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3.  Material und Methoden

3.1. Modellversuche

3.1.1. Untersuchungen zum Einfluss von Rhizosphärenbakterien auf das Pflanzenwachstum in unterschiedlich pathogenbelasteten Erden

Um Erkenntnisse über den Einfluss spezieller Rhizosphärenbakterien auf das Wachstum einjähriger Spargelpflanzen in zwei natürlichen Erden unterschiedlicher pathogener Situation (Nachbau bzw. Fruchtfolge) zu gewinnen, wurden Modellversuche in zwei Folienhäusern (7 x 2,5 m, ohne technische Klimaregelung) durchgeführt. Der Boden war mit weißer Mulchfolie bedeckt. Die bakterisierten Pflanzen wurden in 10 l Mitscherlichgefäße gepflanzt, mit 10 l (ca. 13 kg) der entsprechenden Erden unter Verwendung eines 5 l Meßzylinders befüllt und zufallsverteilt, nach Provenienz der Erden räumlich getrennt, in den Folienhäusern aufgestellt. Die Gefäße wurden regelmäßig nach einem rotierendem System umgestellt. Nach ca. 3 Wochen hatte sich die Erde in allen Gefäßen so stark gesetzt, dass die Rhizomkronen z. T. frei­lagen. Es erfolgte daraufhin in beiden Versuchsjahren eine Auffüllung der Mitscherlichgefäße mit jeweils 1 bis 2 l der entsprechenden Erden.

3.1.1.1. Beschreibung der Prüfglieder und Erdherkünfte

Im Versuchsjahr 1997 wurden die in Tab. 1 aufgeführten Mikroorganismen-Varianten in den zwei Erdsituationen mit jeweils 5 Wiederholungen (Gefäße) geprüft. 1998 erfolgte nur eine Applikation der drei Bacillus subtilis-Stämme, jedoch diesmal mit jeweils 10 Wiederholungen (Gefäße) pro Variante. Die Rhizome der Kontrollvarianten wurden mit Leitungswasser behandelt.

Die verwendeten Mikroorganismen stammten von der FZB-Biotechnik GmbH Berlin. Bacillus subtilis umfasst nach GORDON et al. (1973) eine heterogene Gruppe aus der Gattung Bacillus und beinhaltet B. subtilis, B. licheniformis und B. amyloliquefaciens. Aufgrund exakterer Charakterisierungsergebnisse mit Hilfe der Lysotypie erfolgt neuerdings eine korrigierte taxonomische Zuordnung der Bacillus-Stämme FZB24 und FZB42 in die Art Bacillus amyloliquefaciens (KREBS et al. 1998). In der vorliegenden Arbeit wird jedoch in Anlehnung [Seite 45↓]an die Klassifizierung nach BERGEY´s Manual of Systematic Bacteriology (SNEATH et al. 1986) bei FZB24, FZB42 und FZB37 generell von Bacillus subtilis gesprochen.

Tab. 1: Art und Herkunft der geprüften Mikroorganismen.

Rhizosphärenbakterium/ Art

Stamm

Herkunft

Medium/Anzucht

Varianten-bezeichnung

Bacillus subtilis bzw.
B. amyloliquefaciens

FZB24

Süßgräserwurzel

Granulat KNO3

BS-FZB24

Bacillus subtilis bzw.
B. amyloliquefaciens

FZB42

Edelnelkenkultur-substrat

Granulat KNO3

BS-FZB42

Bacillus subtilis

FZB37

Torfsubstrat

Granulat KNO3

BS-FZB37

Bacillus pumilus

FZBRK13

Zuckerrübenwurzel

GNB1); 64 h bei 27° C und 220 rpm

BP-RK13

Streptomyces graminofaciens

FZBN 6

Torfsubstrat

HM2); 96 h bei 27° C und 220 rpm

SG-N6

1 Glucose-Nährbouillon (SIFIN), Zusammensetzung: Pankreatisches Pepton (Casein, Fleisch) 2,25%, Glucose 0,1%, Dikaliumhydrogenphosphat 0,2%, Natriumchlorid 0,3%.
2 Hefe-/Malzextrakt-Medium, Zusammensetzung: Hefeextrakt 0,4%, Malzextrakt 1%, Glucose 0,4%.

Diese Bacillus subtilis-Stämme wurden fermentativ hergestellt und als gefriergetrocknete, in Wasser dispergierbare Granulatpräparate, gebunden an KNO3 als Trägersubstanz mit einer Sporendichte von 1x1011 cfu/g (FZB24, FZB37) bzw. 5x1010 cfu/g (FZB42)geliefert. Die Antagonisten Bacillus pumilus RK 13 und Streptomyces graminofaciens N 6 lagen nach Fermentation als gebrauchsfertige Bakteriensuspensionen mit einem Titer von 8x1010 bzw. 6x1010 cfu/g vor. Während S. graminofaciens N6 in einer Glucosenährbouillon fermentiert wurde, erfolgte die Anzucht von B. pumilus RK 13 in einem Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium (siehe Tab. 1).

Die oben genannten Rhizosphärenbakterien wurden in zwei Erden unterschiedlicher Herkunft und pathogener Belastung geprüft. Bei allen Z-Varianten erfolgte die Pflanzung der Rhizome in gesiebte Felderde aus der Versuchsanstalt Zepernick. Die Erde stammte von einer Parzelle, auf der in der Vergangenheit kein Spargel angebaut wurde. Als Vorkulturen standen Rosenkohl und Buschbohne. Bei den M-Varianten wurde gesiebte Erde von einer Parzelle der Versuchsstation Möringen/Altmark mit 35-jährigem kontinuierlichem Spargelnachbau verwendet. Da in dieser Erde bei einem früheren Spargelsaatgutversuch ein Totalausfall erfolgte (GOTTWALD 1997a), wurde sie für die Untersuchungen 1997 im Verhältnis 1:1 mit der Zepernicker Erde gemischt (50% Z / 50% M). Im Versuchsjahr 1998 hingegen fand die Pflanzung in 'pure' Möringer Erde statt.


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3.1.1.2.  Pflanzmaterial und Mikroorganismenapplikation

Verwendet wurden einjährige, unbehandelte Spargelpflanzen der mittelfrühen männlichen Sorte 'Horlim F 1' aus holländischer Züchtung. Im Versuchsjahr 1997 wurde das Pflanzmaterial von einem Jungpflanzenbetrieb in der Peripherie von Berlin (Klaistow) geliefert; 1998 stammten die Pflanzen aus eigener Anzucht der Versuchsstation Zepernick, von einer Fläche ohne vorangegangenen Spargelanbau. Da es sich bei Spargeljungpflanzen um äußerlich relativ inhomogenes Material handelt, wurden vor der Pflanzung die einzelnen Rhizomgewichte erfasst, um den Zuwachs an Frischmasse in Gramm zu Versuchsende ermitteln zu können.

Die Rhizombakterisierung erfolgte 1997 als Tauchbehandlung mit einem Titer von 2x107 cfu/ml. Die für jeweils 5 Liter Tauchlösung benötigten Quanta der Bacillus subtilis-Granulate wurden 30 min in 100 ml temperiertem Wasser (60°C) aktiviert. Um eine homogene Auflösung der zum Teil schwer löslichen Granulate zu gewährleisten, wurden die Suspensionen mittels Magnetfisch kontinuierlich gerührt. Nach der Aktivierungsphase wurden die 100 ml B. subtilis-Konzentrate in Plastikschalen mit Leitungswasser auf 5 l verdünnt.

Die entsprechende Menge Kulturlösung von Bacillus pumilus RK13 und Streptomyces graminofaciens N6 wurde abpipettiert und unmittelbar in 5 l Wasser eingerührt. Anschließend erfolgte, unter gelegentlichem Rühren, eine 15-minütige Tauchung der Spargelrhizome. Es wurden immer 10 Rhizome (jeweils 5 für die entsprechenden Z- und M-Varianten) in 5 l Lösung getaucht. Nach 10-minütiger natürlicher Lufttrocknung auf einem Gitter wurden die Mitscherlichgefäße bepflanzt und in den Folienhäusern aufgestellt.

Im Versuchsjahr 1998 wurde das Applikationsverfahren nach JUNGE (1998) modifiziert und jeweils 10 Rhizome pro Variante mit 150 ml Mikroorganismenlösung besprüht. Hierfür wurden die entsprechenden Quanta B. subtilis-Granulate abgewogen und in 150 ml temperiertem Wasser wie oben beschrieben aktiviert. Nach Abkühlung auf ca. 30° C erfolgte eine gründliche Benetzung der Rhizome mit einem elektrischen Handsprühgerät (Typ Gloria) und ein sofortiges Bepflanzen der Mitscherlichgefäße. Der Vorteil dieser Anwendung liegt in einer effektiveren Nutzung durch wesentlich geringere Abtropfverluste, Mittel- und Zeitersparnis, da die Rücktrocknung entfällt. Vor jeder Applikation eines anderen B. subtilis-Stammes wurde das Sprühgerät mit heißem Leitungswasser und Bürsten gründlich gereinigt.


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3.1.1.3.  Kulturführung 1997 und 1998

Die Kulturdauer betrug in beiden Versuchsjahren 19 Wochen und erstreckte sich von Ende April bis Mitte September. Die Bewässerung erfolgte manuell, je nach Bedarf (Einstichtensiometer, Fa. Tensio-Tech, Geisenheim), in der Regel alle 2 Tage; zunächst mit 250 ml, mit zunehmendem Wachstum 400-500 ml pro Gefäß. Um Verdichtungen im Oberboden zu vermeiden, wurde einige Stunden nach dem Gießen die Bodenoberfläche vorsichtig gelockert. Im 14-tägigen Rhythmus wurde mit Flüssigvolldünger Wuxal Super (0,2%) gedüngt (Anhang 1). Im Juni und Juli erfolgte jeweils eine Insektizidspritzung mit Spruzit (Pyrethrum) 0,1%-ig gegen Spargelkäfer, 1998 wegen Blattlausauftretens zusätzlich eine Pirimorbehandlung (50% Pirimicarb) in einer Konzentration von 0,05% Ende Juli.

Nach Versuchsende wurden die Wachstumsparameter Wurzelfrischmasse [g] und Wurzeltrockensubstanz [%] erfasst und zusätzlich Wurzelsegmente für phytopathologische Untersuchungen aufbereitet.

3.1.2. Untersuchungen zur Pathogenität der verwendeten Fusarium-Isolate

3.1.2.1. Anzucht der Versuchspflanzen

Die Anzucht der Spargelpflanzen erfolgte im Gewächshaus bei 20° bis 22° C Tag- und 17° bis 18° C Nachttemperatur und Zusatzbelichtung (14 h, ca. 4600 lux) in gedämpfter Einheitserde Typ P. Ungebeitztes Saatgut der Sorte 'Backlim F1' wurde in desinfizierten (Didecyl-dimethylammonium-chlorid, 1%-ig) Quickpot-Standardplatten mit einer Einzeltopfgröße von 38 x 38 x 75 mm (ca. 75 cm3) ausgesät. Die Töpfe wurden nach Bedarf gewässert und nach Entfaltung der Phyllokladien erfolgte eine Düngung mit Wuxal Super flüssig (0,1%). Nach 6 Wochen waren die Einzeltöpfe durchwurzelt und die Pflanzen standen für die Infektionsversuche zur Verfügung.

3.1.2.2. Inokulumgewinnung

Die eingesetzten Fusarium-Erreger wurden von symptomatischen Spargelpflanzen (Triebwelke, Nekrosen an der Triebbasis unter der Bodenoberfläche) aus dem Jungpflanzenversuch (F. oxysporum), von faulen Rhizomen der M-Varianten des in Kapitel 3.1.1 beschriebenen Gefäßversuches (F. proliferatum, F. culmorum) und von den Bodenproben aus Möringen (F. acuminatum) isoliert. Die Pflanzenprobenahme erfolgte im Oktober bzw. zum Ende des [Seite 48↓]Gefäßversuches im September. Die Proben wurden alle für die mikroskopische Untersuchung aufbereitet (siehe Kapitel 3.3.3). Die so determinierten Fusarium spp. wurden jeweils auf SNA+- und PDA-Petrischalen abisoliert und bis zur Inokulation bei 4° C in Alufolie versiegelt 6 Tage in der Kühlzelle aufbewahrt.

3.1.2.3. Inokulumapplikation

In der Literatur werden eine ganze Reihe verschiedener Modi zur Applikationstechnik phytopathogener Pilze angeführt (NIENHAUS 1969, NIERENBERG 1976, MÜHLE et al 1983, MIEDANER 1997). GOTH und JOHNSTON (1979) verwendeten in Pathogenitätstests mit Fusarium moniliforme und Fusarium oxysporum an Spargel als Inokulumträger Roggenkörner, die direkt in eine gesetzte Wunde in den Stängel plaziert wurden. WACKER et al. (1990), SMITH et al. (1990), und ARRIOLA (2000) setzten Hirsekörner, ELSON et al. (1994) und DUMROESE et al. (1998) Grassamen (Festuca rubra bzw. Lolium perenne) als Inokulumvehikel bei Substratapplikation ein. Im Institut für Phytomedizin der Humboldt Universität Berlin haben sich Weizenkörner als Inokulumträger für verschiedene Fusarium spp. gut bewährt (GOSSMANN 2000a) und wurden auch in dieser Arbeit für die Pathogenitätsversuche bei Spargel verwendet.

Pro 300 ml Erlenmeyerkolben wurden 50 g Weizenkörner mit 50 ml Leitungswasser versetzt und zweimal autoklaviert. Nach dem Abkühlen erhielten jeweils 2 Kolben ein mit dem Korkbohrer ausgestanztes, ca.5 mm2 großes, mit Mycel bewachsenes PDA-Fragment des entsprechenden Fusarium-Isolates. Die Körner der Kontrollvariante wurden nicht beimpft. Nach 10 Tagen Inkubationszeit und regelmäßigem Schütteln im Brutschrank bei 20° C unter UV-Bestrahlung mit einer Hell- und Dunkelphase im Wechsel (14h/10h) waren die behandelten Weizenkörner stark verpilzt (Mycelbildung). Anschließend wurden die Kolben bis zur Substratkontaminierung in der Kühlzelle 10 Tage bei 4° C aufbewahrt.

Beim Pikieren der 6 Wochen alten Sämlinge in 10 cm Töpfe wurde das Inokulum im Volumenverhältnis 1:10 in das Substrat eingebracht. Um eine Infektion zu provozieren, erhielten die Wurzelspitzen während des Pikierens ein Verletzung durch einen minimalen Rückschnitt mit einer Schere. Die Kontrollvariante wurde analog mit nichtinfiziertem Weizen behandelt. Der Versuchsumfang betrug 10 Gefäße bzw. Pflanzen je Variante. Die Weiterkultur erfolgte nach Varianten getrennt unter Gewächshausbedingungen (s.o.). Insgesamt umfasste der Versuch also 5 Varianten, nämlich die Kontrolle und die vier Fusariumarten F. oxysporum, [Seite 49↓] F. proliferatum, F. culmorum und F. acuminatum. Nach 6 Wochen erfolgte ein Umtopfen mit dem gesamten Wurzelballen in 13-er Töpfe. Beim Pikieren und Umtopfen wurde gedämpfte Einheitserde Typ P und desinfizierte Plastiktöpfe verwendet. Die Pflanzen wurden je nach Bedarf gewässert und wöchentlich mit Wuxal-Super flüssig 0,1%-ig gedüngt. Die Kulturdauer nach Substratinokulation belief sich auf insgesamt 12 Wochen. Am Ende des Versuches wurden die Parameter Trieb- und Wurzelfrischmasse [g] erfasst.

3.1.3. Prüfung präinfektioneller Bakterienbehandlungen auf die Pflanzen­­-entwicklung

Um Aussagen über den Einfluss von speziellen Rhizosphärenbakterien auf das Pflanzenwachstum bei definiertem Erregerdruck treffen zu können, wurden zwei Modellversuche angelegt, die zum einen den bereits am Markt erhältlichen Bacillus subtilis Stamm FZB24 (® Bayer Vital GmbH & Co KG) im Zusammentreffen mit im Spargelanbau wichtigen Fusariumarten und zum anderen auch weitere potentielle Rhizosphärenbakterien im Einsatz gegen die in Europa häufigste Fusariumart, F. oxysporum, untersuchen sollten. Die Anzucht und Aufbereitung der geprüften Mikroorganismen erfolgte durch die FZB-Biotechnik GmbH Berlin. Diese Versuche wurden im Gewächshaus bei ca. 20-22° C Tag- und 17-18° C Nachttemperatur sowie Zusatzbeleuchtung (14 h, 4600 lux) durchgeführt. Alle verwendeten Substrate wurden im Sterilo gedämpft, die Gefäße in einer Didecyl-dimethylammoniom-chlorid-Lösung (1%) desinfiziert und anschließend mehrmals mit klarem Wasser gespült. Die Bewässerung erfolgte je nach Bedarf alle 1-2 Tage, nach Entfaltung der Phyllokladien wurde wöchentlich mit Wuxal Super flüssig gedüngt (0,1%).

3.1.3.1. Einsatz von Bacillus subtilis FZB24 gegen spezielle pathogenrelevante Fusarium spp.

3.1.3.1.1. Anzucht und Bakterisierung der Versuchspflanzen

Unmittelbar vor der Aussaat erfolgte eine Samenbehandlung mit Bacillus subilis FZB24 als Naßbeizung im Tauchverfahren mit einer Sporendichte von 2x108 cfu/ml. Das entsprechende Quantum Bacillus subtilis-Granulat wurde in 100 ml temperiertem aqua dest. (60° C) unter kontinuierlichem Rühren 30 min aktiviert. Nach Abkühlung auf ca. 30° C wurden 100 Körner ungebeiztes Spargelsaatgut ('Backlim F1') in dieser Lösung unter gelegentlichem Umrühren 20 min getaucht. Nach 15-minütiger Rücktrocknung in der Laminarbox auf feinmaschigem Gazegewebe wurde in Quickpot-Standardplatten in gedämpfte Einheitserde Typ P gesät. Nach [Seite 50↓]7 Wochen erfolgte eine zweite Bacillus subtilis FZB24-Applikation im Gießverfahren mit 25 ml Sporenlösung (2x107 cfu/ml) pro Einzeltopf. Die Kulturdauer bis zur Inokolation mit den Fusarium-Isolaten betrug 9 Wochen.

3.1.3.1.2. Inokulumapplikation

Für die Inokulation wurden wieder, wie in Kapitel 3.1.2.3 beschrieben, infizierte Weizenkörner verwendet, die beim Überführen der Spargelsämlinge aus den Multitopfplatten in die 13-er Endtöpfe dem Substrat beigemischt wurden. Das Verhältnis Inokulum:Substrat betrug wieder 1:10. Die eingesetzten Erreger waren F. oxysporum, F. culmorum und F. proliferatum (Kap. 3.1.2.2) in jeweils 15 Gefäßen. Die Gefäße der Kontrollpflanzen wurden mit den nichtinfizierten Weizenkörnern behandelt. Die Weiterkultur erfolgte nach Varianten getrennt im Gewächshaus. Nach 16 Wochen wurden die Frisch- und Trockenmassen [g] der Triebe und Wurzeln erfasst.

3.1.3.2. Prüfung potentieller Fusarium-Antagonisten im Pathosystem Asparagus officinalis-Fusarium oxysporum f. sp. asparagi

3.1.3.2.1. Anzucht und Bakterisierung der Versuchspflanzen

Vor der Aussaat ('Backlim F1' ungebeizt) erfolgte die Bakterisierung der Saatkörner im Tauchverfahren analog zu dem in Kapitel 3.1.3.1.1 beschriebenen Versuch. Die applizierten Mikroorganismen waren die drei Bacillus subtilis-Stämme FZB24, FZB42 und FZB37, Bacillus pumilus RK 13 und Streptomyces graminofaciens N 6. Je Variante wurden 30 Körner in 50 ml Sporenlösung getaucht. Das Saatgut der Kontrolle wurde nur mit temperiertem Aqua dest. behandelt. Die Aussaat erfolgte nach Varianten getrennt in Einheitserde Typ P in Quickpot Standardplatten. Nach 8 Wochen erfolgte ein Gießen der Pflanzen mit den entsprechenden Mikroorganismen-Lösungen. Jeder Topf erhielt 25 ml Sporenlösung mit einem Titer von 2x107 cfu/ml. Nach 9 Wochen erfolgte das Umtopfen von 20 Spargelsämlingen pro Variante mit dem gesamten Wurzelballen in 13-er Töpfe in gedämpfte Komposterde. Anschließend wurden die Pflanzen in einer begehbaren Klimazelle von HERAEUS VÖTSCH, Typ TSI 1.52 mit computergesteuertem Klimaprogramm, nach Varianten getrennt, auf Rolltischen aufgestellt. Die Luftfeuchtigkeit lag bei 75 %, Tag-/Nachttemperatur bei 20° C bzw. 16° C; nach ca. 4 Wochen modifiziert auf 25° C bzw. 18° C. Die Belichtung betrug während der 12 Std. Tag[Seite 51↓]zeit ca. 16.000 lux; jeweils morgens und abends erfolgte 1 Stunde Dämmerung mit entsprechend adaptiertem Temperaturanstieg bzw. -abstieg.

3.1.3.2.2. Inokulumgewinnung und Applikation

Ausgangsmaterial für die Inokulumgewinnung war das Fusarium oxysporum-Isolat aus dem Pathogenitätsversuch (Kap. 3.1.2.2). Diesmal wurde das Inokulum jedoch in einer Schüttelkultur angezogen und als Flüssigmedium den Pflanzen zugeführt.

Acht Tage vor Herstellung der Schüttelkultur wurde das oben genannte Isolat, das auf PDA- und SNA+-Agar in der Kühlzelle bei 4° C lagerte, auf eigens entwickeltem Spargelagar überimpft und bei 20° C und Wechsel-UV im Brutschrank inkubiert. Für das Flüssigmedium und den Spargelagar wurden 150 g tiefgefrorener Spargel in 500 ml destilliertem Wasser 15 min lang gekocht. Dann wurde die Flüssigkeit dekantiert und mit 5 g Glucose und destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und mit einer 1 n HCL –Lösung auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,0 eingestellt. Anschließend kamen die Kolben für ca. 15 min in den Autoklav. Für die Verwendung als Festmedium wurden vor dem Autoklavieren der Agar eingerührt und nach Abkühlung auf ca. 55° C noch 150 ppm Streptomycin zugefügt.

Von dem Flüssigmedium für die Schüttelkultur wurden jeweils 100 ml Flüssigkeit in 200 ml Rundkolben gefüllt und mit jeweils 2 bewachsenen Agarstückchen (ca. 5 mm2 ) belegt. Die Inkubation erfolgte im Schüttler bei Zimmertemperatur (ca. 18-20° C), natürlichem Tag-Nachtrhythmus und 115 Bewegungen pro Minute. Nach 7 Tagen hatten sich massenhaft Mikrokonidien gebildet. Nach Auszählung in der Thomakammer wurde ein Titer von 4x106 cfu/ml eingestellt und die Sporenlösung in der Kühlzelle bei 4° C bis zur Applikation gelagert. Nach drei Tagen erfolgte die Inokulation mit 100 ml Sporenlösung pro Topf. Die Versuchsdauer nach Infektion mit Fusarium oxysporum betrug weitere 9 Wochen. Die Pflanzen wurden in der Regel alle 2 Tage gewässert und einmal wöchentlich mit Wuxal Super flüssig gedüngt (0,1%). Bei Versuchsende erfolgte die Erfassung der Prüfmerkmale Triebfrisch- und Triebtrockenmasse [g] und Wurzelfrisch- und Wurzeltrockenmasse [g].

Da Fusarium oxysporum als Trachaeomykose auch das Gefäßsystem besiedeln kann, wurden zusätzlich von 5 Pflanzen pro Variante von allen Trieben und von jeweils 10 Wurzeln, insgesamt 30-40 Triebe bzw. 50 Wurzeln pro Variante, Längsschnitte angefertigt und mit dem Binokular auf nekrotische Veränderungen hin untersucht, um eine eventuelle Korrelation zwischen der Länge der Verbräunung und der Infektionsintensität, wie von JOHNSTON et al. [Seite 52↓](1979) bei Spargel und BOCHOW (1992) und BOCHOW und DUGASSA GOBENA (1992) bei Tomaten beschrieben, zu ermitteln.

3.2. Parzellenfeldversuche

3.2.1. Standortbedingungen

Die Freilandversuche wurden auf den Flächen der Versuchsstation des Institutes für Gartenbauwissenschaften der Humboldt-Universität zu Berlin, Fachgebiet Gemüsebau, in Zepernick durchgeführt. Der Standort liegt 60 m über NN in der nördlichen Peripherie von Berlin im maritim beeinflussten Binnentiefland des Raumes Berlin-Brandenburg. Das langjährige Niederschlagsmittel (1901-1950) liegt bei 575 mm, das der Temperatur bei 8,6° C. Es herrschen überwiegend westliche Winde.

Der Versuchsstandort ist als D 3 a – Standort (Sickerwasser bestimmte Tieflehme und Sande) charakterisiert, mit einer Ackerzahl zwischen 27 und 31. Es dominiert eine Sandtieflehm-Fahlerde, durchsetzt mit Sand-Rosterde (20%). Der Boden ist als Sl 4 D, z. T. auch S 4 D klassifiziert und weist das in Tab. 2 dargestellte Profil auf.

Tab. 2: Bodenprofil des Versuchstandortes Berlin- Zepernick.

Horizont

Tiefe (cm)

Kennzeichen

Ap

0 – 30

dunkelbrauner, schwachhumoser Sand, Bröckelgefüge

BSV/Et

> 30 – 60

hellgelblichbrauner, nach unten zunehmend fahlgrauer Sand, Einzelkorngefüge

Bt

> 60 – 140

graubrauner Sand mit rotbraunen Lehmschleiern

Cc

> 140

Geschiebemergel


Die bodenchemischen Eigenschaften der Versuchsflächen sind der Tab. 3 und Tab. 4 zu entnehmen. Die Nährstoffversorgung lag in beiden Versuchsflächen auf mittlerem bis hohem Niveau. Die im ersten Versuchsjahr in dem Jungpflanzenversuch niedrigen Kalium- und Magnesiumwerte konnten durch Düngungsmaßnahmen gesteigert werden. Auffallend waren die sehr hohen Phosphorgehalte in allen Parzellen. Die Bodenreaktionen lagen im oberen pH-Bereich. Der Kohlenstoffgehalt war durch die zu Versuchsbeginn eingebrachte organische Substanz recht hoch, baute sich im Laufe des Versuchszeitraumes, wie im Spargelanbau oft beobachtet (KAUFMANN und KAUFMANN 1967, HARTMANN 1989), sukzessive ab. Die Sorptionsfähigkeit wurde mit 3,8 mval/100g Boden ermittelt.


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Tab. 3: Bodenchemische Eigenschaften des Versuchsstandortes Zepernick, Parzelle Jungpflanzen­versuch.

Versuchsjahr

Horizont

pH-Wert

Ct (%)

Nährstoffgehalte mg/100g Boden

K2O / Mg / P2O5

1997

1998

1999

1997

1998

1999

1997

1998

1999

0-30 cm

7

6,6

7,1

1,5

1,6

1,3

9

4,8

42

12

6,2

37

18

n.b.

39

>30-60 cm

6,9

6,4

7,1

0,8

0,9

0,3

7

2,3

23

9

3

19

15

n.b.

20

>60-90 cm

7,7

7,2

6,8

0,3

0,2

0,1

7

2

10

7

1,9

11

11

n.b.

8

Tab. 4: Bodenchemische Eigenschaften des Versuchsstandortes Zepernick, Parzellen Aussatversuch.

Versuchsjahr

Horizont

pH-Wert

Ct (%)

Nährstoffgehalte mg/100g Boden

K2O / Mg / P2O5

1997

1998

1997

1998

1997

1998

0-30 cm

6,6

6,2

2

1,7

26

9,7

56

11

6

42

>30-60 cm

6,4

6,1

1,2

0,6

12

5,3

31

7

3,4

26


Die Effektivität von Mikroorganismenapplikationen korrelliert eng mit ökologischen Faktoren (BURPEE 1990) und kann im Freiland starken Schwankungen unterliegen. Deshalb wurden wichtige Witterungsparameter erfasst.

Die Klimadaten während des Versuchszeitraumes wurden von der meteorologischen Meßstation des Institutes für Pflanzenbau der Humboldt-Universität Berlin in Blumberg, unweit von Zepernick entfernt, erfasst. Die Abbildungen 2 bis 7 zeigen die Tagesmittelwerte während der Hauptentwicklunssphase des Spargels für die Parameter Bodentemperatur und Niederschlag in den Versuchsjahren 1997-1999 bzw. die Monatsmittelwerte der Temperatur und des Niederschlags im Vergleich zum langjährigen Mittel (1961-1990).

Im Versuchsjahr 1997 zeigte die Temperaturkurve der Monatsmittel während der Vegetationsphase bis auf den August mit fast 21° C nur geringfügige Abweichungen vom langjährigen Mittel (Abb. 2). Außer Juli, mit extrem hohen Niederschlägen über 100 mm, war der Zeitraum März bis Oktober generell geprägt durch relativ geringe Niederschlagsmengen und mit einem deutlichen Minimum im September, zur Zeit der Reservestoffeinlagerung des Spargels in das Rhizom. Zum Zeitpunkt der Pflanzung und Aussaat Ende April war es verhältnismäßig kühl. Die Bodentemperaturen erreichten erst ab Mitte Mai Werte über 15° C und damit für Wachstum und Rhizosphärenkolonisierung der Bakterien günstige Bedingungen (KIM et al. 1997, ZIMMER et al. 1997, GANTCHEVA 1993), fielen jedoch gegen Ende des Monats stark zurück und lagen dann wieder ab Anfang Juni bis Anfang Spetember, bis auf wenige Extremtage, im Bereich um 20° C und mehr (Abb. 3) und entsprachen damit erst relativ spät[Seite 54↓] dem von GUPTA und UTKHEDE (1986) für ein maximales Wachstum von Bacillus subtilis ermittelten Temperaturbereich. Im August waren die Bodentemperaturen dann auch während mehrerer Tage konstant über 25° C.

Abb. 2: Monatsmittelwerte der Lufttemperatur und des Niederschlages im Versuchsjahr 1997 in Relation zum langjährigen Mittel (1961-1990).

Abb. 3: Tagesmittelwerte der Bodentemperaturen und Tageswerte des Niederschlages in der Hauptentwicklungsphase des Spargels (Aussaat bzw. Pflanzung bis Ende September) 1997. Die gekennzeichneten Niederschlagssäulen stellen die Bewässerungsgaben in den Versuchsparzellen dar. * = Aussaatversuch, ° = Jungpflanzenversuch.

1998 war gekennzeichnet durch relativ milde Frühjahrsmonate, die einem bereits moderatem Winter folgten (Abb.4). Die Lufttemperaturen im Juli und August aber lagen unter dem langjährigem Mittel und waren v. a. im August deutlich kühler als im Vorjahr. Analog hierzu entwickelten sich die Bodentemperaturen. In den Horizonten 5 cm und 20 cm erreichten die Temperaturen bereits Ende April Werte über 15° C (Abb. 5). Anfang Juli und Ende August waren längere Intervalle mit auffallend niedrigen Temperaturen zu verzeichnen.

Abb. 4: Monatsmittelwerte der Lufttemperatur und des Niederschlages im Versuchsjahr 1998 in Relation zum langjährigen Mittel.


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Abb. 5: Tagesmittelwerte der Bodentemperaturen und Tageswerte des Niederschlages in der Hauptentwicklungsphase des Spargels 1998. Die gekennzeichneten Niederschlagssäulen stellen die Bewässerungsgaben in den Versuchsparzellen dar.* = Aussaatversuch, ° = Jungpflanzenversuch.

Zu Beginn des Hauptwachstums im Mai regnete es extrem wenig, während in den Folgemonaten Juni und Juli überdurchschnittlich viele, im August und September jedoch wieder geringere Niederschläge zu verzeichnen waren (Abb. 5). Ein Extremmonat mit über 100 mm Wassersäule war der Oktober.

Die Monatswerte der Lufttemperaturen lagen im Versuchsjahr 1999 tendenziell über dem langjährigen Mittel (Abb. 6). Das Frühjahr war ähnlich mild wie 1998, die Sommermonate jedoch wesentlich wärmer. Die Bodentemperaturen überschritten 15° C-Werte aufgrund kühler Witterung in der letzten Aprilwoche allerdings erst Ende Mai (Abb. 7).


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Abb. 6: Monatsmittelwerte der Lufttemperatur und des Niederschlages im Versuchsjahr 1999 in Relation zum langjährigen Mittel.

Abb. 7: Tagesmittelwerte der Bodentemperaturen und Tageswerte des Niederschlages in der Haupt­entwicklungsphase des Spargels 1999. Die gekennzeichneten Niederschlagssäulen stellen die einzelnen Bewässerungstermine in den Versuchsparzellen dar. * = Aussaatversuch, ° = Jungpflanzenversuch.


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3.2.2.  Beschreibung der Prüfglieder

In den Freilandversuchen kamen neben den in Kap. 3.1.1.1 vorgestellten Rhizosphärenbakterien BS-FZB24, BS-FZB42, BS-FZB37, BP-RK13, SG-N6 noch das Pflanzenstärkungsmittel Goemar Fruton Spezial (GFS) zum Einsatz. GFS ist ein Pflanzenstärkungsmittel auf der Basis einer zellulosefreien Algencreme, die in einem schonenden Herstellungsverfahren aus der Braunalge Ascophyllum nodosum gewonnen und über die Blätter appliziert wird. Es enthält 4% N, 3,5% MgO, 1,7% Bor und 0,2% Molybdän sowie Spuren von Pflanzenhormonen wie Auxine, Gibbereline und Cytokinine, wichtige Aminosäuren wie Dicarboxylsäuren (Glutamin- und Asparaginsäure), Monocarboxylsäuren (Alanin, Leucin, Glycin, Valin) und Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin (AUGIER und SANTIMONE 1978) und Vitamine (B1, B2, B12, C, D, E, Folsäure, Pantothensäure u. a.). Die in GFS enthaltenen Oligosaccharide (ß-1,3,6-Glucan) haben eine Elicitor-Wirkung, die die Enzymaktivität, wie z. B. a-Amylase, fördern. Nach GFS-Behandlungen konnte laut technischer Produktinformation des Herstellers Goemar (Laboratoires Goemar, St. Malo, Frankreich) ein erhöhter Polyamingehalt in den Pflanzen registriert werden, was sich in einer Wachstumsförderung, Stress- und Seneszenskompensation äußerte. Desweiteren wird hier eine durch GFS verursachte Optimierung von Nährstoffaufnahme, -transport und -verwertung vor allem in den meristematischen Zellen beschrieben.

Außer BS-FZB37 wurden zusätzlich alle Rhizosphärenbakterien auch als Varianten in Kombination mit GFS-Applikationen während der Vegetationsperiode geprüft, um eventuelle synergistische Auswirkungen zu untersuchen. Insgesamt erfolgte also mit der Kontrolle die Prüfung von 11 Varianten (Tab. 5).

Tab. 5: Aufstellung der in den Spargelfreilandversuchen (Jungpflanzen-/Aussaatversuch) geprüften Varianten.

Variante

Bezeichnung

Beschreibung

1

Kontrolle

Leitungswasser

2

BS-FZB24

Bacillus subtilis Stamm FZB24

3

BS-FZB42

Bacillus subtilis Stamm FZB42

4

BS-FZB37

Bacillus subtilis Stamm FZB37

5

BP-RK13

Bacillus pumilus Stamm RK13

6

SG-N6

Streptomyces graminofaciens Stamm N6

7

GFS

Algenpräparat Goemar Fruton Spezial

8

GFS+BS-FZB24

Bacillus subtilis Stamm FZB24 + Goemar Fruton Spezial

9

GFS+BS-FZB42

Bacillus subtilis Stamm FZB42 + Goemar Fruton Spezial

10

GFS+BP-RK13

Bacillus pumilus Stamm RK13 + Goemar Fruton Spezial

11

GFS+SG-N6

Streptomyces graminofaciens Stamm N6 + Goemar Fruton Spezial

  

 


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3.2.3.  Jungpflanzenversuch

Der über drei Jahre geführte Versuch wurde im März 1997 als Bleichspargelkultur in einer randomisierten Blockanlage mit 4 Wiederholungen und einer Gesamtfläche von 560 qm angelegt. Die Pflanzgräben waren 6 m lang, 30 cm tief und 40 cm breit; je Wiederholung wurden 15 Pflanzen pro Variante verwendet. Der Reihenabstand betrug 1,60 m, der Pflanzenabstand 40 cm. Zwischen den Reihen war während der Vegetationszeit schwarzes Mulchgewebe (50 g/qm) ausgelegt. Auf diesem Standort wurde in den vergangenen 10 Jahren kein Spargel angebaut; als Vorfrucht stand Rosenkohl.

3.2.3.1. Pflanzmaterial und Mikroorganismenapplikation

Verwendet wurden einjährige, unbehandelte Spargelpflanzen der mittelfrühen, männlichen Sorte "Horlim F 1". Es handelt sich um eine holländische Züchtung mit mittelhohem bis hohem Ertrag und dicken, besonders weißen Stangen. Die Qualität der verwendeten Jungpflanzen lag im Durchschnitt bei 56 g Einzelgewicht, mit 25 Speicherwurzeln und 7 gut entwickelten Triebknospen und entsprach damit den praxisüblichen Anforderungen (FRITZ und STOLZ 1989, HARTMANN 1989). Die Pflanzen stammten von einem Jungpflanzenproduzenten in Klaistow, ca. 60 km südwestlich von Berlin.

Die Mikroorganismenapplikation erfolgte analog dem in Kapitel 3.1.1.2 beschriebenen Modus als Tauchbehandlung mit einem Titer von 2 x 107 cfu/ml. Die Kontrollpflanzen wurden in Leitungswasser getaucht. Da die GFS-Spritzungen erst nach Entwicklung einer angemessenen Benetzungsfläche (Entfaltung der Phyllokladien) einsetzten, erhielten zunächst alle Varianten nur die entsprechende Bakterienbehandlung. Es wurden immer 30 Pflanzen je Wiederholung in 10 l Mikroorganismen-Lösung getaucht. Nach 10-minütiger Lufttrocknung wurde in die Gräben gepflanzt und die Pflanzen bis ca. 5 cm über die Krone mit Boden bedeckt. Wegen der relativ starken Verschmutzung wurde nach jeder Wiederholung die Tauchlösung erneuert.

In populationsdynamischen Untersuchungen konnte bei applizierten Rhizosphärenbakterien ein kontinuierlicher Rückgang der Bakteriendichte in der Rhizosphäre festgestellt werden (JUHNKE et al. 1982, ZEINAT 1982, FEY 1992). Im 2. und 3. Versuchs­jahr erfolgte deshalb jeweils im Juli eine Mikroorganismenbehandlung im Gießverfahren mit einem Aufwand von 1,5 l /lfm bei einer Sporendichte der Suspension von 2 x 107 cfu/ml.


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3.2.3.2.  Kulturführung 1997 bis 1999

Die während der Versuchsdauer durchgeführten Kulturmaßnahmen sind in den Tabellen 6 bis 8 dargestellt. Da eine Beeinflussung der eingesetzten Mikroorganismen durch Herbizide nicht auszuschließen ist, erfolgte die Unkrautbekämpfung in den Reihen manuell und zwischen den Reihen und auf den Wegen mechanisch. Vor der Gießbehandlung wurde die Bodenoberfläche vorsichtig gelockert, um ein optimales Eindringen der Sporenlösungen zu erreichen.

Zur Vermeidung unerwünschter Abdrift auf Nachbarreihen kamen bei der Applikation des Algenpräparates Goemar Fruton Spezial (GFS) zwei 6 m x 2 m Spritzschirme zum Einsatz. Die Ausbringung erfolgte in der Regel am frühen Morgen mit einer Pflanzenschutz-Spritze GLORIA Typ Perfekt 3531 unter maximaler Druckausnutzung, um eine gute Benetzung auch der inneren Phyllokladien zu erreichen. Die Bewässerung erfolgte tensiometerorientiert in den Reihen. Es wurden Einstich-Tensiometer mit Druckmeßgerät der Fa. Tensio Technik, Geisenheim verwendet.

Tab. 6: Aufstellung der wichtigsten Kulturmaßnahmen im Spargel-Jungpflanzenversuch 1997.

Termin

Kulturmaßnahme

Bemerkungen

07.04.

Bodenproben gezogen

20 Entnahmestellen, 3 Horizonte bis 90 cm, pH-Wert- und Nährstoffbestimmung

08.04. bis

15.04.

Gräben für Bleichspargelkultur angelegt

Graben 30 cm x 40 cm

23.04.

23.04./24.04.

Organische Düngung

Pflanzung

Kompost (Anhang 2), 3 cm Schicht auf die Grabensohle
Rhizomtauchung in Bakteriensuspension

30.05.

Mineralische Düngung

60 kg N/ha,120 kg K/ha, 30 kg Mg/ha,

02.06.

Insektizid-Spritzung

E 605 Kombi (Parathion), 600 ml/ha

03.06.

Gräben mit Boden aufgefüllt

Erhöhung der Standfestigkeit

Juni-September

Bewässerung

insgesamt 78 mm

14.06./16.07. 21.08./11.09.

Spritzungen mit Goemar Fruton Spezial

jeweils 3 l/ha

18.06.

Mulchen

Bodenbedeckung zwischen den Reihen mit schwarzem Vliesgewebe (50g/qm)

23.06./20.08.

11.09.

Unkrautbekämpfung

in den Reihen manuell, auf den Wegen gehackt

02.07.

Mineralische Düngung

55 kg K/ha, 18 kg Mg/ha

09.07.

Insektizid- und Fungizidspritzung

Neudosan 0,2%, Polyram Combi 0,2%

20.07.

Insektizidspritzung

Spruzit (Pyrethrum) 0,1%

22.08.

Fungizidspritzung

Phytox-Super 1,2 kg/ha

14.10.

Triebschnitt

Erfassung Wachstumsparameter

20.11.

Vlies entfernt

 


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Tab. 7: Aufstellung der wichtigsten Kulturmaßnahmen im Spargel-Jungpflanzenversuch 1998.

Termin

Kulturmaßnahme

Bemerkungen

23.03./14.05.15.06./04.08.

Unkrautbekämpfung

wie 1997

16.04.

30.04.

Bodenproben gezogen

Mineralische Düngung

wie 1997

55 kg N/ha, 120 kg K/ha, 30 kg Mg/ha

17.05.

Gräben mit Boden gefüllt

 

Mai-September

Bewässerung

insgesamt 72 mm

05.05.

Insektizidspritzung

E 605 Kombi (Parathion) 600 ml/ha

13.05.

Mulchen

wie 1997

13.06.

Insektizidspritzung

Spruzit (Pyrethrum) 0,1%

14.06./20.07.

08.08./11.09.

Spritzungen Goemar Fruton Spezial

jeweils 3 l/ha

30.06.

Mineralische Düngung

40 kg N/ha, 6 kg P/ha, 40 kg K/ha, 12 kg Mg/ha

05.07.

Bakterienapplikation

Gießverfahren, 1,5 l/lfm

17.07.

Fungizidspritzung

Bardos, 1l/ha

13.08.

Fungizidspritzung und Mg-Blattdüngung

Polyram Combi 0,2%, Wuxal Super + Bittersalz 1%

14.09.

Fungizidspritzung und Mg -Blattdüngung

Euparen 1 kg/ha + Bittersalz 1%

13.11

Triebschnitt

wie 1997

Tab. 8: Aufstellung der wichtigsten Kulturmaßnahmen im Spargel-Jungpflanzenversuch 1999.

Termin

Kulturmaßnahme

Bemerkungen

22.02.

Stummelhacken

Entfernung der restlichen Sproßteile

10.03.

Bodenprobe gezogen

wie 1998

20.03.

Entfernung Vliesgewebe

 

25.03.

Mineralische Düngung

45 kg N/ha, 75 kg K/ha, 18 kg Mg

07.04./19.05.-21.07.

Unkrautbekämpfung

wie 1997 und 1998

14.04.bis

17.04.

Aufdämmen der Anlage

manuell

27.04. bis 21.05.

Ernte

manuell, Spargelfrettchen, Messer

24.04.

Einebnen der Dämme

manuell

08.06.

Mineralische Düngung

35 kg N/ha, 100 kg K/ha, 30 kg Mg/ha

13.06.

Mulchen

wie 1997 und 1998

13.06./01.07.

09.08./03.09.

Spritzungen Goemar Fruton Spezial

jeweils 3 l/ha

Juni-Sept.

Bewässerung

insgesamt 74 mm

22.07.

Mikroorganismenapplikation

Gießverfahren wie 1998

21.07.

Fungizidspritzung

Bardos 1l/ha

27.07.

Fungizidspritzung und Mg-Blattdüngung

Euparen 1kg/ha + Bittersalz 1%

13.08.

Fungizidspritzung

Polyram Combi 0,2%, Wuxal Super

14.09.

Fungizidspritzung und Mg-Blattdüngung

Euparen 1 kg/ha + Bittersalz 1%

27.09.

Triebschnitt

wie 1997

   


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3.2.4.  Aussaatversuche

Die Versuche wurden mit der Sorte 'Horlim F1' als randomisierte Blockanlage mit 4 Wiederholungen angelegt.

1997 hatte die Parzelle eine Gesamtfläche von 108 qm. Der Reihenabstand betrug 50 cm, der Pflanzenabstand 15 cm. Im Unter­suchungsjahr 1998 erfolgte die Versuchsdurchführung auf einer Gesamtfläche von 205 qm. Die Reihenabstände wurden auf 70 cm und die Pflanzenabstände in der Reihe auf 20 cm erhöht. Pro Wiederholung wurden 25 Samenkör­ner ausgelegt. Zwischen den einzelnen Reihen wurden 35 cm tiefe Kunststoffbänder eingelassen (Abb. 8). Durch die Schaffung solcher Kompartimente sollte die Wurzelrodung und Zuordnung der Wurzelmasse je Variante optimiert werden und einer möglichen horizontalen Bakteriendrift in Nachbarreihen entgegengewirkt werden.

Abb. 8: Schaffung von Wurzelkompartimenten durch eingelassene Kunststoffbänder (Pfeil).

Auf beiden Versuchsflächen wurde in der Vergangenheit kein Spargel angebaut; als Vorfrucht standen Buschbohne bzw. Phacelia. In einem Wartebeet auf gleicher Parzelle erfolgte in jedem Versuchsjahr parallel die Aussaat von 15 entsprechend behandelten Samen pro Variante, um Ausfälle nicht gekeimter Versuchspflanzen zu ergänzen. Die Keimfähigkeit des eingesetzten Saatgutes lag nach Aussagen der Vertriebsfirma (HILD) bei 87%.


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3.2.4.1.  Saatgutbehandlung

Die Saatgutbehandlung mit den Mikroorganismen wurde wie in Kap. 3.1.3.1 beschrieben als Naßbeizung im Tauchverfahren mit einem Titer von 2x108 cfu/ml durchgeführt. Die Tauchmenge für das erforderliche Saatgut je Variante betrug 100 ml. Nach natürlicher Rücktrocknung erfolgte die Aussaat als Einzelkornablage mit der Pinzette.

3.2.4.2. Kulturführung 1997 und 1998

Die wesentlichen Kulturmaßnahmen in den Jahren 1997 und 1998 sind in den Tabellen 9 und 10 dargestellt. Unkrautbekämpfungs- und GFS - Applikationsmodi waren analog dem Jungpflanzenversuch. Nach Ausbildung eines entsprechenden Wurzelsystems Anfang Juli wurden die Pflanzenreihen mit den zu prüfenden Mikroorganismen im Gießverfahren behandelt. (Abb. 9). Die Konzentration betrug 2 x 107 cfu/ml bei einer Aufwandmenge von 1 l pro lfm. Vor dem Gießen wurden auch hier die Reihen oberflächig gelockert, um ein gutes Eindringen der Rhizosphärenbakterien zu gewährleisten.

Abb. 9: Wurzelhabitus zum Zeitpunkt der Bakterien-Applikation.


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Tab. 9: Aufstellung der wichtigsten Kulturmaßnahmen im Spargelaussaatversuch 1997.

Termin

Kulturmaßnahme

Bemerkungen

07.04.

Bodenproben gezogen

Mischprobe aus 20 Entnahmestellen

Horizonte:0-30 cm / 30-60 cm,

pH-Wert und Nährsrtoffbestimmung

10.04.

Saatbeetvorbereitung

 

23.04.

Aussaat nach Mikroorganismenapplikation

Nassbeizung des Saatgutes
Titer: 2 x 108 cfu/ml

April-Sept.

Bewässerung

insgesamt 68 mm

14.06.

Mineralische Düngung

63 kg N/ha, 125 kg K/ha, 30 kg Mg/ha

01.07./17.07.

26.08./01.09.

05.07.

Spritzungen Goemar Fruton Spezial

Bakterienapplikation

jeweils 3 l/ha

Gießverfahren, 1l/lfm

17.07./11.08.

25.08./22.09.

Unkrautbekämpfung

in den Reihen manuell, zwischen den Reihen mechanisch

01.08

Insektizidspritzung

Spruzit (Pyrethrum), 0,1%

22.08.

Fungizidspritzung

Phytox Super, 1,2 kg/ha

05.09.

Fungizidspritzung

Polyram Combi, 0,2%

13.10.

Triebschnitt

Erfassung oberirdische Pflanzenmasse

19.02.98

Wurzelrodung

Erfassung Wurzelfrisch- und Trockenmasse

Tab. 10: Aufstellung der wichtigsten Kulturmaßnahmen im Spargel-Aussaatversuch 1998.

Termin

Kulturmaßnahme

Bemerkungen

20.03.

Bodenproben gezogen

wie 1997

15.04.

Mineralische Grunddüngung

60 kg N/ha, 125 kg K/ha, 30 kg Mg/ha

24.04.

Aussaat nach Mikroorganismenapplikation

wie1997

April-Sept.

Bewässerung

insgesamt 62 mm

12.05./26.06.

04.08.

Unkrautbekämpfung

wie 1997

13.06.

Insektizidspritzung

Spruzit (Pyrethrum), 0,1%

29.06.

Mineralische Düngung

15 kg/N/ha,17 kg P/ha, 30 kg K/ha

05.07.bis

07.07

Trennung der Varianten durch in den Boden eingelassene Kunsstoffkanten

35 cm tief

13.07.

Bakterienapplikation

Gießverfahren, 1 l/lfm

09.07./20.07

12.08./03.09.

Spritzungen Goemar Fruton Spezial

jeweils 3 l/ha

17.07.

Fungizidspritzung und Blattdüngung

Bardos, 1l /ha, Wuxal S 2%-ig

14.09.

Fungizidspritzung

Euparen, 1kg/ha

15.10.

Triebschnitt

Erfassung oberirdische Pflanzenmasse

22.03.99

Wurzelrodung

Erfassung Wurzelfrisch- und Trokenmasse

   


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3.3.  Bonitur und Untersuchungsmethoden

3.3.1. Pflanzenentwicklung

Um die Reaktion der Behandlungen mit den Rhizosphärenbakterien auf das Wachstum der Pflanzen zu prüfen, erfolgte bei Versuchsende die Erfassung verschiedener Wachstumsparameter. Bei dem Jungpflanzenversuch wurde nach Abreife des Spargelkrautes Ende Oktober bzw. Anfang November die Triebanzahl, die Gesamttrieblänge [cm] und der Gesamttriebdurchmesser [mm] pro Pflanze bestimmt.

Nach Abschluß der Vegetationsperiode in den Aussaatversuchen wurde im Versuchsjahr 1997 vom 13.-20. Oktober und im Versuchsjahr 1998 vom 15.-19. Oktober der Triebschnitt durchgeführt und die Triebanzahl und die Gesamttrieblänge [cm] ermittelt. Zusätzlich erfolgte 1997 vom 22. bis 23. März und 1998 vom 19. bis 21. Februar die Rodung der Wurzeln mit Erfassung der Wurzelfrischmasse [g], der Wurzeltrockensubstanz [%] und der Anzahl der Speicherwurzeln und der Knospen pro Rhizom. Wegen des großen Aufwandes wurden bei der Untersuchung der unterirdischen Pflanzenorgane pro Variante nur zehn (1998) bzw. 20 Rhizome (1999) aus 3 Wiederholungen berücksichtigt. Als Parameter für die Pflanzenentwicklung wurden in den Modellversuchen, wie in den jeweiligen Kapiteln bereits erläutert, Trieb- bzw. Wurzelfrisch- und –trockengewichte [g] erfasst. Die Ermittlung der Trockengewichte erfolgte nach Zerkleinerung und Behandlung im Trockenschrank bei 105° C bis Gewichtskonstanz mit anschließender 30-minütiger Abkühlung im Exsiccator.

3.3.2. Erntemenge und Stangenqualität

1999 erfolgte im Jungpflanzenversuch in einem Umfang von 3 Wiederholungen die erste Ernte mit quantitativer und qualitativer Erfassung. Die Ernte erstreckte sich über einen Zeitraum von ca. 3 Wochen vom 27.04.99 bis 21.05.99. Gestochen wurde morgens; anfangs mit dem Spargelfrettchen, nach technischen Problemen (Klinge) dann mit dem Spargelmesser. Die Qualitätssortierung basierte auf der aktuellen Sortierungsliste des Südwestdeutschen Spargelverbandes (Abb.10, Anhang 3).


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Abb. 10: Sortierungklassen.

3.3.3. Fusariumnachweis in den Pflanzenorganen und Bodenproben

Der Nachweis einer Fusariuminfektion im Trieb und in der Wurzel erfolgte mikroskopisch. Hierfür musste das Probenmaterial entsprechend aufbereitet und auf ein geeignetes Nährmedium überführt werden. Diese Arbeitsschritte fanden unter sterilen Bedingungen in einer Laminarbox statt.

Nach Segmentierung der Proben in kleine Fragmente, die z. T. bereits nekrotische Läsionen aufwiesen oder aber auch unauffällig waren, wurden diese 2 min in einer 3%-igen NaOCl-Lösung oberflächendesinfiziert, dreimal in sterilem Aqua dest. gespült und nach Trocknung auf sterilem Filterpapier auf SNA-Nährmedium (Anhang 4) unter Zugabe von Anti­biotika in 9 cm Petrischalen ausgelegt. Das SNA (slight nutrient agar) ist ein für Fusarium spp. prädestiniertes Agar (NIRENBERG 1976). Der geringe Nährstoffgehalt bedingt ein nur schwaches Mycelwachstum der Pilze und eine sehr geringe Verfärbung des Mediums. Die Sporenbildung ist hingegen ungehemmt, in der Regel aufgrund des Nährstoffmangels sogar gefördert. Es werden bevorzugt Mikrokonidien gebildet, die formstabil bleiben, aber auch Makrokonidien. Weiterhin regt SNA auch zur Kettenformierung an (z. B. bei F. proliferatum), es entstehen rasch Polyphialiden und gegebenenfalls auch Chlamydosporen. Wegen seiner Transparenz eignet es sich auch gut für die direkte Untersuchung der Petrischalen mit dem Mikroskop. So können im sogenannten Trachtbild bei kleiner Vergrößerung (125-250:1) Sporen und sporenbildende Zellen in situ untersucht werden und z. T. bereits konkrete [Seite 67↓]Aussagen getroffen werden, die bei weiterer Präparation eventuell nicht mehr möglich sind. So kann beispielsweise bei der Anfertigung eines mikroskopischen Präparates die für Fusarium proliferatum charakteristische Kettenbildung der Mikrokonidien als wichtiges Diagnoseindiz zerstört werden

Nach Belegung der Petrischalen erfolgte eine acht- bis zehntägige Inkubation im Brutschrank bei 20° C und UV im Wechsel (250-350 nm, 14 h beleuchtet, 12 h dunkel). Das umfangreiche Probenmaterial erforderte zum Teil mehrere Tage mikroskopischer Untersuchung. Die nicht unmittelbar untersuchten Agarplatten wurden dann in Alufolie versiegelt und bei 4° C in der Kühlzelle gelagert.

Die Proben von jeweils 10 Entnahmestellen der beiden grob gesiebten Erden (Zepernick und Möringen) wurden zu 2 Mischproben von ca. 500 g in Plastiktüten zusammengefasst und im Labor in einer sterilen Laminarbox luftgetrocknet. Um die Erden auf ihre Fusariumbelastung hin zu untersuchen, wurden die beiden Proben mit einem feinmaschigen Bodensieb (ca. 1 mm Maschenweite) in relativ einheitliche Partikel fraktioniert und pro Erdherkunft 100 Partikel einzeln in jeweils 100 Petrischalen mit SNA plus Antibiotika abgelegt.

Bei der mikroskopischen Untersuchung der Wurzeln aus dem Gefäßversuch mit den Erdherkünften unterschiedlich pathogener Belastung (Nachbau bzw. Fruchtfolge) wurden die kompletten Rhizome der jeweiligen Variante mit dem Skalpell in kleine Segmente geschnitten, diese Fragmente gemischt und hieraus zufallsverteilt 6 Proben entnommen und wie bereits beschrieben behandelt.

3.3.3.1. 3.3.3.1Differenzierung des Erregerspektrums

Die Artenbestimmung innerhalb der Gattung Fusarium orientierte sich an den z. T. sehr typischen morphologischen Charakteristika wie Form, Größe und Septierung der Makrokonidien (Abb. 11 und Abb. 12), Gestalt der Konidienträger und Mikrokonidien sowie der Ausbildung von Chlamydosporen. Als Bestimmungsliteratur kamen insbesondere die Werke von REINKING und WOLLENWEBER (1935), BOOTH (1971), NIRENBERG (1976), GAMS und DOMSCH (1979), DOMSCH (1980), GERLACH und NIRENBERG (1982) und NELSON et al. (1983) zum Einsatz.


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Abb. 11: Makrosporen von Fusarium culmorum (x500).

Abb. 12: Makrosporen von Fusarium acuminatum (x500).


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Abb. 13: Makrospore von Fusarium oxysporum (x500) mit hakenförmiger Apikalzelle (Pfeil).

Abb. 14: Typisch keulenförmige Phialide (Pfeil) mit Mikrosporen von Fusarium oxysporum (x500).


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Da sich diese morphologischen Besonderheiten im Laufe der Zeit ändern (z. B. Degeneration der Makrosporen), auch z. T. nicht mehr zu erkennen sind (z. B. primäre Konidienträger) oder aber erst gebildet werden (z. B. Chlamydosporen), ist der Zeitpunkt der Untersuchung für eine exakte Aussage wesentlich. Unter diesem Aspekt erfolgte auch in der Regel ein mehrmaliges Untersuchen der Petrischalen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Zusätzlich wurde bei den meisten Proben auch eine Überimpfung auf ein nährstoffreiches PDA-Agar durchgeführt, da auch Konsistenz und Wuchsverhalten des Mycels wichtige taxonomische Merkmale sind und erst auf einem solchen Vollmedium zur Ausprägung kommen. Die Inkubation erfolgte analog zu den SNA-Schalen. Bei anschließender Aufstellung bei Zimmertemperatur erhält der PDA-Agar, je nach Fusariumart, eine typische Färbung, die auch bei der Determinierung ergänzend hilfreich ist. Eine Artenzuordnung erfolgte in der Regel erst, wenn alle Bestimmungskriterien erfüllt waren und ein aussagefähiges Gesamtbild ergaben. Nicht eindeutig identifizierte Arten wurden als Fusarium spp. erfasst. Zusätzlich erfolgte, wenn möglich, eine Gattungsbestimmung der Begleitflora, die jedoch nicht detailliert dokumentiert wurde. Hier sind vor allem Alternaria, Ulocladium, Acremonium, Penicillium, Cladosporium, Aureobasidium, Cylindrocarpon, Mortierella und auchdiverse Zygomyceten, wie z. B. Zygorhynchus, zu nennen. Häufig konnten auch Mischinfektionen beobachtet werden.

3.3.4. Statistische Auswertung der Untersuchungsergebnisse

Die varianzanalytische Auswertung der Daten erfolgte mit den Statistikprogrammen SPSS 10.0 und STATISTICA 6.0 für Windows. Multiple Mittelwertvergleiche wurden mit dem Tukey-Test bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 durchgeführt. War die Voraussetzung der Varianzhomogenität und Normalverteilung nicht erfüllt, wurden die nichtparametrischen Äquivalenzverfahren, Kruskal-Wallis-Test (einfaktoriell) und Friedman-Test (zweifaktoriell), die auf der Bildung von Rängen und deren Analyse basieren, angewendet. Bei Vorliegen einer asymptopischen Signifikanz erfolgten dann die adäquaten Anschlusstests nach Nemenyi bzw. Wilcoxon-Wilcox (KÖHLER et al. 1995), bei denen nach Ermittlung einer kritischen Summendifferenz in einem Rangsummenvergleich Signifikanzen zwischen den einzelnen Varianten berechnet werden können. Eine Grenzdifferenz (HSD) wie beim Tukey-Test ist deshalb in den betreffenden Tabellen und Grafiken nicht angegeben. Die ermittelten Häufigkeiten der einzelnen Fusariumarten bei der mikroskopischen Untersuchung der Rhizome wurden als nominalskalierte Daten dem Chi-Quadrat-Test unterzogen.


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03.03.2004