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4.  Diskussion

Die Belastung der Umwelt mit endokrin wirksamen Substanzen, welche die Fortpflanzungsbiologie der Lebewesen stören, ist ein aktuelles Problem in der ökotoxikologischen Forschung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei mögliche Ansätze durchgeführt, die mit Hilfe des Modellorganismus Xenopus laevis zur Feststellung der Belastung und Gefährdung von aquatischen Lebewesen durch ED beitragen können.

Der erste Ansatz ging von der umfassenden Untersuchung eines Einzelstoffes (BPA) aus, der zum einen hinsichtlich seiner biologischen Aktivität, zum anderen hinsichtlich seiner chemischen Nachweisbarkeit im Labor und in der Umwelt erfasst wurde. Es wurde berücksichtigt, dass Wirkungen von ED auf die Reproduktionsbiologie der Lebewesen in erster Linie sichtbar werden, wenn der Gesamtorganismus diesen Substanzen ausgesetzt wird. Bisher bestand häufig eine Diskrepanz zwischen artifiziellen molekularbiologischen Testverfahren und der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf das intakte Lebewesen. Eine umfassende Betrachtung der Effekte bestimmter ED muss von der Wirkung der jeweiligen Substanz auf den Gesamtorganismus ausgehen. Jedoch sind auch Laboruntersuchungen, die diesen Weg verfolgen, immer auf künstliche Testsysteme beschränkt.

Der zweite Ansatz untersuchte Gewässerproben aus einem Modellgewässer, die aus einem komplexen Gemisch von endokrin wirksamen Substanzen bestehen. Dieses Gemisch wurde fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden biochemischen und molekularbiologischen Testmethoden unterzogen. Dadurch ließ sich die endokrine Wirksamkeit einer Gewässerprobe abschätzen. Dazu war es erforderlich, neben den Bioassays zur Feststellung östrogener Wirkungen zusätzliche Methoden anzuwenden, die eine Aussage über andere Wirkmechanismen zuließen. Dies wurde im Rahmen der Arbeit durch die Verwendung von Androgenrezeptorbindungsstudien und durch die Einführung des RBP als summarischen Biomarker für sämtliche Wirkmechanismen durchgeführt. Begleitende gewässeranalytische Untersuchungen sollten Hinweise auf die Belastung von Umweltproben mit bestimmten ED liefern.

Die folgende Diskussion soll die erzielten Ergebnisse kritisch beleuchten und abschließend beide Ansätze vergleichend betrachten.


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4.1.  Umweltbelastung mit ED – Einzelstoffansatz

4.1.1.  In vivo-Labormethoden zur Untersuchung der Wirkungen von ED

Kontrollierte Laboruntersuchungen mit geeigneten Testorganismen liefern nützliche Hinweise zu Dosis-Wirkungs-Beziehungen und molekularen Wirkmechanismen einzelner Substanzen. Ihre Aussagekraft ist jedoch hinsichtlich einer integrativen biologischen Antwort der Organismen auf eine chronische Exposition mit realen Konzentrationen eines Gemisches von Umweltchemikalien limitiert (Fox 2001). Nur mit in vivo-Experimenten lassen sich realistische Expositionsszenarien simulieren. Deshalb sollten unabhängig von den beobachteten in vitro-Effekten zwingend in vivo-Untersuchungen erfolgen, um zu klären, ob die verdächtigen Substanzen tatsächlich einen Einfluss auf die Reproduktionsbiologie haben. Dabei sollte beachtet werden, dass die zu untersuchenden Substanzen über das Wasser oder das Futter den Tieren verabreicht werden, da dies die normalen Aufnahmewege in der Natur sind. Ein weiterer kritischer Faktor ist der Expositionszeitraum, da viele niedere Wirbeltiere ihr Geschlecht während eines relativ kurzen Entwicklungszeitfensters ausdifferenzieren. Eine Exposition während dieses Zeitraumes hat irreversible Effekte zur Folge (Sumpter 1997).

Weitergehend fordern Toft & Baatrup (2001), dass neben den vielen bestehenden molekularen Endpunktmethoden, die einen Hinweis auf die Aktivität verschiedener Umweltchemikalien geben können, Biomarker auf höheren Organisationsebenen entwickelt werden müssen. Dadurch können Informationen über die Effekte auf die Reproduktionsbiologie des Individuums und im idealen Fall auf die Population gewonnen werden. In ihren Untersuchungen mit Guppies (Poecilia reticulata) etablierten sie Biomarker auf fünf Organisationsebenen: Zuerst untersuchten sie die Vitellogeninsynthese nach ED-Exposition auf der molekularen Ebene. Auf zellulärer Ebene wählten sie die Veränderung der Spermienanzahl als Biomarker und auf der Organebene untersuchten sie das Gonadengewicht. Auf der Ebene des individuellen Organismus wurde das Paarungsverhalten und die sexuelle Reifung der Jungfische untersucht und schließlich spiegelte der Reproduktionserfolg unter ED-Einfluss Effekte auf der Populationsebene wider.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde im sogenannten Einzelstoffansatz eine umfassende Charakterisierung einer bestimmten Substanz (BPA) im Sinne der Forderungen der oben aufgeführten Autoren durchge[Seite 84↓]führt. Dabei wurden als Endpunkte die individuelle Sexualdifferenzierung, die Entwicklung der Gonaden und der Zellen des Gonadengewebes sowie die Expression eines molekularen östrogenen Biomarkers (ER-mRNA) in Kaulquappen von Xenopus laevis gewählt und damit die Organismus-, Organ-, zelluläre und molekulare Ebene untersucht. Zusätzlich erfolgte die Exposition mit BPA in vivo über das Wasser und während der gesamten Larvalentwicklung oder während der für die Sexualdifferenzierung empfindlichen Entwicklungsphase.

4.1.2.  Amphibien als Modellorganismen zur Untersuchung von ED

Xenopus laevis ist ein geeignetes Studienmodell zum Nachweis hormoneller Wirkungen von Umweltchemikalien, da zum einen sein endokrines System eine hohe Ähnlichkeit mit dem der landlebenden Vertebraten aufweist, was die Relevanz der Ergebnisse, die mit diesem Testsystem erzielt werden, erhöht. Zum anderen eignet sich die aquatische Lebensweise für Untersuchungen zur Wirkung von ED, da diese sich in Oberflächengewässern anreichern und von im Wasser lebenden Tieren leicht aufgenommen werden können. Eine besondere Bedeutung kommt dabei der Larvalentwicklung zu, die bei Amphibien im Wasser verläuft und einen besonders sensiblen Entwicklungsabschnitt für exogene Einflüsse darstellt.

Im Gegensatz zu Säugetieren besitzt die Mehrheit der Anuren keine heteromorphen Geschlechtschromosomen. Bei Xenopus laevis wurde festgestellt, dass die Weibchen heterogametische Anlagen haben. Die Geschlechtschromosomen werden bei X. laevis mit WZ / ZZ bezeichnet. Zusätzlich besitzen bis auf eine Art – Xenopus tropicalis – Frösche aus der Gattung Xenopus einen tetraploiden Chromosomensatz (36 Chromosomen), was zu mehrfachen Genexpressionen führen kann (Graf 1989a). Dennoch kann X. laevis als funktioneller diploider Organismus betrachtet werden, da während der Meiose nur Bivalente auftreten. Außerdem ist der Karyotyp von X. laevis diploid-ähnlich organisiert und es wurde herausgefunden, dass die große Komplexität des X. laevis Genoms ihre Ursache in einer Verdoppelung des Genoms und nicht in Tandem-Mutationen hat (Graf 1989b). Bis heute ist kein Markergen zur genotypischen Geschlechtsbestimmung bei X. laevis bekannt, so dass Auswirkungen auf die Sexualdifferenzierung nur anhand statistischer Vergleiche der erhaltenen Phänotypen von behandelten Kaulquappen und von Kontrolltieren möglich sind.


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Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse bestätigen die Verwendbarkeit des Modellorganismus Xenopus laevis zur Untersuchung der Wirkungen von ED (Kloas et al. 1999; Lutz & Kloas 1999; Kloas 2002). Amphibien stellen eine unterrepräsentierte Tiergruppe im Bereich der ED-Forschung dar, obwohl sie als klassische Tiermodelle in der Entwicklungsbiologie und Endokrinologie bekannt sind. Der Krallenfrosch Xenopus laevis ist beispielsweise ein bevorzugter Testorganismus zur Untersuchung von Prozessen der Sexualentwicklung, womit er zum allgemeinen Verständnis der Gonadenentwicklung in Wirbeltieren beitrug (Hayes 1998). Gonadenentwicklung und Sexualdifferenzierung in X. laevis sind gute Endpunkte bei der Untersuchung von Verweiblichungsprozessen von ED: Die primäre Geschlechtsdifferenzierung in den Kaulquappen wird durch eine indifferente Gonadenphase eingeleitet und endet in der Organdifferenzierung zu Ovarien und Hoden. Ovarien- und Hodengewebe sind mit bloßem Auge bzw. Binokular nicht zu unterscheiden, bevor die Kaulquappen Entwicklungsstadium 55 erreicht haben. Es konnte gezeigt werden, dass die sensitivste Phase zur Induktion einer Geschlechtsveränderung in X. laevis zwischen den Stadien 50 und 52 liegt (Miyata et al. 1999). Eine Behandlung mit exogenen Sexualsteroiden in dieser Entwicklungsphase verändert die genetisch determinierte Ausprägung des Geschlechts der Tiere (Hayes 1998; Bögi et al. 2002; Kloas 2002).

Das Phänomen der Geschlechtsveränderung bei Kaulquappen von X. laevis wurde entdeckt, als Witschi & Allison (1950) Kaulquappen während der Gonadendifferenzierungsphase mit E2 behandelten. Sie beobachteten, dass sich alle behandelten Kaulquappen zu fruchtbaren Weibchen entwickelten. Die Annahme, dass das erwartete Geschlechterverhältnis 1 : 1 sein müsste, führte zu der Schlussfolgerung, dass die Hälfte der phänotypischen Weibchen genotypische Männchen sein mussten. Folglich war E2 dazu in der Lage, in genetischen Männchen einen weiblichen Phänotyp entstehen zu lassen. Schon diese frühen Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass Veränderungen im Verhältnis der endogenen Sexualsteroide das genetische Programm zur Geschlechtsbestimmung überlagern können (Kelley 1996; Bögi et al. 2002; Kloas 2002).


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4.1.3.  Einfluss von BPA auf die Sexualentwicklung von Xenopus laevis

Die Östrogenität von BPA ist bereits seit Beginn des 20. Jahrhunderts bekannt. Zu dieser Zeit veröffentlichten Dodds & Lawson (1936) eine Studie, in der sie Ratten mit BPA behandelten. Dabei stellten sie fest, dass BPA das Uteruswachstum in den Tieren stimulierte. Inzwischen wurde BPA intensiv als Testsubstanz in vielen in vitro- und in vivo-Studien eingesetzt und es wird allgemein anerkannt, dass BPA mit E2 um die Bindung an den ER konkurrieren kann, obwohl seine Struktur wenig Ähnlichkeiten mit der von E2 hat (vgl. Abb. 2-1). Uneinigkeit herrscht allerdings in der Frage nach der Bioaktivität von BPA und dabei hauptsächlich in der Frage nach seinem Potenzial, in niedrigen Konzentrationen östrogenähnliche Wirkungen zu vermitteln (Ben-Jonathan & Steinmetz 1998).

Diese wissenschaftliche Kontroverse betraf auch unsere Arbeitsgruppe, denn in einer anderen Studie zu in vivo-Effekten von BPA auf die Geschlechtsdifferenzierung von X. laevis Kaulquappen wurden keine Verweiblichungsphänomene festgestellt (Pickford et al. 2003), im Gegensatz zu den ursprünglich von Kloas et al. (1999) veröffentlichten Ergebnissen, in denen BPA signifikant verweiblichend wirkte. Folglich sollte mit der Verwendung von BPA im Einzelstoffansatz dieser Arbeit sowohl eine umfassendere Untersuchung zur Verifizierung der Wirkungen einer umstrittenen Chemikalie als auch der Nachweis der Umweltbelastung mit dieser Chemikalie durchgeführt werden.

Für die Expositionsversuche wurde ein semistatisches Behandlungsregime eingerichtet, das sich bereits früher als eine nützliche Methode zur Untersuchung von ED und deren Einfluss auf die Geschlechtsdifferenzierung herausstellte (Kloas et al. 1999). Im Gegensatz dazu wurden die Untersuchungen von Pickford et al. (2003) mit einer Durchflussanlage durchgeführt, wobei keine Effekte von BPA auf die Sexualentwicklung festgestellt wurden. Gleichzeitig blieb auch die als Positivkontrolle verwendete E2-Behandlung der Tiere in letztgenannter Studie hinter den zu erwartenden Verweiblichungseffekten zurück. Das Behandlungsregime scheint folglich eine Rolle für die Wirksamkeit einer Substanz zu haben.

Der erste Expositionsansatz diente der Bestätigung der Ergebnisse von Kloas et al. (1999), indem mit der gleichen Vorgehensweise eine signifikante Verweiblichung bei einer Behandlung der Tiere mit BPA 10-7 M erzielt werden konnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass E2 im semistatischen Behandlungsregime als Positivkontrollsubstanz verwendet werden kann (Levy et al. 2004a).


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Die effektivste BPA-Konzentration lag auch im zweiten Expositionsansatz bei 10-7 M. Die Wirkungen der nächsthöheren und nächstniedrigeren Konzentrationen (10-6 M und 10-8 M) waren weniger deutlich und uneinheitlich. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit neueren Ergebnissen zu kontrovers diskutierten Wirkungen von ED in geringen Konzentrationen (sogenannte „low-dose effects“), die zeigten, dass einige ED eine zweiphasige, U-förmige Dosis-Wirkungs-Beziehung hervorrufen (Calabrese 2001). Die Bedeutung der U-förmigen Wirkungskurven konnte in weiteren Studien verstärkt beleuchtet werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass einige ED störende Effekte bei Konzentrationen bewirkten, die unterhalb der Wirkungsgrenze in toxikologischen Studien lag. Es ist also angebracht, beim Vorhersagen von Grenzwerten vorsichtig zu sein, denn es könnten ökologisch relevante hormonstörende Effekte in Konzentrationen auftreten, die nicht mehr untersucht oder als gefahrlos für Mensch und Umwelt definiert wurden (Welshons et al. 1999).

Eine mögliche Ursache für das Auftreten zweiphasiger Dosis-Wirkungs-Beziehungen ist, dass in Lebewesen eine bestimmte Schwellenkonzentration überschritten werden muss, bevor eine physiologische Reaktion im Organismus auftritt. Beim Überschreiten der wirksamsten Konzentration werden dann Metabolisierungs- und Ausscheidungsprozesse aktiviert, welche die Reaktionen wieder verlangsamen oder unterdrücken können. Im Falle von BPA zeigte eine jüngst veröffentlichte Studie, dass in Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) eine geringere Sensibilität für die östrogenen Wirkungen von BPA in hohen Konzentrationen als in niedrigen vorliegt. Dies könnte auf eine erhöhte Metabolisierungsrate von BPA zurückgeführt werden, nachdem die Aktivität von Entgiftungsenzymen gesteigert wurde (Lindholst et al. 2000).

In der vorliegenden Arbeit wurde wiederholt ein Verweiblichungseffekt bei einer Konzentration von 10-7 M BPA festgestellt. Die Wirkungen der höheren (10-6 M) und niedrigeren Konzentration (10-8 M) waren uneinheitlich und zeigten nur tendenziell eine Verweiblichung. Möglicherweise liegt auch hier das Überschreiten einer Schwellenkonzentration und das Einsetzen einer erhöhten Metabolisierungsaktivität vor. Allerdings liegen noch keine Informationen zum Metabolismus von BPA in Xenopus laevis Kaulquappen vor. Weiterführende Studien zur Klärung dieser Frage sind geplant.

BPA bewirkte in den eingesetzten Konzentrationen im zweiten Expositionsansatz (10-6 bis 10-8 M) keine signifikante Änderung des Körpergewichtes der juvenilen Frösche im Vergleich mit den Kontroll- oder Positivkontrolltieren. In der vorliegenden Studie scheint BPA nicht in Wachstums- oder Metamorphoseprozesse einzugreifen. Ob BPA die Organentwicklung [Seite 88↓]beeinträchtigen kann, wurde durch morphologische und histologische Untersuchungen der Gonaden festgestellt.

Die Unterscheidung in Hoden und Ovarien nach einer Behandlung mit BPA sagt noch nichts über die tatsächliche Funktionsfähigkeit der Gonaden aus. Es besteht die Möglichkeit, dass ein morphologisch intakter Hoden nicht funktionsfähig ist, wenn er zum Beispiel zelluläre Fehlentwicklungen aufweist. Diese ED-induzierten Fehlentwicklungen sind inzwischen aus Hoden und Ovarien bekannt (Gray & Metcalfe 1997; Yokota et al. 2000). Bei der Betrachtung von Verweiblichungseffekten spielt der sogenannte Ovo-Testis-Zustand eine Rolle. Dieser Zustand beschreibt das Vorkommen von Oocyten bzw. Follikeln im Hodengewebe. Ovo-Testes wurden in einigen gonochoristischen Fischarten sowohl im Labor als auch im Freiland gefunden (Jobling et al. 1998; Yokota et al. 2000).

In Amphibien ist der Ovo-Testis- oder Zwitterzustand nicht zwangsläufig eine Fehlentwicklung, da er in einigen Arten einen Zwischenzustand im Verlauf der Sexualentwicklung darstellt. So bildet der Grasfrosch (Rana temporaria) einen Zwitterzustand aus, bevor er Ovarien entwickelt (Wallace et al. 1999). Das Auftreten von Ovo-Testes in X. laevis ist sehr selten dokumentiert (Hayes et al. 2002; Bögi et al. 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde das Hodengewebe auf Abnormalitäten untersucht. Von 360 Hodenproben enthielten nur zwei im Gewebe Oocyten, so dass die Schlussfolgerung gezogen werden muss, dass dieser Zustand bei Xenopus laevis nur zufällig auftritt, da weniger als 1 % der untersuchten Gewebe betroffen waren. Diese Aussage wurde in einem Expositionsexperiment, das in einem anderen Labor durchgeführt wurde, bestätigt (Bögi et al. 2003). Somit kann zusammengefasst gesagt werden, dass die Änderung des Geschlechts vom Männchen zum Weibchen vollständig und endgültig ist, was in Expositionsexperimenten mit X. laevis Kaulquappen zu klaren Ergebnissen führt, weshalb diese zur Untersuchung von Verweiblichungseffekten geeignet sind.

Von BPA ist bekannt, dass es an den X. laevis ER bindet (Lutz et al. 1999) und östrogene Aktivität in primären Leberzellkulturen zeigt (Kloas et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit konnte eine kurzzeitige Exposition (14 Tage, Kaulquappen ab Entwicklungsstadium 50) mit BPA demonstrieren, dass die ER-mRNA-Transkription in den Tieren erhöht wurde. Damit wurde gezeigt, dass BPA in vivo über eine ER-vermittelte Wirkungsweise auf die Sexualdifferenzierung einwirkt.

Der ER kann in X. laevis als östrogener Biomarker verwendet werden, weil er durch positive Rückkopplungsmechanismen seine eigene Synthese reguliert. Diese Erkenntnis wurde gewonnen, indem in männlichen Lebern von X. laevis gezeigt wurde, dass die Anzahl der Östrogenrezeptoren nach einer E2-Behandlung von 100 – 200 Molekülen pro Leberzelle auf ungefähr [Seite 89↓]1 500 in den E2-stimulierten Zellen anstieg (Corthésy et al. 1990). Varriale & Tata (1990) stellten fest, dass innerhalb von 48 Stunden in einer Ovarienzellkultur der ER-Gehalt nach Behandlung mit 10-7 M E2 um das Vierfache anstieg. Zur Geschlechtsdifferenzierung müssen Östrogenrezeptoren vorhanden sein, so dass der Nachweis der ER-mRNA-Expression in Kaulquappen den Einfluss östrogenartiger Substanzen verdeutlichen kann.

Im Gegensatz dazu kann in Kaulquappen Vitellogenin nur eingeschränkt als Biomarker benutzt werden, da die Vitellogenin-mRNA während der Larvalentwicklung nicht vor dem Entwicklungsstadium 62 nachweisbar ist, also nachdem durch die Metamorphose eine Leber mit adulten Merkmalen entwickelt wurde (May & Knowland 1981; Bögi et al. 2002). Untersuchungen zum Einfluss von ED auf die frühen Entwicklungsstadien bei Xenopus laevis lassen sich deswegen besser mit dem ER als Biomarker realisieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Synthese von ER-mRNA um mehr als das Doppelte in behandelten Kaulquappen ansteigt, wenn die Tiere 2 Wochen mit 10-7 M BPA während der sensitiven Gonadendifferenzierungsphase behandelt wurden. Dieses Ergebnis demonstriert, dass BPA in vivo ebenso eine Wirkung ausübt wie in vitro und die Induktion der Synthese der ER-mRNA über eine Bindung von BPA an den ER erfolgt.

Eine Bindung an den ER ist eine grundlegende Voraussetzung dafür, dass rezeptorvermittelte Effekte auftreten, die bei geringeren Konzentrationen wirksam sind als die, die für direkte, zum Teil toxische, Wirkungen auf Organe, Zellen oder Enzyme erforderlich sind. Es muss kritisch bemerkt werden, dass eine Erhöhung der mRNA-Transkription nur bedingt mit einer Erhöhung der Synthese des funktionellen Proteins korreliert werden kann, da die Regulation der Proteinexpression meist auf translationalem oder posttranslationalem Wege geschieht (Fielden & Zacharewski 2001).

Die festgestellten wirksamen Konzentrationen von BPA sind umweltrelevant, so dass diese Ergebnisse eine Grundlage für eine Risikoabschätzung der Gefahren für Mensch und Umwelt durch BPA ermöglichen. Bezogen auf freilebende Amphibienpopulationen stellt eine kurzeitige Exposition während eines empfindlichen Entwicklungsstadiums ein realistisches Umweltszenario dar. Da viele Arten in verschiedenen Wasserhabitaten laichen, kommt es vor, dass diese Habitate von landwirtschaftlichen oder industriellen Abwässern belastet werden. Folglich können Kaulquappen während einer bestimmten Zeit ihrer Ontogenese den Abwasserinhaltsstoffen ausgesetzt sein. Einige dieser Substanzen sind schnell abbaubar, so dass eine kurzzeitige Exposition regelmäßig auftreten kann (Bridges 2000). In Zeiten weltweit zurückgehender Amphibienpopulationen stellen komplexe Laborstudien über die Effekte von ED auf Amphibien wichtige Ergebnisse zur Verfügung, denn Sub[Seite 90↓]stanzen mit hormonähnlichem Wirkpotenzial tragen vermutlich zum Populationsrückgang der Amphibien bei (Carey et al. 2001).

4.1.4.  Chemische Analyse von BPA in den Ex-positionsversuchen und in Gewässerproben

Im vorangegangenen Kapitel wurden die in vivo-Effekte von BPA auf Xenopus laevis Kaulquappen umfassend diskutiert. Um die Frage nach dem Vorkommen von BPA in der Umwelt beantworten zu können, musste für diese Chemikalie eine analytische Nachweismethode entwickelt werden. Dabei bot sich an, Wasserproben aus den Expositionsexperimenten zu analysieren. Zum einen war dadurch die Möglichkeit der Entwicklung einer chemisch-analytischen Methode im Labormaßstab gegeben, zum anderen konnte eine Überprüfung der BPA-Behandlung und der Abbaurate des BPA im semistatischen Versuchsansatz stattfinden. Die Analyse wurde mit Hilfe einer HPLC-Trennung durchgeführt.

In der vorliegenden Arbeit wurde der BPA-Gehalt im Untersuchungswasser zu Beginn und am Ende eines Expositionsintervalls (48 Stunden-Zeitraum) analysiert. Dabei zeigte sich, dass BPA nach 48 Stunden noch zu 15 – 30 % der Nominalkonzentration vorhanden war. Um weitergehende Informationen darüber zu erhalten, welches Abbauverhalten BPA in den 48 Stunden zeigte, wurde in Abständen von 6 Stunden in unterschiedlichen Ausgangsproben die BPA-Konzentration gemessen. Es wurde nur eine geringe Verringerung der BPA-Mengen in Becken nachgewiesen, die nur das Standardmedium oder Standardmedium und Kaulquappenfutter enthielten. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass BPA kaum durch Mikroorganismen metabolisiert wurde, die sich in den Becken ansiedelten oder möglicherweise das Futter als Nährstoffquelle benutzten.

Die Meinungen zur mikrobiellen Abbaubarkeit von BPA gehen weit auseinander. Während einige Studien eine schnelle Degradierung von BPA mit Halbwertszeiten von weniger als 4 Tagen zeigten (Dorn et al. 1987; Klecka et al. 2001; West et al. 2001), führten andere Untersuchungen zum Ergebnis, dass BPA eine gewisse Persistenz gegenüber Abbauprozessen hatte (Stone & Watkinson 1983). Ein schneller BPA-Abbau benötigt genügend adaptierte Mikroorganismen, wie sie zum Beispiel im Auslaufwasser von BPA-produzierenden Firmen nachzuweisen sind (Fürhacker et al. 2000).


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Die Ergebnisse der chemischen Analyse zeigten außerdem, dass BPA aus dem Standardmedium von den Kaulquappen aufgenommen worden sein muss, da die BPA-Konzentration nur in Anwesenheit von Kaulquappen eindeutig erniedrigt wurde. Allerdings gibt es keine aktuellen Informationen, die sich auf die Aufnahme, Metabolisierung oder Exkretion von BPA in Anuren-Kaulquappen beziehen und damit diese Vermutung stützen könnten, so dass weiterer Forschungsbedarf in dieser Richtung besteht.

Die gerade angesprochene HPLC-Methode erwies sich als ungeeignet für das analytische BPA-Screening von Umweltgewässerproben. Die Ursache dafür war, dass trotz einer durchgeführten Fraktionierung der Albextrakte die Vielzahl der Inhaltsstoffe in den Extrakten die HPLC-Trennsäule verstopften und eine Auftrennung unmöglich machten. Aus diesem Grund musste eine weitere analytische Methode entwickelt werden, die sich auf eine GC / MS-Technik stützte. Diese Methode lieferte gute Ergebnisse bezüglich des Nachweises von BPA aus Gewässerproben, die aus der Alb oder aus Kläranlagenausläufen stammten. Die ermittelten Messwerte zeigten, dass BPA im Flussverlauf der Alb durchgehend vorhanden war. Die BPA-Konzentrationen bewegten sich zwischen 2 und 4 ng / L. Erst das Auslaufwasser der Kläranlage Neureut beinhaltete 16 ng / L BPA und die Probennahmestelle flussabwärts des Auslaufkanals enthielt ebenfalls noch eine erhöhte BPA-Konzentration von 8 ng / L. Diese Ergebnisse stimmen im Wesentlichen mit Daten aus weltweit durchgeführten Untersuchungen des BPA-Gehalts in anthropogen belasteten Oberflächengewässern bzw. in Kläranlagenauslaufwasser überein und belegen eine moderate Belastung der Alb mit BPA.

So wurden zum Beispiel in Kläranlagenauslaufwasser in Berlin BPA-Konzentrationen zwischen 8 und 33 ng / L gefunden (Hansen 1997). In der Elbe wurden neben anderen ED auch BPA (höchste Konzentration: 5 ng / L) nachgewiesen (Hecker et al. 2002). Wenzel et al. (1998) fanden in deutschen Oberflächengewässern geringe BPA-Mengen von 23 ng / L. In Kläranlagenausläufen wurden jedoch bis zu 702 ng / L detektiert. Diese Autoren nehmen an, dass der Eintrag von BPA über Kläranlagenausläufe der Haupteintragspfad in Oberflächengewässer ist. Sehr hohe Konzentrationen von BPA werden auch durch die Abwässer von BPA-synthetisierenden bzw. -verarbeitenden Firmen in Oberflächengewässer eingeleitet (bis zu 118 µg / L, Fürhacker et al. 2000). In Japan wurde in einer großangelegten Studie die Gewässerbelastung mit BPA untersucht. In 88 von 130 Probennahmestellen wurde BPA nachgewiesen und die höchste gefundene Konzentration betrug 940 ng / L (Hu et al. 2002).

In der vorliegenden Arbeit betrug die in den Expositionsversuchen wirksamste BPA-Konzentration 10-7 M, was 22,23 µg / L entspricht. Somit sollten [Seite 92↓]die aufgeführten Werte in Oberflächengewässern und auch die Werte, die im Flussverlauf der Alb gefunden wurden, nicht ausreichen, um vergleichbare Effekte auszulösen. Dabei darf nicht außer Acht gelassen werden, dass möglicherweise additive oder synergistische Effekte von einem ED-Gemisch hervorgerufen werden können, die sich aus für die Substanzen alleine unwirksamen Konzentrationen zusammensetzen.

Dennoch sind die gemessenen BPA-Konzentrationen im Auslaufwasser der Kläranlage Neureut nur noch ca. zwei Zehnerpotenzen geringer als der in der vorliegenden Arbeit festgestellte NOEC-Wert (no observed effect level), der bei 10-8 M (2,23 µg / L) liegt. Eine Risikoabschätzung muss zumindest im Bereich des Auslaufkanals der Kläranlage die möglichen Folgen für die dort lebenden aquatischen Organismen in Betracht ziehen.

4.2.  Umweltbelastung mit ED – Gemischansatz

4.2.1.  ED in der Umwelt als komplexes Gemisch von Stoffen mit verschiedenen Wirkmechanismen

Die im Einzelstoffansatz untersuchte Chemikalie BPA wirkt ähnlich wie weibliche Sexualsteroide. Eine Studie mit einer einzelnen Substanz erfasst die Situation in einem komplexen System wie einem Oberflächengewässer nur unzureichend. Da sich in der Umwelt ED nachweisen lassen, die über mehrere Wirkmechanismen auf die Reproduktionsbiologie von aquatischen Organismen einwirken können. Es handelt sich um vier prinzipielle Wirkmechanismen, mit denen östrogene, antiöstrogene, androgene und antiandrogene Effekte verursacht werden können (Döhler & New 1989). Dabei führen östrogene Substanzen zur Verweiblichung, androgene zur Vermännlichung, antiöstrogene neutralisieren die sexuelle Differenzierung und antiandrogene Stoffe haben ebenfalls verweiblichende Effekte zur Folge (Kloas 2002).

Es ist zur Zeit eine kontrovers diskutierte Frage, ob diese generelle Einteilung auch bei Amphibien zutrifft, da es Untersuchungen gibt, die gegensätzliche Ergebnisse hinsichtlich der Geschlechtsdifferenzierung bei Amphibien zeigten (Hayes 1998; Wallace et al. 1999; Kloas 2002; Bögi et al. 2003). Nur Östrogene erzeugten immer eine eindeutige Verweiblichung, Vermännlichung aufgrund von Androgenen scheint abhängig von der Amphibienart bzw. -ordnung zu sein, wobei die widersprüchlichen Resultate zum [Seite 93↓]Teil auf unvergleichbaren Expositionsansätzen beruhen. Bisher wurden Effekte von Antiöstrogenen und Antiandrogenen bei Amphibien sehr selten untersucht (Kloas 2002), so dass ein Bedarf an weiteren Untersuchungen besteht, um die generalisierte Aussage zu den Wirkmechanismen für Amphibien zu bestätigen.

Die meisten Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Reproduktionsbiologie beeinflussen, sind wie die Sexualsteroide lipophil. In Oberflächengewässern wurden verschiedene Stoffklassen in relevanten Konzentrationen gefunden. Dazu gehören die natürlichen Sexualsteroide, synthetische Steroide wie Kontrazeptiva, antiöstrogene Brustkrebswirkstoffe, Anabolika, Phytoöstrogene, Mycoöstrogene, Umweltchemikalien, Insektizide, Pestizide und Fungizide (Kolpin et al. 2002). Diese Vielzahl an Substanzen in der Umwelt erlaubt es nicht, Wirkungen aufgrund der chemischen Struktur vorauszusagen, da die Struktur eines potenziellen ED nur bedingt Rückschlüsse auf seine Wirkung zulässt. Ein vielversprechenderer Ansatz ist die Unterscheidung zwischen den angesprochenen vier Wirkmechanismen, die durch adäquate biologische Testsysteme festgestellt werden können, und diese mit chemischen Analysemethoden zu verbinden.

Dieser Gedanke wurde mit dem Gemischansatz im Rahmen der vorliegenden Arbeit verfolgt. Dazu wurde in Rezeptorbindungsstudien (ER und AR) festgestellt, ob Inhaltsstoffe von Gewässerextrakten der Alb an die Rezeptoren binden. Weiterhin wurde durch Behandlung von X. laevis Leberzellkulturen mit Gewässerextrakten und dem Nachweis der Expression eines östrogenen Biomarkers (ER) und eines summarischen (anti)östrogenen / (anti)androgenen Biomarkers (RBP) untersucht, ob die entsprechende Biomarkerexpression beeinflusst wurde. Im Gegensatz zum Einzelstoffansatz handelte es sich um in vitro-Methoden. Die mit diesen Methoden erzielten Ergebnisse werden im Folgenden diskutiert.

4.2.2.  Untersuchungen der Gewässerproben mit ausgewählten Bioassays

Die Extrakte der Gewässerproben wurden aufkonzentriert und fraktioniert in den Bioassays eingesetzt. Diese Vorgehensweise lässt sich folgendermaßen begründen: Bei der Auswahl der entsprechenden Umweltmatrix wurde der fließende Wasserkörper der Alb gewählt. Dadurch müssen alle ED unentdeckt bleiben, die sich in den Flusssedimenten befinden oder die assoziiert [Seite 94↓]mit pflanzlichem Material oder Huminstoffen (vgl. Steinberg et al. 2003) im Wasserkörper zu finden sind, denn diese wurden herausgefiltert.

Weiterhin beträgt der gesamte DOC-Gehalt (dissolved organic carbons) im Wasserkörper eines Gewässers meistens weniger als 10 mg / L (Thurman 1985) und die Massenkonzentrationen der entsprechenden Schadstoffe liegen im Bereich von ng / L bis µg / L, was weniger als 1 Promille vom Gesamt-DOC ausmacht. Folglich ist eine Anreicherung der ED durch Aufkonzentrierung unerlässlich. Schließlich sind Fraktionierungen erforderlich, um die Komplexität des ursprünglichen Stoffgemisches zu verringern. Zur Fraktionierung werden im Allgemeinen verschiedene Substanzeigenschaften ausgenutzt, im vorliegenden Fall erfolgte eine Fraktionierung aufgrund der unterschiedlichen Lösungseigenschaften der ED in unterschiedlich polaren Lösungsmitteln. Eine alternative Fraktionierungsmethode ist die von Müller & Frimmel (2001) entwickelte Ultrafiltrationsfraktionierung, mit der die Bestandteile nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Es muss bei jeder gewählten Gewässerextraktions- und Fraktionierungsmethode generell berücksichtigt werden, dass nach der Probenaufarbeitung die Zusammensetzung der ED im Extrakt qualitativ und quantitativ nicht mehr exakt der Originalgewässerprobe entsprechen muss.

1.  Rezeptorbindungsstudien mit Albextrakten

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass mit dem Modellorganismus Xenopus laevis erfolgreich Rezeptorbindungsstudien durchgeführt werden konnten. Dabei wurden definierte Substanzen in Kompetitionsexperimenten eingesetzt. Alle untersuchten östrogenartigen ED (Tetrachlorobiphenyl, Dibutylphthalat, Butylhydroxyanisol, Nonylphenol, BPA, Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT)) zeigten eine relativ geringe Bindungsaffinität an die cytosolischen Östrogenrezeptoren. Einzig der natürliche Ligand E2, sowie EE und Tamoxifen konnten das radioaktiv markierte E2 äquivalent vom Rezeptor verdrängen. Im Gegensatz dazu hatten z.B. Nonylphenol und BPA eine 1000-fach geringere Bindungsaffinität an den ER als E2 (Lutz & Kloas 1999).

Rezeptorbindungsstudien zur Untersuchung der Bindung bestimmter Substanzen an den AR wurden in Amphibien bisher nicht durchgeführt. In Vorversuchen wurde ein Radiorezeptorassay (RARA) für Androgenrezeptoren aus X. laevis entwickelt, in dem [3H]-T als markierter Ligand eingesetzt wurde. T, DHT und MT konnten diesen vom Rezeptor äquivalent verdrängen, die Antiandrogene VC and p,p’-DDE zeigten kein Verdrängungspotenzial. [Seite 95↓]Diese Substanzen sind dafür bekannt, den AR durch allosterische Hemmung zu blockieren und nicht als Ligand aufzutreten (Kelce & Wilson 1997).

Beide RARA-Ansätze kamen in dieser Arbeit zum Einsatz, um die Bindungsaffinität von Gewässerinhaltsstoffen an die Rezeptoren zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass das Bindungspotenzial der Extrakte im Flussverlauf der Alb ansteigt. Weiterhin konnte dokumentiert werden, dass in den Kläranlagenauslaufextrakten Inhaltsstoffe mit dem größten Interaktionspotenzial mit den Rezeptoren zu finden sind. Im Fluss werden diese Stoffe entsprechend verdünnt, so dass nur geringere Bindungsaffinitäten an beide Rezeptoren nachgewiesen werden konnten. Im Vergleich der E2- mit den T-Äquivalenten fällt auf, dass das Auslaufwasser der Kläranlage Neurod (Alb 2) eine höhere Konzentration an E2-Äquivalenten als an T-Äquivalenten aufweist. Bei der Kläranlage Neureut (Alb 5) verhält es sich genau anders herum. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass die Konzentrationen der entsprechenden Hormonäquivalente abhängig vom Abwasserzulauf der jeweiligen Kläranlagen sind. Da die Kläranlage Neurod nur kommunales Abwasser bearbeitet, verwundert es nicht, dass im Verhältnis mehr E2-Äquivalente zu finden sind. Kommunales Abwasser enthält einen großen Teil natürlicher weiblicher Sexualsteroide sowie synthetische Östrogene wie EE, die als Bestandteil von Verhütungsmitteln verwendet werden (Körner et al. 2001).

Die durchgeführten Rezeptorbindungsstudien lassen keine Entscheidung darüber zu, ob eine Substanz, die an den Rezeptor bindet, auch tatsächlich ein Rezeptoragonist ist und damit eine direkte Wirkung über eine Rezeptorbindung vermittelt. Es könnten auch antagonistische ED an den Rezeptor binden, die diesen dann blockieren und dadurch einen Einfluss auf rezeptorgesteuerte Regulationsprozesse haben.

Neben den angesprochenen natürlichen Östrogenen können in Umweltproben auch sogenannte Phytoöstrogene vorkommen. Unter einem Phytoöstrogen wird eine pflanzliche Substanz verstanden, die strukturell und / oder funktional den Östrogenen ähnelt. Die zwei Hauptklassen der Phytoöstrogene sind Lignine und Isoflavonoide. Viele Studien haben festgestellt, dass Lignine und Isoflavonoide erfolgreich mit E2 um die Bindung an den ER konkurrieren können. Weiterhin wurde gezeigt, dass Phytoöstrogene nicht nur an Rezeptoren binden, sondern dass auch Gentranskriptionen eingeleitet werden können (Whitten & Patisaul 2001). Phytoöstrogene tragen auch in der Alb zur östrogenen Belastung bei (s. Kapitel 3.3).

Androgene Agonisten des AR in Umweltproben sind unter anderem die endogenen Hormone Testosteron und Dihydrotestosteron sowie die Pharmazeutika Danazol, Methandriol und Methyltestosteron. Als Antiandrogene können verschiedene Pestizide wie Vinclozolin und seine Metabolite M1 und [Seite 96↓]M2, die DDT-Metabolite p,p’-DDE und o,p’-DDE, das auch in Albextrakten gefunden wurde (s. Kapitel 3.3), sowie die Fungizide Procymidon und Flutamid auftreten (Euling & Kimmel 2001). Antiandrogene binden ebenfalls an den AR und reduzieren oder verhindern dabei die Androgenantwort. Für VC wurde gezeigt, dass die Metabolite M1 und M2 an Ratten- und Menschenandrogenrezeptoren binden und als AR-Antagonisten wirken. M1 und M2 blockieren die androgenabhängige Genexpression in vivo und in vitro, indem sie die androgenvermittelte AR-DNA-Bindung verhindern (Ostby et al. 1999).

2.  Etablierung von RBP-mRNA als Biomarker

RBP gehört zur Proteinfamilie der Lipocaline. Diese sind eine große Gruppe kleiner extrazellulärer Proteine. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich dadurch aus, dass sie kleine hydrophobe Moleküle binden, an spezifische Membranrezeptoren andocken und Komplexe mit löslichen Makromolekülen bilden können. Die Lipocaline wurden häufig als Transportproteine bezeichnet, es ist jedoch inzwischen bekannt, dass die Lipocaline eine große funktionelle Diversität besitzen und beispielsweise eine Rolle beim Retinoltransport, bei der Farbgebung von Invertebraten, beim Pheromontransport und bei der Prostaglandinsynthese besitzen. Weiterhin werden sie mit verschiedenen Regulationsprozessen in Verbindung gebracht, z.B. bei der Immunantwort, und als Carrierproteine spielen sie eine Rolle bei der Entsorgung exogener und endogener Substanzen (Flower 1996).

Das RBP wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert und ins Serum ausgeschieden. Sein spezifischer Ligand ist das Retinol (Vitamin A), das hydrophob ist und deswegen an ein Bindungsprotein gebunden zum Wirkungsort transportiert werden muss. Vitamin A spielt unter anderem eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, im Zellwachstum und in der Zelldifferenzierung. Die RBP-Synthese wird durch Steroidhormone reguliert. Der Verwendung des RBP als Biomarker lag die Hypothese zugrunde, dass diese Regulationsprozesse das RBP zu einem geeigneten Biomarker für den Nachweis von (anti)östrogenen und (anti)androgenen Effekten machen.

McKearin et al. (1987) fanden heraus, dass Steroidhormone die RBP-mRNA-Transkription regulieren und eine E2-Behandlung von männlichen Xenopus laevis erhöhte die Synthese von hepatischer RBP-mRNA um das Zehnfache. Es scheint jedoch, dass die Erhöhung der RBP-Synthese durch Östrogene artabhängig sein könnte, denn eine einzige Behandlung mit E2 verringerte die hepatischen RBP-mRNA-Gehalte in der Goldbrasse (Sparus aurata; Funkenstein 2001).


[Seite 97↓]

Die steroidhormonabhängige Regulation des RBP lässt sich dadurch erklären, dass Retinol als ein Retinol-RBP-Komplex in den Oocyten von oviparen Wirbeltieren gespeichert wird. So kann Retinol bei Bedarf dem sich entwickelnden Embryo zur Verfügung gestellt werden (Funkenstein 2001). Deswegen kann RBP mit dem Vitellogenin, einem anderen Eizellen-Vorläuferprotein, verglichen werden, das ebenfalls unter Regulation der Steroidhormone synthetisiert und in die Eier eingelagert wird.

In der vorliegenden Arbeit konnte klar gezeigt werden, dass die RBP-mRNA-Expression durch E2 und EE in X. laevis Leberzellen dosisabhängig erhöht wird, womit die Daten von McKearin et al. (1987) bestätigt wurden. Damit eignet sich RBP grundsätzlich als östrogener Biomarker. Es muss aber einschränkend hinzugefügt werden, dass die Höhe der RBP-mRNA-Induktion durch die beiden Östrogene uneinheitlich war. Nur das synthetische Östrogen EE erzeugte eine signifikante Erhöhung der RBP-mRNA-Expression. Das liegt hauptsächlich daran, dass EE im Gegensatz zu E2 sehr stabil ist und damit eine gewisse Abbauresistenz gegenüber Metabolisierungsprozessen zeigt. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit früheren Erkenntnissen, in denen eine Halbwertszeit von E2 in Xenopus laevis Hepatocyten von 120 min festgestellt wurde, wenn die Zellen mit E2 10-6 M behandelt wurden (Tenniswood et al. 1983). Dadurch erwies sich EE als die sinnvollere Positivkontrolle zur Erhöhung der RBP-mRNA-Synthese.

In einer weiteren Studie entdeckten McKearin & Shapiro (1988), dass T in der Lage war, RBP-Gehalte in weiblichen Xenopus laevis um das 12-fache zu erniedrigen, womit das Niveau erreicht wurde, das üblicherweise in männlichen Fröschen vorherrscht. Es konnte in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuchen keine signifikante Erniedrigung der RBP-mRNA-Synthese durch T in Leberzellen nachgewiesen werden. Es scheint jedoch möglich zu sein, dass T und auch DHT die RBP-mRNA-Expression unterdrücken, da eine klare Tendenz zur verminderten Synthese durch diese Substanzen beobachtet wurde. Die fehlende Signifikanz der Ergebnisse lässt sich möglicherweise auf die semiquantitative Erfassung der mRNA-Expression zurückführen. Dabei erfolgte die Analyse der Expressionsverringerung in Bezug auf das Kontrollniveau, das selbst eine relativ geringe RBP-Expression aufwies. Dadurch war die Genauigkeit der Analyse nicht immer gewährleistet und führte zu statistischen Auswertungsproblemen. Die Entwicklung einer Real-Time PCR-Methode mit spezifischen RBP-Sonden sollte die Genauigkeit des Testsystems erhöhen und wird zur Zeit in unserem Labor etabliert. Weiterhin zeigten Zellen, die mit MT behandelt wurden, eine geringere Tendenz zur Unterdrückung der RBP-mRNA-Expression als T und DHT. MT gilt als potentes synthetisches Androgen, da es relativ abbauresistent und strukturstabil ist. Es sind allerdings keine Daten zum Metabolismus [Seite 98↓]und zur biologischen Effektivität von MT in Amphibien bekannt, so dass weiterer Klärungsbedarf besteht.

In einem weiteren Experiment wurden die Wirkungen einer kombinierten Behandlung mit verschiedenen Androgenkonzentrationen (T, DHT, MT, jeweils 10-9  bis 10-6 M) und einer wirksamen EE-Konzentration (10-6 M) auf die RBP-mRNA-Synthese untersucht. Die antagonistischen Effekte von Androgenen und Östrogenen konnten eindeutig demonstriert werden, denn sowohl T als auch DHT unterdrückten signifikant die EE-stimulierte Erhöhung der RBP-mRNA-Transkription. Die Androgene waren in diesem Ansatz sogar in relativ niedrigen Konzentrationen (10-9 M und 10-8 M) effektive Hemmstoffe. Hinsichtlich der Hemmung der RBP-mRNA-Transkription war MT wiederum nicht so wirksam wie T und DHT.

Es lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse zur RBP-Regulation die Hypothese bestätigen, dass RBP-mRNA-Gehalte ein Gleichgewicht zwischen den antagonistischen Regulationseffekten von Östrogenen und Androgenen darstellen (McKearin & Shapiro 1988). In Bezug auf die Anwendung des RBP als Biomarker zur Untersuchung von Umweltproben bedeutet diese Erkenntnis, dass androgen wirksame ED dadurch erkannt werden können, dass sie die Fähigkeit besitzen, östrogen bedingte Erhöhungen der RBP-mRNA-Expression zu unterbinden.

Diese Aussage trifft auch für antiöstrogen wirksame ED zu. Bei der Behandlung von X. laevis Leberzellkulturen mit EE in Kombination mit dem Antiöstrogen TAM, welches alleine keine Wirkung auf die RBP-mRNA-Synthese hat, erfolgte eine signifikante, dosisabhängige Inhibition der EE-bedingten Stimulation der RBP-mRNA-Transkription. Die höchste inhibitorische Wirksamkeit zeigte TAM in äquivalenter Konzentration mit EE (beide 10-6 M), wobei die RBP-Gehalte nur noch das Kontrollniveau erreichten. Somit hatte TAM in Kombination mit EE ähnliche regulierende Fähigkeiten wie T und DHT. Im Gegensatz zu diesen beiden Androgenen konnte TAM aber nicht die basale RBP-mRNA-Transkription unterdrücken, so dass es möglich ist, zwischen androgenen und antiöstrogenen Wirkungen von ED zu unterscheiden, indem RBP-mRNA als Biomarker genutzt wird. TAM ist nur ein partieller Antagonist des ER und erzielt dadurch in manchen Fällen keine antiöstrogenen Wirkungen (Wijayaratne et al.1999). In Bezug auf die RBP-Regulation in Hepatocyten scheint TAM jedoch ein potentes Antiöstrogen zu sein.

Des Weiteren wurde das Antiandrogen VC den Leberzellen zugegeben. VC alleine erzielte keine Wirkungen auf die RBP-mRNA-Regulation. Eine Kombination von VC 10-7 M und 10-6 M mit DHT 10-6 M hob die transkriptionshemmenden Effekte von DHT auf bzw. die RBP-mRNA-Gehalte erreichten das Kontrollniveau. VC ist dafür bekannt, antiandrogene Wirkungen zu vermitteln. So konnte es bei erwachsenen männlichen Guppies in Konzentra[Seite 99↓]tionen von 1 – 10 µg / L eine Entmännlichung hervorrufen (Baartrup & Junge 2001) und in Xenopus laevis Kaulquappen verweiblichend wirken (Kloas 2002). Von einigen Wissenschaftlern wird vermutet, dass nicht VC selbst das wirksame Antiandrogen ist. So konnten Kelce et al. (1994) nachweisen, dass die primären Metabolite M1 und M2 mit den Androgenen um die Bindung an den AR konkurrieren (vgl. 4.2.2.1). Es existieren keine Angaben dazu, ob VC in X. laevis Leberzellen metabolisiert wird. Zur Zeit laufende Experimente sollen den Verbleib von VC in unserem Zellkultursystem näher beleuchten und dadurch die verantwortlichen Mechanismen für die Antiandrogenität von VC bei der RBP-Regulation klären. Die vorgestellten klaren Ergebnisse belegen mit den diskutierten Einschränkungen die Anwendbarkeit der RBP-mRNA als antiandrogenen Biomarker.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die RBP-mRNA-Expression von definierten Wirkmechanismen beeinflusst wird und Laborstudien zur Untersuchung von ED mit RBP als Biomarker gestaltet werden können, um (anti)östrogene und (anti)androgene ED-Effekte nachzuweisen. Gerade diese Reaktivität auf alle vier möglichen Wirkmechanismen belegt allerdings, dass RBP bei komplexen Stoffgemischen nur als summarischer Biomarker angewandt werden kann, der die resultierende biologische Wirkung all dieser Mechanismen darstellt (Levy et al. 2004b).

3.  Biomarkerexpression in Leberzellkulturen nach Behandlung mit Gewässerextrakten der Alb

Es stellte sich nun die Frage, ob RBP tatsächlich als Biomarker zur Untersuchung der Umweltbelastung mit ED herangezogen werden kann. Da für östrogene Effekte gezeigt werden konnte, dass die Erhöhung des RBP-mRNA-Gehalts durch östrogene Substanzen geringer ausfiel als die des reinen östrogenen Biomarkers ER-mRNA, sollte dieser als spezifischer östrogener Biomarker bevorzugt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die ER-mRNA ein nützlicher östrogener Biomarker ist, wenn nur das östrogene Potenzial der drei Kläranlagenauslauffraktionen (Alb 5) betrachtet wurde. Es stellt keine Überraschung dar, dass Kläranlagenauslaufwasser östrogene ED enthält, denn es gibt eine Reihe von Studien, die als Hauptkomponenten im Abwasser hohe Konzentrationen von EE, E2, Östron und östrogenähnlichen Chemikalien wie Alkylphenolen und BPA nachwiesen (Körner et al. 2001; Kirket al. 2002).

Die Expression der RBP-mRNA in kultivierten Leberzellen, die mit den drei Gewässerextraktfraktionen behandelt wurden, stellt einen Summenpa[Seite 100↓]rameter aller (anti)östrogenen und (anti)androgenen Substanzen in den Fraktionen dar. Der Nachweis der RBP-mRNA-Expression nach der Behandlung der Leberzellen mit Fraktionen des Kläranlagenauslaufwassers ergab für alle Fraktionen eine geringere bis ähnliche relative Erhöhung der Expression im Vergleich mit dem östrogenen Biomarker ER-mRNA. Die verminderte RBP-mRNA-Expression im Vergleich zu der stimulierten Expression der Positivkontrolle (EE 10-6 M) legt die Vermutung nahe, dass auch androgene Substanzen, welche in allen Fraktionen aufgrund der Ergebnisse der Rezeptorbindungsstudien vorhanden sein müssen, die Synthese hemmen. Hypothetisch könnte dieses relative Absinken der Östrogenität zumindest teilweise auf dem Vorhandensein von antiöstrogenen Stoffen beruhen. Der vergleichende Ansatz im Bioassay mit den Biomarkern RBP- und ER-mRNA deutet darauf hin, dass in der Summe die Effekte der (anti)östrogenen und (anti)androgenen Substanzen, die durch die RBP-mRNA-Expression dargestellt werden, östrogener Art sind. Da die östrogenen Effekte im Vergleich zur ER-mRNA-Expression eindeutig reduziert auftreten, müssen andere ED in den Proben vorhanden sein, die androgene und eventuell auch antiöstrogene Komponenten im Gemisch repräsentieren.Kürzlich wurde in Großbritannien eine Studie angefertigt, die androgene Aktivität in Oberflächengewässern nachwies und damit die hier vorgestellten Ergebnisse unterstützt (Thomas et al., 2002).

Die eindeutigsten Effekte wurden mit Fraktionen der Stelle Alb 5 erzielt. Die Probennahmestelle Alb 5 spiegelt die endokrine Wirksamkeit eines Kläranlagenauslaufs wider. Kläranlagenauslaufwasser wird normalerweise stark verdünnt, wenn es in den Vorfluter eingeleitet wird. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass die Konzentrationen einzelner ED unter die Nachweisgrenze bzw. unter die Grenze der niedrigsten wirksamen Konzentration in einem Bioassay fallen. Trotzdem ist es möglich, wie Beispiele aus Großbritannien zeigen, dass die Flüsse hauptsächlich aus Auslaufwasser bestehen und ED in der Trockenzeit sogar akkumulieren können (Harries et al. 1997).

Schließlich müssen noch einige offensichtliche Grenzen der Verwendbarkeit von RBP-mRNA als Biomarker zur Untersuchung der Wirkungen von ED genannt werden. Mit Hilfe der RBP-mRNA-Expression lässt sich nicht exakt zwischen antiandrogenen, androgenen, antiöstrogenen und östrogenen Wirkmechanismen unterscheiden. Der große Vorteil bei der Verwendung von RBP-mRNA liegt allerdings darin, dass RBP einen Summenparameter für alle vier Wirkmechanismen darstellt. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, alle möglichen Wirkmechanismen von verschiedenen potenziellen ED im Nachweis eines Biomarkers zu vereinen. Es lässt sich eine Aussage darüber treffen, ob die endokrinen Effekte eines komplexen Gemisches eher in Richtung Verweiblichung oder Vermännlichung tendieren oder ob sie summarisch [Seite 101↓]nur einen geringen Effekt zeigen. Durch zusätzliche Verwendung eines spezifischen östrogenen (wie hier die ER-mRNA) oder (anti)androgenen Biomarkers können die tatsächlich vorhandenen effizienten Wirkmechanismen charakterisiert und teilweise auch semiquantitativ erfasst werden.Zusätzlich kann durch die Verwendung von Reinsubstanzen in Kombination mit bekannten (anti)östrogenen oder (anti)androgenen Chemikalien der spezifische Wirkmechanismus einer bestimmten Substanz über den Nachweis der RBP-mRNA-Expression ermittelt werden. Zusammengefasst erbringen die Ergebnisse, die mit dem RBP als Biomarker gewonnen wurden, den Beweis, dass RBP-mRNA als Summenparameter für den Nachweis (anti)östrogener und (anti)androgener Wirkungen auf die Reproduktionsbiologie dienen und zusätzlich spezifische Wirkmechanismen eines vermuteten ED genauso wie summierte Einflüsse von komplexen Umweltgemischen nachweisen kann.

4.3.  Bewertung der ED-Belastung der Alb

Die Probenextrakte der Alb wurden auf ihr Potenzial hinsichtlich ihrer endokrinen Wirksamkeit untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass im Oberlauf des Flusses (Alb 0 bis Alb 3) eine relativ geringe Reaktion in den verwendeten Bioassays zu beobachten ist. Eine Ausnahme war dabei die Stelle Alb 2, die einen Kläranlagenauslauf repräsentiert. Dieser zeigte sowohl im RARA als auch in den Biomarkernachweisen eine östrogene Tendenz, wobei auch Substanzen, die an den AR binden nachgewiesen wurden. Im Unterlauf der Alb (Alb 4 bis Alb 6) schien die Belastung des Flusses mit ED erhöht zu sein. Vor allem das Kläranlagenauslaufwasser der Kläranlage Neureut (Alb 5) zeigte in den Untersuchungen ausgeprägte resultierende Östrogenität in den Bioassays. Im weiteren Flussverlauf war dann trotz des Verdünnungseffektes des Flusswassers die Konzentration an potenziellen ED erhöht, denn auch Alb 6 ergab noch eindeutige Ergebnisse in den Versuchen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass nur in den Kläranlagenauslaufwassern und im Extrakt der Probe von Alb 6 (Mündungsbereich) eindeutige östrogene Reaktionen in den entsprechenden Bioassays erzielt werden konnten, auch wenn die Ergebnisse der RBP-mRNA-Nachweise belegen, dass zusätzlich androgene und / oder antiöstrogene Substanzen in nicht unerheblicher Menge vorhanden sein müssen.


[Seite 102↓]

Dass dies der realen Situation entspricht, belegen die Ergebnisse der chemischen Analytik ausgewählter ED, die neben BPA nachgewiesen werden konnten (vgl. Kapitel 3.3). Hier zeigte sich, dass beispielsweise EE punktuell über die Kläranlagenausläufe in den Fluss gelangt und dadurch auch im Flussverlauf in Konzentrationen von einigen ng / L bis zu ca. 10 ng / L im Mündungsbereich der Alb vorkommt, was aufgrund der extremen Persistenz und biologischen Effektivität von EE gegenüber E2 schon sensitive biologische Wirkungen erwarten lässt (Yamasaki et al. 2002). Der DDT-Metabolit o,p’-DDE mit geringer antiandrogener Wirkung scheint ebenfalls über die Kläranlagen punktuell eingeleitet zu werden. Weitere Beispiele sind die schwachen Phytoöstrogene Campesterol und β-Sitosterol, die eine mehr
oder weniger gleichmäßige Belastung des Gewässers aufweisen, ohne in den biologischen Effizienzbereich zu gelangen. Das gleichmäßige Auftreten dieser beiden Substanzen deutet auf natürliche Eintragswege hin (z.B. Laubfall, Wiesenabflusswasser, etc.). Da dies nur ausgewählte Beispiele von ED sind, die mittels chemischer Analytik nachgewiesen werden konnten, muss angenommen werden, dass die Gesamtheit der ED vor allem in Unterlauf der Alb eine Umweltbelastung mit deutlicher biologischer Wirkung darstellt.

Welche Bedeutung haben diese Ergebnisse für die aquatischen Lebewesen in der Alb? Zur Beantwortung dieser Frage muss zuerst festgestellt werden, dass es sich bei den durchgeführten Untersuchungen um Momentaufnahmen von einem bzw. drei Probennahmezeiträumen handelt. Es ist fraglich, ob die Belastung der Alb mit ED im Jahresverlauf konstant ist. Eigene Beobachtungen während der Probennahmen zeigten, dass die Wasserstände der Alb um bis zu 1,50 m variierten, so dass alleine durch Verdünnungseffekte durch das Niederschlagswasser bzw. durch Anreicherung der ED durch hohe Verdunstung Uneinheitlichkeiten der Belastung vorhanden sind. In Ländern mit hoher Bevölkerungsdichte (wie in Deutschland) ist es nicht ungewöhnlich, dass Abwässer einen großen Anteil an der Gesamtwassermenge eines Oberflächengewässers haben. In Großbritannien wurde festgestellt, dass Flüsse zu durchschnittlich 50 % aus Abwässern bestehen, wobei der Anteil in einer Trockenperiode bis auf 90 % ansteigen kann (Sumpter 1997).

Zusätzlich spielt der Expositionszeitraum in der Natur eine große Rolle. Sowohl die Dauer einer Exposition als auch der Entwicklungsstand der betroffenen Organismen sind wichtige Faktoren bei der Wirkung von ED. Eine Besonderheit kommt bei oviparen Vertebraten noch hinzu: Im Gegensatz zu Säugetieren sind die Eier der Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische eine isolierte, unabhängige metabolische Einheit. Daraus folgt, dass lipophile, persistente Substanzen mit den Eidotterlipoproteinen im Ei angereichert werden können und damit Teil des Umgebungsmilieus des Embryos bis zum [Seite 103↓]Schlüpfen werden (Fox 2001; Bögi et al. 2002). Bei Oviparen kann also eine Belastung mit ED unabhängig von der tatsächlichen Gewässerbelastung auftreten. Bei Fischen wurde festgestellt, dass diese Art der Exposition häufig bedeutsamer ist als die Exposition durch ED im Wasserkörper. Zusätzlich sind in jungen Entwicklungsstadien die exkretorischen und metabolisierenden Enzyme nur eingeschränkt aktiv, so dass eine kritische Phase der Exposition besteht (Van der Kraak et al. 2001).

Weiterhin beleuchten die vorgestellten Ergebnisse hauptsächlich einen Angriffspunkt für ED, nämlich die Bindung an die Steroidrezeptoren bzw. die dadurch hervorgerufene Genexpression. Es gibt jedoch zusätzliche Angriffsmöglichkeiten für umweltrelevante ED in den Organismen. So können Enzyme, die im Syntheseweg der Steroidhormone eine Rolle spielen, Angriffspunkte für ED sein. Besonders Cytochrom P450 Enzyme spielen dabei eine Rolle. Aromatase (CYP19) katalysiert zum Beispiel den letzten, limitierenden Schritt bei der Umwandlung von Androgenen in Östrogene. Es wurde gezeigt, dass Imidazol-ähnliche Fungizide die Aromatase in Mikrosomen von Regenbogenforellen hemmen und dadurch die natürlichen Östrogenantworten unterdrücken, so z.B. die Vitellogenin-Synthese während der Fortpflanzung. Es wird begründet vermutet, dass östrogene und antiandrogene Effekte unter anderem durch eine Erhöhung der Aromataseaktivität zustande kommen, während bei antiöstrogenen und androgenen Effekten die Aktivitätsminderung der Aromatase eine Rolle spielt. Vinclozolin scheint der effektivste Aktivator für die Aromatase zu sein (Euling & Kimmel 2001). Somit könnte VC einen Teil seiner antiandrogenen Wirkungsweise statt über eine Hemmung der AR-Transaktivierung über eine Erhöhung der Aromataseaktivität erzielen. Dasselbe wurde für p,p’-DDE gezeigt, das die Aromataseaktivität in Rattenlebern in vivo erhöhen konnte (Sanderson et al. 2002).

Die Belastung von Oberflächengewässern mit ED wird in der Fachliteratur ebenfalls unterschiedlich bewertet. Eine Studie kam beispielsweise zu dem Ergebnis, dass lediglich das Phytoöstrogen β-Sitosterol in relevanten Konzentrationen von 20 – 56 ng / L gefunden wurde und dieses voraussichtlich natürlichen Quellen entspringt (Stumpf et al. 1996). Wenzel et al. (1998) führten eine großangelegte Studie in Deutschland durch, in der sie natürliche und synthetische Östrogene fanden, die überwiegend durch die Abwässer der Kläranlagen und, je nach ihren Adsorptionseigenschaften, mit dem Klärschlamm in die Umwelt gelangten. Die Zufuhr von natürlichen Östrogenen erfolgt nach Meinung dieser Autoren über die natürlichen Exkretionsprozesse des Menschen. Der Mensch scheidet E2, Östriol und Östron bzw. ihre Konjugate (Sulfatester und Glucuronide) aus.

Die metabolische Inaktivierung des E2 erfolgt im Körper durch Einbau von Hydroxy- und Ketogruppen an verschiedene Ringpositionen und damit [Seite 104↓]zur Entstehung von Östron und Östriol, welches das Hauptabbauprodukt darstellt. Zusätzlich können nach Berechnungen, welche die produzierte Menge an EE zur Grundlage haben, EE-Konzentrationen im Auslaufwasser erwartet werden, die im ng / L-Bereich liegen. E2 und seine Metabolite Östron und Östriol sowie 17α-Ethinylöstradiol besitzen eine biologische Aktivität, die gegenüber Industriechemikalien um ein Vielfaches erhöht ist. Eine hormonelle Wirkung des EE auf Regenbogenforellen wurde schon bei Konzentrationen von 0,3 ng / L beobachtet. Effekte im aquatischen System bei einem Wirkstoffgehalt von 0,1 ng / L werden nicht ausgeschlossen (Toft & Baartrup 2001).

Weitere ED, die in Kläranlagenauslaufwasser gefunden wurden, waren Phthalat-Derivate. Es ergaben sich DEHP (Diethylhexylphthalat)-Konzentrationen in Kläranlagenausläufen von 1,5 – 81 µg / L. Bei DBP (Dibutylphthalat) lagen die Konzentrationen bei 0,2 – 10,4 µg / L. Die Autoren untersuchten ihre Gewässerextrakte im Hefetest und fanden in vier von sechs untersuchten Proben eine eindeutige östrogene Aktivität (Toft & Baartrup 2001).

Schließlich spielt auch die Behandlung der den Kläranlagen zugeführten Abwässer eine Rolle für die Umweltbelastung mit ED. Endokrine Stoffe können sowohl durch kommunale als auch durch industrielle Abwässer in Kläranlagen gelangen. Sie kommen in der Regel in gelöster Form an und können teilweise in der mechanischen Reinigungsstufe durch Anlagerung an Feststoffe aus dem Abwasser entfernt und in den Klärschlamm überführt werden. Die dann noch im Abwasser gelösten Stoffe gelangen in die aerobe biologische Reinigung. Einige sind leicht metabolisierbar (Steroidhormone, Phytohormone), andere sind besonders langlebig. Zu letzteren zählen vor allem Xenoöstrogene. Die Adsorption an eine Belebtschlammflocke ist ebenso möglich wie eine Deglucuronierung der konjugierten Östrogene und damit eine Mobilisierung, denn die Glucuronidbindung kann mikrobiologisch sehr schnell gespalten werden (Wenzel et al. 1998). In Proben des Auslaufwassers verschiedener Kläranlagen wiesen Körner et al. (2000) E2-Äquivalentkonzentrationen von 2,5 –25 ng / L im Auslaufwasser nach, was mit den in dieser Arbeit ermittelten Werten gut übereinstimmt.

Kirk et al. (2002) zeigten, dass die androgene und östrogene Aktivität geringer wurde, nachdem das Abwasser die Reinigungsstufen der Kläranlage durchlaufen hatte. Die höchste ED-Reduktionsrate wurde nach der zweiten (biologischen) Klärstufe erreicht. Die meisten Auslaufproben enthielten sehr wenig oder geringe östrogene und androgene Aktivität (max. 13 ng / L E2-Äquivalente bzw. max. 143 ng / L DHT-Äquivalente). Im Vergleich zu den in dieser Arbeit gefundenen Ergebnissen, die klar belegen, dass überwiegend östrogene, aber auch nicht zu vernachlässigende andere Wirkmecha[Seite 105↓]nismen in Kläranlagenausläufen vorhanden sind und im Flussverlauf akkumulieren, erscheinen die bei oben genannter Studie angewandte Nachweismethode als weniger sensitiv.

4.4.  Vergleich der Untersuchungen von Einzelstoff- und Gemischansatz

Ein Vergleich zwischen Einzelstoff- und Gemischansatz führt zu der Aussage, dass beide Ansätze für bestimmte Fragestellungen Vorteile aufweisen. Letztlich ist es aber erforderlich, eine methodische Synthese zwischen den in vitro-Screeningmethoden und den in vivo-Expositionsversuchen zu erarbeiten. So können Ergebnisse aus in vitro-Experimenten mit Gewässerextrakten unvermeidlich nur begrenzte Informationen zur Aktivität der enthaltenen ED liefern. Sie können aber wertvolle Einsichten in die Störungsmechanismen geben. Allerdings müssen einzelne ED oder ED-Gemische ebenfalls in vivo getestet werden, um ein genaues Bild von der Wirkungsweise zu bekommen, besonders deswegen, weil viele Substanzen mehr als eine Art von Aktivität aufweisen können (Sohoni et al. 2001). Prinzipiell scheinen in vitro-Assays nicht sinnvoll zu sein, um Vorhersagen zur Gefährdung der Umwelt durch ED zu machen. Sie sollten aus diesem Grund nur dazu dienen, die Wirkmechanismen von ED aufzuklären und sie können mit Abstrichen dem schnellen Screening von potentiellen ED oder von Umweltproben dienen (Segner et al. 2003).

Eine bereits praktizierte Möglichkeit, wirksame Konzentrationen von ED in Gewässern zu untersuchen, stellen Experimente dar, bei denen in den Gewässern heimische Tiere in Käfigen in definierten Flussabschnitten den Belastungen ausgesetzt sind (sogenannte caging-Experimente). So wurden zum Beispiel in den Geweben von Fischen (Catostomus commersoni), die in Auslaufwasser von Papiermühlen gehalten wurden, Substanzen gefunden, die an den ER, AR und das SHBG binden konnten (Hewitt et al. 2000). Der Nachteil von caging-Experimenten besteht darin, dass Kontrolltiere benötigt werden, die nicht schon ED-adaptiert sind und somit eine belastete Kontrolle darstellen.

Weiterhin werden bei beiden vorgestellten Ansätzen zusätzliche Faktoren unberücksichtigt bleiben müssen, die auf die Reproduktionsbiologie einen Einfluss haben können. Bei Fischpopulationen wurde beispielsweise festgestellt, dass Habitatszerstörung, Klimaveränderungen, Nahrungsres[Seite 106↓]sourcen, Konkurrenz, chemische Gifte, Prädatoren und ED gemeinsam auf die Reproduktionsbiologie Einfluss nehmen (Van der Kraak et al. 2001).

Schließlich muss noch die Übertragbarkeit der erzielten Ergebnisse auf andere Amphibien bzw. andere Wirbeltiere diskutiert werden. Xenopus laevis lebt nicht in mitteleuropäischen Gewässersystemen. Es muss festgehalten werden, dass es eine nicht vernachlässigbare Übereinstimmung der Hormonsysteme von Amphibien und höheren Vertebraten bezüglich der Hormonnatur, der Rezeptoren, der intrazellulären Signalübertragungswege und der Regulation des Hormonsystems gibt. Bögi et al. (2003) fanden heraus, dass grundsätzlich eine Korrelierbarkeit von Ergebnissen zwischen der freilebenden Art Rana temporaria und dem Modellorganismus Xenopus laevis in Bezug auf die Wirkungen von ED besteht.

Die vorgestellten Ergebnisse belegen, dass es prinzipiell möglich ist, mit einer Kombination aus chemischer Fraktionierung und Analytik sowie aus spezifischen Bioassays die Belastung von Gewässern mit ED zu charakterisieren. Das folgende Kapitel dient der Zusammenfassung der erzielten Erkenntnisse und betrachtet abschließend die zukünftigen Möglichkeiten, die sich aus dieser Arbeit ergeben werden.

4.5.  Zusammenfassung und Ausblick

Mit dem bekannten östrogen wirksamen ED BPA wurden sowohl Untersuchungen im Labor zur Bestimmung der biologischen Wirkung auf die Sexualdifferenzierung sowie auf die Induktion des östrogenen Biomarkers ER-mRNA bei Kaulquappen im sensiblen Stadium durchgeführt. So konnte eine Risikobewertung über in vivo-Ansätze ermöglicht werden. Parallel wurde hierzu die chemische Analytik für BPA etabliert, um die tatsächlich vorhandenen BPA-Konzentrationen in Labor- und Freiland-Proben zu bestimmen. Es zeigte sich, dass BPA in Gewässerextrakten der Alb in Konzentrationen vorhanden ist, die ca. zwei Größenordnungen unterhalb einer östrogenen Wirkung liegen. Nach dem Vorsorgeprinzip gelten diese Werte als bedenklich. Da es sich hier nur um eine Einzelsubstanz handelt und ergänzende chemische Analysen belegten, dass daneben noch weitere ED wie z.B. EE teilweise in biologisch wirksamen Mengen vorhanden sind und auch Phytoöstrogene wie Campestrol und β-Sitosterol sowie o,p’-DDE in gut messbaren Quantitäten die Alb belasten, muss davon ausgegangen werden, dass die Umweltbelastung der Alb durch die Gesamtheit an ED biologische Wirkungen induzieren kann.


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Zur Bestimmung der möglichen Wirkmechanismen ((anti)östrogen und (anti)androgen) in Extrakten der Alb wurden konventionelle Rezeptorbindungsstudien für den Nachweis der Bindung an AR und ER eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass neben den erwarteten hohen Werten für Interaktionen mit dem ER unerwartet deutlich auch Inhaltsstoffe vorhanden sind, die an den AR binden und somit potenziell (anti)androgene ED anzeigten. Parallel wurden dieselben Proben-Extrakte auch auf ihre Fähigkeit untersucht, in Primärzellkulturen Biomarker zu induzieren. Um Aussagen über die Wirkmechanismen zu erhalten, wurde zum einen der rein östrogene Biomarker ER-mRNA angewendet und zum anderen RBP-mRNA als neuer Biomarker, der sowohl (ant)östrogene als auch (anti)androgene Wirkmechanismen detektieren und somit als summarischer Biomarker für alle vier Wirkmechanismen angesehen werden kann, etabliert und bestimmt. Der Nachweis beider Biomarker, ER- und RBP-mRNA, um die biologische Wirkung der Alb-Extrakte in Primärzellkulturen zu ermitteln, ergab im Vergleich mit den Ergebnissen der Radiorezeptorassays, dass in der Alb überwiegend östrogenartige ED vorhanden sind, die vor allem über die Kläranlagenausläufe eingeleitet werden. Im Vergleich mit den Resultaten des rein östrogenen Biomarkers ER-mRNA, die eine relativ hohe östrogene Potenz der Gewässerbelastung anzeigen, ergeben die Werte für den summarischen Biomarker RBP-mRNA ein deutlich geringeres östrogenes Potenzial, was darauf schließen lässt, dass neben den östrogenen auch androgene bzw. antiöstrogene Wirkmechanismen in nennenswertem Umfang vorhanden sind.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen belegen anhand der Kombination von chemischer Analytik und verschiedener spezifischer Bioassays, dass in durchschnittlich anthropogen belasteten Oberflächengewässern wie der Alb ED mit verschiedenen Wirkmechanismen in nennenswertem Umfang vorhanden sind, so dass biologische Wirkungen auf die Reproduktionsbiologie von Wirbeltieren auftreten können. Besonders interessant erscheint die Tatsache, dass, wie am Vergleich des rein östrogenen Biomarkers ER-mRNA und des summarischen Biomarkers RBP-mRNA zu sehen ist, die östrogenen Hauptwirkungen durch antagonistische androgene Wirkmechanismen wieder reduziert werden, so dass die Summe aus antagonistischen biologischen Wirkungen auf die Tierwelt geringer ausfallen dürfte als die Detektion der spezifischen Wirkmechanismen jeweils alleine erwarten ließe. Ob diese Hypothese, dass sich die Wirkungen von ED mit verschiedenen Wirkmechanismen tatsächlich aufheben oder aufsummieren, verifiziert werden kann und inwieweit dies geschieht, ist Gegenstand laufender und künftiger Untersuchungen.


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Eine Weiterentwicklung des Testsystems zur Untersuchung der Gewässerbelastung mit ED sollte die Etablierung weiterer wirkungsspezifischer Biomarker für die potenziellen reproduktionsrelevanten Wirkmechanismen beinhalten. Zusätzlich muss über die Entwicklung von Reprotergenassays die Möglichkeit geschaffen werden, das Transaktivierungspotenzial von ED zu erfassen und zu bestimmen. Diese in unserem Labor zur Zeit stattfindenden Bemühungen werden durch die Weiterentwicklung der chemischen Fraktionierungs- und Analysemethoden unterstützt, so dass die durch diese Arbeit gezeigten Möglichkeiten, mit dem Amphibienmodell Xenopus laevis Untersuchungen zur Gewässerbelastung mit ED durchzuführen, optimiert und erweitert werden.


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21.04.2005