3 Ergebnisse

3.1 Untersuchung der Zellgrößen zur Ploidiestufenbestimmung verschiedener Klone von Pelargonium zonale` Kleiner Liebling`

3.1.1 Untersuchung der Epidermiszellgrößen in Laubblattquerschnitten

↓26

Die Querschnitte von in Kunststoff eingebetteten Laubblättern zeigten, dass die Epidermiszellgrößen des homohistisch haploiden und des homohistisch diploiden Klons relativ regelmäßig waren. Dagegen sind die Epidermiszellgrößen von Klon 5/74/2 unregelmäßig, wobei einzelne große Zellen deutlich aus der Epidermisoberfläche herausragen (Abb. 5).

Abb. 5: Querschnitt durch in Kunststoff eingebettete ausgewachsene Laubblätter von verschiedenen Klonen aus Pelargonium zonale `Kleiner Liebling`. A. Querschnitt eines haploiden Blattes von `Kleiner Liebling`,
B. Querschnitt eines diploiden Blattes von `Weißer Liebling`, C. Querschnitt von Klon 5/74/2, sowohl auf der Blattober- als auch Blattunterseite treten in der Epidermis stark vergrößerte Zellen in Erscheinung, die zum Teil aus der Epidermisoberfläche herausragen. D. Querschnitt von einem Sektorblatt (N/B) von Klon 5/74/2. Davon sind die oberen Epidermiszellen diploid und die unteren Epidermiszellen zeigen unterschiedliche Größe.

Je 100 Zellen der oberen Epidermis der in Kunststoff eingebetteten Laubblattquerschnitte des 3. vollständig entfalten Laubblattes wurden in Höhe und Breite vermessen. Dabei waren die oberen Epidermiszellen des diploiden Klons signifikant breiter und höher als die des haploiden (Tab. 3). Die Epidermiszellen von Klon 5/74/2 wiesen auffällig unregelmäßige Größen auf. Die Mittelwerte der Epidermiszelllängen und -breiten bei Klon 5/74/2 unterschieden sich signifikant von den für haploide und diploide Klone ermittelten Werten. Die Streubreiten variierten bei Klon 5/74/2 dreimal stärker als bei den anderen beiden Klonen.

↓27

Tab. 3: Epidermiszellgröße von Laubblattschnitten bei verschiedenen Klonen (Mittelwert ± Standardabweichung (SD), jede Variante n = 100)

Klon

Zellbreiten (µm)

 

Zellhöhe (µm)

 

Mittelwert±SD

Streubreiten

 

Mittelwert±SD

Streubreiten

haploid

22,3a ± 6,3

11,0- 47,0

 

19,7 a± 2,6

14,0- 27,0

diploid

31,1b ± 6,8

16,0- 49,0

 

25,4 b± 4,5

17,0- 36,0

5/74/2

56,1c ± 26,6

16,0-156,0

 

48,0 c± 15,5

20,0-100,0

Mittelwerte, die in einer Spalte mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p< 0,05, H-Test und Nemenyi-Test).

3.1.2 Stomatagrößen in verschiedenen Klonen aus `Kleiner Liebling`

Um eine indirekte Aussage über den Ploidiegrad der Epidermiszellen des Klons 5/74/2 zu erhalten, wurden zunächst Stomata eines haploiden, eines diploiden und eines tetraploiden Klons von `Kleiner Liebling` gemessen und mit den entsprechenden Messwerten von 5/74/2 verglichen. Länge und Breite der Stomata nimmt von der haploiden über die diploide zur tetraploiden Stufe zu (Abb.6A-C, Tab. 4). Die Stomata von Klon 5/74/2 sind größer als die des tetraploiden Klons (Abb. 6D). Die Größe der Stomata von 5/74/2 ist aber nicht so einheitlich (Abb.6E), wie sie von einer normalen Ploidiestufe (haploid, diploid, tetraploid) bekannt ist. Außerdem wurden Stomataszwillinge und Stomatamehrlinge bei 5/74/2 beobachtet (Abb. 6F).

Die Mittelwerte der Stomatabreiten und –längen der 3. vollständig entfalteten Laubblätter nehmen von haploid über diploid zu tetraploid zu und steigen signifikant mit der Ploidiestufe an (Tab.4). Die Distanz der Mittelwerte der Stomatalängen zwischen dem haploiden Klon und dem diploiden Klon beträgt 7 µm und zwischen dem diploiden und dem tetraploiden 6,5 µm. Das heißt, dass eine Ploidieverdoppelung beim Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` in einer Stomataverlängerung von ca. 6,8 µm führt.

↓28

Abb. 6: Gegenüberstellung von Epidermisausschnitten der Klone mit unterschiedlichen Ploidiestufen aus `Kleiner Liebling`

Die Stomatabreite nimmt jedoch nicht so stark zu wie die Stomatalänge. Die Differenz der Stomatabreiten zwischen dem haploiden Klon und dem diploiden Klon beträgt 5,1 µm, und zwischen dem diploiden und dem tetraploiden 3,0 µm. Der Quotient von Stomatalänge zu Stomatabreite nahm unregelmäßig mit der Steigerung der Ploidiestufe zu. Somit hat die Stomatabreite weniger Aussagekraft als die Stomatalänge bei der Abschätzung der Ploidiestufe. Deshalb wurde später nur die Stomatalänge als Parameter zur Analyse der Ploidiestufen benutzt.

Zwar kommen im Blatt der KB-Sprosse einige Inseln mit größeren oder kleineren Stomata vor, aber es ist keine Gesetzmäßigkeit der Anordnung dieser Inseln zu beobachten. Die Stomata von Klon 5/74/2 waren im Mittelwert sehr viel länger als bei dem tetraploiden Klon (Tab. 4) und die Spannweite zwischen Minimum und Maximum der Stomatalängen war 3 mal größer. Die Häufigkeitsdiagramme der Stomatalängen zeigten, dass jeder der drei definierten Ploidieklone (haploid, diploid, tetraploid) von Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling` nur einen Gipfel bildete (Abb. 7). Die statistische Überprüfung der Messwerte zeigt beim K-S-Test Normalverteilung an. Das bedeutet, die Stomatalängen der untersuchten Blätter gehörten zu jeweils nur einer Ploidiestufe. Die Überlappungen der Stomatalängen zwischen benachbarten Ploidiestufen bedeutet, dass die Messung einer zu kleinen Zellanzahl zu unsicheren Aussagen führen kann. Eine statistische Prüfung ist notwendig.

↓29

Tab. 4: Länge und Breite der Stomata bei verschiedenen Klonen aus `Kleiner Liebling` (Mittelwert ± Standardabweichung (SD), jede Variante n = 200)

Klon

Länge in µm

 

Breite in µm

Quotient = Länge/ Breite

Mittelwert±SD

Streubreiten

 

Mittelwert±SD

Streubreiten

 

haploid

22,0a±1,9

17,0-27,0

 

19,4 a±2,1

15,0-25,0

1,134

diploid

29,0b±2,6

24,0-34,0

 

24,5 b±2,5

22,0-32,0

1,184

tetraploid

35,5c±2,4

29,0-42,0

 

27,5 c±2,3

23,0-35,0

1,291

5/74/2

52,3d±9,1

34,0-77,0

 

35,1 d±5,2

25,0-47,0

1,490

Mittelwerte, die in einer Spalte mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, H-Test und Nemenyi-Test).

Das Häufigkeitsdiagramm der Stomatalängen von Klon 5/74/2 zeigt eine fünfgipflige Verteilung (Abb. 7) und weicht von den Häufigkeitsverteilungen der Klone mit bekannter Ploidiestufe von `Kleiner Liebling` ab. Hier handelte es sich nicht um eine Normalverteilung, sondern um eine multimodale Verteilung.

Die fünf Gipfel im Häufigkeitsdiagramm der Stomatalänge des 3. Blattes von Klon 5/74/2 befinden sich bei 39, 47, 55, 63 und 69 µm. Die Unterschiede der benachbarten Gipfel der multimodalen Stomatalängenverteilung waren ca. 7,5 µm, also ungefähr so groß wie die durchschnittliche Steigung zwischen zwei benachbarten Ploidieverdopplungen in Vergleichsklonen von `Kleiner Liebling`, die bei 6,8 µm lag.Die Untergrenze der Stomatalängen von Klon 5/74/2 lag bei 35 µm, was offensichtlich dem Bereich und Mittelwert des tetraploiden Klons entspricht.

↓30

Abb. 7: Gegenüberstellung der Häufigkeitsdiagramme (Anzahl von Stomata) der Stomatalängen (in µm) verschiedener Klone aus `Kleiner Liebling` (n=200).

Nach RISLER (1961) gehören alle Werte, die sich um einen Gipfel gruppieren, im wesentlichen einer Ploidiestufe an. Somit lässt sich anhand der Anzahl der Gipfel die Anzahl der unterschiedlichen Ploidiestufen ableiten und schlussfolgern, dass es sich bei der Epidermis von Klon 5/74/2 offensichtlich um ein Gewebe mit unterschiedlichen Ploidie-stufen handelt.So kann man annehmen, dass die möglichen Ploidiestufen der Epidermis-zellen des 3. Blattes bei den untersuchten Pflanzen von Klon 5/74/2 4, 8, 16, 32 und 64 sind.

3.1.3 Das Verhältnis von Stomatalängen zu Ploidiestufen unterschiedlicher Klone aus `Kleiner Liebling`

Das Verhältnis der Mittelwerte der Stomatalänge zwischen haploidem und diploidem Klon in Pelargonium zonale war nicht wie das Ploidiestufenverhältnis 1:2, sondern ca.1: 1,35 (Tab.5), zwischen haploid und tetraploid war es durchschnittlich 1:1,65. Das Verhältnis zwischen diploidem und tetraploidem Klon betrug ca. 1:1,22, war also kleiner als das Verhältnis zwischen haploidem und diploidem Klon. Das heißt, dass das Verhältnis des Mittelwertes der Stomatalänge aufeinander folgender Ploidiestufen nicht linear wie das Verhältnis der Ploidiestufen der Zellen anstieg, sondern mit Steigerung der aufeinander folgenden Ploidiestufen abnahm.

↓31

Die Regression zwischen Stomatalänge und Ploidiestufe der Epidermiszellen wurde berechnet. Die Analyse offenbarte, dass der Zusammenhang zwischen den Stomatalängen und den Ploidiestufen bei den drei untersuchten Vergleichsklonen sehr eng war. Diese Korrelation betrug 0,90. Das heißt, mit steigender Ploidiestufe erhöhten sich die Mittelwerte der Stomatalängen. Dabei betrug das Bestimmtheitsmaß der Korrelation zwischen Ploidiestufen und Stomatalänge 0,80. Das bedeutet, über 80% der Variabilität der Stomatalänge unter Voraussetzung einer linearen Abhängigkeit kann durch die Variabilität der Ploidiestufen erklärt werden.

Die Regression war bei α = 0,05 signifikant. Deswegen kann man durch die Ermittlung der Stomatalänge die Ploidiestufen der Epidermiszellen der Klone von Pelargonium zonale indirekt bestimmen. Somit lassen sich die Stomata- und Epidermiszellgröße für die Ploidie bestimmung der ersten Sprossscheitelschicht nutzen.

Tab. 5: Quotienten der Mittelwerte der Stomatalänge und deren Ploidiestufe in verschiedenen homohistischen Klonen aus Pelargonium zonale `Kleiner Liebling`

Ploidiestufe

diploid

Tetraploid

Verhältnis zu haploid

1,35

1,65

Verhältnis zu diploid

-

1,22

↓32

Aufgrund der Polyploidisierung der somatischen Zellen durch Chromosomenverdopplungkann die Ploidiestufe bei den Varianten von Pelargonium zonale hier im Allgemeinen als Zweier-Potenz angegeben wurden, um die Analyse zu vereinfachen. Daraus folgt:

die somatische Ploidiestufe: 2n = 2 k

die Haploidie: 2n = 1 = 2 0, k = 0,

↓33

die Diploidie: 2n = 2 = 2 1, k = 1,

die Tetraploidie: 2n = 4 = 2 ², k = 2,

die Oktoploidie: 2n = 8 = 2³, k = 3 usw.

↓34

Nach der mathematischen Formel ist die Regressionsfunktion zwischen den untersuchten Sollwerten und den bekannten Basiswerten der Stomatalänge:

y = b 0 + b 1 k

y = Sollwert der Stomatalänge der untersuchten Objekte

↓35

k = Variable der Potenz der Ploidiestufe der untersuchten Objekte

b1 = Steigung ist ein Maß für die Änderung entlang der Regressionsgeraden.

↓36

b0= Ein Basiswert der Stomatalänge der Kontroll-Objekte mit bekannter Ploidiestufe, Funktionswert für k=0.

Anhand dieser Analyse von dem haploiden, diploiden sowie dem tetraploiden Klon wurde eine Bezugsformel zwischen Stomatalänge und ihren Ploidiestufen bei Pelargonium zonale aufgestellt. Damit kann man die Ploidiestufen höher polyploidisierter Stomata abschätzen.

y = 6,94 k + bo

↓37

Ploidiestufe 2n ≈ 2 (y-b0)/6,94

Dabei ist 6,94 die durchschnittliche Steigung b1 nach der zweijährigen Analyse.

Beispielsweise lässt für die Stomatalänge der Haploiden der Wert 22,0 µm aus den vorliegenden Untersuchungen als Basis-Wert b0. Daraus ergibt sich folgende Gleichung:

↓38

y = 6,94 k + 22,0

Die mögliche, unbekannte Ploidiestufe einer Pflanze kann durch den Vergleich mit der Stomatalänge einer als haploid bekannten Pflanze errechnet werden.

Ploidiestufe 2n ≈ 2(y-22,0)/6,94

3.1.4 Stomatagrößen im Verlauf der Sprossentwicklung unterschiedlicher Klone aus `Kleiner Liebling`

↓39

Die Zellen in den Blättern eines Sprosses befinden sich während des Wachstums in unterschiedlichen Entwicklungsphasen. Zellen im jüngeren Blatt sind noch in der Wachstumsphase, während die Zellen im ausgewachsenen Blatt eine maximale Größe erreicht haben.Die Stomatalängen verschiedener Laubblätter von 5 Sprossen, die am Spross von oben nach unten numeriert wurden, zeigten eine Entwicklungstendenz (Tab. 6). Die Mittelwerte der Stomatalängen an verschiedenen Laubblättern nahmen bei dem haploiden, diploiden und tetraploiden Klon mit der Steigerung der Blattposition zu.Ältere Blätter hatten signifikant längere Stomata als jüngere Blätter.

Die statistische Analyse zeigte, dass sich die Werte für das 1. und 3. Blatt signifikant von denen des 5. Blattes auf allen drei Ploidiestufen unterschieden, aber nur beim tetraploiden Klon eine maximale Differenz der Messwerte zwischen den benachbart gemessenen Blättern von 5,7 µm erreicht wurde, die dem Ploidie-Kriterium angenähert ist.

Die Stomatalängemessung der KB-Sprosse von 5/74/2 zeigte manchmal einige Inseln mit größeren oder kleineren Stomata, aber eine Gesetzmäßigkeit der Verteilung dieser Inseln wurde nicht beobachtet. Die Differenz der Mittelwerte der Stomatalänge zwischen dem 1. und 7. Blatt von Klon 5/74/2 hingegen betrug ca. 21 µm. Dies entspricht einer dreimaligen Chromosomenverdoppelung bezogen auf die Ploidiestufe des haploiden Klons `Kleiner Liebling`. Jedoch waren die Unterschiede der Mittelwerte zwischen benachbarten gemessenen Blättern bei Klon 5/74/2 unregelmäßig.

↓40

Tab. 6: Stomatalängen (in µm) des 1., 3. und 5. (bzw. 7) Laubblattes verschiedener Klone aus `Kleiner Liebling` (Mittelwerte, ± Standardabweichung, Streubreite, n = 100 Stomata pro Blatt an 5 Sprossen, n = 150 für Klon 5/74/2).

 

Haploider Klon

Diploider Klon

Tetraploider Klon

Klon 5/74/2

Blatt 1

20,8a ± 1,8

16,0 - 25,0

26,5a ± 2,2

18,0 - 31,0

32,6a ± 2,7

25,0 - 38,0

39,4a ± 7,0

24,0 - 55,0

Blatt 3

21,4a ± 1,7

17,0 - 25,0

26,6a ± 1,7

23,0 - 31,3

33,0a ± 2,4

27,0 - 39,0

53,1b ± 9,5

34,0 - 79,0

Blatt 5

22,9b ± 2,0

16,0 - 31,0

27,4b ± 1,8

23,0 - 31,3

38,3c± 3,6

31,0 - 47,0

54,1b ± 8,4

42,0 - 88,0

Blatt 7

-

-

-

60,8c ± 13,8

44,0 - 98,0

Mittelwerte in einer Spalte, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05; Tukey-Test bei haploidem und diploidem Klon; Nemenyi-Test bei tetraploidem Klon und Klon 5/74/2).

Die Häufigkeitsverteilungen der Stomatalängen der untersuchten Blätter hatten bei den haploiden und diploiden Pflanzen nur einen Gipfel. Die Gipfelstelle der Häufigkeiten der Stomatalängen vom 1. bis 5. Blatt verschob sich leicht nach rechts (Abb. 8). Dies weist darauf hin, dass die Stomatalängen der untersuchten Blätter in haploiden und diploiden Pflanzen bei Pelargonium zonale zu einer Ploidiestufe gehören und erst beim Wachstum der Blätter eine maximale Größe erreicht wurde.

Die Häufigkeitsdiagramme der Stomatalängen der drei untersuchten Laubblätter des tetraploiden Klons zeigten, dass die Stomatalängen im 1. und 3. Blatt den gleichen Gipfel und eine annähernde Normalverteilung besaßen (Abb. 8).

↓41

Abb. 8: Gegenüberstellung der Häufigkeitsdiagramme (Anzahl von Stomata) der Stomatalängen (µm) des 1., 3. und 5. Laubblattes von Pflanzen mit unterschiedlichen Ploidiestufen bei verschiedenen Klonen aus `Kleiner Liebling` (n= 100 Stomata aus 5 Sprossen), H1= haploid, Blatt 1; D3 = diploid, Blatt 3; T5 = tetraploid, Blatt 5.

Für das 5. Blatt fand sich dagegen eine zweigipflige Verteilung. Außer dem normalen Gipfel bei 34 µm, der dem des 1. und 3. Blattes entsprach, trat ein weiterer bei 42 µm auf. Letzterer entspricht nahezu dem Ploidie-Kriterium und weist darauf hin, dass die Stomata im 5. Blatt der tetraploiden Pflanze möglicherweise bereits zwei unterschiedlichen Ploidiestufen angehörten.

Die Häufigkeitsdiagramme der Stomatalängen vom 1. bis 7. Blatt der typischen KB-Sprosse von Klon 5/74/2 zeigten mehrere Gipfel und sehr große Streubreiten (Abb. 9). Das wies daraufhin, dass die Epidermis verschiedenen Ploidiestufen existierte. Das ältere Blatt hatte höhere Stomatagrößen als das jüngere Blatt. Offensichtlich lag neben der üblichen Zellvergrößerung im Verlauf der Ontogenese eine atypische Entwicklung vor. Im Verlauf der Blattentwicklung von Klon 5/74/2 kam es zur Bildung extrem großer Zellen. Daher ist anzunehmen, dass die Zellpolyploidisierung des Blattes mit der Entwicklung des Gewebes im Zusammenhang steht, d.h. die Epidermiszellen werden bei der Entwicklung des Gewebes weiter polyploidisiert.

↓42

Abb. 9: Häufigkeitsdiagramme (Anzahl von Stomata) der Stomatalängen (µm) verschiedener Laubblätter von fünf typischen KB-Sprossen von Klon 5/74/2 (n= 150).

3.1.5 Stomatamessungen an Entmischungen des Klons 5/74/2

Innerhalb des Klons 5/74/2 neigen die einzelnen Pflanzen unterschiedlich stark dazu, morphologisch abweichende Sprosse zu bilden. Die aus 5/74/2 Pflanzen mit typischen KB-Blättern getriebene Sprosse mit kräuselten (K) oder stark behaarten (B) oder glatten und kurzhaarigen (N) Blättern wurden abgenommen und als K-, B- und N-Sports weiter-kultiviert. An K- und B-Sports treten auch N-Sprosse auf. Im Verlauf der weiteren Entwicklung blieben diese N-Sports morphologisch stabil und ein Rückschlag von Typ 5/74/2 wurde niemals an N-Sports beobachtet.

An drei Pflanzen wurden die Stomatalängen der Ausgangspflanze und der Sprossaustriebe verglichen (Tab. 7). Die Stomatalängen von K- und B-Sports lagen in verschiedenen Ploidiebereichen. Die Stomata der N-Sprosse aus KB-Pflanzen bzw aus K-, B-Sports, waren jeweils signifikant kürzer als die der entsprechenden Ausgangspflanzen und lagen in der Größenordnung des diploiden Klons von `Weißer Liebling` (vgl. Tab. 4).

↓43

Tab. 7: Stomatalängen der Sprossaustrieben im Vergleich zu den Ausgangssports (n = 50)

Ausgangsports

Sprossaustriebe

Mittelwert (µm)

SD

Modalwert (µm)

Streubreiten (µm)

KB

KB

52,8a

9,3

39,0;46,0;54,0;62,0;69,0

34,0 - 71,0

 

N

29,9b

2,3

31,0

26,0 - 34,0

B

B

50,6a

7,0

49,0; 42,0

36,8 - 68,8

 

N

26,8b

1,8

27,7

22,1 - 32,0

K

K

73,9a

12,8

49,0; 74,0

49,0 -108,0

 

N

30,0b

2,3

30,0

24,0 - 36,8

Mittelwerte in einem Block, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, Nemenyi-Test).

An Klon 5/74/2 wurden auch verschiedene Blätter mit morphologisch auffälligen Sektoren beobachtet (Abb. 10). Die Stomatalängen dieser Blattvariationen wurden ebenfalls gemessen. Die Stomata der N-Sektoren waren signifikant kürzer als die Stomata der KB-, K- und B-Sektoren und lagen auch in der Größenordnung des diploiden Klons `Weißer Liebling` (Tab. 8). Somit lagen die Stomatalängen sowohl des neu aufgetretenen N-Sprosses als auch der N-Blattsektoren (Tab. 7, 8) überwiegend im diploiden Bereich.

Dagegen lagen die Stomatalängen des K- und B-Sprosses (Tab. 7) bzw. des K- und B-Sektors (Tab. 8) in verschiedenen polyploiden Bereichen, wie es auch an dem KB-Spross (Tab. 7) beobachtet wurde. Extreme Kräuselung and Behaarung scheint in den vorliegenden Fällen mit dem Auftreten extremer Stomata in Verbindung zu stehen. Die K- und B-Sports aus den KB-Pflanzen sind wahrscheinlich durch Entmischungen entstanden.

↓44

Abb. 10: Gegenüberstellung von Blättern mit auffälligen Sektoren und von Epidermisabzügen an Klon 5/74/2. A- B. KB-Blatt mit N-Sektor und Stomata in der Übergangszone einer KB-Pflanze, C- D. B-Blatt mit N-Sektor und Stomata in der Übergangszone einer B-Pflanze, E- F. K-Blatt mit N-Sektor und Stomata in der Übergangszone einer K-Pflanze.

Außerdem wurde somatische Ploidiereduktion anhand der Zellgrößen in der Epidermis bei zwei Pflanzen von Klon 5/74/2 beobachtet. Der Mittelwert der Stomatalängen in Pflanze 5 von Klon 5/74/2 mit gekräuselten und stark behaarten Blättern betrug 55,6 µm im polyploiden Bereich von 39-76 µm, der Mittelwert der Stomatalängen des ersten N-Sprosses 5/N(1) betrug 39,2 µm im tetraploiden Bereich von 32-47 µm. Jedoch lag der Mittelwert der Stomatalänge des Austriebes 5/N(2) aus dem ersten N-Spross 5/N(1) nur bei 25,8 µm im diploiden Bereich von 19-29 µm. Die Pflanze B3 von Klon 5/74/2 weist eine ähnliche Entwicklungstendenz auf (Tab.9).

Tab. 8: Stomatalängen in verschiedenen Sektoren auf Blattvariationen von Klon 5/74/2 (Abb. 10), in jedem Sektor wurden je 50 Stomata gemessen.

Blatt-Variante

 

Mittelwert (µm)

SD

Modalwerte (µm)

Streubreiten (µm)

KB

(Abb. 10A, B)

KB-Blatt

55,5a

8,9

52,0; 58,0; 63,0

37.0 – 78,0

N-Sektor

31,3b

4,3

25,0; 32,0; 37,5

22,0 – 37,0

B

(Abb.10C, D)

B-Blatt

56,6a

6,8

39,0; 49,0; 56,0

41,0 – 71,0

N-Sektor

28,6b

1,8

29,0

24,0 – 33,0

K

(Abb. 10E, F)

K-Blatt

55,6a

8,1

49,0; 54,0; 61,0

36,8 – 73,5

N-Sektor

33,5b

3,4

29,0

29,4 – 39,2

↓45

Mittelwerte in einem Block, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, Nemenyi-Test).

Tab. 9: Stomatalängen und mögliche Ploidiestufe bei verschiedenen Sprossaustrieben von Klon 5/74/2

Pflanze

Mittelwert in µm

Modalwert in µm

Intervall in µm

Ploidiestufe

Jahr

5/KB

55,6

49,0

39,0-76,0

P

2000

5/N(1)

39,2

39,2

32,0-47,0

T

2000

5/N(2)

25,8

27,0

19,6-29,4

D

2001

B3-1

50,0

49,0

24,5-66,2

P

2000

-2

34,5

36,8

27,0-44,1

T

2001

-3

28,6

29,4

24,5-36,8

D

2001

3.2 Histologische Untersuchungen an Sprossscheiteln von Pelargonium zonale

3.2.1 Zellgröße in Sprossscheitelschichten verschiedener Klone aus `Kleiner Liebling`

Im Längsschnitt durch den Sprossscheitel von `Kleiner Liebling`, HHH war die Zellgröße in den drei Scheitelschichten gleich (Abb. 11).

↓46

Abb. 11: Längsschnitt durch den Sprossscheitel von Sorte `Kleiner Liebling`.

Das Häufigkeitsdiagramm der Zellgrößen in Radiusrichtung von drei Sprossscheitelschichten zeigte jeweils nur einen Gipfel (Abb. 12).

Abb. 12: Häufigkeitsdiagramme (Zellzahl) der Zellgrößen (µm) der drei Sprossscheitelschichten der haploiden Sorte `Kleiner Liebling`.

↓47

Die statistische Prüfung der Zellgrößen bei Messungen in Radiusrichtung zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Zellschichten (Tab.10).

Tab. 10: Zellgrößen in den Sprossscheitelschichten der haploiden Sorte `Kleiner Liebling`

Schicht

N

Mittelwert (in µm)

SD

Streubreiten (in µm)

L1

33

7,7a

0,8

6,3-9,4

L2

33

7,5a

1,1

6,3-9,4

L3

33

7,5a

1,3

4,7-9,4

Mittelwerte in einer Spalte, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, Tukey).

Im Längsschnitt durch den Sprossscheitel von `Weißer Liebling`, HDD waren die Zellen in der L1 deutlich kleiner als die Zellen in L2 und L3 (Abb. 13).

↓48

Abb. 13: Längsschnitt durch den Sprossscheitel des cytochimärischen Klons HDD (haploid-diploid-diploid) von `Weißer Liebling`. Die Zellen in L1 sind deutlich kleiner als die Zellen in L2 und L3.

Das Häufigkeitsdiagramm der Zellgrößen in Radiusrichtung der drei Sprossscheitelschichten des cytochimärischen Klons HDD zeigte jeweils nur einen Gipfel (Abb. 14).

Abb. 14: Häufigkeitsdiagramme (Zellzahl) der Zellgrößen (in µm) der drei Sprossscheitelschichten des cytochimärischen Klons HDD von `Weißer Liebling`.

↓49

Die Zellmessungen bei dem cytochimärischen KlonHDD von Pelargonium zonale `Weißer Liebling` zeigten, dass die Zelldurchmesser in Radiusrichtung des Sprossscheitels in der haploiden L1 signifikant kleiner als die in der diploiden L2 und der L3 waren (Tab. 11). Die Größenunterschiede der Zellen der diploiden L2 und L3 waren nicht signifikant. Das Verhältnis der Mittelwerte der Zellgrößen zwischen den L1-Schicht und L2 oder L3 betrug ca. 1,2.

Tab. 11: Zellgrößen in den Sprossscheitelschichten des cytochimärischen Klons HDD von Pelargonium zonale `Weißer Liebling`

Zellschicht

n

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

L1 (haploid)

66

7,0a

1,0

6,0 – 9,0

L2 (diploid)

66

8,5b

0,9

6,0 – 11,0

L3 (diploid)

66

8,3b

1,0

6,0 – 11,0

Mittelwerte, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, Tukey-Test).

3.2.2 Entwicklungen der L1-Zellen in Sprossscheiteln von Klon 5/74/2

Die Scheitel von 15 Achsel- und 11 Blütenknospen mit der somatischen Variabilität (Polyploidisierung) der Epidermis bei der Blattentwicklung von Klon 5/74/2 wurden untersucht, um festzustellen, ob haploide, diploide bzw. polyploide L1-Zellen bzw. L1-bürtige bereits im Sprossscheitel bzw. Blütenknospen nachweisbar sind.

↓50

In 7 von 15 geschnittenen Sprossen wurde beobachtet, dass die Zellen in L1 weit größer waren als die in L2 und L3 bzw. die in haploiden Sprossscheiteln (Abb. 15, vgl. Abb. 11, 13). Größere Zellen in der ersten Zellschicht wurden ebenfalls in 3 von 11 Blütenknospen gefunden. Die Zellgrößen in den zwei inneren Scheitelschichten (L2 und L3) unterschieden sich untereinander nicht. Auf Grund der Zellgrößenunterschiede kann man annehmen, dass die in diesen Fällen untersuchten Pflanzen des Klons 5/74/2 bereits periklinale Cytochimären waren.

Die Zelldurchmesser in Radiusrichtung in L1, L2 und L3 von Sprossscheiteln liegen in Tabelle 12 vor (vgl. Tab. 10, 11). Die Mittelwerte unterschieden sich signifikant. Diese Parameter waren bei L1-Zellen um das ca. 1,7 fache größer als bei haploiden Zellen in L2 und L3. Bei Stomatamessungen entspricht eine 1,7fache Vergrößerung der Zelllänge einer zweimaligen Verdopplung der Ploidiestufe (vgl. Kap. 3.1.2), d. h. dass die L1-Zellen in diesem Fall wahrscheinlich tetraploid sind.

Abb. 15: Längsschnitte durch den Sprossscheitel mit stark vergrößerten Zellen in L1 von Klon 5/74/2. Sprossscheitel (A) und Blütenknospe (B) mit vergrößerten Zellen in der ersten Zellschicht. Dies zeigt, dass bereits eine Cytochimäre vorliegt.

↓51

Tab. 12: Zellgrößen der drei Sprossscheitelschichten der Pflanzen von Klon 5/74/2 mit stark vergrößerten Zellen in L1 ( n = 72)

Zellschicht

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

L1

12,7a

1,5

9,8 –17,2

L2

7,6b

1,8

4,9 –12,3

L3

7,2b

2,0

4,9 –14,7

Mittelwerte, die mit verschiedenen Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant (p<0,05, Tukey).

Häufigkeitsdiagramme der Zellgrößen des Sprossscheitels zeigten, dass die Messwerte in allen drei Sprossscheitelschichten nur einen Gipfel aufwiesen (Abb. 16). Daher kann davon ausgegangen werden, dass in den hier untersuchten Sprossscheiteln in L1 die tetraploide Stufe vorlag. Das bedeutet, dass die L1-Zellen im Sprossscheitel bereits polyploidisiert und die Pflanzen der Klon 5/74/2 in diesem Fall Cytochimären PHH sind.

↓52

Abb. 16: Häufigkeitsdiagramme (Zellzahl) der Zellgröße (in µm) in drei Sprossscheitelschichten der Pflanze mit stark vergrößerten Zellen in L1 von Klon 5/74/2.

Im Gegensatz zu Abbildung 15 zeigt Abbildung 17 Scheitel mit kleinen L1-Zellen von Klon 5/74/2. In 8 von 15 geschnittenen Achselknospen wurde gefunden, dass die L1-Zellen am Gipfel teilweise in ihrer Größe mit Zellen der haploiden Innenkomponente (L2 und L3) übereinstimmten. Wenn der Scheitel getroffen wurde, konnte man die kleinen L1-bürtigen Zellen in der Mitte oder an einer Seite des Scheitels erkennen (vgl. Abb.11). Bei 8 von 11 geschnittenen Blütenknospen waren die Zellen der ersten Zellschicht genauso groß wie die der beiden darunter liegenden Zellschichten. Aber die Epidermiszellen an den Blattprimordien waren teilweise vergrößert (Abb. 17, Vgl. Abb. 15).

Abb. 17: Längsschnitte durch den Sprossscheitel mit kleinen Zellen in L1 von Klon 5/74/2 bei Pelargonium.
A. Achselknospe, B. Blütenknospe. In beiden Abbildungen sind die Zellen der ersten Zellschicht nicht größer als die Zellen der tiefer liegenden Zellschichten. Die Epidermiszellen der Blattprimordien in der Nähe des Sprossscheitels sind bei der Blattentwicklung teilweise vergrößert.

↓53

Die Zellgröße in der äußersten Zellschicht unterschied sich nicht signifikant von den zwei inneren Zellschichten (Tab. 13) und der haploiden Pflanze (vgl. Tab. 10).

Tab. 13: Zellgrößen in Blütenknospenlängsschnitten einer Pflanze mit kleinen Zellen in L1 von Klon 5/74/2

Zellschicht

n

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

L1-bürtig

63

7,8a

0,9

6,0 – 9,0

L2-bürtig

63

7,4a

1,2

5,0 – 9,0

L3-bürtig

63

7,4a

1,4

5,0 – 11,0

Die Mittelwerte unterscheiden sich nicht signifikant (p<0,05, Tukey).

Die Häufigkeitsdiagramme der Zellgrößen zeigten bei jeder Schicht nur einen Gipfel (Abb. 18). Chromosomenzählungen der kleinen L1-Zellen aus haploiden Bereichen liegen leider nicht vor. Aus dieser Größengleichheit lässt sich schließen, dass sich solche kleinen Zellen in L1 der betroffenen Pflanzen offenbar in haploidem Zustand befanden. Das stimmt mit der Beobachtung von LIEBAU (1988) überein.

↓54

Abb. 18: Häufigkeitsdiagramme (Zellzahl) der Zellgrößen (in µm) der Mittelzone der Blütenknospe mit kleinen Zellen in L1 von Klon 5/74/2.

Außerdem wurden zwei Sprossscheitel mit leicht vergrößerten L1-Zellen ohne weitere somatische Variabilität (Polyploidisierung) der Epidermis bei der Blattprimordienentwicklung aus Klon 5/74/2 beobachtet (Abb. 19, vgl. Abb. 11, 15, 17). Die Mittelwerte der Zellgrößen dieser Sprossscheitel (gemessen in Radiusrichtung) zeigten signifikante Unterschiede mit einem Quotienten von 1,22zwischen den L1-Zellen und L2- bzw. L3-Zellen (Tab. 14). Die Häufigkeitsdiagramme der Zellgrößen zeigten bei jeder Schicht nur einen Gipfel (Abb. 20). Das heißt, dass die L1 Zellen nach dem Quotienten (ca. 1,2) im diploiden Bereich liegen.

Abb. 19: Längsschnitt durch den Sprossscheitel mit leicht vergrößerten L1-Zellen ohne deutliche Zellvergrößerung in der Epidermis bei der Blattentwicklung von Klon 5/74/2.

↓55

Die diploiden L1-Zellen in diesen beiden Sprossenscheiteln und den diploiden Epidermiszellen sind wahrscheinlich durch L1-Perforation mit diploidisierten L2-Zellen entstanden. Auf diesem Wege können dann auch diploide N-Sprosse entstehen, die keine Rückschläge zur typischen Morphologie von Klon 5/74/2 aufweisen.

Tab. 14: Zellgrößen in Sprossscheitellängsschnitten der Pflanze mit leicht vergrößerten Zellen in L1 aus Klon 5/74/2 (siehe Abb. 19, n =50 Zellen)

Zellschicht

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

L1

9,3a

0,6

7,9 – 11,5

L2

7,6b

0,5

6,3 – 9,4

L3

7,6b

0,7

6,3 – 9,4

Die Mittelwerte unterscheiden sich nicht signifikant (p<0,05, Tukey).

Abb. 20: Häufigkeitsdiagramme (Zellzahl) der Zellgrößen (in µm) der Scheitelschichten mit leicht vergrößerten Zellen in L1 von Klon 5/74/2 der Abbildung 19.

3.2.3 Entwicklungen der Epidermiszellen im Blatt von Klon 5/74/2

↓56

Vergleiche der Zellgrößen in L1 und den sich daraus ableitenden Epidermen (Abb. 21) zeigten, dass die Epidermiszellen, die weiter vom Sprossscheitel entfernt waren, größer waren als diejenigen, die nahe am Sprossscheitel lagen. Das spricht dafür, dass die Ploidieänderung der Epidermiszellen von Klon 5/74/2 offenbar nicht nur auf einen einmaligen Akt im Sprossscheitel zu führen ist, sondern auch häufig, unabhängig und extra-apikal stattfindet.

Abb. 21: Zellgrößenzunahme in der Epidermisschicht in verschiedenen Positionen bei Sprossscheiteln von Klon 5/74/2. A. Längsschnitt durch den Sprossscheitel mit vergrößerten L1-Zellen, B. Längsschnitt durch den Sprossscheitel mit kleinen L1-Zellen.

3.3 Chromosomenzählungen in cytochimärischen Geweben

Die Zellgröße bietet eine schnelle und einfache Methode zum Unterscheiden der Ploidiestufen. Jedoch kann die genaue Ploidieänderung in verschiedenen Zellschichten von Cytochimärengewebe nur über die direkte Chromosomenzählung bestimmt werden.

3.3.1 Einflussfaktoren für die Chromosomenbestimmung

↓57

Behandlungszeit mit Kolchizin

Zur Beobachtung der Chromosomen spielt außer dem Entnahmezeitpunkt die Behandlungsdauer mit Kolchizin eine wichtige Rolle. Ohne Behandlung mit Kolchizin sind die Chromosomen bei Pelargonium ineinander gewickelt (Abb. 22A) und können nicht genau gezählt werden; auch nach einer Behandlungszeit von 3 Stunden mit Kolchizin sind die Chromosomen noch zu lang (Abb. 22B), und können bei Sprossscheitelschnitten zerschnitten werden, was die Ergebnisse verfälscht.

Abb. 22: Vergleich der Chromosomen in Abhängigkeit von der Behandlungszeit mit 0,1%iger Kolchizinlösung für die Dauerpräparation.
A. Ohne Kolchizinierung, mit Karmin-Essigsäure-Lösung gefärbt,
B. 3 h Kolchizinierung, mit modifizierter Feulgen-Lösung gefärbt,
C. 6 h Kolchizinierung mit Toluidinblau-Lösung gefärbt,
D. 20 h Kolchizinierung mit Hämatoxylin-Lösung gefärbt.

↓58

Bei einer 6stündigen Vorbehandlungszeit mit Kolchizin sind die Chromosomen kurz und bei niedrigen Ploidiestufen zählbar (Abb. 22C). Die Behandlungszeit von 20 Stunden verkürzt die Chromosomen weiterhin und eignet sich für Zellen höherer Ploidiestufen (Abb.22D).

Die Behandlungszeit mit Kolchizin hängt also von der Art des Gewebes und von der Ploidiestufe der Zellen ab. Komplexere Gewebe wie Sprossspitzen und hochploide Zellen sollten für eine längere Zeit behandelt werden, weil dadurch die Chromosomen besser zählbar sind. Außerdem müssen in Serienschnitten die Zellen gezielt untersucht werden, damit eventuell angeschnittene Chromosomen nicht doppelt gezählt werden.

Effekt der verschiedenen Farbstoffe

↓59

In Voruntersuchungen wurde die Eignung von vier Färbeverfahren (Tab. 15) verglichen. Alle getesteten Farbstoffe können Zellen, Chromosomen und Nukleoli gleichzeitig anfärben. Die Hämatoxylin-Lösung kann das schärfste histologische Bild der Schichten-konstitution des Sprossscheitels schaffen. Mit der modifizierten Feulgen-Lösung lässt sich der Nukleolus besonders gut beobachten. Karmin-Essigsäure zeigt Chromosomen und Nukleolus deutlich, zerstört jedoch die Struktur des Einbettungsschnittes.

Tab. 15: Effekte der Farbstoffe auf die Beobachtung von Kernteilung und Chromosomen in Dauerpräparaten

Farbstoffe

Chromosomen

Spindeln

Nukleoli

Karmin-Essigsäure

***

-

***

Modifizierte Feulgen-Lösung

**

-

****

Hämatoxylin-Lösung

***

*

*

Toluidinblau-Lösung

****

****

*

- nicht erkennbar, *schwach, ** stark, *** stärker, **** am stärksten

Mit Toluidinblau-Lösung können nicht nur die Chromosomen, sondern auch die Spindelapparate sehr gut angefärbt und fotografiert werden (Abb.23), deshalb sind solche Präparate gut für die Untersuchung von Zellteilungsvorgängen geeignet.

↓60

Abb. 23: Mit Toluidinblau angefärbte Chromosomen und Spindelapparate.
A. 18 Chromosomen in einer Haarzelle, B-C. Chromsomen in der Anaphase.

3.3.2 Chromosomenzahlen in verschiedenen somatischen Zellschichten des Blattgewebes unterschiedlicher Klone

In Blattlängsschnitten des homohistisch diploiden Klons von `Weißer Liebling` wurden in Zellen der Epidermisschicht (Abb. 24A), der Subepidermisschicht (Abb. 24B) und des inneren Schwammparenchyms (Abb. 24C) in Dauerpräparaten schätzungsweise zwei Chromosomensätze (ca. 18 Chromosomen) ermittelt.

Abb. 24: Zellen mit erkennbaren Chromosomen in unterschiedlichen Blattschichten des Klons DDD von Pelargonium `Weißer Liebling`. A. diploider Chromosomensatz in einer Epidermiszelle, mit modifizierter Feulgen-Färbung gefärbt, B. diploider Chromosomensatz in einer Subepidermiszelle, mit modifizierter Feulgen-Färbung gefärbt, C. diploider Chromosomensatz in einer Zelle der Innenkomponente mit Hämatoxylin-Lösung gefärbt.

↓61

Die Chromosomenzahlen in Epidermis- und Subepidermiszellen sowie in den Zellen der Innenkomponente von jüngeren Blättern des cytochimärischen Klons HDD von `Weißer Liebling` zeigten übereinstimmende Ergebnisse mit den Scheiteluntersuchungen. Epidermiszellen enthielten nur einen Chromosomensatz (Abb. 25A). Die Zellen in der Subepidermisschicht und im mittleren Gewebe der Blätter hatten jeweils zwei Chromosomensätze (Abb. 25B-C). Zellen der Wurzel enthielten ebenfalls zwei Chromosomensätze (Abb. 25D).

D

 

Abb. 25: Zellen mit zählbaren Chromosomen in verschiedenen Blattschichten bei dem cytochimärischen Klon HDD von `Weißer Liebling`.
A. Epidermiszelle mit Toluidinblau gefärbtem, haploidem Chromosomensatz, B. Subepidermiszelle mit Toluidinblau gefärbtem, diploiden Chromosomensatz, C. Diploide Zelle im mit Toluidinblau gefärbtem mittleren Gewebe, D. Wurzel-Quetschpräparat mit einem Karmin-Essigsäure gefärbtem, diploiden Chromosomensatz.

↓62

Ebenso zeigten die Epidermiszellen in jüngeren Blättern von Pelargonium zonale `Weißer Liebling`, DHH eine diploide Chromosomenzahl, die Subepidermiszellen bzw. Zellen der inneren Komponente den haploiden Chromosomensatz (Abb. 26).

Abb. 26: Zellen mit erkennbaren Chromosomen in verschiedenen Blattschichten des cytochimärischen Klons `Weißer Liebling` DHH.
A. Haarzelle mit diploidem Chromosomensatz, B. Epidermiszelle mit diploidem Chromosomensatz, C. Subepidermiszelle mit haploidem Chromosomensatz, D. Zelle haploidem Chromosomensatz in der inneren Komponente des Blattes.

Die nach der Zellgröße geschätzten Ploidiestufen stimmten mit der Chromosomenzahl in den entsprechenden Zellschichten des jungen Blattes überein (Tab.16).

↓63

Tab. 16: Chromosomenzahl der verschiedenen Gewebeschichten der verschiedenen Klone von Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling` (Zellanzahl = 5)

Klone

L1-bürtige Epidermiszellen

L2-bürtige Zellen

L3-bürtige Zellen im Blatt

Wurzelzellen

KL, HHH

9

9

9

9

WL, HDD

9

18

18

18

WL, DHH

18

9

9

9

WL, DDD

18

18

18

18

3.3.3 Chromosomenzahlen in somatischen Zellschichten des Blattgewebes von Klon 5/74/2

Eine hier abgebildete, vergrößerte Epidermiszelle von Klon 5/74/2 besaß nach Schätzung ca. 4 Chromosomensätze (Abb. 27A). Die anderen vergrößerten Epidermiszellen in Abbildung 27 B, C besaßen jeweils einen polyploiden Chromosomensatz. Im Gegensatz dazu besaßen die L2- und L3-bürtigen Zellen der inneren Komponente des Klons 5/74/2 (Abb. 28) wie die Ausgangspflanze `Kleiner Liebling` nur einen haploiden Chromosomensatz.

Die Ergebnisse der Chromosomenzählungen an Epidermiszellen der Dauer- und Frischpräparate stimmen mit den Zellgrößemessungen der Stomata überein und zeigen, dass die L1-bürtigen Epidermiszellen von Klon 5/74/2 unterschiedliche Ploidiestufen hatten. Jedoch liegt die Chromosomenzahl im Sprossscheitel nicht vor.

↓64

Abb. 27: Zellen mit verschiedenen Chromosomensätzen in der Epidermis von Klon 5/74/2.
A. Epidermiszelle vermutlich mit tetraploidem Chromosomensatz in der Anaphase, B-C. Epidermiszellen vermutlich mit oktoploidem Chromosomensatz.

Abb. 28: Zellen mit 9 Chromosomen der inneren Komponentenschichten von Klon 5/74/2.
A. 9 Chromosomen in L2-bürtiger Palisadenzelle, B-C. 9 Chromosomen in L3-bürtigen Zellen.

3.3.4 Nukleolusanzahl in Zellkernen verschiedener Ploidiestufen

Verhältnis zwischen der Nukleolusanzahl und Kerngrößen der Zelle

↓65

Der durch die modifizierte Feulgen-Lösung angefärbte Nukleolus besitzt eine größere, auffallende rundliche Struktur im interphasischen Zellkern (Abb. 29). Deshalb kann man ihn leicht von den anderen Organellen in den Zellen unterscheiden. Die Untersuchungen verdeutlichen, dass Kerne mit mehreren Nukleoli deutlich größer sind als diejenigen, die nur einen Nukleolus enthalten.

Abb. 29: Zellkerne mit verschiedener Nukleolusanzahl in dem Klon 5/74/2. Zellkerne mit mehreren Nukleoli in Epidermiszellen sind größer als die Zellkerne mit wenigen Nukleoli in Zellen der Subepidermis und Innen- Komponente.

Verhältnis zwischen der Nukleolusanzahl und Chromosomenanzahl der Zelle

↓66

In Abbildung 30 sind zwei benachbarte Zellen in derselben Subepidermisschicht eines jüngeren Blattes der haploiden Pflanze von `Kleiner Liebling` mit erkennbaren Chromosomen und Nukleoli zu sehen. Eine Zelle befindet sich in der mitotischen Phase und hat einen deutlich erkennbaren einfachen Chromosomensatz, andere Zellen befinden sich in der Interphase und enthalten mehr als einen Nukleolus. Das kann als ein direkter Beweis gelten, dass haploide Zellen mehr als einen Nukleolus enthalten können.

Abb. 30: Zellen mit erkennbaren Chromosomen und Nukleoli im Blattlängsschnitt des haploiden Klons `Kleiner Liebling` (Kunststoff-Dauerpräparat).

Die in histologischen Untersuchungen direkt vergleichbaren Nukleoli- und Chromosomenzahlen beweisen, dass die Ploidiestufe in verschiedenen Zellschichten unterschiedlicher Klone bei Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling` mit der maximalen Nukleolusanzahl der Zellen nicht übereinstimmt (Tab.17).

↓67

Tab. 17: Maximale Anzahl der Nukleoli und Chromosomen in verschiedenen Zellschichten bei unterschiedlichen Klonen von Pelargonium zonale`Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling`

Klon

Maximale Nukleolianzahl der Zelle (n = 50)

 

Chromosomenanzahl der Zelle (n = 5)

 

Epidermis

Subepidermal

Innenkomponente

 

Epidermis

Sub-epidermal

Innenkompo-nente (Wurzel)

KL, HHH

5

5

5

 

9

9

9

WL, HDD

4

5

5

 

9

18

18

WL, DHH

5

4

4

 

18

9

9

WL, DDD

4

4

4

 

18

18

18

3.4 Cytologische Beobachtungen in Epidermiszellen von Klon 5/74/2

In den vorliegenden Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Epidermiszellen von Klon 5/74/2 verschiedene Ploidiestufen aufwiesen. Es ist jedoch offen, welche cytologischen Anomalien für die verschiedenen Ploidiestufen verantwortlich sind.

3.4.1 Reguläre mitotische Zellteilung der Epidermis

In den Epidermiszellen der untersuchten Pflanzen von Klon 5/74/2 wurden verschiedene Stadien der normalen Mitose beobachtet, in der die Chromosomen durch die Funktion der Spindel regulär auf die zwei Zellpole aufgeteilt wurden (Abb. 31). In Zellen der Metaphase waren alle Chromosomen auf einer Äquatorialebene der Zelle angeordnet (Abb. 31A). Bei Zellen in der Anaphase wurden die Zwei-Chromatiden-Chromosomen mit Hilfe des Spindelapparates voneinander getrennt und zu den zwei Polen der Zelle gezogen (Abb. 31B, C). Ebenfalls wurden zwei gleichgroße Tochterkerne in der Telophase beobachtet (Abb. 31D). Dies weist darauf hin, dass sich auch die vergrößerten Epidermiszellen von Klon 5/74/2 durch einen normalen Mitoseablauf vermehren konnten.

↓68

Abb. 31: Normale mitotische Zellteilung in Zellen von Klon 5/74/2. A. Zelle mit Chromosomen in der Metaphase, B. Zelle mit Chromosomen in der Proanaphase. C. Chromosomen in der Anaphase,
D. Zellteilung in der Telophase.

3.4.2 Cytologische Anomalien in Epidermiszellen

In den Epidermiszellen von Klon 5/74/2 wurden bei den cytologischen Untersuchungen jedoch auch Anomalien der Zell- und Kernteilung feststellt. In Schnittpräparaten wurden gestörte Metaphaseplatten gefunden, in denen sich nicht alle Metaphasechromosomen regelmäßig in der Äquatorialebene, sondern in verschiedenen unregelmäßigen Formen anordneten. Abbildung 32 zeigt zwei Beispiele solcher gestörten Metaphasen.

Abb. 32: Gestörte Metaphasen in mitotischen Zellen von Klon 5/74/2.

↓69

Durch irreguläre Anordnungen der Chromosomen in der Metaphase ist ihre reguläre und gleichmäßige Verteilung im Verlauf der Anaphase nicht mehr gewährleistet. Es kann zu Aufteilungen in mehr als zwei Gruppen und zu ungleich großen Gruppen kommen. Abbildung 33 zeigt ein Beispiel für die Aufteilung der Chromosomen in drei Gruppen.

Abb. 33: Epidermiszelle mit unregelmäßiger Chromosomenverteilung in der Anaphase von Klon 5/74/2.

In der Folge solcher gestörter Mitosen können Zellen mit mehreren Kernen entstehen, wobei es auch zur Bildung unterschiedlich großer Kerne kommen kann. Bei Klon 5/74/2 wurden in der Epidermis verschiedene mehrkernige Zellen beobachtet (Abb. 34, Abb. 35). Dabei wurden Zellen mit zwei oder drei annähernd gleich großen Kernen (Abb. 35A, Abb. 35D), mit einem Makro- und einem Mikrokern (Abb. 34A) sowie Zellen mit einem Makrokern und mehreren Mikrokernen (Abb. 34 B, Abb. 34C) gefunden. Das weist darauf hin, dass teilweise die Cytokinese gestört war. Dies kann eine wichtige Ursache für die unregelmäßigen Polyploidisierungen in den Epidermis bei Klon 5/74/2 sein.

↓70

Abb. 34: Zellen mit mehreren Kernen in der Epidermis von Klon 5/74/2. A. Zwei ungleich große Kerne in einer Zelle, B-C. Zelle mit einem Makrokern und zwei Mikrokernen.

Abb. 35: Zellen mit unterschiedlichen Kernen in der Epidermis von Klon 5/74/2. A. Zwei Kerne mit unterschiedlicher Nukleolusanzahl in einer Zelle, B-C. Zelle mit zwei Kernen, D-F. Zelle mit drei Kernen.

Neben den oben gezeigten anomalen Chromosomenverteilungen und Zellen mit mehreren Zellkernen wurden in der Epidermis auch Zellen mit unregelmäßig geformten und eingeschnürten Zellkernen beobachtet (Abb. 36). So traten eingeschnürte U-förmige Kerne und Kerne mit zwei Einschnürungen auf (Abb. 37). Dies kann eine weitere Ursache für die unregelmäßigen Polyploidisierungen in den Epidermis bei Klon 5/74/2 sein

↓71

Abb. 36: Kerneinschnürung in Epidermiszellen von Klon 5/74/2. A-B. Eingeschnürter Zellkern in Epidermis, C. Einschnürung der Zelle und des Zellkernes.

Abb. 37: Kerneinschnürungen in den Epidermiszellen von Klon 5/74/2. A-C. Kerne mit Einschnürung, D. Kern mit zwei Einschnürungen

3.5 In vitro-Kultur mit periklinalen Chimärengeweben von Pelargonium zonale

Es ist in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine geeignete Methode für die in vitro-Kultur mit adultem Gewebe von Pelargonium zonale zu entwickeln. Es konnten bei verschiedenen Klonen Adventivpflanzen aus unterschiedlichen Geweben regeneriert werden.

3.5.1 Verfahrensoptimierung der Gewebekultur

↓72

Effekte der verschiedenen Substanzen auf die Phenolbildung und die Kallusinduktion

Da das adulte Gewebe bei Pelargonium zonale auf dem Nährmedium schwarze, toxische phenolähnliche Substanzen anreichern kann (Pierik 1997), entsteht ein schwarzer Ring um die Explantate (Abb. 38A), wodurch die Kallusinduktion oder das Gewebewachstum verhindert wird (HILDEBRANDT & HARNEY 1988; BAUER 1993; NEUMANN 1995; BOASE et al. 1998).

Abb. 38: Verminderung der Phenolbildung und Kallusinduktion von Pelargonium zonale.
A. Explantate mit schwarzem Phenolring. B—C. Kallusinduktion nach Überführung von flüssigem Perlit—Medium auf das feste PVP-Medium.

↓73

Die getesteten Zusatzstoffe zur Verminderung der Phenolakkumulation zeigten unterschiedliche Wirkung (Tab.18). Die Verminderungseffekte auf die Bildung der Phenolverbindungen wurde anhand der Schwarzfärbung an den Schnittoberflächen der Explantate im flüssigen Medium bewertet.Die Papierbrücke konnte Phenolverbindungen adsorbieren. Jedoch war der Abstand zwischen Papier und Flüssigkeit nicht einfach zu regulieren, weil sich die Nährlösungsmenge durch Verdunstung im Kulturverlauf verringerte. 0,5 g/l Aktivkohle und 0,5 g/l PVP konnten die Bildung schwarzer Phenolstoffe in der Lösung vermindern. Die Explantate mussten jedoch mehrmals umgesetzt werden, sonst reichen auch diese Varianten nicht aus, um die Bildung von Phenolen zu unterdrücken Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure und Glutamin hatten keine deutliche Wirkung auf die Verminderung schwarzer Phenolverbindungen im Medium.

Tab. 18: Effekte der verschiedenen Substanzen im Kulturmedium bei der in vitro—Kultur von Pelargonium zonale

Material

Anzahl der Explantate

Phenolbildung an Explantaten

Explantate mit Kallusbildung (%)

Anzahl der Adventivsprosse

Sand

25

++

0

0

Papierbrücke

25

+++

0

0

Ascorbinsäure + Glutamin

25

+++

0

0

PVP

30

++

6,6

0

Aktivkohle

30

++

3,3

0

Perlit + PVP

280

+

13,0

346

+ Leichte Phenolbildung, beste Wirkung, ++ Mittlere Phenolbildung und Wirkung, +++ Starke Phenolbildung, schlechte Wirkung

Flüssiges Medium mit Perlit zeigte bei der Kalluskultur die beste Wirkung zur Verminderung der Phenolakkumulation in den vergleichbaren Varianten (Abb. 38B, C). Jedoch wurde das Wachstum der Kalli mit der Kulturdauer auf Perlit verlangsamt. Als beste Methode erwies sich, die Explantate in der ersten Phase auf Perlit mit flüssigem Medium bis zum Auftreten von Kallus zu kultivieren. Danach wurden sie auf festes PVP-Medium übertragen, um Adventivsprosse zu regenerieren (Tab. 18).

↓74

Effekte der Wachstumsregulatoren auf die Kallusinduktion und Adventivsprossregeneration

Mit den Wachstumsregulatoren IAA und BAP konnte bei den vorliegenden Untersuchungen Kallus aus Blattgeweben und Stängelsegmenten induziert werden (Tab. 19). In den ersten vier Wochen entstand nur wenig Kallusgewebe. In dieser Zeit mussten die Explantate mindestens einmal pro Woche umgesetzt werden, sonst starb der Kallus langsam ab. Der Zusatz von 2,4-D in die Medien induzierte in diesen Versuchen keinen Kallus. TDZ zeigte die beste Wirkung auf die Kallusinduktion und Regeneration von Adventivsprossen aus Explantaten bei Pelargonium zonale. Auf dem TDZ-Medium konnte der Kallus für längere Zeit vermehrt werden und Sprosse regenerierten. Sobald die regenerierten Sprosse auf ein Bewurzelungsmedium umgesetzt wurden, bildeten sich nach einer Woche Wurzeln.

Tab. 19: Effekte verschiedener Wachstumsregulatoren und Explantate auf die Kallusinduktion und Regeneration bei Pelargonium zonale

Wachstums-regulatoren

Explantate

Anzahl der Explantate

Explantate mit Kallusbildung abs. (%)

Anzahl induzierter Sprosse

Anzahl regenerierter Pflanzen

IBA 1 mg/l +BAP 2 mg/l

Blattsegment

25

0 (0,0)

0

0

IAA 2 mg/l + BAP 1mg/l

Blattsegment

Stängelsegment

30

20

1 (3,3)

2 (10,0)

0

0

0

0

2,4-D 3 mg/l + BAP 2 mg/l

Blattsegment

25

0 (0,0)

0

0

 

Blattsegment

50

0 (0,0)

0

0

TDZ 5mg/l

Stängelsegment

20

3 (15,0)

60

13

 

Blattstiel

40

7 (17,5)

105

13

 

Blattsegment

40

0 (0,0)

0

0

TDZ 2,2 mg/l

Stängelsegment

45

7 (15,6)

60

26

 

Blattstiel

55

9 (13,8)

66

12

TDZ 0,75 mg/l

Blattsegment

50

6 (12,0)

35

25

 

Blattstiel

25

5 (20,0)

20

5

↓75

Die optimale TDZ Konzentration war abhängig von der Art des Explantates (Tab. 19). Im Medium mit 5 mg/l TDZ verdickten sich die Blattstücke zuerst, dann starben sie ab. Jedoch war dieses Medium sehr gut geeignet für die Internodiensegmente und die ganzen Blattstiele. Bei diesen trat nach einer Woche Kallus auf. Das Medium mit 2,2 mg/l TDZ eignete sich für Blattstiel- und Internodiensegmente. Bei diesen wurden an den Explantaten direkt Kallus induziert und Sprosse regeneriert, ohne das Medium wechseln zu müssen. Jedoch eignete sich das Medium nicht für Blattstücke. Eine niedrigere Konzentration von TDZ (0,75 mg/l) konnte für die Blattgewebe verwendet werden.

3.5.2 Einfluss der Zellschichtposition auf die Adventivsprossregeneration

Die 10 Internodien- und 20 Blattstielexplantate von dreifach markierten chimärischen Ausgangspflanzen von `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR (Abb. 2 und Abb. 39) wurden auf das Medium gesetzt. Aus den Internodiensegmenten regenerierten 5 Adventivpflanzen und aus Blattstielexplantaten 4 Adventivpflanzen. Diese 9 Adventiv-pflanzen hatten grüne Blätter und weiße Blüten (Abb. 39C). Im Gegensatz zu den Ausgangspflanzen (Abb. 39B), die rote Blütenstiele besaßen, waren die Blütenstiele der Adventivpflanzen grün (Abb. 39 D).

Abb. 39: Ausgangs- und Adventivpflanzen des dreifach markierten chimärischen Klons `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR. A. Ausgangspflanze mit GWG-Blattmuster; B. Weiße Blüten der Ausgangspflanze mit rotem Blütenstiel, C. Adventivpflanze mit weißen Blüten und grünen Blättern, D. Weiße Blüten der Adventivpflanze mit grünem Blütenstiel.

↓76

Die Mittelwerte der Stomatalängen der 9 Adventivpflanzen lagen im Bereich von 28 – 44 µm und die Modalwerte der Stomatalängen lagen im Bereich von diploid bis zu 16-ploid (Tab.20). Davon lag die Stomatalänge von vier Adventivpflanzen im diploiden Bereich und von zwei Adventivpflanzen im tetraploiden Bereich. Drei Adventivpflanzen enthielten möglicherweise verschiedene Ploidiestufen in der Epidermis. Es zeigt sich eine Polyploidisierung durch Mutation während der Gewebekultur gegenüber konventioneller Vermehrungsweise. Es wurden keine haploiden Adventivpflanzen beobachtet.

Blatt- und Blütenfarbe der Adventivpflanzen aus dem dreifach markierten Klon `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR stimmten mit dem entsprechenden Genotyp der L1 (diploid, grünes Blatt, weiße Blüten) der Ausgangspflanze übereinDeshalb wurde geschlussfolgert, dass die Kallus- und Sprossbildung in diesem Experiment mit hoher Wahrscheinlichkeit von L1-bürtigen Zellen der Blattstielsegmente ausgehen.

Tab. 20: Stomatalängen der in vitro regenerierten Adventivpflanzen aus den dreifach markierten Geweben von `Weißer Liebling` (DHH, GWG, WRR)

Adventivpflanze

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

Ploidiebereich

1

31

2,8

25-37

D

2

28

1,8

25-32

D

3

44

6,8

32-66

T-O-16

4

34

2,5

29-37

T

5

37

5,9

27-51

D-T

6

36

4,8

25-44

T

7

28

1,8

25-32

D

8

32

3,2

25-41

D

9

39

5,6

28-57

T-O

3.5.3 Chimärenkonstitution der Adventivpflanzen von `Mrs. Pollock`

↓77

Von Gewächshauspflanzen der Sorte `Mrs. Pollock` wurden 20 Internodien- und 20 Blattstielsegmente (ohne Blattgrund) von Laubblättern jeder Konstitution GWG und GGW auf das Regenerationsmedium gestellt. Darüber hinaus wurden 55 Blattsegmente von ausgewachsenen Laubblättern aufgesetzt. Von den Internodiensegmenten regenerierten 84 Adventivsprosse und von den Blattstielsegmenten 101 Adventivsprosse. Die Blattsegmente bildeten keine Regenerate. Die in vitro regenerierten Adventivsprosse hatten verschiedene homohistische und chimärische Konstitutionen (Abb. 40).

Abb. 40: Chimärische Adventivpflanzen aus der Sorte `Mrs. Pollock`. A-B. Kallusinduktion;
C. Chimärische Sprosse vom Typ GWG; D. Chimärische Sprosse vom Typ GGW; E. Chimärische Sprosse vom Typ GWW; F. Chimärische Sprosse mit sektoralen Blättern.

Bei den 185 Adventivsprossen aus den chimärischen Geweben von `Mrs. Pollock` wurden unterschiedliche Blattmuster beobachtet, unter anderem einige neue Blattmuster, die nicht dem Ausgangsmuster entsprachen (Tab.21).

↓78

Tab. 21: Konstitution der in vitro regenerierten Adventivsprosse aus den Geweben von Pelargonium `Mrs. Pollock`

Konstitution der Explantate

Anzahl induzierter Sprosse

 

Gesamtanzahl

Grün

abs. (%)

Weiß

abs. (%)

GWG

abs.(%)

GGW

abs.(%)

Sektorial

abs. (%)

GWG

71

61 (85,9)

7 ( 9,9)

1 (1,4)

1 (1,4)

1 (1,4)

GGW

114

49 (43,0)

48 (42,1)

5 (4,4)

3 (2,6)

9 (7,9)

Gesamt

185

110 (59,5)

55 (29,7)

6 (3,2)

4 (2,2)

10 (5,4)

Aus GWG-Geweben wurden 85,9 % grüne und 9,9 % weiße Adventivsprosse regeneriert und das bedeutet, dass die L2-bürtige weiße Zellen an der Adventivsprossbildung beteiligt haben. Aus GGW-Geweben wurden 43,0 % grüne und 42,1 % weiße Adventivsprosse beobachtet. Das heißt, dass die L3-bürtige weiße Zellen an Adventivsprossbildung beteiligt haben. Das kommt Schluss, dass sich Zellen von mindestens zwei unterschiedlichen Gewebeschichten von Explantaten bei dieser Untersuchung an der Kallus- und Adventiv-sprossbildung beteiligt haben. Im Durchschnitt wurden bei `Mrs. Pollock` 10,8 % chimärische Adventivsprosse regeneriert, 4,2 % chimärische Adventivsprosse aus den GWG-Explantaten und 14,9 % aus GGW-Explantaten. Davon sind insgesamt 8,6 % neuartige Chimären (GGW aus GWG, beziehungsweise GWG aus GGW und die Sektorialchimären), die sich in ihrer Konstitution von den Ausgangsexplantaten unterscheiden.

3.5.4 Ploidiestufe der Adventivpflanzen von 5/74/2

65 Internodien-, 50 Blattstielsegmente und 100 junge Laubblattexplantate (nicht entfaltet) von Klon 5/74/2 wurden bei diesem Experiment auf das Medium gelegt. Nach Kallusinduktion konnten 25 Adventivpflanzen regeneriert werden (Abb. 41, Tab. 22), dabei 9 von Internodien-, 15 von jungen Laubbattsegmenten und eine Adventivpflanze von Blattstielsegmenten.

↓79

Abb. 41: Kallusinduktion und Regeneration von Adventivsprossen aus Klon 5/74/2. A-C. Kalluswachstum auf dem PVP-Medium, D. Sprossregeneration, E. Adventivpflanze mit Wurzeln, F. Adventivpflanze mit Blüten.

Alle Adventivpflanzen von Klon 5/74/2 aus der in vitro-Kultur hatten rote Blüten wie die Ausgangspflanzen. Jedoch waren die Blätter aller Adventivpflanzen weder gekräuselt noch stark behaart. Das entspricht nicht der typischen Morphologie von Klon 5/74/2. Das heißt, dass die typische Morphologie von Klon 5/74/2, gekräuselt und stark behaart, sich über Kallus in vitro-Regeneration nicht reproduzieren ließ.

Tab. 22: Stomatalängen der in vitro regenerierten Adventivpflanzen von Klon 5/74/2

Pflanzen Nummer

Mittelwert (µm)

SD

Streubreiten (µm)

Ploidiebereich

1

34

4,6

27-47

D-T

2

34

3,4

27-39

D

3

36

4,1

30-44

D-T-O

4

31

3,6

25-39

D

5

29

3,1

24-36

D

6

28

1,2

25-32

D

7

29

1,8

25-37

D

8

28

2,9

25-29

D

9

29

2,5

25-34

D

10

28

1,2

25-29

D

11

31

3,2

25-36

D

12

27

2,6

24-33

D

13

31

2,3

27-39

D

14

30

2,7

24-38

D

15

31

2,4

25-35

D

16

33

3,6

27-39

T

17

29

3,8

25-37

D

18

32

3,1

27-39

D

19

33

3,2

25-37

D-T

20

33

3,6

27-37

D-T

21

30

3,2

25-37

D

22

35

3,2

29-47

T

23

34

3,2

27-39

D-T

24

36

3,4

24-42

T

25

30

4,4

25-37

D

↓80

Die Mittelwerte der Stomatalänge der in vitro regenerierten Adventivpflanzen aus den Geweben von Klon 5/74/2 lagen im Bereich von 27-36 µm (Tab. 22). Die Verteilungen der Stomatalängen von 20 der 25 Adventivpflanzen hatten nur einen Modalwert und 17 davon befanden sich im diploiden Bereich und drei im tetraploiden Bereich. Die der anderen 5 Adventivpflanzen hatten 2-3 Modalwerte und lagen in verschiedenen Ploidiestufen.

Deswegen wurden 17 Adventivpflanzen als diploid, vier als diploid-tetraploid, drei als tetraploid und eine als diploid-tetraploid-oktoploid bewertet. Das deutet auf Ploidiemutation in der in vitro–Kultur hin.

Die Stomatalängen der Adventivpflanzen aus Geweben von `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR sowie von Klon 5/74/2 mit der Konstitution PHH wiesen darauf hin, dass die Epidermiszellen der meisten Adventivpflanzen aus DHH- sowie aus PHH-Geweben im diploiden Bereich lagen und nur selten im tetraploiden oder gemischten Bereichen. Die Ploidieverteilungen der Adventivpflanzen in beiden Fällen war ähnlich (Tab. 23). Die vorhandenen haploiden Zellen in beiden Explantatherkünften und die polyploiden Epidermiszellen von Klon 5/74/2 regenerieren offensichtlich nicht. Das heißt, dass die Regeneration von polyploiden Zellen der Epidermis von Klon 5/74/2 nicht gelungen ist.

↓81

Tab. 23: Ploidiestufenverteilungen der Epidermiszellen (%) der Adventivpflanzen von `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR und Klon 5/74/2

Explantate

n

Ploidiebereich der Stomatalänge (%)

  

diploid

diploid-tetraploid

tetraploid

diploid-tetraploid-oktoploid

tetraploid-oktoploid

tetraploid-oktoploid-16ploid

WL, GWG, WRR (DHH)

9

44,5

11,1

22,2

 

11,1

11,1

5/74/2 (PHH)

25

68,0

16,0

12,0

4,0

  


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21.10.2005