2 Material und Methoden

2.1 Studiendesign

↓16

Die Studie stellte eine prospektive Anwendungsbeobachtung dar, in der sowohl die Wirksamkeit als auch die Nebenwirkungsrate von Antidepressiva in Abhängigkeit vom Metabolisierungsstatus beobachtet werden sollte. Die Studie war insofern geblindet, als dass die Genotypen weder dem behandelnden Arzt noch dem Patienten für die Dauer der Studie mitgeteilt wurden. Die verschriebenen Medikamente waren die krankenhausüblichen Medikationen bekannter, sich auf dem Markt befindlicher Antidepressiva. Zusatzmedikationen waren grundsätzlich erlaubt und wurden ebenfalls dokumentiert. Jedem Studienteilnehmer war es möglich, zu jedem Zeitpunkt der Studie die Teilnahme ohne Angabe von Gründen zu beenden.
Primär mit der Teilnahme einverstandene Patienten konnten später aus der Studie ausgeschlossen werden, wenn sich im Verlauf der Behandlung die Diagnose änderte oder wenn andere gravierende Umstände eine weitere Teilnahme verhinderten. Die Patientendaten wurden in pseudoanonymisierter Form erhoben, in eine Access®-Datenbank eingegeben und mittels SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) deskriptiv statistisch ausgewertet. Jeder Patient erhielt eine individuelle Codenummer, die computergesteuert verwaltet und gespeichert wurde. Die Zuordnung von Patient zu Code war nur den im Krankenhaus arbeitenden Ärzten bekannt und wurde nicht an die datenverwaltende Stelle (Institut für Klinische Pharmakologie) weitergegeben. Ein Datenzugriff anderer Personen als den behandelnden Ärzten des jeweiligen Krankenhauses war nur zum Zweck der Auswertung der Studienziele gestattet.

2.1.1 Patientenauswahl

Im Rahmen dieser Studie zur Optimierung der Arzneimitteltherapie mit Antidepressiva durch die molekulargenetische Bestimmung individueller genetischer Unterschiede sind für die Patienten Ein- und Ausschlusskriterien festgelegt worden. Die Rekrutierung der Patienten erfolgte in vier Berliner Kliniken von den dort zuständigen Studienärzten. Dabei handelte es sich um das Universitätsklinikum Charité, Abteilung für Psychiatrie, das Krankenhaus am Urban, Abteilung für Psychiatrie und Psychotherapie, das Krankenhaus Hellersdorf, Erste und Zweite Psychiatrische Abteilung (ö.B. Wilhelm-Griesinger-Krankenhaus) und die Gemeindepsychiatrische Klinik Wilmersdorf (ö.B. Eschenallee). Die molekulargenetischen Laboranalysen wurden am Universitätsklinikum Charité im Institut für Klinische Pharmakologie durchgeführt. Das Institut für Klinische Pharmakologie an der Universität in Göttingen war für die Bestimmung der Serumkonzentration zuständig.

2.1.1.1 Einschlusskriterien

↓17

Bei den untersuchten Patienten handelte es sich um primär depressive Patienten, die aufgrund ihrer Krankheit in eine Klinik aufgenommen und dort stationär mit Antidepressiva behandelt wurden. Die Diagnosestellung erfolgte durch die Kurzversion des strukturierten klinischen Interviews für DSM-IV, SKID I (Wittchen et al., 1991). Die Durchführungszeit beträgt etwa 60 Minuten. Einen Überblick über die Einschlussdiagnosen gibt die Tabelle 10.

Tabelle 10: Einschlussdiagnosen

2.1.1.2 Ausschlusskriterien

Ausgeschlossen wurden sämtliche Patienten unter 18 oder über 70 Jahren und Patienten mit primär nicht affektiven Erkrankungen. Dazu gehören postpsychotische depressive Phasen, organische depressive Störungen, depressive Störung bei Demenz, psychische Verhaltensstörungen durch psychotrope Substanzen, schizoaffektive Störungen und Persönlichkeitsstörungen. Auch Patienten, die primär an einer Alkohlkrankheit litten, wurden nicht in die Studie aufgenommen. Ein weiteres Ausschlusskriterium war die Behandlung mit einem nicht medikamentösen Therapieverfahren oder mit nicht als Antidepressiva zu bezeichnenden Medikamenten.

2.1.2 Stationärer Ablauf der Studie

↓18

Die Blutabnahme zur Genotypisierung (2 x 8ml EDTA-Blut) am 1.-3. Tag sowie zur Medikamentenspiegelmessung (je 8ml pro Substanz) am 20.-22. Tag erfolgten wenn möglich im Rahmen der üblichen Routine-Blutennahmen. Die Therapieeffizienz bzw. die Wirksamkeit der medikamentösen antidepressiven Therapie wurden mittels der Hamilton Depression Rating Scale (HDRS), der Cli nical Global Impression Scale (CGI) und der Global Assessment Scale (GAS) dokumentiert. Als ausschlaggebenden Parameter für eine Therapieresponse wurde ein Abfall um mindestens sieben Punkte in der HDRS, eine Erhöhung der Punktwerte in der GAS sowie eine Verbesserung auf möglichst niedrige Items in der CGI festgelegt. Diese Testverfahren wurden zu Beginn der Studie, am 20.-22. Tag und (mit Ausnahme der CGI) zwei Monate nach Entlassung des Patienten durchgeführt. Im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit wurden unerwünschte Nebenwirkungen (UAWs) sowohl in einer Selbstbeurteilungsskala als auch in einer Fremdbeurteilungsskala durch den Studienarzt erfasst. Um mögliche kardiale Begleiterscheinungen aufzuzeichnen, wurde bei Aufnahme und während der Therapie jeweils ein EKG geschrieben und der Blutdruck an drei hintereinander folgenden Tagen im Liegen gemessen. Änderungen des Körpergewichtes wurden im Verlauf der Studie dokumentiert ebenso wie Auffälligkeiten im Routine-Labor (v.a. Blutbild und Leberwerte). Die Erhebung notwendiger Grunddaten wie Krankheitsvorgeschichte, berufliche Tätigkeit, sonstige Erkrankungen, familiäre Belastung, Medikamenten- und Suchtanamnese erfolgte zu Beginn in einer ausführlichen Krankheitsanamnese. Eine Übersicht über den stationären Ablauf gibt die folgende Tabelle 11.

Tabelle 11: Zeitschema zur Durchführung des stationären Teils der Studie

SKID I: Kurzversion des SKID zur Diagnosesicherung; HDRS: Hamilton Depression Rating Scale; GAS: Global Assessment Scale; CGI: Clinical Global Impressions; BE: Blutentnahme; G: 2x8ml EDTA-Blut zur Genotypisierung; P: Plasmaspiegel je Antidepressivum 10ml Serum; GD: Grunddatenbogen, MS: Messungsblatt; UAW 1: Selbstbeurteilungsbogen für den Patienten, 1x wöchentlich auszufüllen; UAW 2: Fremdbeurteilungsbogen; M: Medikamentendokumentation; KB: Katamnesebogen

2.2 Genetische Analysen

2.2.1 DNA-Extraktion mittels Adsorption an Magnetpartikel

Für die DNA-Extraktion und die Genotypisierung wurde pro Patient eine EDTA-Monovette mit 5 ml venösem Blut benötigt. Der MagNA-Pure ist ein vollautomatisches Gerät. Durch die Zugabe vom Lysis/Binding Buffer kommt es zu einer kompletten Zellauflösung. Die Proteine werden denaturiert und die DNA liegt als freies Molekül vor. Die hinzugegebene Proteinase K ist für die Verdauung der zellulären Proteine verantwortlich. Der Lysis/Binding Buffer enthält chaotropische Salze und hat eine hohe ionische Stärke. Das ist die Voraussetzung für eine Bindung der DNA an die mit Siliziumdioxid beschichtete Oberfläche der Magnetpartikel. Der Wash Buffer I entfernt ungebundene Substanzen wie Proteine (Nukleasen), Zellmembranen etc. und PCR-Inhibitoren wie Heparin und Hämoglobin. Der Wash Buffer II entfernt Verunreinigungen (Zellreste) und vermindert die chaotropische Salzkonzentration. Im Elution Buffer wird die pure DNA bei erhöhter Temperatur gelöst. Nach ca. 90 Minuten ist die Extraktion abgeschlossen und die DNA liegt in 100µl Elution Buffer mit einer Endkonzentration zwischen 30-100 ng/µl gelöst vor. Die Überführung in die beschrifteten Eppendorfgefäße erfolgte anhand der Probenliste. Alle Reagenzien und Arbeitsmaterialien wurden von der Firma Roche geliefert (Tabelle 12).

↓19

Tabelle 12: Chemikalien und Lösungen zur DNA-Extraktion mittels Adsorption an Magnetpartikel

2.2.2 Photometrische DNA-Quantifizierung

Nach der Extraktion am MagNa-Pure-Gerät wurde die DNA mit Hilfe des Eppendorf-BIO-Photometers und DPU-414 Druckers photometrisch quantifiziert. Verwendet wurden 50 µl der extrahierten Probe sowie 50 µl Elution Bufferals Leerwert. Neben der Konzentrationsbestimmung diente die photometrische Messung der Qualitätssicherung der Extrakte. Der Quotient der Extinktion bei 280/260 läßt auf die Qualtität der isolierten DNA schließen und sollte zwischen 1,6 und 2,0 liegen.

2.3 Genotypisierung

Die Genotypisierung des polymorphen Cytochrom-P450-Enzyms 2D6, 2C19 und 2C9 anhand der aus Vollblut gewonnenen genomischen DNA erfolgte mittels der Polymerase-Kettenreaktion mit anschließendem Verdau durch Restriktionsendonukleasen und Auftrennung der einzelnen DNA-Abschnitte mittels Gelelektrophorese.

2.3.1 Polymerase - Kettenreaktion

↓20

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um eine In-vitro-Methode, die mit Hilfe von DNA-Polymerasen gezielt einen DNA-Abschnitt amplifizieren kann. Voraussetzung dafür ist die Information über die Nukleotid-Sequenz beiderseits eines DNA-Abschnitts. An diesen können sich geeignete, d.h. komplementär zu der einsträngigen DNA-Matrize, Oligonukleotide (Primer) binden. Der erste Primer wird vom 5´-Ende in Richtung des 3´-Endes des ersten Stranges abgeleitet und Vorwärts-Primer genannt; der zweite Primer wird vom 5´-Ende in Richtung des 3´-Endes des Gegenstranges abgeleitet und Rückwärts-Primer genannt. Die PCR läuft temperaturgesteuert in Thermocyclern automatisch in Reaktionszyklen ab. Es werden 1µl DNA mit DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und den beiden Primern in einem geeigneten Reaktionsgemisch inkubiert. Der folgende Zyklus, der 20-50mal wiederholt wird, besteht aus drei Schritten: Bei einer Temperatur von 94°C denaturiert der ursprüngliche DNA-Doppelstrang. Nach Abkühlen und Erreichen der Anlagerungstemperatur („annealing-temperature“) bei 58-60°C hybridisieren die Primer im zweiten Schritt an die jeweils komplementäre DNA–Sequenz und bilden den Startpunkt für die DNA-Polymerase. Im dritten Schritt kann die DNA-Polymerase bei einer optimalen Temperatur von 72°C mit der Verlängerung der Primer beginnen und es entstehen neu synthetisierte DNA-Doppelstränge. Bei Wiederholung der Reaktionsfolge aus Denaturierung, Anhybridisierung der Primer und Verlängerung zu einem neuen DNA-Strang kommt es nach jedem Zyklus zur Verdopplung der DNA und damit zu einer exponentiellen, selektiven Amplifizierung der durch die Oligonukleotide begrenzten DNA-Sequenz (siehe Abb.2).

Abbildung 2: Schema einer Polymerase-Kettenreaktion

2.3.2 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)

Die PCR-Produkte wurden zum Zweck der RFLP-Analyse mit Restriktionsendonukleasen verdaut. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die einen DNA-Abschnitt sequenzspezifisch an festgelegten Schnittstellen schneiden und DNA-Fragmente gleicher Länge produzieren. Wird durch eine Mutation die Nucleotid-Sequenz einer Schnittstelle verändert, kann die Restriktionsendonuklease das PCR-Produkt an dieser Stelle nicht schneiden und es entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus). Die unterschiedlichen Restriktionsmuster lassen auf den entsprechenden Genotyp schließen. Die Fragmente wurden anschließend in der Gelelektrophorese untersucht.

2.3.3  Bestimmung der CYP2D6-Allele

↓21

Zur Bestimmung der in dieser Arbeit untersuchten CYP2D6-Allele wurde eine Nested-PCR, bestehend aus zwei aufeinanderfolgenden PCRs, verwendet. Für die erste PCR wurde das ExpandTM Long PCR System (Fa.Boehringer Mannheim, Deutschland) verwendetdas mit einem Gemisch aus Taq- und Pwo-DNA-Polymerasen arbeitet und in der Lage ist, Fragmente bis zu einer Länge von 20kb zu amplifizieren. Um mögliche Fehlerquellen durch Koamplifikationen der beiden benachbarten homologen Pseudogene CYP2D7 und CYP2D8 zu vermeiden, wird zu Beginn das gesamte CYP2D6-Gen mit einer Länge von 4681bp amplifiziert. Im zweiten Schritt können mit Hilfe der Nested-PCR-Technik und spezifischer PCR-RFLP-Tests (Sachse et al., 1997) die einzelnen Punktmutationen nachgewiesen werden. Das spezifische PCR-Produkt aus der ersten Reaktion wird dabei verdünnt als Matrix für die nachfolgenden PCR-RFLP-Tests verwendet. Es folgt die Amplifikation eines bestimmten Genabschnitts durch den dazugehörigen Primer. Der amplifizierte Abschnitt wird anschließend durch Restriktionsendonukleasen entsprechend des Genotyps geschnitten.

Ebenfalls mit Hilfe des ExpandTM Long PCR Systems wurden die Deletion (CYP2D6*5) und die Duplikation (CYP2D6*MxN) nachgewiesen. Durch eine allelspezifische PCR-Reaktion (Lovlie et al., 1996) wird mit Hilfe eines Forwärts-Primer in Exon 9 und eines Rückwärts-Primers in Exon 2 ein 9,3kb-Fragment bei Personen mit einer vorhandenen Duplikation (42kb–Allel) amplifiziert. Die Sequenz des 9,3kb-Fragments ist sowohl bei dem 42kb CYP2D6*1-, als auch bei dem CYP2D6*2-Allel identisch. Fällt die PCR-Reaktion positiv aus, handelt es sich um eine CYP2D6-Duplikation.

Bei der Deletion wird mit Hilfe der Long-Amplifikationstechnik nach der Methode von Steen et al., 1995aein 3500bp langes PCR-Produkt nachgewiesen. Nach Verlust (Deletion) des gesamten CYP2D6-Gens liegt dieses innerhalb des verkürzten 13kb Allel.

↓22

Zur Kontrolle der PCR wurde sowohl das aus der Long-Amplifikation entstandene PCR-Produkt als auch die nachfolgenden PCR-Produkte aus den Nested-PCRs auf einem 1%igen Agarosegel aufgetragen und die Ergebnisse mittels Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Die Bestimmung der Genotypen nach dem Verdau mit den Restriktionsendonukleasen erfolgte durch den Nachweis der entsprechenden Restriktionsmuster ebenfalls mittels Gelelektrophorese auf einem 3%igen Agarosegel. Alle Ergebnisse wurden mit dem digitalen Videosystem (Eagleeye™, Fa. Stratagene) dokumentiert. Die schematische Darstellung der PCR-Strategie, abgeleitet aus der genomischen Lage und dem molekulargenetischen Aufbau des CYP2D6, der CYP2D6-Deletion und der CYP2D6-Duplikation ist der folgenden Abbildung zu entnehmen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der PCR-Strategie, abgeleitet aus der genomischen Lage und dem molekulargenetischen Aufbau des CYP2D6, der CYP2D6-Deletion und der CYP2D6-Duplikation. Die Angabe der Fragmentlänge entspricht den bestimmten CYP2D6-Allelen

2.3.4 Bestimmung der CYP2C9-Allele

Die beiden Allele CYP2C9*2 und CYP2C9*3 sowie der Wildtyp CYP2C9*1 wurden nachgewiesen durch PCR-RFLP-Tests (Sullivan-Klose et al., 1996, Aynacioglu et al., 1999). Die Mutation C>432T in Exon 3 des codierenden CYP2C9-Genabschnittes, verantwortlich für den Aminosäure-Austausch Arg>144 Cys, wurde in einem 372bp umfassenden Abschnitt mit Hilfe spezifischer Primer amplifiziert und anschließend durch Zugabe eines Restriktionsenzyms entsprechend ihres Genotyps gespalten. Die Bestimmung der Mutation A>1077T in Exon 7, die den Aminosäureaustausch Ile>359Leu zur Folge hat, erfolgte auf die gleiche Weise. Zur Verhinderung einer Koamplifikation mit dem zu 96%igen homologen CYP2C19-Genabschnit diente ein modifizierter CYP2C9 Intron-spezifischer Primer (Sullivan-Klose et al., 1996). Die Kontrolle der erfolgreichen Amplifikation erfolgte auf einem 1%igen Agarosegel. Die Genotypen wurden entsprechend ihres Restriktionsmusters nach Verdau mit den Restriktionsendonukleasen auf einem 3%igen Agarosegel sichtbar gemacht und die Ergebnisse mit dem digitalen Videosystem dokumentiert.

2.3.5 Bestimmung der CYP2C19-Allele

↓23

Die Mutation des CYP2C19*2-Allel besteht aus einem einfachen Basenaustausch (G>681A) in der codierenden Sequenz im Exon 5 des CYP2C19-Gens, der zu einer veränderten Schnittstelle führt. Diese Mutation resultiert aus einem Verlust der Aminosäuren 215-227, verschiebt das Leseraster der mRNA beginnend bei der Aminosäure 215 und führt zu einem vorzeitigem Stop-codon 20 Aminosäuren weiter downstream. Das Ergebnis ist ein nicht funktionelles verkürztes Protein, bestehend aus 234 Aminosäuren (De Morais et al., 1994). Der Nachweis des CYP2C19*2-Allels erfolgte mit Hilfe eines PCR-RFLP-Tests. Durch den Verlust der Schnittstelle für das Restriktionsenzym Sma1 unterschied sich das CYP2C19*2-Allel von dem Wildtyp (CYP2C9*1) anhand des nicht geschnittenen PCR-Produkts. Die Bestimmung des Genotyps sowie die Dokumentation der Ergebnisse erfolgte entsprechend dem Nachweis der CYP2C9-Allele. Die PCR-Strategie ist in der Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4: PCR-Strategie zum Nachweis des CYP2C19*2-Allels

2.3.6 Material, Methoden, Ansätze und Reaktionsbedingungen für die PCR-RFLP-Tests

2.3.6.1 Chemikalien, Puffer, Lösungen und Geräte für die PCR-RFLP-Tests

Tabelle 13: Chemikalien für die PCR-RFLP-Tests

↓24

Tabelle 14: Geräte für die PCR-RFLP-Tests

2.3.6.2 Primer für die PCR-Reaktionen

Tabelle 15: CYP2D6-, 2C9- und 2C19-Primer

fett markierte Nukleotide entsprechen mismatch-Basen zur Generierung einer künstlichen Restriktionsstelle (ACRS), f = forward Primer, r = reverse Primer

2.3.7 Übersicht über alle PCR-Reaktionen

Tabelle 16: Design der PCR-RFLP-Tests für die CYP2D6-Mutationen

Die PCRs Nr. 4-9 sind Nested-Amplifikationen aus der PCR Nr.1; PCR Nr. 11 ist eine Nested-Amplifikation aus PCR Nr. 10, die PCRs NR. 1-3 sind Amplifikationen aus genomischer DNA; Methoden nach Sachse et al., 1997, a Steen et al., 1995a, b Lovlie et al., 1996

↓25

Tabelle 17: Design der PCR-RFLP-Tests für die CYP2C9-Mutationen

Tabelle 18: Design des PCR-RFLP-Tests für die CYP2C19*2-Mutation

2.3.7.1 Reaktionsbedingungen im Einzelnen

Die Reaktionsansätze und die entsprechenden Cyclerprogramme zur Bestimmung der in dieser Arbeit untersuchten Mutationen des CYP2D6-, CYP2C9- und CYP2C19-Gens sind im Folgenden dargestellt. Die Mengenangaben für die PCR-Reaktion (25µl) sind für je eine Probe berechnet und mit der Anzahl der Proben multipliziert worden. Zur Herstellung des Reaktionsansatzes wurden die bei –20°C gelagerten Lösungen mit einem halbautomatischen Schüttler aufgetaut, anschließend auf Eis gestellt und entsprechend dem vorgegebenen Ansatz pipettiert. Nach zweimaligem Mischen und Zentrifugieren wurde der Reaktionsansatz auf die einzelnen PCR-Gefäße verteilt. Die Zugabe von 1µl genomischer DNA (Reaktionen 1-3, 10 und 12-14) beziehungsweise 1µl des verdünnten Long-Amplifikationsprodukts (Reaktionen 4-9 und 11) erfolgte kurz vor dem Cyclerstart in einem extra dafür vorgesehen Raum zwecks Kontaminationsverminderung. Nach nochmaligem Mischen und Zentrifugieren des nun vollständigen Reaktionsansatzes wurden die PCR-Gefäße bei ca. 85-90°C in den Cycler gestellt. Dieser sogenannte Hot-Start bewirkte den sofortigen Beginn der DNA-Hitzedenaturierung zur Vermeidung einer Kontamination durch unspezifische Amplifizierung durch die DNA–Polymerasen. Die Bestimmung der Genotypen für die Deletion (*5) und die Duplikation (MxN) konnte bereits nach diesem Schritt mittels Auftrennung in die spezifischen Fragmente erfolgen. Zur Genotypisierung der übrigen Allele wurden die PCR-Produkte mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut und die gewonnenen Restriktionsergebnisse anschließend auf einem 3%igen Agarosegel dargestellt und mit einem digitalen Videosystems dokumentiert.

↓26

Tabelle 19: PCR Nr.1: Amplifikation des gesamten CYP2D6-Gens

Das verbleibende PCR-Produkt wurde 1:5 mit destilliertem H2O verdünnt und war Ausgangsmaterial für die Nested-PCRs.

Abbildung 5: CYP2D6-Amplifikation

↓27

Tabelle 20: PCR Nr.2: Nachweis der CYP2D6-Deletion (Allel*5)

Abbildung 6: CYP2D6-Deletion

Tabelle 21: PCR Nr.3: Nachweis der CYP2D6-Duplikation (MxN)

↓28

Abbildung 7: CYP2D6-Duplikation

Tabelle 22: PCR-Nr.4: Nachweis der CYP2D6-Mutation Del A2637 (*3)

Abbildung 8: CYP2D6*3

↓29

Die Reaktionsansätze, die Auswahl des Cycler-Programmes sowie die Angaben zur Elektrophorese der PCRs Nr.5-9 entsprachen denen des Nachweises der CYP2D6-Allel*3-Mutation. Die einzelnen Auswertungen sind im Folgenden dargestellt. Die verwendeten Enzyme sind der Tabelle mit der Übersicht über alle PCR-Reaktionen zu entnehmen.

Tabelle 23: PCR Nr.5: Nachweis der CYP2D6-Mutationen G>1934A (*4), DelT1795 (*6) und G>1846T (*8)

Abbildung 9: CYP2D6 *4/*6

↓30

Abbildung 10: CYP2D6 *8

Die Mutation G>4268C findet sich auch bei den Allelen *4, *8, *9, *10 und *17. Die Bezeichnung Allel*2 ist nur dann gegeben, wenn keine weitere Mutation vorliegt.

Tabelle 24: PCR Nr.6: Nachweis der CYP2D6-Mutation G>4268C (*2)

↓31

Abbildung 11: CYP2D6*2

Tabelle 25: PCR Nr.7: Nachweis der CYP2D6-Mutation Del A2701-2703 (*9) und der Position C>2938T

Abbildung 12: CYP2D6 *9 und Position 2938

↓32

Tabelle 26: PCR Nr. 8: Nachweis der CYP2D6-Mutation C>188T (*10)

Abbildung 13: CYP2D6*10

Tabelle 27: PCR Nr.9: Nachweis der CYP2D6-Mutation C>1111T (*17)

↓33

Abbildung 14: CYP2D6*17

Tabelle 28: PCR Nr. 10: Long-PCR des CYP2D6-Allels *41

Das PCR-Produkt wurde 1:5 verdünnt und in der PCR Nr.11 eingesetzt.

↓34

Abbildung 15: CYP2D6 Long-Amplifikationsprodukt des CYP2D6*41-Allels

Die mutierte Variante in der *2-Promotorregion (C> -1496G) wurde als *2A-Allel in die CYP2D6-Nomenklatur eingeführt (Gaedigk et al., 2003); laut aktueller Studienlage kommt sie wahrscheinlich bei allen CYP2D6*2-Allelen vor (Johansson et al., 1993 und Raimundo et al., 2000, Gaedigk et al., 2003). Die -1496C-Variante ist spezifisch für das *41-Allel in der Promotorregion. Die Nukleotidposition -1496C nach Kimura et al., 1989 entspricht der Position -1584C der Nomenklatur nach http://www.imm.ki.se/CYPallels/cyp2D6.htm.

Tabelle 29: PCR Nr.11: Nachweis der CYP2D6-Variante -1496C (*41)

↓35

Abbildung 16: CYP2D6 *41

Für die Bestimmung der CYP2C9- und C19-Allele wurden dem Reaktionsansatz 1µl genomischer DNA zugegeben.

Tabelle 30: PCR Nr. 12 und 13: Nachweis der CYP2C9-Mutationen Arg>144/Cyst (*2) und Ile>359/Leu (*3)

↓36

Tabelle 31: Auswertung der CYP2C9-Allelbestimmung

Abbildung 17: CYP2C9*2

Abbildung 18: CYP2C9*3

↓37

Tabelle 32: PCR Nr. 14: Nachweis der CYP2C19-Mutation G>681/A (*2)

Abbildung 19: CYP2C19*2

2.3.8 Agarosegel-Elektrophorese

2.3.8.1 Chemikalien, Reagentien und Lösungen für die Agarosegel-Elektrophorese

Tabelle 33: Reagenzien und Lösungen für die Agarosegel-Elektrophorese

2.3.8.2 Elektrophorese

↓38

Die Proben wurden, wie in den einzelnen PCR-Reaktionen beschrieben, für die Elektrophorese vorbereitet. Für die PCR-Kontrolle wurden 5µl PCR-Produkt in einer Mikrotiterplatte zu 10µl Bromphenolblau pipettiert, gemischt und auf das 1%ige Gel aufgetragen. Für die PCR-RFLP-Analysen wurden 10µl des über Nacht mit Restriktionsenzym inkubierten PCR-Produktes ebenfalls mit 10µl Bromphenol-Blau gemischt und auf das 3%ige Gel aufgetragen. Um die Fragmentlänge der aufgetrennten PCR-Produkte bestimmen zu können, lief pro Probenreihe eine Tasche mit einem Marker, entsprechend der gesuchten Fragmentgröße, mit. Die Fragmente wanderten abhängig von ihrer Größe unterschiedlich schnell durch die netzähnlichen Polysaccharidstrukturen des Agarosegels und wurden schließlich durch intercalierende Farbstoffe wie Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Abhängig von der Amplifikatgröße wurden die Elektrophoresen mit unterschiedlichen Spannungen und Laufzeiten auf einem 1%igem oder 3%igem Gel durchgeführt (siehe Beschreibung unter den einzelnen PCR-Reaktionen).

2.4 Sotfware und statistische Berechnungen

Die umfangreichen Patientendaten wurden in einer Access®-Datenbank (Microsoft, USA) archiviert. Für die statistischen Untersuchungen wurde das Programm SPSS® 8.0 (Statistical Package for the Social Sciences; Inc., USA) für Windows verwendet.

Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Allelvarianten für CYP2D6, CYP2C9 und CYP2C19 wurden mit nichtparametrischen Tests ermittelt, wie dem T-Test und dem Levene-Test der Varianzgleichheit. Zur Feststellung signifikanter Unterschiede hinsichtlich pharmakokinetischer Eigenschaften in Bezug auf die einzelnen Genotypen wurde der Trendtest nach Jonckheere-Terpstra verwendet. Die Reihenfolge zur statistischen Testung der Langzeitresponse unter medikamentöser antidepressiver Therapie wurde entsprechend der Anzahl aktiver Allele wie folgt festgelegt: CYP2D6: PM > IM > EM > UM

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Die Analyse der Häufigkeitsverteilung der untersuchten CYP2D6-, 2C9- und 2C19-Allele und die Abhängigkeit zum Therapieerfolg und der Nebenwirkungsrate erfolgte mittels des Chi 2 -Test(x2-Test).


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30.11.2005