2 Material und Methoden

2.1 Pflanzenmaterial

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Die Ausgangspflanze des Untersuchungsmaterials war die Sorte `Kleiner Liebling` von Pelargonium zonale. Hauptgegenstand dieser Untersuchung ist der Klon 5/74/2. Außerdem dienten die Ausgangssorte `Kleiner Liebling` sowie der diploide Klon DDD von `Weißer Liebling` und der tetraploide Klon TTT von `Kleiner Liebling` bzw. verschiedene mehr-fach markierte chimärische Klone (doppelt markierter Klon `Weißer Liebling`, HDD, WRR bzw. dreifach markierter Klon `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR) (Abb. 2) als Vergleichsmaterial. Weiterhin wurde die Sorte `Mrs. Pollock` (Abb. 4) für in vitro-Kultur-Experimente eingesetzt.

Klon 5/74/2 wurde aus dem Sport 5/74/1 ausgelesen und gehört zu der Sportfamilie 5/74, die in einem Mutationsversuch mit Röntgenstrahlung aus der haploiden Sorte `Kleiner Liebling` entstand (Abb. 2, oben rechts) (POHLHEIM 1978; LIEBAU 1988). Die Größe und der Habitus der Pflanzen von Sport 5/74 unterschieden sich nicht von `Kleiner Liebling`, alle drei Gewebeschichten waren haploid (LIEBAU 1988). Die Blätter der Pflanzen hatten ein helles Binnenfeld. Die Blätter des Sports 5/74/1 besaßen eine gekräuselte und stark behaarte Oberfläche und ebenfalls ein helles Binnenfeld. Wurzel-austriebe der Sports 5/74 und 5/74/1 waren weiß. Das heißt, dass die L3 beider Varianten chlorophylldefekt war. Leider sind die Pflanzen des Klons 5/74/1 inzwischen eingegangen und stehen für Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung.

Das Blatt von `Kleiner Liebling` ist glatt und leicht behaart (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu ist das Blatt von Klon 5/74/2 gekräuselt und stark behaart, jedoch im Unterschied zu Klon 5/74/1 völlig grün (KB) (Abb. 3B). LIEBAU (1988) vermutet, dass Klon 5/74/2 durch eine Verdopplung der grünen L2 mit gleichzeitiger Verdrängung der chlorophylldefekten L3 aus Klon 5/74/1 entstanden ist. Der Klon 5/74/2 ist nicht stabil. Bei vegetativer Vermehrungen durch Stecklinge in vivo entstehen nicht selten Sprosse mit neuer Blattform aus der ursprünglichen KB-Form von Klon 5/74/2: Die Blätter dieser Sprosse sind entweder gekräuselt ohne starke Behaarung (K), oder stark behaart ohne Kräuselung (B) oder glatt mit kurzen Haaren (N) wie `Kleiner Liebling`. Abbildung 3C zeigt eine Pflanze von Klon 5/74/2 mit einem Spross mit nur behaarten Blättern (B) und mit einem typischen Spross mit gekräuselten und stark behaarten Blättern (KB). Die Stabilität des Sports aus Klon 5/74/2 wurde untersucht. Sprosse mit gekräuselten oder stark behaarten oder glatten und kurzhaarigen Blättern wurden abgenommen und als Sports K, B und N weiter-kultiviert. Dabei sollte geprüft werden, ob an K- und B-Sports wiederum N-Sprosse auftreten und an N-Sprossen Rückschläge von Typ 5/74/2 entstehen.

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Abb. 3: Morphologie der Blätter des untersuchten Klons 5/74/2.
A. Normales Blatt von `Kleiner Liebling`, glatt und schwach behaart (N).
B. Typisches Blatt von Klon 5/74/2, gekräuselt und stark behaart (KB).
C. Spross mit behaarten Blättern (B) und Spross mit gekräuselten und stark behaarten Blättern (KB) an einer Pflanze des Klons 5/74/2.

Der dreifach markierte chimärische Klon `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR ist eine Cytochimäre und kombiniert Laub- und Blütenblattmuster (Abb. 2, unten links). Die Zellen der L1-bürtigen Epidermis sind diploid und die Zellen der L2- sowie L3-bürtigen Gewebe sind haploid. Darüber hinaus sind die Epidermis und die inneren Gewebe des Blattes grün, der Rand des Blattes (L2-bürtig) ist weiß. Die Blütenfarbe der Blüten ist weiß.

Der genutzte Klon `Mrs. Pollock` hat ein Weißrand-Blattmuster (GWG) (Abb. 4A, B). Bei der mehrjährigen vegetativen Vermehrung durch Stecklinge entstanden auch Sprosse mit Weißkern-Blattmuster (GGW) oder völlig grünen Blättern (GGG) (Abb. 4C-H).

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Abb. 4: Blattmuster und Blattvariation von `Mrs. Pollock`. A-B. Blattmuster GWG und der Querschnitt im Binnenfeld; C-D. Blattmustervariante GGW und der Querschnitt im Binnenfeld; E-F. Blattmustervariation von GWG zu GGW und GGG; G-H. Querschnitt im Binnenfeld der Übergangszone von GWG zu GGW und im grünen Binnenfeld von GWG.

2.2 Untersuchungsmethoden

Zum Nachweis der Variabilität der Epidermiszellen von Klon 5/74/2 wurden die Stomatalängen in Frischpräparaten und die Zellgrößen von Sprossscheitellängsschnitten gemessen. Dazu wurden Epidermisabzüge und Kunststoffpräparate angefertigt. Weiterhin wurde die Chromosomenzahl der L1-, L2- und L3-bürtigen Gewebe untersucht. Alle Pflanzen wurden unter gleichen Bedingungen im Gewächshaus herangezogen.

2.2.1 Untersuchungen der Stomatagrößen

Zur Bestimmung der Stomatagrößen an Frischpräparaten wurde jeweils das 3. Laubblatt von vier Pflanzen des haploiden, und tetraploiden Klons der Sorte `Kleiner Liebling`, des diploiden Klons `Weißer Liebling` sowie von Klon 5/74/2 abgenommen. Unter der Lupe wurde die untere Epidermis des Laubblattes vorsichtig abgezogen. Dann wurde die Epidermis direkt auf einen mit einem Wassertropfen vorbereiteten Objektträger aufgelegt. Nach Bedecken mit dem Deckglas wurden die Stomatalängen und die Stomatabreiten unter dem Mikroskop mit einem Messokular bestimmt. Der Faktor für die Ermittlung der wirklichen Größe der Zellen wurde unter Zuhilfenahme eines Objektmikrometers wie folgt errechnet:

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Dabei wurde auf eine bei jeder Messung gleiche Entnahmestelle am Laubblatt (Interkostalfeld) und eine ähnliche Konstitution der Pflanzen (Alter, Gesundheits- und Ernährungszustand, gleiche Position des untersuchten Laubblattes) geachtet (SCHWANITZ 1952). Die Erfassung von Messwerten der Stomata einer Pflanze und der Vergleich mit anderen Pflanzen bekannter Ploidiestufe in einer ausreichend großen Stichprobe gilt als sicheres Mittel, um zu einer relativen Aussage über die Ploidiestufe der ersten Scheitelschicht zu kommen. Jedoch ist die Zellgröße ein quantitatives Merkmal und es kann von Umweltfaktoren beeinflusst werden. Deswegen wurden die Daten statistisch abgesichert.

2.2.2 Untersuchung der Chromosomenzahl an Frischpräparaten

Direkte Chromosomenzählung ist die sicherste Methode zur Bestimmung der Ploidiestufe des Gewebes. Mindestens 10 Wurzel- und Sprossspitzen pro Klon wurden am frühen Mittag bei Sonnenschein gesammelt, da zu dieser Zeit schnelles Wachstum stattfindet und die mitotische Aktivität am höchsten ist. Sie wurden sofort in 0,1 %iger Kolchizinlösung für 3 -20 h bei einer Temperatur von 4°C vorbehandelt, um die Chromosomen zu stauchen. Zur Fixierung wurden die Präparate in Fixierlösung (Verhältnis von 3:1; 96%iges Ethanol:100%ige Essigsäure) bei Zimmertemperatur für 24 h gegeben. Die fixierten Präparate lassen sich in 70%igem Ethanol aufbewahren. Die Präparate wurden in 1%iger Karminessigsäure für 24 h gefärbt und anschließend in Karminessigsäure gekocht bis sie weich waren. Danach wurden die Präparate gequetscht und mikroskopiert (Durchlicht-mikroskope Jenaval-contrast und Laboval-2, Dokumentation der Ergebnisse mit dem mikrofotografischen Aufsetzkamerasystem mf-AKS).

2.2.3 Herstellungen von Dauerpräparaten mit Kunststoff-Einbettung

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Zur Untersuchung der Ploidiestufen der verschiedenen Scheitelschichten wurden vom haploiden `Kleinen Liebling`, diploiden ‚Weißen Liebling’ sowie von Klon 5/74/2 mindestens 10 Präparate pro Klon in Kunststoff eingebettet. Weiterhin wurden histolog-ische Schnitte von Laubblättern angefertigt.

Einbettung mit Kunststoff

Von Pelargonium entnommene Sprossspitzen (sowie Laubblätter) wurden nach folgendem Verfahren für die Einbettung behandelt: Die Sprossspitzen wurden bei Sonnenschein je nach Temperatur zwischen 9-15 Uhr entnommen. Nach Entfernung der Hüllblätter der Sprossspitzen unter der Stereolupe wurden die Präparate sofort in 0,1%ige Kolchizinlösung für 3, 6, 20 Stunden bei 4 °C gegeben. Nach der Kolchizinbehandlung wurden sie in Fixierlösung (96%iges Ethanol : 99%iges Chloroform : 100%ige Essigsäure = 6:3:1) für 15 min mit Hilfe einer Vakuumpumpe entlüft und zur weiteren Fixierung 24 Stunden darin belassen. Eine Entwässerungsreihe mit 99%igem Ethylenglykolmonomethylether, 96%igem Ethanol, reinem n-Propanol und 99,5%igem n-Butanol für jeweils 24 Stunden bei Zimmertemperatur wurde angeschlossen.

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Für die Einbettung wurden die Präparate in einer Polymer-Lösung I aus Technovit 7100 (GMA + Co-Katalysator XCl) und Härter I (Dibenzoylperoxid) bei Raumtemperatur 24 Stunden infiltriert. Anschließend wurden die Präparate in einem Gemisch aus Polymer-Lösung I mit Härter II (Dimethylsulfoxid) im Verhältnis 10:1 in Formen bei Zimmertemperatur 24 Stunden polymerisiert. Nach der Polymerisation wurden Trägerblöcke an den Formen befestigt.

Die eingebetteten Präparate wurden am Rotationsmikrotom RM 2155 der Firma LEICA in einer Dicke von 6-10 µm geschnitten. Alle Schnitte wurden auf mit Alkohol gesäuberten Objektträgern in einem Wassertropfen nacheinander in serienmäßigen Reihen aufgelegt. Vor der Trocknung der Objektträger auf der Heizplatte bei 60°C wurden die Objektträger mit Bleistift an der Seite numeriert, damit die Serienschnitte bei der Untersuchung nicht vertauscht wurden.

Anfärbung der Dünnschnitte

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Die Dünnschnitte von in Kunststoff eingebetteten Dauerpräparaten wurden in verschiedenen Farbstofflösungen angefärbt.

Modifizierte Feulgen –Färbung

Für die modifizierte Feulgen-Färbung wurde Schiffs-Reagenz-Lösung (Firma, Merck) mit 1%iger Formalin-Essigsäure-Mischlösung (38%iges Formaldehyd: 100%ige Essigsäure = 1:1 V/V) versetzt. In dieser Lösung wurden die Dauerpräparate 15 bis 30 min gefärbt und anschließend mit Leitungswasser kurz gespült.

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Toluidinblau-Färbung (ROMEIS 1989)

60 ml 1 %ige Toluidinblau O –Wasserlösung (Firma Fluka) wurde mit 30 ml 2,5 %iger wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 10 ml 70 %igem Alkohol versetzt (pH-Wert 12). Je nach gewünschter Färbung wurden die Präparate 5 Sekunden bis 1 Minute in dieser Lösung belassen und im Anschluss daran gründlich mit Leitungswasser gewaschen.

Hämatoxylin – Färbung (HT)

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Die Dünnschnitte der Dauerpräparate wurden in 2 %iger Hämatoxylin-Lösung (Firma Merck) nach DELAFIELD (ROMEIS 1989) bei Raumtemperatur für 24 Stunden gefärbt. Danach wurden die angefärbten Präparatschnitte 15 bis 20 Minuten in Leitungswasser differenziert.

Karmin-Essigsäure-Färbung

Die geschnittenen Dauerpräparate von Sprossspitzen auf dem Objektträger wurden in 1%iger Karmin-Essigsäure-Lösung für 10 min gefärbt.

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Aufbewahrung und Untersuchung von Dauerpräparaten

Alle Präparate mit gut gefärbten Schnitten wurden auf der Heizplatte bei 60°C getrocknet. Nach der Trocknung wurden sie mit DPX- Lösung (Dermic-Paraxylen, Firma Fluka) und mit einem Deckglas zugedeckt und im Dunkeln aufbewahrt. Um die Farbstoffe der Präparatschnitte nicht zu bleichen, muss eine Belichtung der Objekte vermieden werden.

2.2.4 In vitro-Kultur mit Pelargonium zonale

Genotypen der Ausgangspflanzen

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Somatisches Gewebe von Klon 5/74/2 und Gewebe des dreifach markierten chimärischen Pelargonium zonale-Klons `Weißer Liebling`, DHH, GWG sowie GWG- und GGW-Gewebe von `Mrs. Pollock` wurden in vitro kultiviert, um Adventivpflanzen zu regenerieren. Gleichzeitig sollte die Kompetenz von Zellen im Gewebe zur Induktion von Kallus festgestellt werden.

Nährmedium

Es wurde modifiziertes MS-Medium (MURASHIGE & SKOOG 1962) mit der halben Konzentration der Makrosalze und 30 g Saccharose verwendet (Tab. 1). Dann wurde die Vitaminlösung B5 (GAMBORG et al. 1968) zugegeben. Diesem Medium wurden verschiedene Wachstumsregulatoren und Substanzen zur Verminderung der Phenolakkumulation zugefügt (Tab. 2). Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren mit NaOH oder HCl auf 5,8 reguliert.

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Um Misserfolge durch Phenolverbindung zu vermeiden, wurden 12 physikalische oder chemische Varianten von PIERIK (1989) vorgeschlagen. Jedoch liegen keine publizierten detaillierten Protokolle vor. Als Zusatz der Nährmedien zur Verminderung der Bildung von Phenolakkumulation wurden Sand, Papierbrücken, adsorbierende Stoffe wie Aktivkohle, PVP und Perlit sowie Antioxidationssubstanzen (Ascorbinsäure 6,5 mg/l und Glutamin 200 mg/l) eingesetzt (Tab. 2). Alle Varianten (außer Sand und Papier) wurden als Festmedium (0,8 oder 0,4% Agar-Agar) sowie als Flüssigmedium angesetzt. Nach dem Auflösen des Agars durch Kochen wurde die entsprechende Substanz zugegeben. Die Kultur erfolgte in Wulstrand-Glasröhrchen, die mit 10 ml oder in Erlenmeyerkolben, die mit 20 ml der Nährlösung gefüllt wurden. Perlit wurde in gleichem Volumen mit Flüssigmedium aufgefüllt. Die mit Nährmedium gefüllten und mit Aluminiumfolie verschlossenen Kultur-gefäße wurden im Autoklav 20 Minuten bei 121°C und 1,2 at sterilisiert.

Tab. 1: Bestandteile des für die Gewebekultur verwendeten Nährmediums

Makronährstoffe

mg/l

Mikronährstoffe

mg/l

KNO3

950,0

MnSO4*H2O

16,9

NH4NO3

825,0

H3BO3

6,2

MgSO4*7H2O

185,0

ZnSO4*7H2O

8,6

CaCl2*2H2O

220,0

Na2MoO4*2H2O

0,25

KH2PO4

85,0

CuSO4*5H2O

0,025

Fe-SO4*7H2O

27,8

CoCl2*6H2O

0,025

Na2-EDTA

37,8

KJ

0,83

Organische Bestandteile

Glycin

20,0

  

Myo-Inosit

10,0

  

Zucker

30000,0

  

Vitamine

Nicotinsäure

5,0

  

Pyridoxin

1,0

  

Thiamin

1,0

  

Tab. 2: Zusätze zu den Kulturmedien

1. Wachstumsregulator

A. IAA 2 mg/l + BAP 1 mg/l

B. IBA 0,5 mg/l+BAP 2 mg/l

C. 2,4-D 3 mg/l + BAP 2 mg/l

D. TDZ 5 mg/l

E. TDZ 2,2 mg/l

F. TDZ 0,8 mg/l

2. Substanzen zur Verminderung der Phenolakkumulation

I. PVP 500 mg/l

II. Aktivkohle 0,5%

III. Sand

IV. Perlit + PVP

V. Ascorbinsäure 6,5 mg/l + Glutamin 200 mg/l

VI. Papierbrücke

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Explantatgewinnung

Als Explantate dienten Internodiensegmente (ca. 0,5 cm), Blattspreiten (ca. 0,7 cm x 0,7 cm), Sprossspitzen (ca. 1 cm), und Blattstiele ohne Blattgrund, um den Nebenvegetationskegel auszuschließen. Die von den Pflanzen entnommenen Blätter, Stängel und Blattstiele wurden mit Leitungswasser gründlich gewaschen. Das Pflanzenmaterial wurde zuerst in 70 %igem Ethanol 1 min geschwenkt und dann mit Aqua dest. gespült. Je nach Explantatgröße wurden die Explantate 4 bis 6 Minuten in 0,25 %iger Wofasteril-Lösung (Peressigsäure, Firma, Kasla) mit 2-3 Tropfen/100 ml Tween 20 unter Schütteln sterilisiert und anschließend dreimal mit autoklaviertem Aqua dest. gespült. Alle in vitro-Kultur Arbeitenwurden an einer Laminarbox durchgeführt, die Instrumente wurden mit dem Tisch-sterilisator HBS 920 electronic der Firma AGROGEN-Promotion bei 240°C sterilisiert.

Kultivierung der Explantate

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Jedes Röhrchen enthielt 1 oder 2 Explantate und jeder Kolben enthielt 4 Explantate. Die in vitro-Kulturen wurden im Kulturraum bei Temperaturen von 22-26°C zunächst vier Tage in Dunkelheit, anschließend bei einer Photoperiode von 12 h Hell-/ 12 h Dunkelphase kultiviert. Leuchtstoffröhren mit Tageslichtqualität dienten als Lichtquelle. In der ersten Kulturphase wurden die Explantate 4 Tage in flüssigem Medium oder auf Perlit-Medium kultiviert, um das Phenol auszuwaschen bzw. zu verdünnen. Dann wurden sie auf gleiches, mit Agar verfestigtes Medium überführt. Nach Sprossbildung wurden sie auf hormonfreies Medium umgesetzt, um die Wurzeln zu induzieren. Nach der Bewurzelung wurden die Adventivpflanzen im Gewächshaus weiterkultiviert.

2.2.5 Bilddokumentation und statistische Auswertung der Daten

Die mikroskopischen Untersuchungen erfolgten an den Durchlichtmikroskopen JENAVAL-contrast und LABOVAL-2, die Dokumentationen der Ergebnisse mit dem mikrofoto-grafischen Aufsetzkamerasystem mf-AKS und Kleinbildfilmen der Marke Agfa. Fotoaufnahmen der Pflanzen bzw. Pflanzenteile entstanden mit Apparaten der Marke Practica unter Verwendung von Kleinbildfilmen der Marken Agfa und Kodak.

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit SPSS 10 für Windows (SPSS INC., 2000). Die Daten wurden mit dem K-S-Test (KOLMOGOROV-SMIRNOV) auf Normalverteilung geprüft. Lag Normalverteilung vor, wurden die Ergebnisse mit einer Varianzanalyse (ANOVA) und mit dem Tukey-Test zur Mittelwertvergleich bei einer Irrtumwahrscheinlichkeit von α = 0,05 geprüft. Lag keine Normalverteilung vor, wurden der H-Test (KRUSKAL-WALLIS) und der Nemenyi-Test angewandt (KÖHLER et al. 1992).


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21.10.2005