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3.  Ergebnisse

3.1.  In vivo-Exposition von Kaulquappen

Die Wirkungen von ED auf den sich entwickelnden Gesamtorganismus ließen sich durch Expositionsexperimente nachweisen. Bei der Larvalentwicklung von Xenopus laevis ist die Geschlechtsentwicklung von den Sexualsteroiden abhängig. Durch die Bestimmung des Geschlechterverhältnisses der Tiere nach der Metamorphose konnte die Wirkung verschiedener Substanzen nachgewiesen werden (Witschi & Allison 1950; Kloas 2002; Bögi et al. 2002).

In der vorliegenden Arbeit beschränkten sich die Expositionsexperimente auf die Untersuchung der bekannten östrogen wirksamen Chemikalie Bisphenol A. Da bereits in einem anderen Zusammenhang die verweiblichenden Effekte dieser Substanz in Expositionsversuchen gezeigt wurden (Kloas et al. 1999), konnte auf diese Erkenntnisse aufgebaut werden. Eine umfassende Studie der Wirkungen verschiedener BPA-Konzentrationen sowie des Abbauverhaltens von BPA im Expositionsansatz wurden durchgeführt. Als Positivkontrolle diente E2, das in zahlreichen Versuchen unserer Arbeitsgruppe als konstant verweiblichende Chemikalie wirkte.

3.1.1.  Wirkungen von BPA auf die Sexualdifferenzierung von Xenopus laevis

BPA wurde in zwei Expositionsversuchen getestet. Im ersten Versuch wurde zum Standardmedium 10-7 M und 10-8 M E2 in die Becken der Positivkontrolle und 10-7 M und 10-8 M BPA in die Behandlungsbecken gegeben. In vorangegangenen Testdurchgängen der Experimente waren keine Schädigungen der Tiere durch die zugegebenen Substanzen in den entsprechenden Konzentrationen festgestellt worden. Die Sterberate der Kaulquappen wurde in jedem Becken dahingehend untersucht, ob sie sich signifikant von derjenigen anderer Becken unterschied. Dies konnte ausgeschlossen werden, so dass kein Zusammenhang zwischen Sterberate und Behandlung der Tiere gefunden wurde. Daraufhin wurden Tiere aus Becken gleicher Behandlung zur Auswertung zusammengeführt. Der relative Anteil der toten Tiere während dieses Expositionsexperiments lag in allen Becken zwischen 20 und 30 %. [Seite 49↓]Von den überlebenden Tieren vervollständigten mindestens 75 % die Metamorphose. Es konnten aus jedem Behandlungsbecken Tiere entnommen werden, die vorzeitig die Metamorphose beendet hatten, so dass kein Zusammenhang zwischen Behandlung und Entwicklungsdauer festzustellen war. Die vollständig entwickelten Frösche sowie Kaulquappen ab dem Entwicklungsstadium 56 wurden nach Beendigung des Experiments der Auswertung zugeführt. Die Ungleichverteilung der gestorbenen sowie der unterentwickelten Tiere in den einzelnen Becken erklärt die Varianz der Stichprobenanzahl (n) in Abbildung 3-1.

Abb. 3-1: Prozentuale Verteilung der Geschlechter in den unterschiedlichen Kontroll- und Behandlungsgruppen (17β-Östradiol (E2) und Bisphenol A (BPA) jeweils 10-7 M und 10-8 M). Die schwarze Linie unterteilt die Graphik in die Anteile der Männchen und Weibchen der Kontrollgruppe. Die Sterne bezeichnen statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle (***: p < 0,001; *: p < 0,05). Die Stichprobenanzahl (n) ist angezeigt.

Die Auswertung des ersten Expositionsexperiments ergab, dass das Geschlechterverhältnis der Tiere des Kontrollbeckens einen leicht erhöhten Männchenanteil aufwies (56 % Männchen zu 44 % Weibchen). Die Frösche der Positivkontrollen zeigten eine signifikante Erhöhung (p < 0,001) des [Seite 50↓]Weibchenanteils im Vergleich zur Kontrolle, sowohl bei Behandlung mit 10‑7 M als auch mit 10-8 M E2 (81 % bzw. 84 %). Der Weibchenanteil (69 %) der Tiere, die mit BPA behandelt wurden, war bei einer Konzentration von 10‑7 M signifikant erhöht (p < 0,05), wobei dieser weniger stark ausgeprägt war als bei gleicher E2-Konzentration. 10-8 M BPA wirkte nicht signifikant verweiblichend. Dennoch erzeugte diese Konzentration einen Weibchenüberschuss (65 %) im Vergleich mit der Kontrolle (Abb. 3-1).

Abb. 3-2: Prozentuale Verteilung der Geschlechter in den unterschiedlichen Kontroll- und Behandlungsgruppen (17β-Östradiol (E2) 10-7 M und Bisphenol A (BPA) 10-6 M, 10-7 M und 10-8 M). Die schwarze Linie unterteilt die Graphik in die Anteile der Männchen und Weibchen der Kontrollgruppe. Die Sterne bezeichnen statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle (***: p < 0,001; *: p < 0,05). Die Stichprobenanzahl (n) ist angezeigt.

Die Ergebnisse des zweiten Expositionsansatzes stellt Abbildung 3-2 dar. Unterschiede zum ersten Ansatz bestanden darin, dass als Positivkontrolle nur 10-7 M E2 eingesetzt wurde. Die Behandlung mit BPA erfolgte in drei Konzentrationen (10-6 M, 10-7 M und 10-8 M) und die Tiere wurden nach Beendigung der Metamorphose gewogen, um einen möglichen Einfluss der [Seite 51↓]Chemikalienzugabe auf einen Wachstumsparameter (Körpergewicht) festzustellen (Abb. 3-3).

Die Sterberate im zweiten Expositionsansatz war im Vergleich zum ersten geringer (10 – 20 %). Mindestens 75 % der überlebenden Tiere beendeten den Metamorphoseprozess. Eine statistische Untersuchung der Anzahl der gestorbenen oder unterentwickelten Tiere in den jeweiligen Testbecken ergab keine Signifikanzen hinsichtlich der Behandlung. Folglich wurden parallele Behandlungsgruppen in der Auswertung zusammengeführt. Die Ungleichverteilung der Stichprobenanzahl (n) ist wiederum auf die unterschiedlich hohen Sterbe- und Entwicklungsraten in den einzelnen Becken zurückzuführen.

Abb. 3-3: Mittleres Körpergewicht der juvenilen Frösche unmittelbar nach Abschluss der Metamorphose. Die unterschiedliche Anzahl der Stichproben (n) erklärt sich aus der unterschiedlich hohen Sterbe- und Entwicklungsrate in den einzelnen Becken. Das Körpergewicht wurde als Lebendgewicht gemessen, die Standardabweichungen sind angezeigt.

Im zweiten Expositionsansatz konnte ein leicht erhöhter Männchenanteil (52 %) in der Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Behandlung der Tiere mit 10-7 M E2 führte zu einem Weibchenanteil von 96 %. Dieser war signi[Seite 52↓]fikant verschieden von der Kontrollgruppe. Bei den verschiedenen BPA-Behandlungen zeigten zwei Gruppen keine Verweiblichungseffekte (10-6 M: 47 % Hoden und 53 % Ovarien; 10-8 M: 49 % Hoden und 51 % Ovarien). Die zwischen diesen beiden Konzentrationen liegende BPA-Konzentration (10‑7 M) verursachte wie im ersten Expositionsversuch einen signifikant erhöhten Weibchenanteil (70 %, Abb. 3-2).

Das durchschnittliche Gewicht der Frösche aus den einzelnen Behandlungsgruppen unterschied sich im statistischen Vergleich nicht signifikant voneinander. Tiere der Kontroll- und der E2-Behandlungsgruppen wiesen ein ähnliches durchschnittliches Körpergewicht nach der Metamorphose auf (334 mg bzw. 340 mg). Alle drei BPA-Behandlungsgruppen (10-6 M, 10-7 M und 10-8 M) zeigten ein erhöhtes durchschnittliches Körpergewicht der Tiere (363 mg, 372 mg und 382 mg) verglichen mit den Kontroll- und E2-Gruppen (Abb. 3-3).

3.1.2.  Wirkungen von BPA auf die Gonadenentwicklung

Durch das Fixieren der Gonaden wurde die Struktur der Hoden oder Ovarien deutlich sichtbar gemacht, so dass Entwicklungsstörungen des gesamten Organs beobachtet werden konnten. In keinem der untersuchten Tiere wurde eine oberflächliche Fehlentwicklung der Gonaden festgestellt. Es ließen sich jedoch kleinere Unterschiede in der Größe der jeweiligen Gonaden beobachten, die grundsätzliche Gestalt der jeweiligen Geschlechtsorgane änderte sich allerdings nicht. Sämtliche Tiere wiesen die typischen morphologischen Merkmale der entsprechenden Gonaden auf.

Die Hoden lagen bei ventraler Betrachtung dem kopfnahen Drittel der Nieren auf und zeigten sich nach Fixierung als einheitliches weißes Gewebe, das am unteren Ende spitz zulief (Abb. 3-4, B). Die Ovarien zeigten eine schwammartige, gelappte Struktur, die sich über den gesamten Nierenbereich ausbreitete und mit schwarzen Punkten durchsetzt war. Dabei handelt es sich um eingelagerte Melanocyten, die ausschließlich in den Ovarien auftreten und den Hoden fehlen (Abb. 3-4, A).

Die Betrachtung der Gonaden hinsichtlich morphologischer Auffälligkeiten ließ keine Rückschlüsse auf fehlerhafte Entwicklungen auf zellulärer Ebene zu. Eine Untersuchung der Zellstrukturen in den Geweben sollte hierüber Auskunft geben. Auf Grund der Tatsache, dass die Testsubstanz BPA verweiblichend wirkt, wurden systematisch die Hoden der männlichen Tiere [Seite 53↓]des zweiten Expositionsansatzes histologisch untersucht. Bis auf zwei der untersuchten histologischen Präparate zeigten alle anderen Schnitte eine einheitliche Struktur. Dabei konnten die typischen zellulären Bestandteile eines Hodens identifiziert werden (Tubuli seminiferi mit Sertoli-Zellen und verschiedenen Entwicklungsstadien der Keimzellen, glatte Muskelzellen und Leydigsche Zellen in den Lymphräumen), wobei teilweise Unterschiede im Entwicklungszustand vorlagen (Abb. 3-5, C).

Abb. 3-4: Morphologie von Gonaden der juvenilen Frösche. Bild A zeigt ein typisches Beispiel eines Ovarien-Nieren-Kompexes, Bild B stellt einen typischen Hoden-Nieren-Komplex dar. Die Fixierung erfolgte mit Bouin-Lösung, die Vergrößerung ist 60 x.

Bei den beiden Ausnahmen handelte es sich um Tiere aus den 10-8 M BPA-Behandlungsbecken. Es wurden jeweils Oocyten im Hodengewebe entdeckt. Diese Fehlentwicklung ließ sich auf Grund der geringen Häufigkeit nicht statistisch mit der Behandlung korrelieren, so dass im vorliegenden Fall von zufälligem Auftreten ausgegangen werden musste (Abb. 3-5, B).

Es wurden stichprobenhaft histologische Präparate von Ovarien angefertigt, um die normale zelluläre Entwicklung zu überprüfen. In den untersuchten Schnitten der weiblichen Geschlechtsorgane wurden keine Fehlentwicklungen erkannt und alle Exemplare zeigten die typischen Zellen eines [Seite 54↓]Ovars (verschiedene Entwicklungsstadien der Ovarialfollikel, Bindegewebe mit endokrinen Zellen, Abb. 3-5, A).

Abb. 3-5: Drei histologische Präparate unterschiedlicher Gonaden. A: Schnitt durch ein Ovar. Die unterschiedlichen Reifestadien der Follikel sind zu erkennen. B: Schnitt durch eine Zwittergonade. Im Hodengewebe liegen deutlich sichtbar zwei Oocyten. C: Schnitt durch einen Hoden. Tubuli seminferi sowie Muskel- und Leydigsche Zellen sind erkennbar. Die Färbung erfolgte mit Mayers Hämatoxylin-Eosin, die Vergrößerung ist 200 x.

3.1.3.  Nachweis der ER-mRNA-Expression in Kaulquappen nach kurzzeitiger Behandlung mit BPA

Die Feststellung, dass BPA die Ausbildung weiblicher Geschlechtsorgane induzieren kann, lässt keine Aussage über den Wirkmechanismus dieser Substanz zu. Aus diesem Grund wurden Kaulquappen während der für die Sexualdifferenzierung sensiblen Entwicklungsphase (ab Stadium 50) zwei Wochen lang sowohl mit der wirksamsten BPA-Konzentration (10-7 M) als auch in einem Positivkontrollbecken mit der entsprechenden E2-Konzentration behandelt. Diesem Versuchsansatz lag die Vermutung zu Grunde, dass BPA seine Wirkung über eine Bindung an den ER vermittelt.

Die Untersuchung dieser Hypothese erfolgte, indem gezeigt wurde, dass BPA die Genexpression eines bestimmten östrogenen Biomarkers induzieren kann und dass dessen Expression durch den Liganden-Rezeptor-Transkriptionskomplex reguliert wird. Die Voraussetzungen für einen östrogenen Biomarker erfüllt in Kaulquappen der ER selbst, da eine Erhöhung der ER-Synthese durch den ER selbst induziert wird (Rabelo & Tata 1993).


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Abb. 3-6: ER-mRNA-Expression in Kaulquappen nach kurzzeitiger Behandlung (14 Tage) mit BPA und E2 (jeweils 10-7 M). Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05), Standardabweichungen sind angezeigt.

Im Vergleich mit der Expression in der Lösungsmittelkontrollgruppe wurde die mRNA-Expression des ER durch E2 um das 2,7-fache und durch BPA um das 2,1-fache erhöht. Diese Erhöhung erwies sich jeweils als statistisch signifikant (p < 0,05). Abbildung 3-6, A zeigt einen Ausschnitt eines Agarosegels mit den entsprechenden PCR-Produkten des ER und des internen Standards EF. Die Darstellung der Ergebnisse der semiquantitativen Analyse der PCR-Produkte erfolgte in mittleren Relativwerten. Die Expression des ER in der Kontrolle wurde dabei als 100 %-Wert definiert (Abb. 3-6, B).


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3.1.4.  Nachweis von BPA in den Expositionsversuchen

Im zweiten Expositionsansatz wurde BPA in drei Konzentrationen eingesetzt (10-6 M, 10-7 M und 10-8 M). Mit Hilfe von Wasserproben, die direkt nach der Chemikalienzugabe bzw. vor dem Wasserwechsel (48 Stunden später) genommen wurden, sollte zum einen gezeigt werden, ob sich die Nominalkonzentration in den Testbecken wiederfinden ließ und zum anderen, wie viel BPA nach zwei Tagen noch in den Becken zu finden war.

Abb. 3-7: Ausgewählter BPA-Peak als Ergebnis einer BPA-Analyse mittels HPLC (A) und eine Kalibrierkurve für die BPA-Quantifizierung (B). Kalibrierungsfunktion und Korrelationskoeffizient (R2) sind angegeben. Die Angabe der BPA-Konzentration ist als mg / L des Lösungsmittels zu verstehen.


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Als Grundlage für den analytischen Nachweis von BPA wurde eine chemische Analysemethode, die auf HPLC-Trennung beruhte, entwickelt (vgl. Kapitel 2.2.5). Es wurde eine Kalibrierkurve erstellt, um die Quantifizierung des BPA-Gehaltes in den Wasserproben zu gewährleisten (Abb. 3-7). Weiterhin wurden die Wiederfindungsrate und die Nachweisgrenze von BPA bestimmt. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate von BPA lag bei 92 % und die Nachweisgrenze bei 200 ng / L. Die Berechnungen erfolgten nach (Funk et al. 1992).

In Wasser aus den Kontroll- bzw. Positivkontrollbecken konnte kein BPA nachgewiesen werden. Die Untersuchungen der Wasserproben aus den BPA-Becken ergaben bei jeder Konzentration zu Beginn der Behandlung, dass 90 – 105 % der Nominalkonzentration vorhanden waren. Nach 48 h ließen sich jeweils 15 – 30 % der eingesetzten BPA-Konzentrationen nachweisen (Abb. 3-8).

Abb. 3-8: Analyse der BPA-Konzentration zu Beginn der Behandlung und nach 48 h. Zum Vergleich ist die Nominalkonzentration dargestellt. BPA 1 = 10‑8 M (= 2,23 µg / L) , BPA 2 = 10-7 M (= 22,3 µg / L), BPA 3 = 10-6 M (= 223 µg / L). Stichprobenanzahl (n) und Standardabweichungen sind angegeben.


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Weiterhin wurden Messungen der BPA-Konzentration in Intervallen von 6 Stunden (48 h) durchgeführt, im Zeitraum zwischen zwei aufeinanderfolgenden Wasserwechseln. Die Wasserproben stammten aus drei verschiedenen Behandlungsbecken, nämlich aus Becken, die nur BPA und Standardmedium beinhalteten (A). Weiterhin aus Becken, die BPA, Standardmedium und Futter enthielten (B) sowie aus Becken des Expositionsansatzes, in denen sich BPA, Standardmedium, Futter und Kaulquappen befanden (C). Alle drei Ausgangskonzentrationen von BPA (10-6 M, 10-7 M und 10-8 M) wurden jeweils in den drei Behandlungsbecken eingesetzt.

Abb. 3-9: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10-6 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.


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Die Messung der BPA-Konzentration in den einzelnen Ansätzen ergab, dass BPA im reinen Standardmedium nach 48 h noch mit mindestens 70 % der Nominalkonzentration nachgewiesen werden konnte. Ähnlich verhielt es sich mit der Behandlung B, in der ebenfalls 70 % der Nominalkonzentration gefunden wurde. Lediglich bei 10-8 M BPA sank die Konzentration auf unter 50 % der Nominalkonzentration. Wie erwartet und aus den vorherigen Analysen schon bekannt, enthielten die Wasserproben aus Becken mit der tatsächlichen Expositionszusammensetzung nach 48 h nur noch 15 – 30 % BPA (Abb. 3-9, 3-10, 3-11).

Abb. 3-10: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10-7 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.

Abb. 3-11: Zeitverlauf der BPA-Konzentration in Proben aus drei verschiedenen Behandlungsbecken. Nominalkonzentration 10-8 M. Behandlung A: Standardmedium und BPA. Behandlung B: Standardmedium, Futter und BPA. Behandlung C: Standardmedium, Futter, Kaulquappen und BPA. Die Linien stellen den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar. Standardabweichungen sind angezeigt, die Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Probennahmen.

3.1.5.  Nachweis von BPA in Umweltproben

Da in Umweltproben eine Vielzahl von chemischen Verbindungen vorliegt, konnte BPA nicht mittels HPLC-Technik nachgewiesen werden. Es wurde eine alternative Analysemethode entwickelt, die auf der Trennung und Konzentrationsbestimmung mittels GC / MS beruhte. Dazu war es wiederum erforderlich, eine Kalibrierkurve zur Quantifizierung von BPA zu erstellen (Abb. 3-12) und die Wiederfindungsrate sowie die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für BPA zu bestimmen. Die Ergebnisse beruhen auf Mittelwerten aus drei unabhängigen Messungen. Die Wiederfindungsrate betrug im Mittel 105 %. Die Nachweisgrenze lag bei 1,9 µg / L und die Bestimmungsgrenze bei 5,37 µg / L.


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Abb. 3-12: Massenspektrum von Bisphenol A (A) und Kalibrierkurve für die BPA-Quantifizierung mittels GC / MS (B). Kalibrierungsfunktion und Korrelationskoeffizient (R2) sind angegeben. Die Angabe der BPA-Konzentration ist als mg / L des Lösungsmittels zu verstehen.

Da die Herstellung von Extrakten aus den Gewässerproben viele Schritte der Probenvorbereitung und Aufarbeitung umfasste (vgl. Kapitel 2.3), wurde die komplette Aufarbeitung auch mit destilliertem Wasser durchgeführt, um eventuell auftretende Hintergrundsignale von den Probensignalen subtrahieren zu können. Dadurch wurde gewährleistet, dass in den Gewässerextrakten keine methodischen Artefakte gemessen wurden.


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BPA wurde im Flussverlauf in Proben aller Entnahmestellen gefunden. Abbildung 3-13 zeigt die um den Anreicherungsfaktor 1000 bereinigte BPA-Konzentrationen in der Alb bzw. in den Kläranlagenausläufen. Dabei fällt auf, dass BPA bereits in erheblichen Mengen (2,5 ng / L) in der Nähe der Albquelle (Alb 0) auftrat. Diese Konzentration stieg auf mehr als 4 ng / L bis zur nächsten Porbennahmestelle (Alb 1) an. Im Kläranlagenauslaufwasser der Kläranlage Neurod (Alb 2) wurde keine relevante Erhöhung der BPA-Menge festgestellt und auch bei Alb 3 und Alb 4 blieb der Wert in etwa konstant. Eine starke Erhöhung um das 4-fache erlangte der Messwert im Auslaufwasser der Kläranlage Neureut (16,2 ng /L ). Im Fluss selbst nahm der Wert nach dem Klärwasser-Einleitkanal wieder ab (Alb 6), allerdings blieb er fast doppelt so hoch (7,3 ng /L ) wie vor der Kläranlage (Alb 4). Eine statistische Auswertung dieser Messergebnisse konnte nicht erfolgen, da es sich um Einzelbestimmungen eines bestimmten Probennahmezeitraumes (Juli 2001) handelte.

Abb. 3-13: BPA-Nachweis und -Quantifizierung im Flussverlauf der Alb. Die einzelnen Probennahmestellen sind in Kapitel 2.3.1 beschrieben. Die Werte stammen aus einer Einzelbestimmung eines Probennahmezeitraumes (Juli 2001). Die Linie stellt den gleitenden Durchschnitt der Messwerte dar.


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3.2.  endokrin wirksame Substanzen in Gewässerproben

3.2.1.  Rezeptorbindungsstudien mit Gewässerextrakten

Der Nachweis der Bindung von Wasserinhaltsstoffen an den Östrogen- oder Androgenrezeptor liefert einen Hinweis darauf, ob ED im Albwasser vorhanden sind, die den natürlichen Liganden vom Rezeptor verdrängen können. Dazu wurden die Fraktionen der 1000-fach konzentrierten Gewässerextrakte der Probenahme vom Juli 2001 (vgl. Kapitel 2.3.4) in Rezeptorbindungsstudien getestet. Die Bestimmung des Bindungspotenzials erfolgte in zwei unabhängigen Experimenten. Die Rezeptoren wurden aus Lebern von männlichen adulten Xenopus laevis gewonnen.

Abb. 3-14: Beispielkurven der kompetitiven Verdrängung von [3H]-E2 bzw. [3H]-T vom ER durch E2 bzw. T (A) sowie Verdrängungskurven eines Alb-Extraktes (B, Mittelwerte, n = 2). Die entsprechenden Geraden nach logit / log -Umformung zeigen die Teilabbildungen C und D. Durch diese Umformung lässt sich das Bindungspotenzial der Alb- und Kläranlagenauslaufextrakte in E2- bzw. T-Äquivalenten berechnen.


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Beispielhaft soll anhand von Abbildung 3-14 erläutert werden, wie die Verdrängungskurven und die anschließende mathematische Transformation zu Werten für das Verdrängungspotenzial von Gewässerinhaltsstoffen aus den Extrakten führt.

Die in den Rezeptorbindungsstudien erhaltenen Kompetitionskurven wurden durch logit / log – Transformation linearisiert. Die Geradengleichung (y = ax + b) der Regressionsgeraden ergab den Wert für logit = 0. Mit diesem Wert konnte durch Invertierung des Logarithmus der IC50-Wert (Inhibiting Concentration 50 %) der natürlichen Liganden und der Probenextrakte berechnet werden. Bei jedem neuen Versuchsansatz wurde eine Verdrängungskurve des entsprechenden natürlichen Liganden erstellt und der IC50-Wert bestimmt, um die entsprechenden getesteten Proben mit diesem Wert korrelieren zu können. Aus diesem Grund wird die Berechnung an dieser Stelle beispielhaft für die in Abbildung 3-14 aufgeführten Verdrängungskurven der natürlichen Liganden E2 und T aufgeführt: Die Geradengleichungen lauten y = -1,228 x - 8,580 (E2) und y = -1,393 x - 10,155 (T). Daraus ergeben sich nach Invertierung des Logarithmus die IC50-Werte 1,03 * 10-7 M (E2) und 5,1 * 10-8 M (T).

Die Verdrängungsdaten der Gewässerextrakte wurden über Konzentrierungsstufen ermittelt, da absolute Konzentrationsangaben zu Inhaltsstoffen in komplexen Gemischen nicht möglich sind. Folglich musste die Verdrängungskapazität der Albproben durch die Berechnung von E2- bzw. T-Äquivalenten angegeben werden. Bei der Berechnung wurde berücksichtigt, dass die Gewässerextrakte in konzentrierter Form vorlagen. Die entsprechenden Werte, die für die einzelnen Probennahmestellen in Tabelle 3-1 aufgelistet sind, beinhalten demnach nicht mehr den Anreicherungsfaktor der Extrakte.

Alb

F1-E2

F2-E2

F3-E2

F1-T

F2-T

F3-T

0

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

1

n.d.

n.d.

7,72

0,87

2,72

n.d.

2

0,35

24,64

10,19

8,29

10,82

6,69

3

9,84

13,98

3,54

1,57

1,62

2,70

4

7,40

6,33

6,11

9,31

1,57

n.d.

5

9,90

26,36

10,51

26,81

42,01

7,31

6

1,43

19,99

23,18

2,69

31,71

3,33


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Es fällt auf, dass die fraktionierten Extrakte von Alb 0 in den Bindungsstudien weder E2 noch T vom Rezeptor verdrängen konnten und folglich keine Berechnung von E2- bzw. T-Äquivalenten möglich war. Im weiteren Flussverlauf ließen sich einige Regelmäßigkeiten bezüglich des Bindungspotenzials von Extraktinhaltsstoffen an den ER oder AR feststellen. Prinzipiell waren die höchsten Konzentrationen an Hormonäquivalenten in den Extrakten des Kläranlagenauslaufwassers zu finden (Alb 2, Alb 5). Mit den einzelnen Extraktfraktionen wurden uneinheitliche Ergebnisse im Hinblick auf die Hormonäquivalentkonzentration aus Proben vor und nach den Kläranlagenausläufen (Alb 1, 3, 4, 6) erzielt. Zur besseren Übersichtlichkeit wurde deshalb die Summe der Äquivalentkonzentrationen gebildet und in Abbildung 3-15 dargestellt.

Beide Verlaufskurven zeigen, dass die Konzentrationen an rezeptorbindenden Stoffen vor dem Kläranlagenauslauf immer geringer als nach dem Zufluss des Auslaufwassers waren, was auf den Verdünnungseffekt des Flusswassers zurückzuführen ist. Es ist weiterhin zu sehen, dass sich die Konzentration der Hormonäquivalente im Flussverlauf erhöht. Dies wiederum deutet auf eine Anreicherung der in Frage kommenden Substanzen im Flussverlauf hin, die den Verdünnungseffekt überlagert.

Abb. 3-15: Summenkurven der E2- bzw. T-Äquivalente im Albverlauf (als gleitender Durchschnitt). Die Werte setzen sich aus den Einzelwerten der drei Fraktionen jeder Probennahmenstelle zusammen.


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3.2.2.  Behandlung von Leberzellkulturen mit Gewässerextrakten

Die Kultivierung von Leberzellen aus Xenopus laevis und die Behandlung der Zellen mit den Gewässerextrakten diente der Feststellung, inwieweit die Inhaltsstoffe der Extrakte zur Induktion bzw. Repression bestimmter hormonregulierter Biomarkergene beitragen können. Eine Reihe von Vorversuchen ergab ein modifiziertes Durchführungsprotokoll zur Erstellung von Primärkulturen, die in 24-Well-Platten kultiviert werden konnten. Dies ermöglichte einen relativ hohen Probenumsatz pro präpariertem Tier. Es zeigte sich, dass Intervalle von 12 Stunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Mediumwechseln und Substanzzugaben für eine Gesamtdauer von 36 Stunden die sensitivste Behandlungsmethode darstellte.

Die Vitalität der kultivierten Leberzellen wurde durch die Behandlung mit den Testsubstanzen nicht beeinträchtigt, was mit Hilfe einer Trypanblau-Färbung der Zellmembranen festgestellt wurde. Durchschnittlich waren 10 % der Zellen in den Kulturschalen tot, es konnte jedoch kein statistisch relevanter Zusammenhang zwischen Sterberate der Zellen und Behandlung mit den Chemikalien ermittelt werden. Des Weiteren gingen ungefähr weitere 10 % der Zellen während des Behandlungsprozesses verloren, da eine geringe mechanische Belastung beim Mediumwechsel und bei der Substanzzugabe nicht zu vermeiden war. Jede Präparation einer X. laevis Leber ergab
20 – 40 Millionen Zellen, so dass mindestens 40 Kavitäten der Kulturschalen mit Zellen beschickt werden konnten.

3.2.3.  Das Retinol-binding Protein als Biomarker

Neben den östrogenartigen Substanzen befinden sich in Umweltproben auch Stoffe, die andere Wirkmechanismen aufweisen (antiöstrogen, (anti)androgen). Um diese Wirkmechanismen mit einem Summenparameter abschätzen zu können, wurde das RBP als neuer Biomarker etabliert, da er von Androgenen und Östrogenen antagonistisch reguliert wird (McKearin et al. 1987).

Die Expression der RBP-mRNA wurde nach Behandlung der Zellen mit E2 und EE (10-9 bis 10-6 M) gemessen. Steigende Konzentrationen beider Substanzen erhöhten proportional die RBP-mRNA-Expression. Im Gegensatz zu den EE-behandelten Zellen konnte in Zellen, die mit E2 behandelt wurden, nur eine geringere, nicht-signifikante Erhöhung der RBP-mRNA-[Seite 67↓]Transkription gezeigt werden. EE-behandelte Zellen wiesen bei drei Konzentrationen (10-8 bis 10-6 M) eine signifikante Induktion der Transkription auf, die bei 10-6 M ungefähr 2,5-fach über dem Kontrollniveau lag. (Abb. 3-16). Aufgrund dieses Ergebnisses wurde in den folgenden Experimenten 10-6 M EE als östrogene Positivkontrolle verwendet.

Abb. 3-16: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die jeweils mit 4 Konzentrationen der Östrogene E2 und EE behandelt wurden (10-9 bis 10-6 M). Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne weisen auf signifikante Unterschiede im Vergleich mit der Kontrolle hin (p < 0,05).

Das RBP-mRNA-Expressionsmusters nach Zugabe von Androgenen (T, DHT, MT) zu den Zellen ergab eine erkennbare Tendenz zur reduzierten Synthese von RBP-mRNA vor allem durch T und DHT. Eine signifikante Reduktion des RBP-mRNA-Gehalts war durch beide Androgene nicht nachweisbar. MT zeigte keine Wirkung auf die RBP-mRNA-Transkription, da die RBP-mRNA-Messwerte aus den mit MT behandelten Zellen den Kontrollwerten aus unbehandelten Zellen ähnelten (Abb. 3-17). Diese Ergebnisse führten zur Verwendung von DHT 10-6 M als androgene Positivkontrolle.


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Abb. 3-17: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit jeweils 4 Konzentrationen (10-9  bis 10-6 M) dreier verschiedener Androgene (T, DHT, MT) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben.

In einem weiteren Experiment wurden die Wirkungen des Antiöstrogens TAM und des Antiandrogens VC auf die RBP-mRNA-Expression in den Leberzellen von X. leavis untersucht. Beide Chemikalien zeigten in keiner der zugesetzten Konzentrationen (10-9 bis 10-6 M) eine signifikante Veränderung der Transkription der RBP-mRNA im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (Abb. 3-18).


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Abb. 3-18: RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit jeweils 4 Konzentrationen (10-9  bis 10-6 M) des Antiöstrogens TAM und des Antiandrogens VC behandelt wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in Relation zu den mittleren Lösungsmittelkontrollwerten (100 %) dargestellt. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben.

Die Abbildungen 3-16 bis 3-18 stellen die Effekte von einzelnen (anti)östrogenen und (anti)androgenen Substanzen auf die RBP-mRNA-Transkription dar. Weiterführende Experimente sollten zeigen, welche Wirkungen auf die RBP-mRNA-Synthese durch kombinierte Zugabe von Chemikalien mit entgegengesetzten Wirkmechanismen in den Zellen erzielt werden konnten. Zuerst wurden T, DHT und MT in einer Konzentrationsreihe (10-9 bis 10-6 M) mit EE 10-6 M kombiniert. Dabei diente die erhöhte Expression der RBP-mRNA durch EE 10-6 M als Positivkontrolle. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl alle Konzentrationen von T als auch von DHT den RBP-mRNA-Gehalt im Vergleich zur Positivkontrolle signifikant senken konnten. Die höchste Konzentration der beiden Androgene (10-6 M) bewirkte ein Absinken der RBP-mRNA-Expression unter das Kontrollniveau. MT wies wiederum deutlich geringere Effekte auf: Es konnte allerdings ebenfalls die EE-stimulierte Erhöhung der Transkription signifikant hemmen (außer bei [Seite 70↓]10‑8 M), zeigte aber insgesamt eine geringere Reduktion der RBP-mRNA-Synthese als T und DHT (Abb. 3-19).

Abb. 3-19: Relative RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit 4 Konzentrationen (10-9 bis 10-6 M) T, DHT und MT in Kombination mit einer wirksamen Konzentration EE (10-6 M) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in Relation zu den Lösungsmittelkontrollwerten dargestellt. EE 10-6 M dient als Positivkontrolle. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Positivkontrolle (p < 0,05).

In einem weiteren Versuchsansatz wurden die Zellen mit TAM in einer Konzentrationsreihe von 10-9 bis 10-6 M zusammen mit EE 10-6 M behandelt, um die stimulierenden Effekte von EE auf die RBP-mRNA-Expression mit einem Antiöstrogen zu beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass TAM die durch EE hervorgerufene Induktion der RBP-mRNA-Transkription bei jeder Konzentration signifikant unterbinden konnte. Die EE-bedingte Induktion der Transkription wurde komplett gehemmt, wenn die zugegebenen EE- und TAM-Konzentrationen gleich groß waren (Abb. 3-20).


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Abb. 3-20: Relative RBP-mRNA-Expression in Leberzellen, die mit 4 Konzentrationen (10-9 bis 10-6 M) TAM und VC in Kombination mit einer wirksamen Konzentration EE bzw. DHT (10-6 M) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in Relation zu den Lösungsmittelkontrollwerten (Ko) dargestellt. EE bzw. DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl sind angegeben. Die Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur entsprechenden Positivkontrolle (p < 0,05).

Schließlich wurde das Antiandrogen VC in vier Konzentrationen (10-9 bis 10-6 M) mit dem Androgen DHT (10-6 M) kombiniert den Zellen zugegeben. VC erniedrigte die transkriptionshemmende Wirkung von DHT in einer konzentrationsabhängigen Weise. Eine statistische Analyse ergab allerdings keinen signifikanten Effekt. Die RBP-mRNA-Expression übertraf das Kontrollniveau, wenn beide Substanzen in gleicher Konzentration eingesetzt wurden (10-6 M). DHT (10-6 M) wurde als Positivkontrolle verwendet (Abb. 3-20).

In Abbildung 3-21 werden Ausschnitte aus einem typischen Agarosegel gezeigt, das die amplifizierten PCR-Produkte des RBP und des korrespondierenden internen Standardgens EF darstellt. Die densitometrischen [Seite 72↓]Auswertungen der Gele ergaben keine signifikanten Expressionsunter-schiede der EF-mRNA in den einzelnen Behandlungsgruppen. Damit konnte die Anwendbarkeit des EF als internes Standardgen für die semiquantitative RT-PCR erneut gezeigt werden. Zusätzlich sind in Abbildung 3-21 PCR-Produkte abgebildet, welche die RBP-mRNA-Expression nach Behandlung der Zellen mit Gewässerextrakten zeigen. Im folgenden Abschnitt wird auf die Ergebnisse dieser Untersuchungen näher eingegangen.

Abb. 3-21: Ein typisches Bild eines Agarosegels, das die RT-PCR-Produkte des RBP (323 bp) und des EF (285 bp) wiedergibt. T: Testosteron, DHT: Dihydrotestosteron, VC: Vinclozolin, TAM: Tamoxifen, F1 – F3: Fraktion 1 – 3 der Gewässerextrakte, Ko: Kontrolle, EE: Ethinylöstradiol, E2: 17β-Östradiol.

3.2.4.  Biomarkerexpression in Leberzellkulturen nach Behandlung mit Gewässerproben

Die Behandlung von Zellkulturen mit Extraktfraktionen aus den Gewässerproben der Alb sollte zeigen, wie ein komplexes Stoffgemisch in einer Umweltprobe auf die Expression bestimmter Biomarkergene wirkt. Als östrogener Biomarker diente der Nachweis von ER-mRNA und als Summenparameter für (anti)östrogene und (anti)androgene Substanzen der Nachweis von RBP-mRNA. Die Zellen wurden jeweils mit den drei Fraktionen behandelt, die aus den Gesamtextrakten der Albproben gewonnen wurden. Da die 1000-fach aufkonzentrierten Fraktionen verwendet wurden, erfolgten auch in diesem Versuchsansatz regelmäßige Vitalitätstests der Zellen, die durchweg zeigten, dass die Extraktfraktionen die Vitalität der Zellen nicht beeinflussten.


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Die Abbildungen 3-22 bis 3-28 zeigen die Ergebnisse aus jeweils drei unabhängigen Experimenten, in denen die Extraktfraktionen der entsprechenden Probennahmestellen der Alb getestet wurden. Im Folgenden soll das Ergebnis für jede Stelle kurz zusammengefasst werden, wobei Alb 5 einer ausführlicheren Ergebnisbetrachtung unterzogen wird.

Abb. 3-22: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 0. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Fraktion 1 und Fraktion 3 der Probennahmestelle Alb 0 zeigten eine leicht erhöhte RBP-Expression im Vergleich zur Kontrolle. Fraktion 2 erniedrigte die RBP-mRNA-Synthese auf das Niveau der androgenen Positivkontrolle (DHT 10-6 M). Die Expression der ER-mRNA wurde nicht beeinflusst (Abb. 3-22).

Abb. 3-23: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 1. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Alle drei Extraktfraktionen der Probennahmestelle Alb 1 erniedrigten die RBP-mRNA-Transkription im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle. Die ER-mRNA-Synthese erreichte ungefähr das Niveau der Lösungsmittelkontrolle (Abb. 3-23).

Abb. 3-24: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 2. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Die Probennahmestelle Alb 2 repräsentiert Extrakte aus einem Kläranlagenauslauf. Die RBP-mRNA-Expression wurde von allen drei Fraktionen erhöht, wobei Fraktion 3 eine signifikante Erhöhung (1,5-fach) der Expression bewirkte. Eine signifikante Erhöhung der ER-mRNA-Transkription ergab sich für die Fraktion 2 (1,9-fach). Auch die anderen Fraktionen (F1 und F3) induzierten die ER-mRNA-Synthese (Abb. 3-24).

Abb. 3-25: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 3. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Die Fraktionen der Probennahmestelle Alb 3 induzierten ebenfalls eine leichte Erhöhung der RBP-mRNA-Synthese, wobei Fraktion 2 eine ungefähr 1,4-fache Erhöhung bewirkte. Eine signifikante Erhöhung der ER-mRNA-Expression wurde mit Fraktion 2 erzielt (1,6-fach). Die anderen beiden Fraktionen (F1 und F3) ergaben keine Induktion der ER-mRNA-Synthese (Abb. 3-25).

Abb. 3-26: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 4. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Mit Fraktionen der Probennahmestelle Alb 4 konnte keine eindeutige Tendenz der Beeinflussung der RBP-mRNA-Transkription festgestellt werden, die Werte befinden sich im Bereich des Kontrollniveaus. Die Expression des östrogenen Biomarkers ER-mRNA wurde unter das Kontrollniveau reguliert, wobei Fraktion 1 eine ungefähr 30 %ige Reduktion bewirkte (Abb. 3-26).

Abb. 3-27: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 5. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Die aussagekräftigsten Ergebnisse lieferten, wie bereits in den Rezeptorbindungsstudien, die Fraktionen der Stelle Alb 5 (Kläranlagenauslaufwasser). Alle Fraktionen bewirkten eine 1,5- bis 2,5-fache Induktion der ER-mRNA-Transkription. Die statistische Anlayse ergab eine signifikante Erhöhung für die Fraktionen 2 und 3. Der RBP-mRNA-Gehalt stieg nicht signifikant um das 1,3- bis 1,5-fache an. Beide Biomarker gaben Hinweise darauf, dass östrogene ED im gereinigten Abwasser vorkommen. Die Unterschiede in der Höhe der Induktion zwischen einem rein östrogenen Biomarker (ER) und einem summarischen (anti)östrogenen und (anti)androgenen Biomarker (RBP) zeigten, dass neben Substanzen mit östrogenen Effekten auch Substanzen mit antiöstrogenen bzw. mit androgenen Wirkungen in den fraktionierten Extrakten vorhanden sein müssen (Abb. 3-27).

Abb. 3-28: Nachweis der Beeinflussung der Biomarkerexpression (ER und RBP). Ergebnisse der Behandlung von Leberzellen mit den Fraktionen der Gewässerextrakte (F1 – F3) der Probennahmestelle Alb 6. Standardabweichungen und Stichprobenanzahl (n) sind angezeigt. Sterne markieren signifikante Unterschiede im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (p < 0,05). EE und DHT 10-6 M dienten als Positivkontrollen. Eine ER-Expression konnte bei DHT-Behandlung nicht nachgewiesen werden.

Die Fraktionen aus Proben der Stelle Alb 6 verursachten durchweg eine nicht signifikante Induktion der ER-mRNA-Expression (ungefähr 1,2- bis 1,4-fach). RBP zeigte ein uneinheitliches Ergebnis, da Fraktion 1 die RBP-Expression im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle erhöhte, die Fraktionen 2 und 3 erniedrigten die RBP-Synthese, Fraktion 2 sogar um etwa 30 % auf das Niveau der androgenen Positivkontrolle (Abb. 3-28).


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3.3.  Nachweis ausgewählter endokrin wirksamer Stoffe in der Alb

Die Ergebnisse aus den Gewässeruntersuchungen wiesen darauf hin, dass neben BPA weitere ED in der Alb vorhanden sein müssen. Deswegen wurde nach bestimmten bekannten ED in den Gesamtextrakten mittels GC / MS-Analyse gesucht, analog der in Kapitel 2.3.5 beschriebenen Methode. Die Auswahl der Substanzen ist zum einen in den zum Analysezeitpunkt möglichen Nachweismethoden begründet, zum anderen in der gewonnen Erkenntnis (s. Kapitel 3.2), dass überwiegend östrogenartige Substanzen im Fluss auftreten. Eine systematische Untersuchung der Alb bzw. der Albextraktfraktionen hinsichtlich der Identifikation unbekannter ED konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt werden. Die analysierten Substanzen der Wahl waren das synthetische Östrogen EE, die Phytoöstrogene Campesterol und β-Sitosterol sowie das schwache Antiandrogen o,p’-DDE (Di-chlordiphenyldichlorethylen).

Abb. 3-29: Nachweis und Quantifizierung von EE, Campesterol, β-Sitosterol und o,p’-DDE im Flussverlauf der Alb (Linien = gleitender Durchschnitt). Die einzelnen Probennahmestellen sind in Kapitel 2.3.1 beschrieben. Die Werte stammen wie die BPA-Nachweise (Abb. 3-13) aus einer Einzelbestimmung eines Probennahmezeitraumes (Juli 2001).


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Abbildung 3-29 zeigt, in welchen Konzentrationen die einzelnen Substanzen im Albverlauf nachgewiesen wurden. Die Werte für EE (jeweils 13 ng / L) und o,p’-DDE (10 ng / L) sind am höchsten in den Kläranlagenausläufen (Alb2 und Alb 5) und belegen die ansteigende Belastung während des gesamten Verlaufs der Alb bis hin zur Mündung, wo Werte von 10 ng / L für EE und 5 ng / L für o,p’-DDE gemessen wurden. Die Belastung durch die Phytoöstrogene Campesterol sowie β-Sitosterol liegt relativ gleichmäßig bei Werten zwischen 2 und 6 ng / L im gesamten Flussverlauf, so dass eine punktuelle Einleitung durch Kläranlagenausläufe nicht vorliegt.


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21.04.2005