Methoden

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Die Rekrutierung der PPR-Familien und des Fall-Kontroll Kollektivs erfolgte in der Abteilung für Neuropädiatrie der Universität Kiel, dem Universitätsklinikum für Epileptologie in Bonn und der Neurologischen Klinik der Charité Universitätsmedizin in Berlin. Die Ethik-Kommissionen der beteiligten Universitätskliniken haben der Durchführung der Studien zugestimmt. Der Einschluss eines Studienteilnehmers setzte allerorts die Aufklärung und schriftliche Einverständniserklärung voraus.

Klinische Charakterisierung

Die anonymisierten klinischen Daten der Studienteilnehmer wurden anhand standardisierter Erhebungsbögen dokumentiert. Die Klassifikation von epileptischen Anfällen und Syndromen erfolgte gemäß den Vorschlägen der Kommission für Terminologie und Klassifikation der Internationalen Liga gegen Epilepsie [20].

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Das PPR-Merkmal wurde anhand eines standardisierten EEG-Protokolls für die IPS bestimmt [21]. Aktuell werden vier Ausprägungsgrade der PPR unterschieden [21,45]: Typ-I mit eingelagerten Spikes innerhalb des okziptalen α-Rhythmus, Typ-II mit parieto-okziptale Spikes mit biphasischen slow Waves, Typ-III mit parieto-okziptale Spikes mit biphasischen slow Waves, die sich in die Frontalregion ausbreiten und Typ-IV mit generalisierten Spike-Wave Entladungen.

Genome scan nach PPR Determinanten

In die genomweite Kopplungsstudie wurden 60 Familien (295 Individuen) eingeschlossen, bei denen mindestens zwei Geschwister eine PPR Typ I-IV aufwiesen. Zur Differenzierung von PPR-spezifischen und IGE-assoziierten PPR-Determinanten wurden die Familien in zwei distinkte, phänotypisch homogenere Subgruppen unterteilt. Die PPR-Subgruppe schloss 19 Familien (98 Individuen) mit PPR allein oder visuell induzierten Anfällen ohne IGE ein. Die PPR/IGE-Subgruppe umfasste 25 Familien (121 Individuen) mit photosensitiver IGE.

Die Mikrosatelliten-Genotypisierung erfolgte als Multiplex-PCR mit Fluoreszenz-markierten Markern mit dem Qiagen Multiplex Amplification Kit. Als Thermocycler wurden GeneAmp PCR System 9700 verwendet. Die PCR-Fragmente wurden mittels ABI3730 DNA-Sequenzer aufgetrennt und mit Hilfe des Programms GENEMAPPER (Version 3.0) ausgewertet. Insgesamt wurden 455 Marker aus dem "Marshfield Marker Set" [4] für die genomweite Kartierung eingesetzt sowie 123 weitere Marker zur Feinkartierung.

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Für die statistischen Kopplungsanalysen wurden nicht-parametrische und parametrische Methoden angewandt. Die nicht-parametrischen Linkage-scores (NPL) und die korrespondierenden nominalen Typ-I Fehlerraten (P) wurden mit dem Programm GENEHUNTER berechnet [22]. Sie beruhen auf dem Vergleich eines beobachteten Vererbungsmusters eines Chromosomenabschnittes mit den Erwartungswerten einer zufälligen Mendelschen Verteilung (allele sharing). Die parametrischen Analysen wurden mit dem GENEHUNTER-MODSCORE Programm durchgeführt [40]. Bei einer MOD-score Analyse wird der LOD-score (logarithm of the odds) nicht nur über die genetische Position des Erkrankungslocus maximiert, sondern auch in Hinsicht auf die Penetranz der Genotypen und der Allelfrequenzen des Erkrankungsgens. Die mit dem MOD-score korrespondierenden Typ-I Fehlerraten (Pemp) wurden empirisch durch Simulationsstudien unter der Annahme einer zufälligen Allel-Segregation ermittelt. Nominale Typ-I Fehlerraten (Pemp) kleiner als 1.7x10-3 wurden als kopplungshinweisender und ab 4.9x10-5 als signifikanter Kopplungsbefund definiert [23].

Kandidatengenstudien

Sequenzanalyse des ALDH5A1 Gens

Die Sequenzanalyse des ALDH5A1 Gens wurde bei 35 unverwandten PPR/IGE-Probanden (23 IGE, 12 PPR Typ I-IV mit und ohne visuell induzierten Anfällen jedoch ohne IGE) und vier gesunden Populationskontrollen durchgeführt. Insgesamt 31 der 35 PPR/IGE-Probanden waren photosensitiv (PPR Typ I-IV). Die enzymatische DNA-Sequenzierung erfolgte mittels der Kettenabbruch-Methode nach Sanger [35]. Für den PCR Ansatz wurde der ABI Variant Seq Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) verwendet. Die Sequenzreaktion wurde mit dem BigDye™ Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit durchgeführt. Die Sequenzreaktionen wurden auf einem ABI3730 DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, USA) aufgetrennt und mit Hilfe des Programms SeqMan ausgewertet.

Assoziationsstudien

Das Studienkollektiv für die Assoziationsanalysen umfasste insgesamt 736 deutsche unverwandte IGE/PPR-Patienten und 666 gesunde Kontrollen deutscher Herkunft. Das IGE/PPR-Kollektiv setzte sich aus 660 IGE-Patienten (244 JME, 301 IAE, 115 Epilepsien mit Aufwach-Grand-mal (EGMA) sowie 76 Patienten mit PPR (Typ I-IV) oder visuell induzierten Anfällen ohne IGE zusammen. Insgesamt 187 Individuen des IGE/PPR-Kollektivs waren photosensitiv (Typ I-IV). Unterschiede in den Fallzahlen der einzelnen Studien resultierten aus der fortlaufenden Rekrutierung von Studienteilnehmern.

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Basierend auf positionellen und funktionellen Hinweisen wurden folgende Gene für die Kandidatengen-Assoziationsstudien ausgewählt: ALDH5A1 und BRD2 (6p21), GABRD (1p36), KCNJ10 (1q22) und ME2 (18q21). Vorrangig wurden Missense-Variationen überprüft, da diese potentiell funktionell bedeutsamen Aminosäure-Variationen (ALDH5A1: His180Tyr, Ala237Ser; GABRD:Arg220His; KCNJ10:Arg271Cys) einen direkten disponierenden Effekt bedingen können.

Die Genotypisierung der Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) erfolgte mittels eines TaqMan 5’-Nuklease PCR Assay (Applied Biosystems, Foster City, USA). Statistische Vergleiche der Allel- und Genotypfrequenzen (χ2-Test, Odds Ratio (OR), 95%-Konfidenzintervall und das Hardy-Weinberg Equilibrium) wurde mit dem SAS-Programm durchgeführt [36]. Für die Haplotypanalysen wurden die Programme COCAPHASE 2.35 (http://www.hgmp.mrc.ac.uk) [10] und FAMHAP [2] angewendet.


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09.07.2007