Functional analysis of phototropin in
Chlamydomonas reinhardtii

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biochemie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Herr M.S. Yinghong Lu
geboren am 10.08.1975 in Nanjing, China

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter Hegemann
2. Prof. Dr. Maria Mittag
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau

Tag der mündlichen Prüfung: April 25, 2006

Zusammenfassung

In höheren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die Öffnung von Schließzellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepaßten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtschädigung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten.

Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen Händen unlöslich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer löslich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich.

Deshalb wurde für diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene Stämme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen.

In Chlamydomonas wurde neben dem Volllängenprodukt noch eine c-terminal verkürzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkürzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h führten je nach Intensität zu klaren Abbaumustern. Für das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es möglich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen Stämmen nicht zuverlässig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Außerdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abhängig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensitäten gefunden.

Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der für die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenüber bekannten Tests liefert. Aus den durchgeführten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor für die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensitäten keimen Zygoten mit wenig Phototropin später. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren.

Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und für die spätere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatomäen exprimiert. Diese Versuche haben bestätigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volllängenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung für den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identität massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkürzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser löslich als die Volllängenversion. Eine Großproduktion sollte für die Reinigung und nachfolgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinitätsreinigungen sollten für die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgeführt werden.

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13.11.2006