2.  Material und Methodik

Für die vorliegende Arbeit wurden 106 Frauen untersucht, die als Gemeinsamkeit ein erhöhtes Risiko gegenüber der Normalbevölkerung aufweisen, im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken. Sie wurden in der Zeit vom Januar 1999 bis Mai 2001 in der Risikosprechstunde der Frauenklinik Charité, Humboldt-Universität, Campus Mitte, behandelt bzw. beraten. Da es sich um eine sehr heterogene Gruppe handelt, wurde die folgende Einteilung in Haupt- und Subgruppen vorgenommen:

Hauptgruppen:

• Gesunde Frauen, die aufgrund einer positiven Familienanamnese mit einer oder mehreren an Brustkrebs erkrankten Verwandten die Sprechstunde „Familiärer Brustkrebs“ aufsuchten
• Patientinnen, die aufgrund einer Präkanzerose (DCIS,CLIS,ADH) behandelt wurden
• als Kontrollgruppe wurden Patientinnen mit behandeltem Mammakarzinom gewählt

Subgruppen innerhalb der Gruppe der gesunden Frauen:

• Nach Menopausenstatus: prämenopausal/ postmenopausal
• Risikoberechnung nach Gail, dabei wurde ein Risiko von unter 15% als low risk und ein Risiko von über 15% als high risk bezeichnet

Subgruppen innerhalb der Patientinnen mit Präkanzerose:

• Nach Menopausenstatus: prämenopausal/ postmenopausal
• Zusätzliche familiäre Belastung
• Behandlung mit dem Antiöstrogen Toremifen ( Fareston^® ) im Rahmen der Mammakarzinom-Präventionsstudie

Verlaufskontrollen:

Für die Untersuchung der intraindividuellen Streubreite wurden bei 34 Frauen Verlaufskontrollen durchgeführt. Der Abstand der Blutentnahmen war dabei nicht streng vorgegeben, sondern richtete sich nach den Kontrolluntersuchungen entsprechend der Wiedervorstellungen in der Risikosprechstunde der Frauenklinik und lag im Mittel bei 8 Monaten (Streubreite 1-25 Monate).

Tab. 1: Verlaufskontrollen

BRCA 1/2-Mutation:

Da nur bei zwei Patientinnen die Diagnose einer BRCA 1-Mutation vorlag, wurde dieses Merkmal nicht gesondert betrachtet, die erhobenen Werte aber mit in die Auswertung einbezogen.

Folgende anamnestische Daten wurden durch Befragung der Patientinnen und aus den Krankenunterlagen aufgenommen:

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Tab. 2: Gesamtgruppe n=106; Median (Streubreite)

Tab. 3: Gesunde Frauen mit familiärer Belastung; Median (Streubreite)

Tab. 4: Patientinnen mit Präkanzerose; Median (Streubreite)

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Tab. 5: Patientinnen mit Mammakarzinom n=11; Median (Streubreite)

Für jede Frau wurde das individuelle Risiko für die Erkrankung an Brustkrebs nach den anamnestischen Daten berechnet. Dazu wurden die Risikomodelle nach Gail und Chang-Claude verwendet. Die Abschätzung nach Chang-Claude erfolgte mit Hilfe der Tabellen des Deutschen Krebsforschungszentrums, die Berechnung nach Gail wurde mit dem Gail Model Risk Assessment Tool, Cardinal Health Systems Inc., November 1998 durchgeführt.

Die Patientinnen aus der Gruppe der Frauen mit Präkanzerose, die im Rahmen der Mammakarzinompräventionsstudie mit Antiöstrogenen behandelt wurden, erhielten 60 mg Toremifen (Fareston®) pro Tag.

Für die quantitative Bestimmung der Wachstumsfaktoren IGF-1, VEGF und das Bindungsprotein IGFBP-3 wurde Serum gewonnen und ein Sandwich-ELISA verwendet. Gebilligt wurde die Nutzung der Blutproben für Forschungszwecke von der Ethikkommission der Charité. Die Messung wurde im endokrinologischen Labor der Frauenklinik Charité, Campus Mitte durchgeführt.

Den Probandinnen wurde mittels einer 10 ml Serummonovette Blut abgenommen und zentrifugiert. Zur Vermeidung wiederholten Auftauens wurden die Serumproben portionsweise in Kryoröhrchen überführt und bei -18°C gelagert.

	Abb. 3: Die Mikrotiterplatten sind mit einem mono- bzw. polyklonalen Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz beschichtet.

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	Abb. 4: Die Platten werden mit den Proben beschichtet. Die zu bestimmende Substanz bindet an die Antikörper.

	Abb. 5: Nach Inkubation und Waschen wird ein zweiter polyklonaler Antikörper zugegeben. Dieser ist an ein Enzym gekoppelt.

	Abb. 6: Nach einer zweiten Inkubation und weiterem Waschen werden die Mikrotiterplatten mit einer Chromogenlösung beschichtet, die mit dem Enzym reagiert.

	Abb. 7: Durch Zugabe einer Säurelösung wird die Farbreaktion gestoppt und die Extinktion bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen. Die Absorption ist der Konzentration der zu bestimmenden Substanz direkt proportional.

Verwendet wurde der Quantikine® Human VEGF Immunoassay der Firma R&D Systems, Minneapolis, USA. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem monoklonalen VEGF-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

1. Herstellen einer Standardreihe: Pipettieren von 500 νl Standard (2000 pg/ml VEGF in Proteinpuffer) in 500 νl Diluent (tierisches Serum) zum Verdünnen auf 1000 pg/ml, weiteres Verdünnen auf 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml und 31,2 pg/ml.
2. 100 νl Assaypuffer ( Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben.
3. Pipettieren der VEGF-Standards 1-8, der Kontrolle aus Poolserum, sowie des Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 100 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten. Für 2h bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler (500-600 rpm) inkubieren.
4. Die Vertiefungen absaugen und 3´ mit 400 νl Waschlösung (gepufferte Surfactantlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
5. 200 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte polyklonale VEGF-Antikörper) in jede Vertiefung geben, 2h bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
6. 3´ mit 400 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
7. 200 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 25 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
8. 50 νl Stopplösung (2 N Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
9. Absorption der Lösung nach 25 min. bei 450 nm messen.

Standards: Recombinantes humanes VEGF₁₆₅

Tab. 6: Normalwerte des Herstellers: n= 37 (keine Angaben zu Geschlecht und Alter)

Sensitivität: 9 pg/ml

Tab. 7: Präzision VEGF-ELISA

Quelle: R&D Systems Durchführungsvorschrift

	Abb. 8: Mikrotiterplatte

Tab. 8: Bearbeitungsschema (Kontrollen [KO], Standard [ST], Patientenmaterial [Pat])

Verwendet wurde der ACTIVE^TM Non-Extraction IGF-1 ELISA der Firma DSL Deutschland, Sinsheim. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem IGF-1-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

1. Verdünnung der Proben: 20 νl Serum in ein Polypropylenröhrchen pipettieren und mit 990 νl Probenpuffer 1 mischen, 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 990 νl Probenpuffer 2 hinzugeben, mischen.
2. Pipettieren der IGF-1-Standards A-E (IGF-1 in Proteinpuffer [BSA]) in den Konzentrationen von 0 ;7 ng/ml; 8 ng/ml; 60 ng/ml; 167 ng/ml; 580 ng/ml), der Kontrolle 1 (niedrige IGF-1-Konzentration) und Kontrolle 2 (hohe IGF-1-Konzentration), sowie des vorbehandelten Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 20 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten.
3. 100 νl Assaypuffer (Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben, auf einem Horizontalschüttler (500-600rpm) für 2h bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Die Vertiefungen absaugen und 5´ mit 350 νl Waschlösung (gepufferte Salzlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
5. 100 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte IGF-1-Antikörper) in jede Vertiefung geben, 30 min. bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
6. 5´ mit 350 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
7. 100 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] in Zitratpuffer mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
8. 100 νl Stopplösung (0,2 M Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
9. Absorption der Lösung nach 30 min. bei 450 nm messen.

Standards: Die Standards wurden gegen die WHO-Referenzpräparation 87/518 kalibriert.

Normalwerte des Herstellers:

	Abb. 9: IGF-1-Werte von Frauen in Abhängigkeit des Alters

Sensitivität : 0,01 ng/ml

Tab. 9: Präzision IGF-1-ELISA

Quelle: DSL Durchführungsvorschrift

Es wurde zusätzlich ein laborinterner Intra-Assay durchgeführt:

Tab. 10: Intra-Assay IGF-1

Verwendet wurde der ACTIVE^TM IGFBP-3 ELISA der Firma DSL Deutschland, Sinsheim. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem polyklonalen IGFBP-3-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

1. Verdünnung der Proben: 20 νl Serum werden 1:100 mit Nullstandard (Proteinpuffer [BSA]) verdünnt.
2. Pipettieren der IGFBP-3-Standards A-F (IGFBP-3 in Proteinpuffer [BSA] in den Konzentrationen von 0; 2 ng/ml; 5 ng/ml; 20 ng/ml; 50 ng/ml; 100 ng/ml), der Kontrolle 1 (niedrige IGFBP-3-Konzentration) und Kontrolle 2 (hohe IGFBP-3-Konzentration), sowie des vorbehandelten Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 25 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten.
3. 50 νl Assaypuffer ( Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben, auf einem Horizontalschüttler (500-600 rpm) für 2h bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Die Vertiefungen absaugen und 5´ mit 350 νl Waschlösung (gepufferte Salzlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
5. 100 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte IGFBP-3-Antikörper [Ziege, polyklonal] ) in jede Vertiefung geben, 1h bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
6. 5´ mit 350 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
7. 100 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] in Zitratpuffer mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
8. 100 νl Stopplösung (0,2 M Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
9. Absorption der Lösung nach 30 min. bei 450 nm messen.

Standards: Die Standards wurden gegen den recombinant DNA-derived non-glycosylated human IGFBP-3-Standard der Firma Celtrix Pharmaceutical Inc. kalibriert.

Tab. 11: Normalwerte des Herstellers: Frauen n=33

Sensitivität: 0,04 ng/ml

Tab. 12: Präzision IGFBP-3-ELISA:

Quelle: DSL Durchführungsvorschrift

Es wurde zusätzlich ein laborinterner Intra-Assay durchgeführt:

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Tab. 13: Intra-Assay IGFBP-3:

Die Messung der Absorption erfolgte an dem Mikrotiterplattenmeßgerät 400 SF der Firma SLT. Für die Umrechnung der optischen Dichten in Konzentrationen wurde das PC-Programm Synelisa 3.0 der Firma Elias Medizintechnik, Freiburg, Deutschland verwendet. Es wurde damit eine Spline-Approximation OD/OD max.% durchgeführt und so eine Eichkurve erstellt, mit Hilfe derer die Patientenwerte berechnet wurden.

Beispiel:

	Abb. 10: Eichkurve für VEGF

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows. Für jede Haupt- und Subgruppe wurden Median und Mittelwert berechnet und graphisch aufgetragen. Da die Gruppen nicht normalverteilt sind, erfolgte für den Vergleich der Gruppen die Durchführung des nichtmetrischen Mann-Whitney-Tests für unabhängige Stichproben. Für den Vergleich mit Tumorpatientinnen einer früheren Studie erfolgte die Durchführung des T-Test für unabhängige Stichproben. Die Ergebnisse wurden auf Signifikanzen geprüft. Dabei wurden p-Werte unter 0,05 als signifikant betrachtet.

Für die Erstellung der Diagramme wurde das PC-Programm Microsoft Excel verwendet.