4 Diskussion

4.1 Indirekte und direkte Ploidiebestimmungen

4.1.1 Indirekte Ploidiebestimmung über den Zellgrößenvergleich

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In der vorliegenden Arbeit wurden die Zellgrößen der drei Sprossscheitelschichten von verschiedenen Klonen von `Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling` gemessen. Die Zellgrößen der haploiden L1, der diploiden L2 und L3 vom Klon `Weißer Liebling`, HDD waren bei der statistischen Analyse signifikant unterschiedlich (Kapitel, 3.2.1, Tab. 11). Das bestätigt das Vorliegen einer Cytochimäre mittels der Methode des Zellgrößenvergleichs und zeigt den Zusammenhang zwischen der Zell- bzw. Zellkerngröße und dem DNA-Gehalt bzw. der Ploidiestufe (FRANCO 1939; STRAUB 1941; BRYANS & SCHMITH 1985; DORE 1986; BROWN et al. 1991; MELARAGNO et al. 1993; VANDENHOUT 1995; MISHRA 1997; ABAK et al. 1998; TRAAS et al. 1998; SARI et al. 1999). Man bezeichnet diesen Zusammenhang als „Plasma-Kern-Beziehung“. Jedoch war das Zellgrößenverhältnis zwischen den haploiden L1-Zellen und den diploiden L2- oder L3-Zellen im Sprossscheitel in den vorliegenden Untersuchungen nicht wie das Verhältnis zwischen den Ploidiestufen 2, sondern hatte den Wert. 1,2.

Untersuchungen an Chimären zeigen, dass die L1 in der Regel nur die Epidermis bildet (SATINA et al. 1940; BURK et al. 1964; STEWART & BURK 1970; HOWARD 1978). Während Endopolyploidie für sehr viele verschiedene Gewebearten nachgewiesen wurde, herrscht bis jetzt allgemein die Ansicht vor, dass die Ploidiestufe von Stomata stabil bleibt (TSCHERMAK-WOESS 1971; MELARAGNO et al., 1993). Deswegen wurden Messungen von Stomatalängen seit langem zur indirekten Ploidiebestimmung der L1-bürtigen Zellen herangezogen (FRANCO 1939; SPECKMAN et al. 1965; BINGHAM 1968; TAN & DUNN 1973; MELARAGNO et al. 1993; VANDENHOUT 1995; MISHRA 1997).

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STRAUB (1941) beschreibt, dass sich die Mittelwerte der Stomatalänge von diploiden und tetraploiden Stomata bei Rotkohl wie 1:1,2 – 1,4 verhalten. Die Mittelwerte der Pollen verhalten sich beim di- und tetraploiden Tabak wie 1: 1,3. Dieses Verhältnis ist für verschiedene Arten unterschiedlich, innerhalb bestimmter Arten jedoch konstant und damit charakteristisch.

Das Verhältnis der Mittelwerte der Stomatalängen zwischen dem haploiden und dem diploiden Klon von Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` bzw. `Weißer Liebling` war größer als das Verhältnis der Stomatalänge zwischen dem diploiden und tetraploiden Klon (1,35 und 1,22, Kapitel, 3.1.3, Tab. 5). Die Regression (Bestimmtheitsmaß = + 0,8) der Stomatalänge mit der Ploidiestufe der Epidermiszellen war bei den haploiden, diploiden und tetraploiden Klonen von Pelargonium zonale bei α = 0,05 signifikant. Das stimmt mit der Beobachtung von BRYANS & SCHMITH (1985) überein, dass es zwischen Ploidieniveau und Zellvolumen in einem bestimmten Bereich eine enge Korrelation gibt. Deswegen kann die Regressionsfunktion zur Ermittlung der Ploidiestufe der vergrößerten Zellen verwendet werden. Somit können die Ploidiestufen verschiedener Sprossscheitelschichten an Chimärenpflanzen – ohne Pflanzen mit benachbarten Ploidiestufen zum Vergleich – indirekt abgeschätzt werden. Zellgrößenmessungen sind einfach durchzu-führen.

4.1.2 Indirekte Ploidiebestimmung über die maximale Nukleolizahl der Zellkerne

Nukleoli sind Funktionsstrukturen des Zellkerns, in denen rRNA zur Bildung von Ribosomen bereitgestellt wird (ALBERTS & BRAY 1989; SMITH & WOOD 1996). In der Nucleolus-Organizer-Region (NOR) der Satellitenchromosomen sind die Gene für die rRNA lokalisiert, insofern steht die maximale Nukleolizahl der Zelle mit der Zahl der Satellitenchromosomen der Zelle im Zusammenhang (BROWN & BERTKE 1974; ADANIYA & ARDIAN 1994). BADR & HORN (1971) wiesen bei Pelargonium zonale –Hybriden ein Satellitenchromosom (Chromosom Nr. 9) nach, daher wäre bei haploiden Pelargonium–Pflanzen ein Nukleolus, bei diploiden Pelargonium–Pflanzen zwei Nukleoli zu erwarten, etc.

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ADANIYA & ARDIAN (1994) berichteten, dass die maximale Nukleolizahl in diploiden Zellen bei Allium zwei ist, in tetraploiden Zellen vier. Die Nukleolizahl war unabhängig vom Alter und der Position des Blattes. Deshalb hatten sie vorgeschlagen, dass die Ploidiestufen der Cytochimären prinzipiell durch die maximale Nukleolizahl ermittelt werden können.

ALBERTS & BRAY (1989) beschrieben jedoch, dass in den diploiden menschlichen Zellen zehn winzige Nukleoli vorkommen können. Die Nukleoli sind jedoch nach der Mitose nur selten als getrennt erkennbar, sie wachsen sehr rasch und fusionieren zu einem einzelnen großen Nukleolus, der dann wieder typisch für viele Interphase-Zellen ist. Untersuchungen zur Nukleoli- und Chromosomenanzahl in Mikrotomdünnschnitten verschiedener Klone bei Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` in der vorliegenden Arbeit zeigten, dass polyploidisierte, große Zellkerne mehr Nukleoli enthielten als haploide, kleine (Kapitel, 3.3.4, Abb. 29). Jedoch hatte die beobachtete maximale Nukleolizahl pro Zellkern der untersuchten Klone bei Pelargonium zonale kein bestimmtes Verhältnis zur Ploidiestufe der Zellen (Kapitel, 3.3.4, Abb. 29, Tab. 17). Das heißt, dass die maximale Nukleolizahl als Parameter zur Bestimmung der Ploidiestufe in cytochimärischen Geweben bei Pelargonium zonale nicht geeignet ist. Die vorliegende Untersuchung stimmt mit der Beobachtung von SMITH & PHAM (1996) überein, dass die Nukleolizahl vom Zelltyp und Entwicklungsstadium abhängig ist.

4.1.3 Direkte Ploidiebestimmung durch Chromosomenzählung

Die sicherste Methode zur Bestimmung der Ploidiestufe von Zellen in den verschiedenen Schichten des Chimärengewebes ist, direkt die Chromosomenzahl der Zellschichten zu bestimmen. Sollen Cytochimären näher charakterisiert werden, kann nicht auf Quetsch-präparate zurückgegriffen werden, da die Zellschichten dann nicht voneinander unter-schieden werden können.

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Die L3-Deszendenten sind für die Ausbildung des inneren Gewebes und der Stecklingswurzel verantwortlich (BATESON 1916; BERGANN 1967; POETHIG 1984). Daher kann die Chromosomenzählung in der Wurzelspitze zur Ploidiebestimmung der L3 bei Cytochimärengewebe direkt benutzt werden. DAKER (1967) beobachtete aber, dass bei der Sorte `Kleiner Liebling` im Wurzelbereich offenbar unregelmäßig polyploidisierte (diploide) Zellen auftreten, während Zellen des Sprossscheitels haploid sind. Deswegen muss die Aussage mit der Chromosomenzählung in der Stecklingswurzelspitze zur Ploidiebestimmung der L3 bei Cytochimärengewebe vorsichtig sein

Mikrotomdünnschnitte bieten die Möglichkeit, die Ploidiestufe der verschiedenen Zellschichten direkt zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurde durch die Nutzung verschiedener Farbstoffe versucht, eine optimale Methode der Chromosomenzählung zur direkten Ploidiebestimmung für die unterschiedlichen Zellschichten der Cytochimären zu entwickeln. Es zeigte sich, dass die Toluidinblau-Lösung das beste Ergebnis zur Bestimmung der Chromosomenzahl in verschiedenen Zellschichten lieferte (Tab. 15). Damit wurden nicht nur die Ploidiestufen der Zellen in verschiedenen Gewebeschichten jüngerer Blätter verschiedener Klone von `Kleiner Liebling` und `Weißer Liebling` (DDD, HDD und DHH) sowie Klon 5/74/2 durch Chromosomenzählung direkt geprüft (Kapitel 3.3.2, Tab. 16, Abb. 23-28), sondern auch Anomalien in Epidermiszellen von Klon 5/74/2 wie mehrkernige Zellen und eingeschnürte Zellkerne beobachtet (Kapitel, 3.4, Abb. 32-37).

Da die Zellen im Blattgewebe von drei Sprossscheitelschichten abstammen (POETHIG 1984), kann die Ploidiestufe von Cytochimären durch direkte Chromosomenzählung verschiedener Gewebeschichten an Mikrotomschnitten bestimmt werden. Trotzdem erlaubt die direkte Ploidiebestimmung durch Chromosomenzählung in Blattzellen nur indirekt und unzuverlässig Rückschlüsse auf die Zustände im Sprossscheitel, da die Zellen bei der Entwicklung des Blattes mutieren könnten.

4.2 Entwicklung der somatischen Variabilität in Klon 5/74/2

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Die Stomatalängen der Laubblätter aller untersuchten Pflanzen der verschiedenen Klone von Pelargonium zonale `Kleiner Liebling` und `Weißer Liebling` nahmen mit der Steigerung der Blattpositionen zu (Tab. 6, Abb. 8). Beim haploiden und diploiden Klon wurde keine somatische Variabilität der Epidermis von 1. Blatt bis 5. Blatt beobachtet, da die Unterschiede der Mittelwerte der Stomatalängen in verschiedenen Blätter nicht das Ploidie-Kriterium erreichten. Das heißt, dass die Stomata bei diesen beiden Klonen damit im Verlauf der Entwicklung des Blattes wahrscheinlich ihre maximale Größe erreichten. Die Verhältnisse der Stomatalängen lassen darauf schließen, dass beim tetraploiden Klon die Zellen der Epidermis im 5. Blatt zwei Ploidiestufen vorkommen. Es hat möglicherweise eine Mutation stattgefunden.

Durch die Auswertung der Stomatagrößen und Chromosomenzählungen wurde festgestellt, dass in der Epidermis des mutierten Klons 5/74/2 von Pelargonium zonale somatische Variabilität mit unterschiedlichen Ploidiestufen vorlag (Kapitel, 3.1.4, Tab. 6, Abb. 9, Kapitel 3.3.3). Epidermiszellen von Klon 5/74/2 erreichten beim Wachstum des Blattes nicht nur ihre maximale Größe, sondern waren auch polyploidisiert. Die Epidermis in jüngeren Blättern hatte niedrigere und weniger Ploidiestufen als die in älteren Blättern (Kapitel, 3.1.4, Tab. 6, Abb. 9). Somit nahm die minimale Ploidiestufe mit der Steigerung der Blattposition von Klon 5/74/2 zu. Das heißt, dass die unterschiedlichen Ploidiestufen in der Epidermis während der Entwicklung des Gewebes entstehen. Das ist vergleichbar mit den Beobachtungen von GALBRAITH et al. (1991) und BERGERVOET et al. (1996) in verschiedenen Geweben in Arabidopsis und Tomaten.

Die Chromosomenzählungen und Bestimmungen der Zellgrößen in den Mikrotomschnitten zeigten, dass somatische Variabilität in Form der gemischten Ploidiestufen nur in der Epidermis von Klon 5/74/2 auftrat, nicht jedoch in L2- und L3-bürtigen Zellen. Daher ist der Klon 5/74/2 eine periklinale Cytochimäre mit verschiedenen Ploidiestufen in der Epidermis. Solch eine Cytochimäre wurde bisher noch nicht in der Literatur beschrieben.

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Die Zellen in den histologischen Schnitten der Sprossscheitel von Klon 5/74/2 haben gezeigt, dass die Polyploidisierung der Epidermiszellen in einigen Pflanzen bei Klon 5/74/2 schon im Sprossscheitel begann und in anderen Pflanzen zumindest ein Teil der L1 noch haploid ist (Kapitel, 3.2.2). Die Größe der Epidermiszellen von Klon 5/74/2 nahm in beiden Fällen mit der Entfernung vom Sprossscheitel zu (Kapitel, 3.2.3).Die L1-bürtige Epidermis ist in beiden Fällen teilweise polyploidisiert. Offensichtlich ist die Zellen in L1 von den Pflanzen mit vergrößerten Epidermiszellen von Klon 5/74/2 polyploidisiert und ihrer Abkömmlinge variabel. Die haploiden Zellen in L1 von den Pflanzen mit vergrößerten Epidermiszellen von Klon 5/74/2 sind durch Perforation von haploiden L2 entstanden. So setzt sich der Prozess der Polyploidisierung bei der Blattprimordiumbildung fort. Das steht im Gegensatz zur Darstellung von LIEBAU (1988), die von einer Polyploidisierung der Epidermis von 5/74/2 erst bei der Blattentwicklung ausgeht.

Das spricht dafür, dass die somatische Variabilität mit verschiedenen Ploidiestufen in der Epidermis vom Klon 5/74/2 bei Pelargonium zonale offenbar nicht nur auf einem einmaligen Akt im Sprossscheitel zu führen ist, sondern auch häufig, unabhängig und extra-apikal stattfindet.

Die verschiedenen höheren Ploidiestufen in Epidermiszellen von Klon 5/74/2 sind wahrscheinlich durch unregelmäßige Polyploidisierung entstanden. Eine Mutation spielt vermutlich eine Rolle, die zu häufig und unregelmäßig auftretender Polyploidisierung während der Blattentwicklung führt. Endopolyploidie ist nicht selten in Angiospermen zu beobachten (LORZ 1947; D’AMATO 1964; 1984; 1989; DE ROCHER et al., 1990; SMULDER et. al., 1994, 1995; TRAASet al. 1998; GRAFI 1995, 1998; KUDO & KIMURA 2001a,b), aber über eine solche Polyploidisierung wurde bisher noch nicht bei Pelargonium zonale berichtet. Die Ausbildung der verschiedenen Ploidiestufen wird möglicherweise durch mutierte Gene in Wechselwirkung mit äußeren Faktoren verursacht .

4.3 Morphologische Besonderheit und somatische Variabilität von Klon 5/74/2

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Die Pflanzen mit stark beharrten und gekräuselten Blättern von Klon 5/74/2 waren nicht stabil und trieben Sprosse mit stark beharrten oder gekräuselten Blättern oder glatte Blätter mit kurzen Haaren aus (Kapitel, 3.1.5). Die Entmischung in starke Behaarung oder Kräuselung bedeutet, dass die Behaarung und Kräuselung wahrscheinlich keine fest gekoppelten Merkmale sind. Die Epidermis des gekräuselten Blattes und die Epidermis-zellen des beharrten Blattes waren wie die des behaarten und gekräuselten Blattes unregelmäßig polyploidisiert. Die somatische Variabilität mit verschiedenen Ploidiestufen in der Epidermis trat hier nur zusammen mit der morphologischen Besonderheit der gekräuselten und/oder behaarten Blätter auf. In der Epidermis von N-Austrieben und auch in den N-Blattsektoren von Klon 5/74/2 kam dieses Phänomen nicht vor (Kapitel, 3.1.5, Tab. 7, 8, Abb. 10). Die Epidermiszellen in den meisten N-Sprossen mit glatter Blattform und kurzen Haaren lagen im diploiden Bereich. Die Blattkräuselung ist vermutlich eine Folge der somatischen Variation durch unregelmäßigen Polyploidisierungen. Areale der Epidermis mit stark vergrößerten Zellen wölben sich unregelmäßig auf. Die starke Behaarung wird wahrscheinlich durch polyploidisierte Haarzellen verursacht.

Dies legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Blattkräuselung durch verschiedene Zellareale mit extrem unterschiedlichen Ploidiestufen in der Epidermis verursacht wird und die starke Behaarung durch polyploidisierte Haarzellen entsteht. Blattkräuselung kann aber auch durch andere Ursachen entstehen. Zum Beispiel ist bei Poinsettia die sogenannte Kräuselkrankheit durch mutative Wachstumshemmung bzw. Degeneration L2-bürtiger Zellen bekannt (BERGANN & BERGANN 1960).

4.4 Austrieb von N-Sprossen an Pflanzen von Klon 5/74/2

Die histologischen Untersuchungen zur Gewebeentwicklung wiesen darauf hin, dass die Zellen in L1 im Sprossscheitel mit vergrößerten Epidermiszellen von Klon 5/74/2 in zwei unterschiedlichen Zuständen vorlagen: Es gab Pflanzen, wo die L1 Zellen bereits polyploidisiert waren(Kapitel, 3.2.2, Tab. 12, Abb. 15, 16). In anderen Pflanzen war die L1 teilweise jedoch haploid (Kapitel, 3.2.2, Tab. 13, Abb. 17, 18).

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Außerdem traten N-Sprosse auf, deren L1- Zellen und L1-bürtige Epidermiszellen diploid waren (Tab. 14, 7, 8, 9). Bei deren Blattentwicklung wurden nicht wie bei Klon 5/74/2 stark vergrößerte Epidermiszellen beobachtet (Abb.19). Wahrscheinlich entstehen solche N-Sprosse durch Zellumlagerungen im Sprossscheitel.

Denkbar wäre folgende Erklärung: Die typische Pflanze von Klon 5/74/2 ist eine Cytochimäre mit der Konstitution PHH. Die polyploide L1 im Sprossscheitel wurde durch L2-Zellen perforiert und verdrängt. Dadurch entstanden die Sprosse mit den kleinen L1-Zellen und den polyploiden Epidermiszellen.

Die Bildung von N-Sprossen mit diploider Epidermis, deren Zellen ursprünglich auf L2 zurückzuführen sind, würde ebenfalls erklären, warum an diesen Austrieben keine morphologischen Besonderheiten wie Kräuselung und Behaarung auftreten und auch kein Rückschlag zu Variante 5/74/2 zu finden ist.

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STEIN (1936) berichtete über das Auftreten von 2n-Sprossen an Beständen hoch polyploider Antirrhinu m-Pflanzen, die durch Mutagenbehandlung mit Radiumbestrahlung entstanden waren, wahrscheinlich durch Reduktionsmitose. Solche Möglichkeit kann auch in dieser Arbeit nicht völlig ausgeschlossen werden.

4.5 Cytologische Anomalien in der Epidermis von Klon 5/74/2

In den Epidermiszellen vom Klon 5/74/2 wurden verschiedene cytologische Anomalien beobachtet. In der Metaphase traten unregelmäßige Chromosomenplatten in einigen Zellen der Epidermis auf (Kapitel, 3.4.2, Abb. 32). Die in der Metaphase unregelmäßig angeordneten Chromosomen können auf mehrere Pole in der Anaphase verteilt werden (Abb. 33) (KUTZNER 1980; WHEATLEY & WANG 1996; RIEDER 1997; SLUDER et al. 1997, ECKLEY 1997). Man bezeichnet dieses Phänomen als multipolare Mitose (MAYZEL 1875; NEMEC 1926; SCHMID 1966; PERA & SCHWARZACHER 1969).

Die multipolare Mitose bewirkt eine Störung bei der Polwanderung der Chromosomen in Zellteilungen. Die multipolare Mitose wurde schon lange in kranken, mutagenbehandelten oder fusionierten Tierzellen beobachtet (PERA & RAINER 1973; KERYER et al. 1984; ALIEVA & VOROBJEV 1991; GLOVER et al. 1996; WHEATLEY & WANG 1996; RIEDER 1997; SLUDER et al. 1997). In mutierten Pflanzenzellen wurden multipolare Mitosen ebenfalls gefunden (STEIN 1927; 1936; HERVAS 1975; 1987; GIMÉNEZ-ABIÂN et al. 1998).

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In der Epidermis von Klon 5/74/2 wurden verschiedene mehrkernige Zellen gefunden (Kapitel, 3.4.2, Abb. 34, 35) und es wird angenommen, dass die mehrkernigen Zellen durch multipolare Mitosen ohne Zellteilung entstanden sind. Dies kann eine wichtige Ursache für die unregelmäßigen Polyploidisierungen in den Epidermis bei Klon 5/74/2 sein.

Außerdem wurden Kernschnürungen in einigen Epidermiszellen von Klon 5/74/2 beobachtet (Abb.36, 37). Nach RIEGER et al. (1991) und HAGEMANN (1991) wird eine Kernteilung ohne Teilungsspindeln und Sichtbarwerden der Chromosomen als Amitose definiert, so dass es sich hier offenbar ebenfalls um Amitose handelt.

Amitose wurde meistens in kranken und kultivierten Tierzellen beobachtet (WILSON & LEDUC 1950; BUCHER 1959; BARTOS 1965; WARNKE 1982; CHEN & WAN 1986; DAVID & UERLINGS 1992; BHATTATHIRI 2001). In Pflanzenzellen wurden Amitosen auch von einigen Autoren in mutagenbehandelten Geweben von Allium (TORRE & MARTIN 1975), in Gewebekulturen (GUet al 1991; ALTAMURAet al 1991; 1993; VALENTEet al. 1998), und in spezialisierten Geweben wie dem Endosperm und Fruchtgeweben gefunden (KISSER 1922; MILLER 1980; MARCINIAK 1991). Die Kernschnürungen in den Epidermiszellen von Klon 5/74/2 können als Folge der ursprünglichen Mutagenbehandlung eingetreten sein.

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Die gestörten Zell- und Kernteilungen wurden nur in Epidermiszellen von Klon 5/74/2 festgestellt. Allerdings können die gestörten Zellen bereits einige Mitosen durchlaufen haben, bevor es in den L1-bürtigen Zellen zu mehrkernigen Zellen oder Kernschnürungen kam, denn in einigen Sprossscheiteln wurden polyploidisierte Zellen, jedoch keine mehrkernigen Zellen oder Zellen mit eingeschnürten Zellkernen gefunden (Abb. 15). Möglicherweise gehen diese Störungen der Zell- und Kernteilung auf eine oder mehrere Mutationen zurück, die Gene betreffen, die für den normalen Verlauf der Mitose verantwortlich sind. Der Zellzyklus wird durch eine Reihe von Genen gesteuert, die sowohl die geregelte Abfolge der einzelnen Teilungsphasen als auch die Genauigkeit der Replikation und Segregation der Chromosomen kontrollieren. Bestimmte Stoffwechselwege werden in diesem Zusammenhang als „Cell Cycle Checkpoints“ bezeichnet, wobei der Verlust von „Checkpoints“ zur Entregelung der Zellzykluskontrolle und als Folge dessen zu mitotischen Anomalien führt (ELLEDGE 1996). In der Epidermis von Klon 5/74/2 scheint die Mitose an mehreren Punkten gestört zu sein, denn es kommt zu Polyploidisierungen (Kapitel 3.1.4, 3.3.3), zu unregelmäßigen Verteilungen des Kernmaterials und zu eingeschnürten Zellkernen (Kapitel 3.4.2). So wurde die somatische Variabilität mit verschiedenen Ploidiestufen als Mixoploidie bezeichnet.

Die anomalen Mitosen, die zu mehrkernigen Zellen führen, und die Kernschnürungen sind ein Hinweis auf degenerative Prozesse in der Epidermis von Klon 5/74/2. Gestörte Mitosen treten häufig nach Mutagenbehandlung auf, wie beispielsweise auch die Ergebnisse von STEIN (1926; 1927; 1930; 1936; 1942) zeigen. Sie erhielt bei experimenteller Auslösung von Mutationen mit Radiumstrahlen bei Antirrhinu m vielseitig morphologisch veränderte Pflanzen. Sie waren gekennzeichnet durch Riesenzellen, Kernverschmelzung, multipolare Mitose, polyploide Mitose und Reduktionsmitose. Diese Abweichungen wurden unter dem Begriff Radiomorphologie zusammengefasst. Klon 5/74/2 zeigt zum Teil vergleichbare Abweichungen der Zellkernteilung, aber es ist noch unklar, wieso die Abweichungen erst mehrere Jahren nach der Mutagenbehandlung aufgetreten sind. Bemerkenswert ist auch, dass sich diese Mutation in einer Gewebeschicht in chimärischer Konstitution erhalten lässt.

4.6 Mediumoptimierung zur Kallusinduktion und Regeneration von Adventivsprossen bei Pelargonium zonale

Bei der in vitro-Kultur adulter Gewebe von Pelargonium zonale werden schwarze Polyphenolverbindungen in das Medium ausgeschieden. Dadurch werden die Kallusinduktion oder das Gewebewachstum verhindert (HILDEBRANDT & HARNEY 1988; BAUER 1993; NEUMANN 1995; BOASE et al. 1998). In den vorliegenden Versuchen zeigt die Prüfung sechs verschiedener Substanzen bzw. Verfahren zur Verminderung der Polyphenolverbindungen, dass die Kombination von Perlit und anschließend PVP die beste Wirkung bei der Kallusinduktion und Sprossregeneration des Pelargonium-Gewebes hatte (Kapitel, 3.5.1, Abb. 38, Tab.18).

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Bei den Wachstumsregulatoren zeigt TDZ die beste Wirkung zur Induktion von Kallus und zur Regeneration von Adventivsprossen bei Pelargonium zonale (Kapitel, 3.5.1, Tab. 19). Der Kallus wuchs auf dem TDZ-Medium schneller als bei allen anderen eingesetzten Wachstumsregulatoren. Das bestätigt die Beobachtung von VISSER et al. (1992), dass TDZ eine bessere Aktivität zur Induktion von Kallus als Auxin und Kinetin aufweist. Auf dem TDZ-Medium konnten nicht nur Kallus induziert, sondern auch Adventivsprosse ohne Mediumwechsel regeneriert werden. Ob die Adventivsprosse aus Kallus oder durch somatische Embryonen regenerieren, wurde nicht untersucht.

4.7 Kompetenz der Zellen zur in vitro-Regeneration bei Pelargonium zonale

Im Gegenzug stimmt die Konstitution der Adventivsprosse aus Blattstielsegmenten von `Mrs. Pollock` weder mit der Beobachtung von BERGANN & BERGANN (1959), wobei die Genotype der Adventivsprossen mit den L3-Zellen identisch sind, noch mit den Regeneraten aus Klon `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR in der vorliegenden Arbeit, wobei die Morphologie der Adventivsprossen mit L1-Zellen identisch ist (Kapitel, 3.5.2), überein, sondern sie ist heterogen (Kapitel, 3.5.3, Tab. 21; Abb. 39). Darüber hinaus entstanden auch chimärische Regenerate. Die an der in vitro-Regeneration beteiligten Zellen entstammen offensichtlich aus mindestens zwei Gewebeschichten der Explantate. Nachgewiesen werden konnte an `Mrs. Pollock`, dass sich die weiße L2-bürtige Zellen der GWG-Explantate und L3-bürtige Zellen der GGW-Explantaten an der Kallus- und Adventivsprossbildung beteiligen. Im Fall der GWG-Variante von `Mrs. Pollock` kann keine Aussage getroffen werden, ob die grünen Adventivsprosse (85,9 %) von L1- und/oder L3-bürtigen Zellen abstammen.

Daher ist es anzunehmen, dass die Kompetenz von Zellschichten zur Regeneration von dem Zellgenotyp, der Zellposition, der Induktionsfähigkeit und der Anzahl der Zellen, die mit dem Kulturmedium in Kontakt gekommen sind, abhängt.

4.8 In-vitro-Regeneration von Chimären

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KAMEYA (1975) erhielt bei Kulturen mit Protoplasten von chimärischem Pelargonium entweder grüne oder weiße Adventivpflanzen, jedoch wie BURK (1975) bei Tabak keine Chimären. CASSELLS et al. (1980) regenerierten nur homohistische Adventivpflanzen aus Pelargonium-Blattstielen. Daher sind einige Autoren der Ansicht, dass eine Adventiv-pflanze aus einer Zelle hervorgeht (BROERTJES & KEEN 1980; BROERTJES & VANHARTEN 1985; NONOHAY et al. 1999).

Jedoch beobachteten SKIRVIN & JANICK (1976) 0,6 % Chimären bei Kalluskulturen von Pelargonium graveolens. Aus Saintpaulia ionantha Gewebe konnten bis zu 34% Chimären regenerieren (LINEBERGER & DRUCKENBROD 1985). BERGANN & BERGANN (1959) erhielten bei Pelargonium `Madame Salleron` und NORRIS et al. (1983) bei Saintpaulia aus chimärischen Blattgeweben ausschließlich sortentypische Regenerate. In der vorliegenden Arbeit wurden 10,8 % unterschiedliche chimärische Adventivsprosse aus den Geweben von `Mrs. Pollock` regeneriert (Kapitel, 3.5.3, Abb. 40, Tab. 21), wobei nicht nur die ursprüngliche chimärische Konstitution, sondern auch 8,6 % neuartige chimärische Adventivsprosse beobachtet wurden

Eine Reihe von Autoren interpretierte die Entstehung chimärischer Adventivsprosse entweder mit Mutation bei der Sprossentwicklung (BERGANN 1967; HESS 1991) oder mit dem multizellulären Ursprung von Adventivsprossen (DULIEU 1967; OPATRNý & LANDA 1974; SKENE & BARLASS 1983; MARCOTRIGIANO 1986), wo mehr als eine Ursprungszelle zur Adventivsprossbildung beigeträgt (NORRIS et al., 1983; LINEBERGER & DRUCKENBROD, 1985) Die Prüfung der Abrissstellen der Blattstecklinge bei BERGANN & BERGANN (1959) spricht dafür, dass am Blattgrund des `Salleron`-Blattes bei der Sprossregeneration die drei obersten Schichten unaufgespalten und in ihrer ursprünglichen Anordnung in die neuen Scheiteln übernommen werden. Die multizelluläre Theorie wurde auch durch die Experimente von MARCOTRIGIANO & GOUIN (1984) unterstützt. Dabei wurden 0,3% – 0,4% chimärische Adventivsprosse aus gemischtem Kalli mit unterschiedlichen Konstitutionen bei Tabak beobachtet.

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Bei Pelargonium zonale `Mrs. Pollock` ist davon auszugehen, dass sich in der in vitro–Kultur in gewissem Maße (10,8 %) an den chimärischen Explantaten Mischkallus aus Zellen mit grünen Plastiden und Zellen mit weißen Plastiden bildete und beide Zelltypen sich auch an der Bildung eines Adventivsprosses beteiligen konnten (LI, 2005). Da beide Zelltypen sich im Adventivspross zufällig anordnen, konnten neuartige Chimären entstehen (8,6 %), die sich in ihrer Konstitution von Ausgangsvarianten unterschieden.

4.9 Somaklonale Variation der Adventivpflanzen aus Pelargonium zonale

Seit längerer Zeit ist es bekannt, dass in vitro-Kulturen, speziell Kalluskulturen, Regenerate hervorbringen können, die sich beträchtlich vom Ausgangsmaterial unterscheiden (BENNICI et al. 1968; BENNICI 1974; 1990; OGIHARA 1981; BIRADAR et al. 1993; KRIKORIAN et al. 1993; GILISSEN et al. 1993, 1994; SKIRVIN et al. 1994; NEUMANN 1995). Viele dieser Variationen zeigten sich an den regenerierten Pflanzen als vererbbare Mutationen. Dieses Phänomen ist als somaklonale Variabilität bekannt (LARKIN & SCOWCROFT 1981). Somaklonale Variabilität ist von fast allen vegetativ vermehrten Nutzpflanzen seit längerem bekannt und ist anhand sogenannter `Sports` nachweisbar (RÖSSEL 1990).

In der vorliegenden Arbeit wurden für die in vitro-Kultur Explantate des dreifach markierten chimärischen Klons `Weißer Liebling`, DHH, GWG, WRR und des Klons 5/74/2 von Pelargonium zonale `Kleiner Liebling`, PHH aufgesetzt (Kapitel, 3.5.2; Kapitel, 3.5.4). Daher waren die Ausgangszellen für die in vitro-Kultur bei Klon `Weißer Liebling` diploid und haploid, und beim Klon 5/74/2 polyploid und haploid (Kapitel 3.3.3).

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Die Stomatalängen der Adventivpflanzen wiesen aber darauf hin, dass Polyploidisierung und somit somaklonale Variation in der in vitro-Kultur auftrat. Die Ploidiestufe der Stomata lag in den Adventivpflanzen aus DHH- sowie aus PHH-Geweben überwiegend im diploiden Bereich (Kapitel 3.5.2, 3.5.4, Tab20, 22, 23). Das heißt, dass das Phänomen der Diploidisierung in der Sprossregeneration auftritt. Das Phänomen der Diploidisierung stimmt jedoch weder mit der Definition der „diplontische Selektion“ noch mit der „diplontische Drift“ von BALKEMA (1971, 1972) überein. Dabei wurden auch tetraploide, oktoploide und Pflanzen mit verschiedenen Ploidiestufen gefunden. Das ist ähnlich wie bei der Untersuchung von BENNICI (1990).

BENNICI (1974) fand bei der cytologischen Analyse von Regeneraten von `Kleiner Liebling` einen Stabilitätsverlust der Chromosomenzahl des Kallus während der Zelldifferenzierung.Die Chromosomenvariabilität in somatischen Zellen nach der Regeneration hängt mit dem Valenzzustand des Kallus zusammen (OGIHARA 1981). Die regenerierten Adventivpflanzen zeigten weniger Chromosomenvariabilitäten als der Kallus (ORTON 1980). Das weist darauf hin, dass eine Zellselektion bei der Regeneration von Kallus stattfindet. Die Stärke der Selektion ist von der Art des Explantates abhängig (MOK et al. 1976; OGIHARA 1981).

SWARTZ (1991) berichtete, dass sowohl hoch polyploide als auch haploide Zellen gegenüber diploiden eine geringere Fähigkeit zur Organbildung aufweisen. Die diploiden Pflanzen wachsen schneller als die anderen (BALKEMA 1972; RUTH et al., 1985). Nach SINGH (1975) wurden auf B5-Medium diploide und auf MS-Medium tetraploide Regenerate bei Haplopappus gracilisselektiert.

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So ist es denkbar, dass durch die Kultur Mutation und Selektion zur somaklonalen Variation und zur Phänomen der Diploidisierung bei der Sprossregeneration in vitro-Kultur in der vorliegenden Arbeit beitragen. Das heißt, dass diploide Zellen des DHH-Gewebes vom Klon `Weißer Liebling` und diploidisierte haploide Zellen der PHH-Gewebe der Pflanzen von Klon 5/74/2 bevorzugt regenerieren. Damit gingen die polyploiden und haploiden Zellen aus den Geweben von Klon 5/74/2 durch eine Selektion in der in vitro-Kultur verloren. So wurden die annähernd gleichen Ploidiestufenraten der Adventiv-pflanzen aus der DHH- und PHH-Gewebekultur in vorliegendem Experiment verursacht (Tab. 23). Die tetraploiden und ploidiegemischten Adventivpflanzen sind möglicherweise wie bei Untersuchungen von OGIHARA (1981) und von ARNI & HERTNE (1997)durch Ploidiemutation während der in vitro-Kultur entstanden. Die über in vitro-Kultur induzierte Polyploidie und Aneuploidie ist direkt abhängig von der Herkunft der Zellen, der Wachstumsphase, den Initialzellen der Explantate und dem Kulturmedium sowie den Kulturbedingungen (CASSELLS 1985; NASSOUR et al. 2003; SAITO et al. 2003).


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21.10.2005