Functional analysis of phototropin in
Chlamydomonas reinhardtii

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biochemie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Herr M.S. Yinghong Lu
geboren am 10.08.1975 in Nanjing, China

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter Hegemann
2. Prof. Dr. Maria Mittag
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau

Tag der mündlichen Prüfung: April 25, 2006

Zusammenfassung

In höheren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die Öffnung von Schließzellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepaßten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtschädigung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten.

Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen Händen unlöslich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer löslich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich.

Deshalb wurde für diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene Stämme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen.

In Chlamydomonas wurde neben dem Volllängenprodukt noch eine c-terminal verkürzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkürzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h führten je nach Intensität zu klaren Abbaumustern. Für das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es möglich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen Stämmen nicht zuverlässig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Außerdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abhängig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensitäten gefunden.

Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der für die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenüber bekannten Tests liefert. Aus den durchgeführten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor für die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensitäten keimen Zygoten mit wenig Phototropin später. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren.

Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und für die spätere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatomäen exprimiert. Diese Versuche haben bestätigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volllängenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung für den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identität massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkürzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser löslich als die Volllängenversion. Eine Großproduktion sollte für die Reinigung und nachfolgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinitätsreinigungen sollten für die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgeführt werden.

Table of contents

• 1 Summary
• 2 Introduction
  • 2.1 Properties of phototropin
  • 2.2 Phototropin in Chlamydomonas reinhardtii
  • 2.3  Chlamydomonas reinhardtii as host for recombinant protein expression
  • 2.4 RNA interference and gene silencing
  • 2.5 The goal of C. reinhardtii mating assay
• 3 Results
  • 3.1 Localization and expression profile of Phototropin
    • 3.1.1 Distribution and localization of phototropin
    • 3.1.2 Distributions of phototropin in different growth stages
    • 3.1.3 The degradation of phototropin is induced by light.
  • 3.2 Reduction of the phototropin level in C. reinhardtii by RNAi
    • 3.2.1 The Phot1- RNAi construct
    • 3.2.2 Transformation of C. reinhardtii strain cw15 arg- A with the RNAi construct
    • 3.2.3 Transformation of C. reinhardtii strain CC32pab1mt(+) with phototropin RNAi construct
  • 3.3 Mating Assay
    • 3.3.1 The design of mating assay
    • 3.3.2 Optimization of growth conditions for precultures before gametogenesis
    • 3.3.3 Mating assay results
  • 3.4 Expression and purification of phototropin in different expression systems
    • 3.4.1 Expression of Phototropin in Oocytes
    • 3.4.2 Fusion expression of Ble-Phot1 in C. reinhardtii
    • 3.4.3 Analysis of pLY2-A transformant No.21
      • 3.4.3.1 Distribution of the expressed product and the endogenous phototropin
      • 3.4.3.2 Light induced degradation of the fusion protein
      • 3.4.3.3 Purification of the fusion protein
    • 3.4.4 Expression of phototropin in diatom
    • 3.4.5 Establishment of a tandem affinity purification system in C. reinhardtii
      • 3.4.5.1 Use of a directly combined Strep tag II at the N-terminus of the fusion products
      • 3.4.5.2 Final construct for tandem affinity purification and purification of fusion expression product
• 4 Discussion
  • 4.1 Locaization and distribution of phototropin in Chlamydomonas reinhardtii
  • 4.2 Silencing of phototropin in C.reinhardtii
  • 4.3 Mating assay
  • 4.4 Expression and purification of phototropin
• 5 Materials and methods
  • 5.1 Methods about handling with C. reinhardtii (buffer recipes included)
    • 5.1.1 Growing C. reinhardtii in liquid culture
    • 5.1.2 Growing Chlamydomonas reinhardtii on Agar
    • 5.1.3 Gametogenesis
    • 5.1.4 Isolation of Flagella (pH Shock Protocol)
    • 5.1.5 Flagella fractionation
    • 5.1.6 Preparation of Gamete Autolysin
    • 5.1.7 Transformation of Chlamydomonas
      • 5.1.7.1 Transformation of cell-wall-deficient strain (Glass bead method)
      • 5.1.7.2 Transformation of wild type cell
    • 5.1.8 Mating Assay
    • 5.1.9 Fractionation of Chlamydomonas cells
  • 5.2 Methods about handling with Diatom Cylindrotheca fusiformis (buffer recipes included)
    • 5.2.1 Growing C. fusiformis
    • 5.2.2 Transformation of diatom cells
      • 5.2.2.1 Adsorption of plasmid-DNA on tungsten particles (M17)
      • 5.2.2.2 Preparation of diatom cells
      • 5.2.2.3 Shooting of cells
      • 5.2.2.4 Selection of resistant C. fusiformis Cells
  • 5.3 Methods about handling with Escherichia coli(buffer recipes included)
    • 5.3.1 Growing E. coli
    • 5.3.2 Making competent cells of E. coli
    • 5.3.3 Transformation of E. coli cells
    • 5.3.4 Storing and retrieving E. coli in frozen at -80°C
      • 5.3.4.1 Preparing frozen stocks of E. coli
      • 5.3.4.2 Retrieving E. coli from -80°C frozen stocks
  • 5.4 Methods about handling with X. laevis oocyte (buffer recipes included)
    • 5.4.1 Microinjection of X. laevis oocyte and detection of target protein expression
  • 5.5 Methods about handling with DNA (buffer recipes included)
    • 5.5.1 Isolation of genomic DNA from C. reinhardtii
    • 5.5.2 Isolation plasmid-DNA from E. coli
    • 5.5.3 Agarose gel electrophoresis of DNA
    • 5.5.4 Purification of DNA from agarose gel
    • 5.5.5 Amplification of DNA fragment by Polymerase Chain Reaction(PCR)
    • 5.5.6 Digestion of DNA
    • 5.5.7 Ligation of DNA
    • 5.5.8  in vitro synthesis of mRNA from DNA
  • 5.6 Method about handling with Protein (buffer recipes included)
    • 5.6.1 Protein amount detection by BC Assay
    • 5.6.2 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
    • 5.6.3 Staining of SDS-PAG
      • 5.6.3.1 Commassie Brilliant Blue staining
      • 5.6.3.2 Silver staining
    • 5.6.4 Western blot
    • 5.6.5 In gel tryptic digestion
    • 5.6.6 Purification with Ni-NTA column
    • 5.6.7 Purification with Strep-tactin column
  • 5.7 Materials
    • 5.7.1 Strains
    • 5.7.2 Plasmids
    • 5.7.3 Chemicals, Enzymes and Kits
      • 5.7.3.1 Chemicals and Kits
      • 5.7.3.2 Enzymes and Proteins
    • 5.7.4 Oligonucleotides
      • 5.7.4.1 Primers for making RNAi construct
      • 5.7.4.2 Primers for oocyte expressions
      • 5.7.4.3 Primers used for pLY2-phot1
      • 5.7.4.4 Primers for diatom expressions
      • 5.7.4.5 Primers for pLY2-A
      • 5.7.4.6 Primers for pLY2-B
      • 5.7.4.7 Primers for pLY2-C
      • 5.7.4.8 Primers for pLY2-D, pLY2-E
      • 5.7.4.9 Primers for Chapter 3.4.5.1
      • 5.7.4.10 Primers for pLY2-OV
      • 5.7.4.11 Sequencing primers
• Acknowledgments
• Abbreviations
• References
• Lebenslauf
• Erklärung

Tables

• Form 3.4.3.1.1 Distribution of phototropin and the fusion expression product.

Images

• Figure 2.1.1 Domain features of plant phototropin
• Figure 2.1.2 Photocycle of LOV1 domain from C. reinhardtii phototropin (Kottke et al 2003)
• Figure 2.2.1 Amino acid sequence of Chlamydomonas phototropin gene (Huang et al., 2002)
• Figure 2.2.2 Life cycle of Chlamydomonas reinhardtii (Huang et al., 2003)
• Figure 2.4.1 The RNAi pathway. (Dykxhoorn et al 2003)
• Figure 2.4.2 Self-amplifying process of RNAi and transitive RNA siliencing (Ahlquist, 2002).
• Figure 2.4.3 Methods to generate RNAs that silence gene expression (Dykxhoorn et al., 2003).
• Figure 3.1.1.1 Localization of phototropin
• Figure 3.1.1.2 Phototropin level and distribution in different strains grown under same conditions
• Figure 3.1.2.1 Phototropin distributions in pellet, membrane and soluable fraction in different cell stages and in different light conditions.
• Figure 3.1.3.1 Light induced degradation of phototropin.
• Figure 3.2.1.1 Construction of RNAi construct of Chlamydomonas Phototropin gene
• Figure 3.2.2.1 Relative amount of phototropin in the transformants and recipient strain cw15 arg- A
• Figure 3.2.3.1 Relative phototropin amount in transformant, recipient and control strain.
• Figure 3.3.1.1 Description of mating assay
• Figure 3.3.2.1 Difference in phototropin levels in transformant C4 and recipient strain CC32pab1mt(+) under different growth conditions
• Figure 3.3.3.1 Result of mating assay
• Figure 3.4.1.1 Schematic drawing of the two plasmids used for expression of Phot1 and Phot1 (C57S, C250S) in Xenopus laevis oocytes.
• Figure 3.4.1.2 Expression of Phot1 and Phot1 mutant (C57S, C250S) in Xenopus Laevis oocytes.
• Figure 3.4.1.3 Distribution and solubilization of Phot1 expressed in oocyte and light induced degradation experiment.
• Figure 3.4.2.1 Different constructs tested for expressing Phototropin in C. reinhardtii
• Figure 3.4.2.2 Overexpression of fusion protein Ble-TEV-Phot1-12 His in C. reinhardtii
• Figure 3.4.2.3 Western blot of pLY2-A transformants.
• Figure 3.4.2.4 Western blot result from screening of pLY2-B transformants
• Figure 3.4.2.5 Western blot result from screening of pLY2-C transformants
• Figure 3.4.3.1.1 Distribution of fusion expression product and phototropin
• Figure 3.4.3.2.1 Light gradient test for overexpression product and phototropin
• Figure 3.4.3.3.1 Ni-NTA spin column purification of fusion product.
• Figure 3.4.3.3.2 Mass Spectroscopy analysis of the expressed product
• Figure 3.4.4.1 Plasmid construct for fusion expression of Ble-Phot1in Diatom
• Figure 3.4.4.2 Screening of fusion expression transformants and localization of the expressed product in diatom.
• Figure 3.4.5.1.1 Schematic drawing and restriction sites of parts of the five plasmids used for expressing Ble fusion protein.
• Figure 3.4.5.1.2 Comparison of transformation efficiency and products of the different fusion expression constructs with or without Strep tag II in the N-terminus.
• Figure 3.4.5.1.3 Western blot of screening transformants with pLY2-SBP
• Figure 3.4.5.2.1 Final construct for fusion expression of Ble and Phototropin for tandem affinity purification.
• Figure 3.4.5.2.2 Screening of transformants with pLY2-OV
• Figure 3.4.5.2.3 Purification of expressed fusion product (Fb) from strain No. 9.
• Figure 3.4.5.2.4 Purification of full-length fusion product from transformant No.24
• Figure 3.4.5.2.5 MS result: Sequence coverage of transformant No.9. The high-lighted sequences were found in MS analysis.
• Figure 3.4.5.2.6 MS results: Sequence coverage of transformant No.24. The high-lighted sequences were found by MS analysis.
• Figure 4.1.1 Phosphorylation prediction of C. r. phototropin (NetPhos 2.0 Server).
• Figure 4.4.1 Schematic illustration of the roles of LOV1 and LOV2 domains in light regulation of substrate phosphorylation by Kinase domain in A.t. Phot2. P: phosphate; S, substrate; LL, low light conditions; HH, high light conditions ( Mastuoka and Tokutomi, 2005).