklen ein konstanter exponentieller Zusammenhang zwischen PCR-Produkt und Zyklenzahl besteht. Daher kann anhand der Menge des PCR-Produktes auf die Menge an eingesetzter Matrizen-cDNA geschlossen werden.

Chemikalien und Lösungen

DNTP Mix

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP jeweils 10 mM)

Finnzymes, Espoo, Finnland

EF-Primer forward

Biometra, Göttingen

Sequenz: 5’-TGC CAA TTG TTG ACA TGA TCC C-3’

EF-Primer reverse

Biometra, Göttingen

Sequenz: 5’-TAC TAT TAA ACT CTG ATG GCC-3’

ER-Primer forward

TipMOL, Berlin

Sequenz: 5’-ATT TCG CAT GAT GAG GTT ACG-3’

ER-Primer reverse

TipMOL, Berlin

Sequenz: 5’-TAG TGG TAG GTG GAC TCC GG-3’

PCR-Puffer
Zusammensetzung:
Tris-HCl (pH 8,55)
(NH4)2SO4
MgCl2

Hybaid, Heidelberg

20 Mm
16 mM
1,5 mM

Taq-Polymerase (4 Units / µL)

Hybaid, Heidelberg

cDNA-Lösung

Durchführung der PCR

Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode zur Amplifikation bestimmter cDNA-Abschnitte. In diesem Ver[Seite 29↓]suchsansatz wurde sie zur Bestimmung der ER-cDNA-Sequenz von Xenopus laevis benutzt (Weiler et al. 1987). Dazu wurden spezifische ER-Primer hergestellt. 5 µL cDNA-Lösung wurden mit 16,7 µL PCR-Wasser, 2,5 µL PCR-Puffer, 0,2 µL dNTP Mix, 0,2 µL ER-Primer forward, 0,2 µL ER-Primer reverse und 0,2 µL Taq-Polymerase gemischt. Die Amplifikation wurde im Thermocycler durchgeführt und mit einer einminütigen Erhitzung auf 94 °C gestartet. Dadurch wurde die cDNA denaturiert. Danach folgten 37 Zyklen dreier Temperaturschritte (94 °C – 1 min, 60 °C – 1 min, 72 °C – 1 min) und die Reaktion wurde nach dem letzten Schritt des letzten Zyklus gestoppt, indem die Temperatur 2 min auf 72 °C gehalten und danach auf 10 °C abgekühlt wurde. Das amplifizierte ER-Produkt umfasste 407 Basenpaare (bp). Alle PCR-Durchgänge wurden doppelt ausgeführt.

Als interner Standard wurde der Elongationsfaktor 1α (EF) von X. laevis verwendet (Dostal et al. 1994; Dosch et al. 1997). Die PCR für den EF wurde entsprechend der Methode von Kloas et al. (1999) durchgeführt. Die PCR-Produkte hatten eine Länge von 285 bp und die Amplifikation wurde nach 23 Zyklen gestoppt.

5.  Darstellung der PCR-Produkte

Lösungen und Chemikalien

Agarose

Roth, Karlsruhe

BioLadder 100

Hybaid, Heidelberg

Ethidiumbromid

Roth, Karlsruhe

TAE-Puffer (pH 8,5):

Tris-HCl 20 mM

NaEDTA  1 mM

Essigsäure

Serva, Heidelberg

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Roth, Karlsruhe

Probenpuffer (Anteile: 1 : 5 : 4):

Bromphenolblau

DEPC-Wasser

Glycerin

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Merck, Darmstadt

PCR-Produkte

Durchführung

Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. 5 µl der entsprechenden PCR-Produkte wurden mit einem Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Eine horizontale Gelelektrophorese wurde in einer Gelkammer (Agagel, Biometra, Göttingen) mit einem 1,5 %igem Agarosegel [Seite 30↓]in einem TAE-Puffer für 45 min bei einer Spannung von 60 mV angelegt. 10 mL flüssigem Gel wurden 3 µL Ethidiumbromid (0,1 µg / µL) zugegeben. Dadurch konnten die PCR-Produkte unter UV-Licht sichtbar gemacht werden, denn die entsprechenden cDNA-Amplifikate fluoreszierten durch eingelagertes Ethidiumbromid. Die Menge an amplifizierter cDNA konnte mit der gemessenen Fluoreszenz korreliert werden. Die Fluoreszenzintensität wurde durch densitometrische Messungen mit einem Image Analyzer (Gel Doc 2000, Bio-Rad, München) bestimmt. Die Fluoreszenzwerte des EF wurden genutzt, um die ER-Werte zu normalisieren. Die normalisierten Werte der BPA- und E2-behandelten Kaulquappen wurden mit den Werten der Kontrolltiere verglichen. Zur Überprüfung der Produktspezifität wurde die amplifizierte cDNA mit dem QIAquick Gelextraktions-Kit (Qiagen, Hilden) extrahiert, gereinigt und von Sequence Laboratories (Göttingen) durch Taq-Cycle-Sequenzierung analog zur Didesoxymethode von Sanger et al. (1977) sequenziert.

2.2.5.  Chemische Analyse von BPA in den Expositionsversuchen

Zum Nachweis, in welcher Konzentration die zu testende Substanz BPA tatsächlich im Standardmedium vorhanden war, war es erforderlich, chemische Analysen des Expositionswassers vorzunehmen. Zusätzlich konnte überprüft werden, dass sich BPA tatsächlich nur in den Testbecken befand und nicht in den Kontroll- oder Positivkontrollbecken. Durch eine Probenentnahme in einem bestimmten Zeitintervall ließ sich die Änderung der BPA-Konzentration im Zeitverlauf bestimmen.

Chemikalien und Lösungen


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Aceton (HPLC grade)

Roth, Karlsruhe

Acetonitril (HPLC grade)

Roth, Karlsruhe

Methanol (HPLC grade)

Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid (NaCl)

Merck, Darmstadt

Octadecyl (C18, Bakerbond)

J.T. Baker, Deventer, Niederlande

Quecksilberchlorid (HgCl2)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Salzsäure (HCl)

Merck, Darmstadt

Phosphatpuffer (0,01 M, pH 6):

Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4)

Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Durchführung der BPA-Analyse

Der BPA-Gehalt im Wasser aller Glasbecken des zweiten Expositionsansatzes wurde chemisch analysiert. Dazu wurden Wasserproben unmittelbar nach der Chemikalienzugabe entnommen. Weiterhin wurde die BPA-Konzentration in den Becken in Zeitintervallen von 6 Stunden über einen Gesamtzeitraum von 48 Stunden gemessen, also zwischen zwei aufeinander folgenden Wasserwechseln. Die Wasserproben der Zeitverläufe stammten aus drei verschiedenen Behandlungsbecken: Erstens aus Becken des Expositionsansatzes, in denen sich folglich BPA, Standardmedium, Futter und Kaulquappen befanden. Zweitens aus Becken, die BPA, Standardmedium und Futter enthielten sowie drittens aus Becken, die nur BPA und Standardmedium beinhalteten. Probenentnahme und Analyse wurden dreifach ausgeführt, in einigen wenigen Fällen zweifach.

Es wurden jeweils 0,5 – 2 L Wasser entnommen, abhängig von der zugesetzten BPA-Konzentration. Zu jeder Wasserprobe wurde 1 mL HgCl2 / L Wasser gegeben, um Mikroorganismen abzutöten, die durch Stoffwechselprozesse die Inhaltsstoffe der Wasserproben verändern können. Die Proben wurden in Glasflaschen (Schott Duran, Merck, Darmstadt) bei ‑20 °C aufbewahrt. Für die Extraktion von BPA aus den Wasserproben wurde eine Festphasenextraktionsmethode verwendet. Glasfritten wurden mit 500 mg Octadecyl gefüllt und mit Aceton, Methanol und 0,01 M Salzsäure (pH 2) konditioniert. Die Wasserproben wurden aufgetaut und in 500 mL von diesen wurden jeweils 2,5 g NaCl gegeben. Mit Salzsäure wurden die Proben auf pH 2 eingestellt. Die konditionierte Extraktionssäule wurde mit den Wasserproben beschickt. Der Durchlauf des Wassers durch die Säule erfolgte zuerst durch die Schwerkraft. Schließlich wurde mit einer Vakuumpumpe der in der Säule verbliebene Flüssigkeitsrest ausgetrieben, wobei eine Fließrate von ungefähr 15 mL / min entstand. BPA wurde mit 2 x 2,5 mL Aceton aus den Säulen eluiert. Das Eluat wurde unter Stickstoffatmosphäre in einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-200, Büchi, Konstanz) zur Trockene eingeengt und in Acetonitril wieder aufgenommen.

Die Bestimmung der BPA-Konzentration erfolgte durch Trennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) und anschließender Fluoreszenzmessung (Gynkotek HPLC, Idstein). Zur Auftrennung wurde eine 250 mm x 3 mm Ultrasep ES Säule (Sepserv, Berlin) verwendet, die isokratisch mit einem Laufmittelgemisch aus 65 % Acetonitril und 35 % eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 6) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 mL / min betrieben wurde. Die BPA-Detektion erfolgte durch Fluoreszenzlicht mit einer Anregungswellenlänge [Seite 32↓]von 229 nm und einer Emissionswellenlänge von 360 nm. Die BPA-Konzentrationen wurden quantifiziert, indem die Werte der Integrale der BPA-Peaks mit den Werten aus einer BPA-Standardkurve verglichen wurden. Um Aussagen über die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit der Methode zu erhalten, wurden die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie die Wiederfindungsrate für BPA ermittelt (s. Kapitel 3.1.4).

2.3.  Gewässeruntersuchungen

2.3.1.  Charakterisierung des Untersuchungsflusses

Die Alb ist ein kleiner Nebenfluss des Rheins. Sie hat eine Länge von ca. 50 km und ein Einzugsgebiet von ungefähr 460 km2, wovon ein Drittel im Buntsandsteingebiet des Schwarzwaldes liegt. Ihre Quelle befindet sich in der Nähe von Bad Herrenalb (Baden-Württemberg). Die Fließgeschwindigkeiten im Oberlauf liegen bei durchschnittlich 0,5 m / s und verlangsamen sich im Unterlauf auf ca. 0,3 m / s (LFU 1982). Der mittlere Abfluss liegt bei 2,34 m3 / s (1964-1996). Bevor die Alb in den Rhein mündet, durchquert sie die Stadt Karlsruhe und ein Raffineriegelände (weitere Angaben: Huber et al. 1994; LFU 1997; Schäfer 1999).

Abbildung 2-2 zeigt die geographische Lage der gewählten Probennahmestellen und ein Schema ihrer Anordnung im Flussverlauf. Es wurde eine unbelastete Referenzstelle im Quellgebiet gewählt (Alb 0). Die anderen Stellen gruppierten sich um zwei Kläranlagenausläufe (Alb 2, Alb 5) herum, jeweils eine Stelle flussaufwärts (Alb 1, Alb 4) und eine Stelle flussabwärts (Alb 3, Alb 6) des Einleiters.

In Tabelle 2-1 wurden die wichtigsten Lagemerkmale der einzelnen Probennahmestellen vermerkt. Diese wurden durch Begehung der unmittelbaren Umgebung der jeweiligen Stellen erfasst. Die Begehung fand kreisförmig um den Ort der Probennahme statt und der Radius des Begehungskreises betrug – wenn keine Hindernisse den Weg versperrten – ungefähr 300 m.


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Abb. 2-2: Geographische Lage des Modellgewässers (links) und schematische Darstellung der Probennahmestellen im Flussverlauf (rechts). KA: Kläranlagenauslauf.


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Bezeichnung

Beschreibung der Probennahmestelle

Alb 0

Liegt ca. 2 km unterhalb der Quelle bei Bad Herrenalb, keine Einleiter bekannt, möglicherweise Eintrag durch Vieh- und Forstwirtschaft. Am Ort ist die Alb ca. 2 – 3 m breit, 10 – 50 cm tief, linkes Ufer bewaldet, rechtes Ufer offengelassene Weide.

Alb 1

Probennahme in Fischweier, ca. 3 km oberhalb der Kläranlage Neurod, mögliche Einleitung durch Landwirtschaft, Bahn- und PKW-Verkehrseinflüsse möglich; Linkes Ufer Weide, rechtes Ufer Bäume und Bahndamm; Alb ca. 3 – 4 m breit und 20 – 60 cm tief.

Alb 2

Auslaufwasser der Kläranlage Neurod, die Abwasser von 40 000 Einwohneräquivalenten und ausschließlich kommunales Abwasser der Albtalgemeinden bearbeitet.

Alb 3

Probennahme ca. 2 km unterhalb der Kläranlage Neurod und etwa 500 m vom Einleitungskanal der Kläranlage entfernt am Ortseingang von Ettlingen. Die Alb hat hier das Industriegebiet „Ettlinger Spinnerei“ durchflossen, der Fluss ist 4 – 5 m breit und 50 – 70 cm tief, linkes Ufer Firmengelände, rechtes Ufer Bäume und Parkplatz.

Alb 4

Probennahme am Ortsausgang Karlsruhe-Knielingen, ca. 1 km vor Eintritt in Raffineriegelände und 2,5 km vor Einleitungskanal der Kläranlage Neureut, Alb verlässt hier Karlsruher Stadtgebiet; der Fluss ist 8 – 10 m breit, 80 – 100 cm tief; linkes und rechtes Ufer als Damm mit Spazierwegen angelegt.

Alb 5

Auslaufwasser der Kläranlage Karlsruhe-Neureut, die im Gewerbegebiet Neureut-Süd liegt und Abwasser von 740 000 Einwohneräquivalenten bearbeitet, wobei es sich um Industrie- und kommunales Mischabwasser handelt.

Alb 6

Probennahme in der Nähe des Baggersees Eggenstein, max. 1 km vor der Mündung; Entfernung zum Einleitungskanal der Kläranlage Neureut ca. 2,5 km; der Fluss ist ca. 10 m breit und 100 – 250 cm tief und beiderseits von einem Damm eingefasst, wobei sich hinter dem linken Uferdamm die Rheinaue befindet.

2.3.2.  Entnahme der Gewässerproben

An den jeweiligen Probennahmestellen des Flusses (Alb 0, 1, 3, 4, 6) wurden 40 – 50 L Wasser entnommen. Die Entnahme erfolgte jeweils in der Flussmitte, ungefähr 10 cm unter der Wasseroberfläche. Die Temperatur des Wassers wurde vor Ort gemessen und die Proben wurden in Glasbehältern zur Aufarbeitung in die Kläranlagen gefahren. Die Proben unterschiedlicher Flussabschnitte wurden zu ähnlichen Zeitpunkten an aufeinanderfolgenden Tagen genommen. Das Kläranlagenauslaufwasser wurde auf dem Gelände der beiden Kläranlagen direkt aus dem Auslaufkanal entnommen, wobei aufgrund des hohen Schwebstoffgehaltes nur 10 – 15 L des Kläranlagenauslaufs Alb 5 extrahiert wurden.

Es fanden drei Probennahmen zu unterschiedlichen Jahreszeiten statt, und zwar im Juli 2001, im Oktober 2001 und im Februar 2002.


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2.3.3.  Extraktion der Gewässerproben

Chemikalien und Lösungen

Aceton

Roth, Karlsruhe

Dichlormethan

Roth, Karlsruhe

Methanol

Roth, Karlsruhe

n-Hexan

Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid (NaCl)

Merck, Darmstadt

Natriumsulfat (NaSO4)

Merck, Darmstadt

Salzsäure 3,7 % (HCl)

Merck, Darmstadt

Durchführung der Extraktion

Die Extraktion der Gewässerproben erfolgte jeweils auf dem Gelände der Kläranlagen, so dass eine unmittelbare Aufarbeitung durch kurze Transportwege gewährleistet war. Dies war erforderlich, um mögliche mikrobielle Prozesse, die zur Veränderung der Zusammensetzung der Wasserinhaltstoffe führen könnten, so gering wie möglich zu halten. Die Extraktionsmethode war eine Festphasenextraktion über C18-Extraktionsdisks (3M Empore High Performance Extraction Disks, 3M Center, St. Paul, USA). Zuvor wurde das Wasser mit 3,7 %iger Salzsäure angesäuert (pH 2) und mit NaCl (2,5 g / L Wasser) versetzt. Dann wurde es durch Glasfaserfilter (Schleicher & Schuell, Dassel) mit 50 µm Porendurchmesser filtriert und anschließend mit Hilfe einer Vakuumpumpe durch die Extraktionsdisks gesaugt, die vorher mit jeweils 20 mL Aceton, Methanol und 0,01 M Salzsäure (pH 2) konditioniert wurden. Je nach Probennahmestelle konnten 1 – 4 L Wasser pro Disk extrahiert werden. Die Extraktionsdisks wurden in Alufolie verpackt, kühl gelagert und im Labor weiter bearbeitet.

Die Disks wurden im Labor unter Stickstoffatmosphäre getrocknet und daraufhin wurden die zurückgehaltenen Substanzen aus den Disks eluiert. Um ein möglichst großes Spektrum an Substanzen herauszulösen, wurden drei unterschiedlich polare Lösungsmittel (Aceton, Dichlormethan und Hexan) im Überschuss zugegeben. Die so erhaltenen Gesamtextrakte wurden mit einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-200, Büchi, Konstanz) unter Stickstoffatmosphäre bis zur Trockene eingeengt und in einem Dichlormethan / Hexan-Gemisch (30 % zu 70 %) aufgenommen. Anschließend erfolgte noch eine Filtration über eine NaSO4-Säule, um bestimmte Makromoleküle (z.B. Chlorophylle) zu entfernen. Die Gesamtextrakte wurden daraufhin der Fraktionierung zugeführt. Die Extrakte waren gegenüber den Originalproben 1 000-fach konzentriert.


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2.3.4.  Fraktionierung der Gewässerextrakte

Chemikalien und Lösungen

Dichlormethan

Roth, Karlsruhe

Methanol

Roth, Karlsruhe

n-Hexan

Roth, Karlsruhe

Durchführung der Fraktionierung

Die Fraktionierung der Wasserextrakte aus der Alb wurde entsprechend der Methode von Snyder et al. (1999) durchgeführt und unseren Laborbedingungen angepasst. Es handelte sich um eine Normalphasenchromatographie mit einer Trennsäule (Phenomenex, Aschaffenburg, Luna 5 µm Silica Säule (250 mm x 4,6 mm)). Zur Auftrennung wurde eine präparative HPLC (System Gold, Beckman, Fullerton, USA) verwendet und die Fraktionen wurden von einem automatischen Probensammler (ISCO Fraktionensammler, Foxy 200, Colora Messtechnik, Lorch) aufgenommen. Zur Herstellung der ersten drei Fraktionen diente eine dreistufige, isokratische Arbeitsweise, wobei die einzelnen Stufen in der Abfolge 15 min 30 % Dichlormethan in Hexan, 20 min Dichlormethan, 20 min Methanol bei einer jeweiligen Fließgeschwindigkeit von 1 mL / min und einer Beladung der Säule mit jeweils 2,5 mL Extrakt durchgeführt wurden.

2.3.5.  Analyse der Gewässerproben

Die Analyse der Gewässerproben erfolgte mittels Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS), da sich aufgrund der Vielzahl der Substanzen in Gewässerproben die HPLC-Methode als ungeeignet erwies. Das Grundprinzip der Massenspektrometrie ist es, aus anorganischen oder organischen Substanzen in geeigneter Weise Ionen zu erzeugen und diese Ionen nach ihrer Masse und Ladung zu trennen. Ein entsprechendes Registriersystem erlaubt danach die qualitative und quantitative Erfassung der Ionen nach Masse und Häufigkeit. Das Massenspektrum spiegelt also das Verhältnis von Ionenmasse zu Ionenladung wider. Anhand von Referenzspektren lassen sich gut substanzklassenspezifische Charakteristika erkennen. Mit Hilfe von Spektrenbibliotheken können dann unbekannte Verbindungen identifiziert werden.


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Chemikalien und Lösungen

Hexan

Roth, Karlsruhe

Fraktionen der Gewässerextrakte

Durchführung

Zur Probenvorbereitung wurden die Eluate mit einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-200, Büchi, Konstanz) bei 30 °C unter Stickstoffatmosphäre bis zur Trockene eingeengt. Anschließend wurden sie in Hexan aufgenommen. Dabei wurde das Volumen des Lösungsmittels so gewählt, dass eine 1 000-fache Aufkonzentrierung der Proben vorlag.

Die Analyse der Proben erfolgte mit einem GC / MS-System (Agilent 6890 Network GC System, Agilent 5973 Network Mass Selective Detector, Agilent Technologies, PaloAlto, Ca., USA). Es wurden jeweils 2 µL der zu trennenden Proben injiziert. Zur Trennung wurden Helium als inertes Trägergas mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 1,3 mL / min sowie eine Trennsäule (DB5ms, 0,25 mm x 60 m x 0,25 µm) verwendet. Bei 720 °C wurden die Proben im Injektor in die Gasphase überführt. Das Ofentemperaturprogramm startete bei 50 °C. Zuerst wurde auf 130 °C mit einer Aufheizrate von 20 °C / min erhitzt. Die weiteren Schritte waren: 10 min Erhitzung auf 145 °C (4,2 °C / min), 10 min Erhitzung auf 240 °C (4,1 °C / min) und 10 min Erhitzung auf 320 °C (3 °C / min). Das Interface hatte bei den Analysen in der vorliegenden Arbeit eine Temperatur von 280 °C. Die massenspektrometrische Analyse erfolgte in einem Scanbereich von 50 – 500 amu (atomic mass units) und zur Auswertung der erhaltenen Spektren wurde die Spektrenbibliothek NIST02 (SIS, Ringoes, NJ, USA) verwendet.

2.4.  Bioassays zur Untersuchung der Gewässerextrakte

2.4.1.  Rezeptorbindungsstudien

Mit dieser Methode sollten die Steroidrezeptoren ER und AR bezüglich ihres Bindungsverhaltens für bestimmte Liganden charakterisiert werden. Die Messung der Bindung erfolgte über mit Tritium radioaktiv markiertem E2 oder T. Nicht gebundenes [3H]-E2 oder [3H]-T wurde aus den Ansätzen entfernt. So ließ sich zuerst die Gesamtbindung (total binding, TB) ermitteln, bei der alle Rezeptoren besetzt sind. Die unspezifische Bindung (non-specific bin[Seite 38↓]ding, NB) wurde festgestellt, indem die natürlichen Liganden (E2 oder T) im Überschuss zugegeben wurden, damit alle Rezeptoren von diesen besetzt werden konnten und die gemessene Strahlungsenergie von markierten Liganden stammen musste, die unspezifisch an im Cytosol vorhandene Proteine gebunden waren. Die Differenz aus Gesamt- und unspezifischer Bindung ergab folglich die spezifische Bindung (specific binding, SB) des markierten Liganden an den entsprechenden Rezeptor. Durch Zugabe von unmarkierten Hormonen oder Testsubstanzen konnten die markierten Liganden von den Rezeptoren verdrängt werden.

Mit dieser Methode lassen sich sowohl kinetische Experimente als auch Kompetitionsexperimente durchführen. Da im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollte, ob in den Gewässerextrakten Substanzen vorhanden waren, die an den AR oder ER binden, wurden ausschließlich Kompetitionsexperimente durchgeführt. Für die grundlegenden Aussagen zur Bindungsaffinität und zur Sättigungskonzentration wurde auf die Ergebnisse umfangreicher Untersuchungen von Lutz (1999) zurückgegriffen.

Ein Maß für die Affinität, also für die Bindungsstärke zwischen Rezeptor und Ligand, ist die Dissoziationskonstante Kd. Diese stellt die Konzentration des markierten Liganden dar, wenn dieser 50 % der Rezeptoren besetzt hat. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Kompetitions- oder Verdrängungsexperimenten wurden die Radioliganden ([3H]-E2 oder [3H]-T) in der Konzentration der Kd-Werte eingesetzt. Die Verdrängungskapazität der zu untersuchenden Substanz oder Gewässerprobe wurde bestimmt, indem diese in steigender Konzentration zugegeben wurde. Dadurch wurde der markierte Ligand verdrängt und der Messwert sank proportional zur Verdrängung. Daraus ließen sich Verdrängungskurven ableiten, die durch eine logit-log Transformation linearisiert wurden. Weiterhin wurde der IC50-Wert (inhibiting concentration 50 %) bestimmt, bei dem 50 % des gebundenen markierten Liganden verdrängt wurden.

Chemikalien und Lösungen


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17β-Östradiol (E2)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Testosteron (T)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Tris-HCl-Puffer (direkt vor Gebrauch frisch anzusetzen):

Tris-HCl (20 mM)

Saccharose (250 mM)

Na2-Molybdat (10 mM)

Dithiothreitol (5 mM)



Roth, Karlsruhe

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Aktivkohlesuspension:

Tris-HCl-Puffer

Aktivkohle Norit A (4 – 7 µm; 3,75 %)



Serva, Heidelberg

Dextran T 70 (0,375 %)

Roth, Karlsruhe

Hormonlösung (radioaktiv):

[3H]-17β-Östradiol, 52,0 Ci / mmol

Ethanol 5 %

[3H]-Testosteron, 96,0 Ci / mmol


Amersham, Freiburg

Merck, Darmstadt

Amersham, Freiburg

Szintillationscocktail Ultima Gold

Perkin Elmer, Köln

Durchführung der kompetitiven Rezeptorbindungsstudien

Um aus der Leber von Xenopus laevis das die Steroidrezeptoren enthaltende Cytosol zu gewinnen, wurde der Tris-HCl-Puffer für jeden Versuch neu angesetzt und sofort auf Eis gestellt. Ein männlicher Xenopus laevis wurde durch Eis immobilisiert, mit einer Schere wurde das Genick durchgeschnitten und anschließend das Rückenmark mit einer Präpariernadel zerstört. Die beiden Leberlappen wurden herauspräpariert, in eiskalten Tris-HCl-Puffer gelegt und gewogen. In einem Potter (B. Braun Biotech, Melsungen) wurde die Leber homogenisiert und dann gleichmäßig auf Zentrifugenröhrchen verteilt. In einer Ultrazentrifuge (CO-L60, Beckman, München) wurde mit 12 000 g 12 min bei 4 °C zentrifugiert. Der cytosolhaltige Überstand wurde in neue Zentrifugenröhrchen überführt. Danach erfolgte der zweite einstündige Zentrifugationsschritt mit 35 000 g bei 4 °C. Der Überstand, der das rezeptorhaltige Cytosol enthielt, wurde abgenommen und mit Tris-HCl-Puffer verdünnt, so dass pro Gramm Leber 8 mL Cytosol vorlagen. Dieses wurde sofort auf Eis gekühlt.

Die natürlichen Liganden (E2 und T) wurden als 10-2 M Stammlösungen angesetzt. Diese dienten der Herstellung einer Konzentrationsreihe (10-4 M – 10-9 M). Die 1 000-fach angereicherten Extrakte der Gewässerproben wurden ebenfalls in einer Konzentrationsreihe angesetzt, und zwar unverdünnt, 1 : 2, 1 : 10 uns 1 : 50 verdünnt. Schließlich wurden die Lösungen der radioaktiv markierten Liganden hergestellt, so dass im Ansatz 15 nM [3H]-E2 bzw. 20 nM [3H]-T vorlagen.

Die Inkubationsansätze enthielten jeweils 25 µL [3H]-E2 oder [3H]-T, 150 µL Tris-HCl-Puffer, 100 µL Lebercytosol und 10 µL Wasserextrakt. Wasserextrakte wurden parallel zu einer Konzentrationsreihe von 10-9 M bis 10‑4 M unmarkierten E2 oder T eingebracht. Somit konnte in der Auswertung ein Vergleich des kompetitiven Verdrängungspotentials der Extraktinhaltsstoffe mit dem des natürlichen Liganden durchgeführt werden.

Der Versuchsansatz wurde abgestoppt, indem 300 µL Aktivkohlesuspension zu den Proben gegeben und 5 min inkubiert wurde. Als nächstes wurde 15 min mit 3 500 g zentrifugiert. Im Überstand befanden sich die rezeptorgebundenen Steroide, wohingegen die freien Steroide an die Aktivkohle gebunden und sedimentiert waren. Vom Überstand wurden 400 µL abge[Seite 40↓]nommen und zu maximal 3 mL Szintillationsflüssigkeit in spezielle Plastikfläschchen (PonyVials (Polyethylen), Perkin Elmer, Köln) gegeben. Die Fläschchen wurden geschüttelt und in einen Flüssigkeitsszintillationszähler (LSC, TriCarb 1900TR, Packard, Frankfurt) zum Messen gestellt.

2.4.2.  Induktion der Expression von Biomarkergenen durch Behandlung von primären Hepatocytenkulturen

Aus Lebern von adulten männlichen X. laevis wurden Zellkulturen hergestellt, die mit unterschiedlichen Substanzen und Gewässerextrakten in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden, um die Expression bestimmter Biomarkergene zu induzieren. Bei diesen Biomarkern handelte es sich zum einen um den östrogenen Biomarker ER, welcher der Regulation durch östrogene oder östrogenartige Substanzen unterliegt. Zum anderen wurde das RBP als Biomarker etabliert. RBP wird antagonistisch durch männliche und weibliche Sexualsteroide reguliert und konnte erfolgreich eingesetzt werden, um Aussagen über verschiedene Wirkmechanismen der Testsubstanzen und der Gewässerextrakte zu erhalten.

1.  Herstellung der Zellkulturen

Chemikalien und Lösungen

Aminobenzoesäureethylmethansulfonat (MS-222)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Heparin

Serva, Heidelberg

Trypan-Blau

Merck, Darmstadt

Betäubungslösung:

4 g MS-222 / L Leitungswasser

Heparinlösung:

5000 U Heparin / mL Leitungswasser

Zellkulturmedien (vgl. Tabelle 2-2):

 


[Seite 41↓]

 

Calcium-Magnesium-freies (CMF) Medium, pH 7,5

Verdauungsmedium (VM), pH 7,5

Kulturmedium (minimal essential, ME-Medium)

Chemikalien

Molarität oder Menge

Molarität oder Menge

Molarität oder Menge

NaCl, Merck, Darmstadt

110 mM

110 mM

110 mM

KCl, Merck, Darmstadt

5,4 mM

5,4 mM

5,4 mM

CaCl2*2H2O, Merck, Darmstadt

---

1,86 mM

0,93 mM

MgSO4*7H2O, Merck, Darmstadt

---

---

0,8 mM

Na2HPO4, Merck, Darmstadt

0,34 mM

0,34 mM

0,34 mM

KH2PO4, Merck, Darmstadt

0,44 mM

0,44 mM

0,44 mM

NaHCO3, Merck, Darmstadt

0,05 mM

0,05 mM

0,05 mM

Hepes, Merck, Darmstadt

15 mM

15 mM

15 mM

Vitamine 100x, MEM essential vitamine mixture, BioWhittaker, Verviers, Belgien

---

---

10 mL / L

Aminosäuren 50x, MEM amino acid solution, PAN Biotech, Aidenbach

---

---

20 mL / L

Penicillin, BioWhittaker, Verviers, Belgien

10 000 U / 100 mL

10 000 U / 100 mL

10 000 U / 100 mL

Streptomycin, BioWhittaker, Verviers, Belgien

10 mg / 100 mL

10 mg / 100 mL

10 mg / 100 mL

NaEDTA, Serva, Heidelberg

5 mM

---

---

L-Glutamin, BioWhittaker, Verviers, Belgien

---

---

1 mM

Kollagenase (Collagenase D, 0,250 U / mg), Roche Diagnostics, Mannheim

---

40 mg

---


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Durchführung der Zellkulturherstellung

Die Herstellung der primären Leberzellkulturen aus Lebern von X. laevis erfolgte nach der Methode von Kloas et al. (1999). Adulte männliche Tiere wurden mit einer Überdosis MS-222 betäubt. Danach wurde ihnen 0,6 mL Heparinlösung injiziert, um die Blutgerinnung zu verhindern. Unter einer Sterilbank (Kendro, Rodenbach) wurde die Bauchhöhle und der Herzbeutel der Tiere geöffnet. Mit einer Kunststoffkanüle wurde ein Herzkatheder in den Vorhof des dreikammerigen Froschherzes gelegt. Dadurch wurde eine rückläufige Perfusion der Leber erreicht.

Zuerst wurde die Leber mit 125 mL CMF-Medium, das langsam aus einem Schütteltrichter durch einen Silikonschlauch in das Herz floss, durchgespült, um Blut und Ca2+-Ionen zu entfernen. Danach folgte die Behandlung mit 125 mL Verdauungsmedium, das durch die enthaltene Kollagenase das Kollagen im Bindegewebe der Leber auflöste und schließlich wurde nochmals mit 100 mL CMF-Medium gespült, um die restliche Kollagenase und die Ca2+-Ionen auszuwaschen.

Anschließend wurde die Leber herauspräpariert, in eine sterile Petrischale überführt und mit eiskaltem CMF-Medium überschichtet. Die Leberhälften wurden mit einer Rasierklinge zerkleinert und durch Filtration der Zellsuspension durch Gazenetze unterschiedlicher Maschenweite (250 µm bzw. 50 µm) wurden die Zellbestandteile endgültig von Geweberesten getrennt. Im Filtrat befanden sich somit noch Hepatocyten, Erythrocyten und Melanocyten. Um Erythrocyten und Melanocyten möglichst vollständig zu entfernen, wurden drei Zentrifugationen (Megafuge 1.0R, Kendro, Rodenbach) durchgeführt (700 g – 10 min, 500 g – 5 min, 300 g – 5 min). Der Über­stand wurde nach jedem Zentrifugationsschritt verworfen und das Pellet wurde in CMF-Medium resuspendiert. Nach der letzten Zentrifugation erfolgte die Aufnahme der Zellen in ME-Medium, das jeweils vor Gebrauch neu angesetzt wurde. Alle eingesetzten Medien wurden steril filtriert.

Die Zellen wurden mit einer Zählkammer (Neubauer, Roth, Karlsruhe) unter einem Inversionsmikroskop (Axiovert 25, Carl-Zeiss Inc., Jena) ausgezählt und auf 106 Zellen / mL verdünnt. Der Vitalitätstest wurde stichprobenartig mit Trypan-Blau durchgeführt. Dabei färbten sich bei intakten Zellen die Zellmembranen blau, wohingegen tote oder geschädigte Zellen vollständig blau gefärbt erschienen, da ihre Zellmembran das Trypan-Blau nicht zurückhalten konnten. Zur Kultivierung der Zellen wurden Zellkulturschalen mit 24 Kavitäten (Falcon Primaria, Heidelberg) verwendet. Es wurden 500 µL Zellsuspension in jede Kavität gegeben, so dass ungefähr 500 000 Zellen darin vorhanden waren. Die Kulturplatten wurden in einen Brutschrank (Heraeus, Kendro, Rodenbach) überführt, in welchem sie sich zwei Stunden lang [Seite 43↓]bei 20 °C und hoher Luftfeuchtigkeit befanden, damit sich die Zellen absetzen und an die Oberfläche der Kulturschalen anheften konnten.

2.  Behandlung der Zellkulturen

Bevor die Zellkulturen für das Screening von Umweltproben eingesetzt werden konnten, musste getestet werden, welche Kultivierungs- und Behandlungsgegebenheiten geeignet waren, um eine möglichst sensitive Antwort der Zellen auf eine Exposition mit ED zu erhalten.

Lösungen und Testsubstanzen

ME-Medium

s. 2.4.2.1

Ethanol 99 % p.a

Roth, Karlsruhe

E2

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

EE

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

BPA

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Tamoxifen (TAM)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

T

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Dihydrotestosteron (DHT)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Methyltestosteron (MT)

Sigma-Aldrich, Schnelldorf

Vinclozolin (VC)

Riedel-de-Haen, Seelze

Trizol

Invitrogen, Karlsruhe

Durchführung der Zellbehandlung

Zum Ermitteln des geeigneten Expositionszeitraumes wurden 28, 32 und 36 Stunden nach Beginn der Behandlung die Zellen entnommen. Als Testsubstanzen wurden jeweils die Lösungsmittelkontrolle (Ethanol 99 % p.a.) sowie E2, EE, DHT und T in den Konzentrationen 10-9 M, 10-8 M und 10-6 M eingesetzt. Die Auswertung der jeweiligen Biomarkerexpression ergab den geeigneten Kultivierungszeitraum und das geeignete Behandlungszeitintervall.

Zur Etablierung des RBP als neuem Biomarker wurden die Leberzellen mit folgenden Chemikalien behandelt, deren Strukturformeln die Abbildung 2-3 zeigt (Strukturen für E2 und BPA vgl. Abb. 2-1):

Östrogene Substanzen E2, EE und BPA;

Antiöstrogene Substanz TAM;

Androgene Substanzen T, DHT und MT;

Antiandrogene Chemikalie VC.


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Abb. 2-3: Strukturformeln der in die Zellkulturen eingesetzten Testsubstanzen. EE: 17α-Ethinylöstradiol, TAM: Tamoxifen, T: Testosteron, DHT: Dihydrotestosteron, MT: Methyltestosteron, VC: Vinclozolin.

Alle Substanzen wurden in Ethanol 99 % p.a. gelöst und es wurden jeweils 5 µL Lösung einer Konzentrationsreihe der jeweiligen Substanz pro Kavität eingesetzt. Die Konzentrationsreihe umfasste Konzentrationen von 10-9 M bis 10-6 M. Die Chemikalien wurden sowohl einzeln als auch in bestimmten Kombinationen getestet. Dabei wurden jeweils T-, DHT-, MT- und [Seite 45↓]TAM-Konzentrationsreihen mit EE 10-6 M kombiniert. Weiterhin wurden Zellen mit DHT 10-6 M und einer VC-Konzentrationsreihe in Kombination behandelt. Für die jeweiligen Behandlungsansätze wurden die Kontrollkavitäten entsprechend mit einem höheren Volumen Lösungsmittel versetzt (10 µL). Ebenso wurden die Positivkontrollen (EE 10-6 M bzw. DHT 10-6 M) zusätzlich mit 5 µL Ethanol versetzt, um ebenfalls das Endvolumen von 10 µL in den Kombinationsexperimenten zu erreichen.

Zum Screening der Extrakte der Gewässerproben wurden die Zellen mit der Lösungsmittelkontrolle (Ethanol), den Positivkontrollen (EE 10-6 M und DHT 10-6 M) sowie den Extrakten der Gewässerproben behandelt. Diese wurden unverdünnt, 1 : 2, 1 : 5 und 1 : 10 verdünnt eingesetzt. Alle Behandlungen erfolgten als Doppelansatz in jeweils drei separaten Zellkulturen.

Aus den Vorversuchen ging hervor, dass die Zellen am empfindlichsten reagierten, wenn die erste Chemikalienzugabe erfolgte, nachdem die Zellen zwei Stunden zum Absetzen im Brutschrank gestanden hatten. Danach fand alle 12 Stunden ein Mediumswechsel und eine erneute Chemikalienzugabe statt. Beim Mediumswechsel wurde das ME-Medium in den Kavitäten vollständig mit einer Pipette abgezogen. Dann wurden vorsichtig 500 µL Medium hinzugegeben, die wiederum vollständig entnommen wurden. Schließlich wurden nochmals 500 µL ME-Medium in die Kavitäten gegeben. Durch diese Vorgehensweise sollte ein möglichst vollständiger Austausch des Mediums gewährleistet werden. Nach dem Mediumwechsel fand die Chemikalienzugabe statt und die Zellen kamen für weitere 12 Stunden in den Brutschrank. Nach 36 Stunden wurde der Versuch beendet. Das Medium wurde vollständig abgenommen. Die Zellen wurden in 500 µL Trizol resuspendiert und in sterile 2 mL Eppendorfgefäße mit flachem Boden überführt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zur Weiterverarbeitung konnten die Zellen bei -70 °C aufbewahrt werden.

3.  Aufarbeitung der behandelten Hepatocyten

Lösungen und Chemikalien


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Taq-Polymerase

Amersham, Freiburg

PCR-Puffer (pH 9)

Amersham, Freiburg

Zusammensetzung:

 

KCl

MgCl2
Tris-HCl

500 mM

15 mM

100 mM

RBP-Primer

TipMOL, Berlin

Sequenz forward: 5’-ATTAATTGCCTTGGGGTTCC-3’

Sequenz reverse: 5’-TGGCTAGAGCCCCATGATAC-3’

Durchführung der Aufarbeitung

Aus den Leberzellen wurde die Gesamt-RNA isoliert. Das Durchführungsprotokoll entsprach dem in Kapitel 2.2.4.2 beschriebenen bis auf eine zusätzliche Zentrifugation der Proben. Die beim Homogenisieren der Zellen freigesetzten Pigmentmoleküle aus den Melanocyten, die bei der Zellkulturherstellung nicht vollständig entfernt werden konnten, beeinflussten den Reinheitsgrad der RNA. Eine nützliche Lösung dieses Problems war, nach der Homogenisierung der Zellen 5 min bei 10 000 g zu zentrifugieren. Danach wurde der Überstand von den Pigmenten getrennt und in ein neues Gefäß überführt, in dem dann die RNA-Fällung stattfand.

Das Umschreiben der RNA in cDNA erfolgte gemäß Kapitel 2.2.4.3. Die Amplifikation des ER aus den Zellen erforderte eine Änderung der Annealing-Temperatur. Diese musste auf 65 °C angehoben werden, da eine andere Taq-Polymerase verwendet wurde, die ein höheres Temperaturoptimum aufwies. Ansonsten wurden die PCR-Protokolle für den ER und den EF als internen Standard wie in Kapitel 2.2.4.4 verwendet.

Zur Amplifikation des RBP wurde ein spezifischer Primer synthetisiert. Es wurden 3 µL cDNA-Lösung eingesetzt und ein Premix zu jeder Probe dazu gegeben, der aus 18,7 µL PCR-Wasser, 2,5 µL PCR-Puffer, 0,2 µL dNTPs, 0,2 µL Primer forward, 0,2 µL Primer reverse und 0,2 µL Taq-Polymerase bestand. Die Amplifikation wurde gestartet, indem das Gemisch im Thermocycler auf 94 °C erhitzt wurde. Daraufhin folgten 23 Zyklen dreier Temperaturschritte (94 °C – 1 min, 62 °C – 1 min, 72 °C – 1 min). Das Programm endete nach einer zweiminütigen Phase bei 72 °C und anschließender Abkühlung auf 10 °C. Alle PCR-Durchläufe wurden doppelt angesetzt.

Die Amplifikation der RBP-mRNA ergab ein PCR-Produkt mit einer Länge von 323 bp. Die Auftrennung und Färbung der Produkte sowie die Auswertung erfolgte wie in Kapitel 2.2.4.5 beschrieben. Eine Sequenzierung der erhaltenen Produkte bestätigte die Übereinstimmung mit der RBP-Sequenz für Xenopus laevis (Seqlab, Göttingen).


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2.5.  Statistik

Die statistische Analyse der Daten hinsichtlich signifikanter Unterschiede wurde mit der statistischen Software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Version 9.0.1, SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Dabei kamen zur Analyse der BPA-Ergebnisse als Testverfahren der Kruskal-Wallis-Test (Kruskal & Wallis 1952) sowie der Mann-Whitney U-Test (Weber 1986) zur Anwendung. Mit dem Kruskal-Wallis-Test wurde geprüft, ob die Wertegruppen einer Grundgesamtheit entstammten, damit ein Vergleich zweier Gruppen auf signifikante Unterschiede gerechtfertigt werden konnte. Zwei Gruppen wurden daraufhin mit dem parameterfreien Mann-Whitney U‑Test auf signifikante Unterschiede getestet. Als Signifikanzniveau (p) wurde in der Regel p < 0,05 definiert, bei Bedarf erfolgte eine Gewichtung der signifikanten Unterschiede durch Signifikanzniveauintervalle (p < 0,05, p < 0,01 und p < 0,001).

Die statistische Analyse der Zellkulturansätze erfolgte nach dem Wilcoxon-Test für gepaarte Werte (van der Waerden 1969), um signifikante Unterschiede zwischen den jeweiligen Behandlungen und den (Positiv)kontrollgruppen festzustellen.


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21.04.2005