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2.  Material und Methodik

2.1. Patientinnen

Für die vorliegende Arbeit wurden 106 Frauen untersucht, die als Gemeinsamkeit ein erhöhtes Risiko gegenüber der Normalbevölkerung aufweisen, im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken. Sie wurden in der Zeit vom Januar 1999 bis Mai 2001 in der Risikosprechstunde der Frauenklinik Charité, Humboldt-Universität, Campus Mitte, behandelt bzw. beraten. Da es sich um eine sehr heterogene Gruppe handelt, wurde die folgende Einteilung in Haupt- und Subgruppen vorgenommen:

Hauptgruppen:

Subgruppen innerhalb der Gruppe der gesunden Frauen:

Subgruppen innerhalb der Patientinnen mit Präkanzerose:

Verlaufskontrollen:

Für die Untersuchung der intraindividuellen Streubreite wurden bei 34 Frauen Verlaufskontrollen durchgeführt. Der Abstand der Blutentnahmen war dabei nicht streng vorgegeben, sondern richtete sich nach den Kontrolluntersuchungen entsprechend der Wiedervorstellungen in der Risikosprechstunde der Frauenklinik und lag im Mittel bei 8 Monaten (Streubreite 1-25 Monate).

Tab. 1: Verlaufskontrollen

Anzahl der erhobenen Werte

Anzahl der Frauen

2

20

3

9

4

4

5

1

BRCA 1/2-Mutation:

Da nur bei zwei Patientinnen die Diagnose einer BRCA 1-Mutation vorlag, wurde dieses Merkmal nicht gesondert betrachtet, die erhobenen Werte aber mit in die Auswertung einbezogen.

2.1.1. Anamnestische Daten

Folgende anamnestische Daten wurden durch Befragung der Patientinnen und aus den Krankenunterlagen aufgenommen:


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Tab. 2: Gesamtgruppe n=106; Median (Streubreite)

Alter

47 (22-67)

Größe (cm)

167 (153-179)

Gewicht (kg)

64 (47-100)

Menarchealter

13 (11-17)

Alter bei 1.Geburt

24 (15-35)

Anzahl der Verwandten 1.Grades mit Mammakarzinom

1 (0-3)

Anzahl der Verwandten 2.Grades mit Mammakarzinom

0 (0-5)

Anzahl der Biopsien

0 (0-3)

Tab. 3: Gesunde Frauen mit familiärer Belastung; Median (Streubreite)

 

Gesamt n=65

Prämenopausaln=39

Postmenopausaln=26

low risk n=14

high risk n=46

Alter

45 (23-67)

38 (23-56)

56 (34-67)

56,5 (32-67)

44,5 (25-67)

Größe (cm)

167 (153-178)

168 (155-178)

167 (153-175)

167 (155-175)

167,5 (153-178)

Gewicht (kg)

64 (47-100)

60 (47-100)

66,5 (50-85)

66,5 (51-78)

62 (47-100)

Menarchealter

13 (11-16)

12 (11-16)

13 (11-15)

13 (12-15)

12 (11-15)

Alter bei 1.Geburt

23 (15-37)

24 (15-37)

22,5 (19-32)

23 (15-37)

24 (18-28)

Anzahl der Verwandten 1.Grades mit Mammakarzinom

1 (0-3)

1 (0-3)

1 (0-3)

1 (0-1)

1 (1-3)

Anzahl der Verwandten 2.Grades mit Mammakarzinom

1 (0-5)

1 (0-5)

0 (0-2)

1 (0-3)

0 (0-5)

Anzahl der Biopsien

0 (0-3)

0 (0-2)

1 (0-3)

0 (0-1)

0 (0-3)

Tab. 4: Patientinnen mit Präkanzerose; Median (Streubreite)

 

Gesamt n=30

Prä­menopausaln=13

Post­menopausaln=17

Mit familiärer Belastungn=10

Ohne familiäre Belastung n=20

Toremifen (Fareston®)n=18

Kontrollen=12

Alter

54 (22-63)

44 (22-54)

59 (50-63)

59,5 (39-63)

51 (22-63)

54 (40-63)

55 (22-61)

Größe (cm)

163,5 (153-179)

167 (155-179)

163 (153-175)

166,5 (162-170)

163 (153-179)

163,5(155-179)

165 (153-178)

Gewicht (kg)

63 (47-100)

63 (50-86)

63 (47-100)

61 (47-69)

66,5 (51-100)

63 (55-97)

63 (47-100)

Menarchealter

13 (11-17)

13 (11-15)

14 (11-17)

14 (11-17)

13 (11-16)

13,5 (11-16)

13 (11-17)

Alter bei 1.Geburt

24 (18-35)

28 (21-35)

22,5 (18-30)

23 (21-35)

24 (18-31)

24 (18-35)

25 (21-31)

Anzahl der Verwandten 1.Grades mit Mammakarzinom

0 (0-1)

0 (0-1)

0 (0-1)

0 (0-1)

0

0

0 (0-1)

Anzahl der Verwandten 2.Grades mit Mammakarzinom

0 (0-4)

0 (0-2)

0 (0-4)

1 (0-4)

0

0 (0-2)

0 (0-4)

Anzahl der Biopsien

1 (0-2)

1 (0-2)

1 (0-2)

0,5 (0-2)

1 (1-2)

1 (0-2)

1 (0-2)


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Tab. 5: Patientinnen mit Mammakarzinom n=11; Median (Streubreite)

Alter

56 (33-67)

Größe (cm)

167 (157-179)

Gewicht (kg)

68 (52-80)

Menarchealter

13 (11-16)

Alter bei 1.Geburt

25 (20-34)

Anzahl der Verwandten 1.Grades mit Mammakarzinom

1 (0-2)

Anzahl der Verwandten 2.Grades mit Mammakarzinom

0 (0-3)

Anzahl der Biopsien

1 (0-1)

2.1.2. Risikoberechnung

Für jede Frau wurde das individuelle Risiko für die Erkrankung an Brustkrebs nach den anamnestischen Daten berechnet. Dazu wurden die Risikomodelle nach Gail und Chang-Claude verwendet. Die Abschätzung nach Chang-Claude erfolgte mit Hilfe der Tabellen des Deutschen Krebsforschungszentrums, die Berechnung nach Gail wurde mit dem Gail Model Risk Assessment Tool, Cardinal Health Systems Inc., November 1998 durchgeführt.

2.1.3. Toremifeneinnahme

Die Patientinnen aus der Gruppe der Frauen mit Präkanzerose, die im Rahmen der Mammakarzinompräventionsstudie mit Antiöstrogenen behandelt wurden, erhielten 60 mg Toremifen (Fareston®) pro Tag.


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2.2.  Methodik

Für die quantitative Bestimmung der Wachstumsfaktoren IGF-1, VEGF und das Bindungsprotein IGFBP-3 wurde Serum gewonnen und ein Sandwich-ELISA verwendet. Gebilligt wurde die Nutzung der Blutproben für Forschungszwecke von der Ethikkommission der Charité. Die Messung wurde im endokrinologischen Labor der Frauenklinik Charité, Campus Mitte durchgeführt.

2.2.1. Gewinnung der Proben

Den Probandinnen wurde mittels einer 10 ml Serummonovette Blut abgenommen und zentrifugiert. Zur Vermeidung wiederholten Auftauens wurden die Serumproben portionsweise in Kryoröhrchen überführt und bei -18°C gelagert.

2.2.2. Theoretisches Prinzip des Sandwich-ELISA (Enzymimmunoassay)

Abb. 3: Die Mikrotiterplatten sind mit einem mono- bzw. polyklonalen Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz beschichtet.

:
Abb. 4: Die Platten werden mit den Proben beschichtet. Die zu bestimmende Substanz bindet an die Antikörper.

Abb. 5: Nach Inkubation und Waschen wird ein zweiter polyklonaler Antikörper zugegeben. Dieser ist an ein Enzym gekoppelt.

Abb. 6: Nach einer zweiten Inkubation und weiterem Waschen werden die Mikrotiterplatten mit einer Chromogenlösung beschichtet, die mit dem Enzym reagiert.

Abb. 7: Durch Zugabe einer Säurelösung wird die Farbreaktion gestoppt und die Extinktion bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen. Die Absorption ist der Konzentration der zu bestimmenden Substanz direkt proportional.


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2.2.3.  Quantitative Bestimmung von VEGF im Serum

Verwendet wurde der Quantikine® Human VEGF Immunoassay der Firma R&D Systems, Minneapolis, USA. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem monoklonalen VEGF-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

  1. Herstellen einer Standardreihe: Pipettieren von 500 νl Standard (2000 pg/ml VEGF in Proteinpuffer) in 500 νl Diluent (tierisches Serum) zum Verdünnen auf 1000 pg/ml, weiteres Verdünnen auf 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml und 31,2 pg/ml.
  2. 100 νl Assaypuffer ( Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben.
  3. Pipettieren der VEGF-Standards 1-8, der Kontrolle aus Poolserum, sowie des Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 100 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten. Für 2h bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler (500-600 rpm) inkubieren.
  4. Die Vertiefungen absaugen und 3´ mit 400 νl Waschlösung (gepufferte Surfactantlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
  5. 200 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte polyklonale VEGF-Antikörper) in jede Vertiefung geben, 2h bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
  6. 3´ mit 400 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
  7. 200 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 25 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. 50 νl Stopplösung (2 N Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
  9. Absorption der Lösung nach 25 min. bei 450 nm messen.

Standards: Recombinantes humanes VEGF165

Tab. 6: Normalwerte des Herstellers: n= 37 (keine Angaben zu Geschlecht und Alter)

Mittelwert (pg/ml)

Streubreite (pg/ml)

220

62-707

Sensitivität: 9 pg/ml

Tab. 7: Präzision VEGF-ELISA

 

Mittelwert (pg/ml)

Variationskoeffizient V.K. (%)

Intra-Assay

235

< 5

Inter-Assay

388

7

Quelle: R&D Systems Durchführungsvorschrift

Abb. 8: Mikrotiterplatte

Tab. 8: Bearbeitungsschema (Kontrollen [KO], Standard [ST], Patientenmaterial [Pat])

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

KO 1

KO 1

ST 8

ST 8

Pat 8

Pat 8

Pat 16

Pat 16

Pat 24

Pat 24

Pat 32

Pat 32

B

ST 1

ST 1

Pat 1

Pat 1

Pat 9

Pat 9

Pat 17

Pat 17

Pat 25

Pat 25

Pat 33

Pat 33

C

ST 2

ST 2

Pat 2

Pat 2

Pat 10

Pat 10

Pat 18

Pat 18

Pat 26

Pat 26

Pat 34

Pat 34

D

ST 3

ST 3

Pat 3

Pat 3

Pat 11

Pat 11

Pat 19

Pat 19

Pat 27

Pat 27

Pat 35

Pat 35

E

ST 4

ST 4

Pat 4

Pat 4

Pat 12

Pat 12

Pat 20

Pat 20

Pat 28

Pat 28

Pat 36

Pat 36

F

ST 5

ST 5

Pat 5

Pat 5

Pat 13

Pat 13

Pat 21

Pat 21

Pat 29

Pat 29

Pat 37

Pat 37

G

ST 6

ST 6

Pat 6

Pat 6

Pat 14

Pat 14

Pat 22

Pat 22

Pat 30

Pat 30

Pat 38

Pat 38

H

ST 7

ST 7

Pat 7

Pat 7

Pat 15

Pat 15

Pat 23

Pat 23

Pat 31

Pat 31

KO 2

KO 2


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2.2.4.  Quantitative Bestimmung von IGF-1 im Serum

Verwendet wurde der ACTIVETM Non-Extraction IGF-1 ELISA der Firma DSL Deutschland, Sinsheim. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem IGF-1-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

  1. Verdünnung der Proben: 20 νl Serum in ein Polypropylenröhrchen pipettieren und mit 990 νl Probenpuffer 1 mischen, 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 990 νl Probenpuffer 2 hinzugeben, mischen.
  2. Pipettieren der IGF-1-Standards A-E (IGF-1 in Proteinpuffer [BSA]) in den Konzentrationen von 0 ;7 ng/ml; 8 ng/ml; 60 ng/ml; 167 ng/ml; 580 ng/ml), der Kontrolle 1 (niedrige IGF-1-Konzentration) und Kontrolle 2 (hohe IGF-1-Konzentration), sowie des vorbehandelten Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 20 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten.
  3. 100 νl Assaypuffer (Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben, auf einem Horizontalschüttler (500-600rpm) für 2h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Die Vertiefungen absaugen und 5´ mit 350 νl Waschlösung (gepufferte Salzlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
  5. 100 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte IGF-1-Antikörper) in jede Vertiefung geben, 30 min. bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
  6. 5´ mit 350 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
  7. 100 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] in Zitratpuffer mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. 100 νl Stopplösung (0,2 M Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
  9. Absorption der Lösung nach 30 min. bei 450 nm messen.

Standards: Die Standards wurden gegen die WHO-Referenzpräparation 87/518 kalibriert.

Normalwerte des Herstellers:

Abb. 9: IGF-1-Werte von Frauen in Abhängigkeit des Alters


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Sensitivität : 0,01 ng/ml

Tab. 9: Präzision IGF-1-ELISA

 

Mittelwert (ng/ml)

Variationskoeffizient V.K. (%)

Intra-Assay

250

< 5

Inter-Assay

250

6

Quelle: DSL Durchführungsvorschrift

Es wurde zusätzlich ein laborinterner Intra-Assay durchgeführt:

Tab. 10: Intra-Assay IGF-1

N= 25

Mittelwert (ng/ml)

Standardabweichung (ng/ml)

Variationskoeffizient V.K. (%)

 

176,9

14,91

8,4


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2.2.5.  Quantitative Bestimmung von IGFBP-3 im Serum

Verwendet wurde der ACTIVETM IGFBP-3 ELISA der Firma DSL Deutschland, Sinsheim. Die 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit einem polyklonalen IGFBP-3-Antikörper beschichtet.

Durchführungsvorschrift:

  1. Verdünnung der Proben: 20 νl Serum werden 1:100 mit Nullstandard (Proteinpuffer [BSA]) verdünnt.
  2. Pipettieren der IGFBP-3-Standards A-F (IGFBP-3 in Proteinpuffer [BSA] in den Konzentrationen von 0; 2 ng/ml; 5 ng/ml; 20 ng/ml; 50 ng/ml; 100 ng/ml), der Kontrolle 1 (niedrige IGFBP-3-Konzentration) und Kontrolle 2 (hohe IGFBP-3-Konzentration), sowie des vorbehandelten Probenmaterials in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Dabei je 25 νl des Materials in zwei Vertiefungen einbringen, um Doppelbestimmungen zu erhalten.
  3. 50 νl Assaypuffer ( Proteinpuffer [BSA]) in jede Vertiefung geben, auf einem Horizontalschüttler (500-600 rpm) für 2h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Die Vertiefungen absaugen und 5´ mit 350 νl Waschlösung (gepufferte Salzlösung) waschen, auf Fließpapier trocken klopfen.
  5. 100 νl Antikörper-Enzym-Konjugat (an Meerrettichperoxidase [HRP] gekoppelte IGFBP-3-Antikörper [Ziege, polyklonal] ) in jede Vertiefung geben, 1h bei Raumtemperatur auf dem Horizontalschüttler inkubieren.
  6. 5´ mit 350 νl Waschlösung waschen und auf Fließpapier trocken klopfen.
  7. 100 νl Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin [TMB] in Zitratpuffer mit Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung geben, auf dem Horizontalschüttler für 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. 100 νl Stopplösung (0,2 M Schwefelsäure) in jede Vertiefung geben.
  9. Absorption der Lösung nach 30 min. bei 450 nm messen.

Standards: Die Standards wurden gegen den recombinant DNA-derived non-glycosylated human IGFBP-3-Standard der Firma Celtrix Pharmaceutical Inc. kalibriert.

Tab. 11: Normalwerte des Herstellers: Frauen n=33

Mittelwert (ng/ml)

Median (ng/ml)

Standardabweichung (ng/ml)

Streubreite (ng/ml)

3820

3800

690

2670-5580

Sensitivität: 0,04 ng/ml

Tab. 12: Präzision IGFBP-3-ELISA:

 

Mittelwert (ng/ml)

Variationskoeffizient V.K. (%)

Intra-Assay

2743

9,5

Inter-Assay

2513

10,4

Quelle: DSL Durchführungsvorschrift

Es wurde zusätzlich ein laborinterner Intra-Assay durchgeführt:


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Tab. 13: Intra-Assay IGFBP-3:

N= 24

Mittelwert (ng/ml)

Standardabweichung (ng/ml)

Variationskoeffizient V.K. (%)

 

3433

112,8

3,29


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2.2.6.  Auswertung

Die Messung der Absorption erfolgte an dem Mikrotiterplattenmeßgerät 400 SF der Firma SLT. Für die Umrechnung der optischen Dichten in Konzentrationen wurde das PC-Programm Synelisa 3.0 der Firma Elias Medizintechnik, Freiburg, Deutschland verwendet. Es wurde damit eine Spline-Approximation OD/OD max.% durchgeführt und so eine Eichkurve erstellt, mit Hilfe derer die Patientenwerte berechnet wurden.

Beispiel:

Abb. 10: Eichkurve für VEGF

2.3. Statistik

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows. Für jede Haupt- und Subgruppe wurden Median und Mittelwert berechnet und graphisch aufgetragen. Da die Gruppen nicht normalverteilt sind, erfolgte für den Vergleich der Gruppen die Durchführung des nichtmetrischen Mann-Whitney-Tests für unabhängige Stichproben. Für den Vergleich mit Tumorpatientinnen einer früheren Studie erfolgte die Durchführung des T-Test für unabhängige Stichproben. Die Ergebnisse wurden auf Signifikanzen geprüft. Dabei wurden p-Werte unter 0,05 als signifikant betrachtet.

2.4. Erstellung der Diagramme

Für die Erstellung der Diagramme wurde das PC-Programm Microsoft Excel verwendet.


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HTML-Version erstellt am:
17.02.2004