Molekulargenetische Identifizierung von Determinanten der Photoparoxysmalen ReaktionSusanne LorenzZusammenfassung123Einleitung34Methoden4Klinische Charakterisierung 5Genome scan nach PPR Determinanten6KandidatengenstudienSequenzanalyse des ALDH5A1 GensAssoziationsstudien 7ErgebnisseGenome scan nach PPR Determinanten (Tauer et al., 2005)789Positionelle Kandidatengene in der Region 6p21Kandidatengen ALDH5A1 (Lorenz et al., 2006a)10Kandidatengen BRD2 (Lorenz et al., 2006b)Replikationsstudien von positionellen und funktionellen Kandidatengenen GABRD Arg220His-Variation (Lenzen et al., 2005a) KCNJ10 Arg271Cys-Variation (Lenzen et al., 2005b)11 ME2-Risikohaplotyp (Lenzen et al., 2005c)Diskussion1112Genome scan nach PPR Determinanten (Tauer et al., 2005)Positionelle Kandidatengen Studien in der Region 6p21 (Lorenz et al., 2006a,b)1314Replikationsstudien von funktionellen Kandidatengenen GABRD Arg220His-Variation (Lenzen et al., 2005a)15 KCNJ10 Arg271Cys-Variation (Lenzen et al., 2005b) ME2-Risikohaplotyp (Lenzen et al., 2005c)16Perspektiven von molekulargenetischen ForschungsansätzenSelbständigkeitserklärung Publikationsliste: LiteraturverzeichnisdeInhaltsverzeichnisHilfe Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Identifizierung von PPR-Determinanten. Hierzu wurde von uns der molekulargenetische Ansatz der positionellen Kandidatengenanalyse angewandt [14]. Bei diesem Ansatz wird initial eine genomweite Kopplungsstudie durchgeführt, um einzelne Hauptgeneffekte chromosomal zu lokalisieren. In den Kopplungsregionen werden anschließend funktionell plausible Kandidatengene ausgewählt. Danach werden Sequenzvarianten dieser Kandidatengene in Assoziationsstudien auf ein Kopplungsungleichgewicht mit dem vermuteten Erkrankungslocus überprüft (Linkage Disequilibrium Mapping). Abschließend wird durch Sequenzanalysen der assoziierten Kandidatengene direkt nach den verantwortlichen Genmutationen gesucht. Dieses molekulargenetische Vorgehen begünstigt die Identifizierung von häufigen Genvarianten mit substantiellem Effekt.

Familienstudien belegen, dass die PPR genetisch determiniert ist [9,45,46] und häufig (bis zu 30%) mit den IGE assoziiert auftritt [17]. Die standardisierte IPS bietet einen experimentellen Ansatz, die individuelle Anfälligkeit für eine erhöhte kortikale Synchronisation zu bestimmen und Mechanismen zu untersuchen, die an dem Übergang in eine epileptische Aktivität beteiligt sind [33]. Die enge Assoziation der Photosensibilität mit JME im Speziellen und den IGE im Allgemeinen, sowie das gemeinsame EEG-Merkmal generalisierter spike-wave Entladungen stützen die Hypothese, dass die PPR einen geeigneten Endophänotyp für die IGE darstellt [17].

Genome scan nach PPR Determinanten (Tauer et al., 2005)

Unser Genom scan bei 60 PPR-Multiplexfamilien identifizierte zwei PPR-Loci (6p21, 13q31), die sich in ihrer neurogenetischen Beziehung zu den IGE unterschieden [41]. Bei 25 Familien mit photosensitiven IGE fand sich ein signifikanter IGE/PPR-Locus in der chromosomalen Region 13q31, während sich bei 19 Familien mit PPR und visuell induzierten Anfällen ohne IGE ein signifikanter PPR-Locus in der Region 6p21 positionell eingrenzen ließ. Die Aufteilung der Familien in klinisch homogenere Subgruppen war ausschlaggebend für die Dissektion unterschiedlicher PPR-Determinanten. Während der PPR-Locus in der Region 6p21 eher spezifisch für PPR zu sein scheint, ist der PPR-Locus in der Region 13q31 am ehesten an der Disposition von photosensitiven IGE beteiligt. Unser aktueller Genome scan bei 93 europäischen IGE-Multiplexfamilien bestätigt einen IGE-Locus in der Region 13q31 [42]. Unsere Studie belegt, dass PPR sich als Endophänotyp eignet, um die komplexe Pathogenese der häufigen IGE Syndrome auf einheitliche epileptogene Mechanismen einzugrenzen, die die Dissektion einzelner IGE-Gene erleichtert. Ein zweiter unabhängiger Genome scan bei 16 PPR-Multiplexfamilien, die primär durch Indexfälle mit JME rekrutiert wurden, fand signifikante Kopplungsbefunde in den Regionen 7q32 und 16p13 [34]. Damit ergeben sich eindeutige Hinweise für eine genetische Heterogenität, die offensichtlich mit der Untersuchung differenter Phänotyp-Genotyp-Beziehungen korreliert. Aktuell werden kombinierte Genom-weite Kopplungsanalysen beider Datensätze durchgeführt.

Zur Ermittlung von aussichtsreichen Kandidatengenen in den Regionen 6p21 und 13q31 führten wir Datenbankrecherchen durch. In der Kandidatengenregion 13q31 fanden wir keine offensichtlichen Kandidatengene. Deshalb erfolgt zur Zeit eine systematische Feinkartierung dieser Region mit 200 SNPs. In dem Bereich des PPR-Locus in der Region 6p21 halten wir zwei positionelle Kandidatenegene (ALDH5A1, BRD2) für besonders interessant, da beide Gene mit Epilepsien assoziiert wurden [13,32].

Positionelle Kandidatengen Studien in der Region 6p21 (Lorenz et al., 2006a,b)

Das ALDH5A1 Gen kodiert für das Enzym Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (SSADH), das am Abbau des inhibitorischen Neurotransmitters GABA beteiligt ist. Ein SSADH Mangel führt zu einem verminderten Abbau von GABA und sekundär zu einer Erhöhung von γ-Hydroxybuttersäure (GHB). Ein autosomal rezessiv vererbtes SSADH Defizit verursacht eine schwere psychomotorische Entwicklungsstörung, bei der ca. 50% der Betroffenen eine Epilepsie erleiden [13]. Mäuse ohne Aldh5a1 Gen sterben frühzeitig infolge eines Status epilepticus [18] und exogen zugeführtes GHB induziert Absence Anfälle [7]. Das ALDH5A1 Gen stellt somit ein aussichtsreiches Kandidatengen für IGE und PPR dar.

Unsere Sequenzanalyse des ALDH5A1 Gens bei 35 PPR/IGE Patienten aus Familien mit positiver Kopplungsevidenz am ALDH5A1 Locus identifizierte 17 Sequenzvarianten, von denen drei einen Aminosäureaustausch bewirken (His180Tyr, Pro182Leu, Ala237Ser) [27]. Die Varianten Tyr180, Leu182 und Ser237 führen zu einer reduzierten SSADH Aktivität verglichen mit dem Wildtyp-Allel [3]. Nach Korrektur für multiple Testungen ergab unsere Assoziationsstudie von sieben ALDH5A1 Polymorphismen keinen Anhalt für eine allelische Assoziation mit IGE oder PPR. Ein Trend einer Assoziation eines Zwei-Marker-Haplotyps (rs1883415–TNR) mit IGE und JME sollte erneut in einem unabhängigen Studienkollektiv überprüft werden. Der assoziierte Haplotyp schließt die 5’-regulatorische Region ein, in der wir sieben Sequenzvariationen innerhalb eines Abschnitts von 400 bp identifizierten. In diesem Segment liegen der ALDH5A1 Promotor und regulatorische Sequenzen [3]. Es bleibt zu überprüfen, ob Sequenzvarianten in der 5’-regulatorischen Region in Kombination mit den bekannten Missense-Variationen (His180Tyr, Pro182Leu, Ala237Ser) die ausgeprägte inter-individuelle Variation der SSDAH Aktivität erklären.

Ein ebenfalls sehr aussichtsreiches Kandidatengen für den PPR-Locus in der Region 6p21 stellt das BRD2 Gen dar [28]. Durch eine positionelle Kandidatengen Analyse fanden Pal et al. ein starkes Kopplungsungleichgewicht zwischen BRD2 Polymorphismen und JME [15,32]. JME und PPR weisen eine enge klinische Assoziation miteinander auf. Bei einer IPS unter Standardbedingungen findet sich eine PPR bei ca. 30% der JME Patienten [17]. In Abhängigkeit der Intensität der IPS sind sogar bis zu 90% aller JME Patienten photosensitiv [1]. Auch in unserer Kopplungsstudie fanden wir eine signifikante Kopplung zwischen PPR und dem BRD2-Locus bei 19 deutschen Familien mit vorwiegend PPR und photosensitiven Anfällen (Mehrpunkt LOD score = 3.365) [41]. Diese Hinweise stützen die Hypothese, dass das BRD2 Gen sowohl an der Disposition von JME wie auch PPR beteiligt ist.

Unsere Assoziationsstudie bestätigte allelische und haplotypische Assoziationen von sechs BRD2 Polymorphismen mit PPR. Während in unserer Studie die stärkste Assoziation bei SNPs im 3’-Bereich des BRD2 Gens lagen, fanden Pal et al. [32] die stärksten Kopplungsungleichgewichte im 5’-Bereich. Im Gegensatz zu der vorherigen Studie konnten wir keine Assoziation mit dem "Promotor" SNP rs3918149 bestätigen. Unsere aktuellen Befunde belegen einerseits eine Beteiligung des BRD2 Gens an der genetisch komplexen Disposition von PPR und JME, anderseits deuten die unterschiedlich assoziierten SNPs auf eine allelische Heterogenität hin. Bisher konnten keine verantwortlichen BRD2 Mutationen identifiziert werden. Somit sind die Assoziationsbefunde als vorläufig und hinweisend zu betrachten. Die mögliche Funktion von BRD2 bei der Epileptogenese bleibt derzeit noch ungeklärt. Es wird angenommen, dass es sich um einen neuronalen Transkriptionsregulator handelt, dessen Fehlfunktion zu diskreten Hirnentwicklungsstörungen führt, wie sie bei vielen JME Patienten zu finden sind [31,47]. Angesichts der eher geringen Effekte ist es schwierig, die Funktionalität von potentiellen BRD2 Varianten zu testen [44]. Am ehesten sind Rückschlüsse auf die Beteiligung von BRD2 bei der Epileptogenese von transgenen Tiermodellen zu erwarten.

Replikationsstudien von funktionellen Kandidatengenen

Bei drei Kandidatengenen (GABRD, KCNJ10, ME2) überprüften wir publizierte Hinweise auf eine pathogenetische Beteiligung an generalisierten Erregungssteigerungen [6,8,15].

GABRD Arg220His-Variation (Lenzen et al., 2005a)

Eine Mutationsanalyse bei IGE- und GEFS+-Patienten identifizierte eine häufige, funktionelle Missense Variation (c.659G>A, Arg220His) im Gen der GABA δ-Untereinheit (GABRD) [8]. GABAAα1β2δ Rezeptoren mit der GABRD His220-Variante zeigten deutlich niedrigere Spannungsamplituden als GABAA Rezeptoren mit der Wildtyp-Variante bei HEK293T Zelllinien [8,29]. Eine Pilotstudie fand einen Trend für eine höhere Allelfrequenz der His220-Variante bei 203 IGE-Patienten (4,9%) im Vergleich zu 96 Populationskontrollen (2,1%) [8].

Unsere Überprüfung dieses Trends bei 562 IGE-Patienten und 664 Kontrollen ergab keinen Hinweis auf eine allelische Assoziation der GABRD His220-Variante mit IGE oder einzelnen IGE-Subtypen [26]. Unser Studienergebnis spricht gegen einen substantiellen Effekt der GABRD His220-Variante bei der genetischen Disposition von häufigen IGE Syndromen.

 KCNJ10 Arg271Cys-Variation (Lenzen et al., 2005b)

Eine molekulargenetische Kartierung (QTL-Mapping) von Loci für epileptische Anfälle bei Mäusen [5,11] und eine nachfolgende Studie von positionellen Kandidatengenen identifizierte in dem Gen des Kaliumkanals Kcnj10 eine Missense Mutation (Thr262Ser), die eine hohe und niedrige Anfallsdisposition bei verschiedenen Mäusestämmen unterscheidet [12]. Eine Assoziationsstudie einer Arg271Cys Variation des humanen KCNJ10 Gens bei fokalen und generalisierten Epilepsie-Syndromen belegte einen signifikanten protektiven Effekt der Cys271-Variante [6].

Unsere Replikationsstudie konnte eine signifikant verringerte Frequenz der Cys271-Variante bei der IGE-Gruppe und besonders der JME-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen bestätigen [24]. Eine neurophysiologische Testung der Thr262Ser und Arg271Cys Variationen ergaben keine Hinweise auf funktionelle Veränderungen der intrinsischen Eigenschaften von KCNJ10 [37]. Angesichts der nur geringen Effekte der Cys271-Variante (OR = 0.69) kann nicht ausgeschlossen werden, dass der pathogenetische Einfluss auf Störungen der Hirnentwicklung oder auf regionale Funktionsstörungen zurückzuführen ist, die erst im Kontext mit weiteren genetischen Faktoren einen epileptogenen Effekt bewirken.

ME2-Risikohaplotyp (Lenzen et al., 2005c)

Greenberg et al. [16] fand ein starkes Kopplungsungleichgewicht zwischen einem IGE-Locus in der Region 18q21.1 und SNPs im Bereich des ME2 Gens. Homozygote Träger eines häufigen ME2-Risikohaplotyps wiesen ein sechsfach erhöhtes Risiko für IGE auf [16]. Eine zugrunde liegende ME2 Mutation konnte bisher nicht identifiziert werden. ME2 ist ein mitochondriales Enzym, welches Malat zu Pyruvat umwandelt. Ein ME2 Mangel würde durch eine verringerte Bereitstellung von Pyruvat die neuronale GABA-Synthese vermindern und dadurch eine neuronale Desinhibition begünstigen.

Unsere Replikationsstudie konnte weder eine allelische noch eine genotypische oder haplotypische Assoziation von ME2 Polymorphismen mit IGE oder PPR bestätigen [25]. Wir fanden auch keinen Hinweis für eine Assoziation des vermeintlichen, homozygoten Risikohaplotyps mit IGE oder PPR. Power-Simulationen belegen, dass unser Studienkollektiv mit einer Wahrscheinlichkeit von über 90% eine häufige Mutation mit einem relativen Risiko von RR > 2 erfassen sollte. Somit ist die verantwortliche ME2 Mutation entweder zu selten oder die Effektstärke zu gering, um in unserem Studienkollektiv identifiziert zu werden. Unser Studienergebnis dämpft optimistische Erwartungen, dass eine häufige ME2 Mutation einen substantiellen Effekt zur Pathogenese der häufigen IGE Syndrome beiträgt.

 Perspektiven von molekulargenetischen Forschungsansätzen

Während rasche Fortschritte bei der Aufklärung von monogenen Epilepsie-Formen erzielt wurden, liegen bisher keine gesicherten Erkenntnisse von Genveränderungen bei den häufigen, genetisch komplexen Epilepsien vor [38,44]. Aufgrund der meist oligo- bzw. polygenen Disposition und a priori unklaren Phänotyp-Genotyp-Beziehungen ist das bisherige Vorgehen der positionellen Klonierung nur eingeschränkt anwendbar. Assoziationsstudien sind effizienter, um häufige Genvarianten mit moderatem Effekt zu identifizieren [19]. Ein Schlüssel zur Dissektion der genetisch komplexen Epilepsien ist die Verwendung von neurobiologisch determinierten Endophänotypen, wie sie die Photosensibilität darstellt. Rasche Fortschritte in der molekulargenetischen Aufklärung von genetisch komplexen Epilepsien sind durch den wachsenden Erkenntnisstand der genetischen Variabilität des humanen Genoms (International HapMap Project; [43]) und technologischen Weiterentwicklungen in der Hochdurchsatzgenotypisierung von SNPs (z.B. Affymetrix GeneChip Human Mapping 500K Set) zu erwarten. Hierdurch werden erstmals die Voraussetzungen geschaffen, Genom-weite Assoziationsstudien durchzuführen. Gleichzeitig eröffnet sich die Gelegenheit, das herkömmliche Prinzip der "Locus-by-Locus" Analyse zu verlassen und mit neuen biostatischen Analyse-Programmen, Konfigurationen von mehreren disponierenden Genvarianten zu erfassen [30]. Eines der Hauptprobleme stellt die hohe Anzahl von zu erwartenden falsch-positiven Assoziationen infolge multipler Testungen dar. Für die umfassende Dissektion der wichtigsten IGE/PPR Gene sind daher sehr große, klinisch einheitlich charakterisierte Studienkollektive (>500 Multiplexfamilien, >2000 Einzelfälle) erforderlich, die sich meist nur im Rahmen von multizentrischen Initiativen rekrutieren lassen (European Consortium on the Genetics of Photosensitivity and Visual Epilepsies). Insgesamt scheinen jetzt erstmals die Voraussetzungen gegeben, eine systematische Aufklärung genetisch komplexer Erkrankungen in Angriff zu nehmen.