1 Einleitung

1.1  Das Hepatitis-B-Virus (HBV)

1.1.1  Struktur und Genomorganisation

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Das humane HBV gehört zur Familie der Hepadnaviridae [1] und zum Genus Orthohepadnavirus. Alle Hepadnaviren sind durch ihren Lebertropismus charakterisiert und nur in sehr kleinen Mengen auch in Nieren, Pankreas und mononukleären Zellen der infizierten Organismen zu finden. Tierische Viren dieser Familie, wie das Waldmurmeltier (woodchuck)-Hepatitis-Virus (WHV), das Erdhörnchen (ground squirrel)-Hepatitis-Virus (GSHV) und das Enten (duck)-Hepatitis-B-Virus (DHBV), dienen häufig als Modellsysteme in der Hepatitisforschung. Die infektiösen, sphärischen Viruspartikel des HBV (auch nach seinem Entdecker Dane-Partikel genannt) haben einen Durchmesser von ca. 42 nm und sind von einer Lipidhülle umgeben, die die 3 viralen Oberflächenproteine enthält. Hauptbestandteil der Hülle ist das kleine Oberflächenprotein (SHBs), während das mittlere (MHBs) und das große (LHBs) Oberflächenprotein zu gleichen Teilen zusammen etwa 30 % der Hüllproteine ausmachen [2,3] (Abb. 1.1). Innerhalb der Virionhülle befindet sich das ikosaedrische Nukleokapsid, das aus 90 oder 120 Core-Protein-Dimeren aufgebaut ist. Es umschließt das offen zirkuläre, partiell doppelsträngige, mit der viralen Polymerase assoziierte DNA-Genom, das je nach Genotyp 3181–3221 bp groß ist.

Abbildung 1.1: Aufbau des HBV (nach Preikschat [4]).

Die zirkuläre Genomstruktur entsteht durch die Überlappung der kohäsiven 5'-Enden des Plus- und Minus-DNA-Stranges in einem Bereich von 226 bp zwischen den direct repeat (DR)-Sequenzen 1 und 2 (Abb. 1.2). Der vollständige Minusstrang ist also nicht kovalent geschlossen, sondern bleibt am sogenannten nick des HBV-Genoms offen. Er bindet an seinem teilweise redundanten 5'-Ende das terminale Protein der viralen Polymerase. Der Plusstrang umfasst nur einen Teil des Genoms und bindet an seinem 5'-Ende ein RNA-Oligomer mit Cap-Struktur. Das hochkomplexe Genom enthält 4 teilweise überlappende offene Leserahmen (ORF), die in verschiedenen Leserastern abgelesen werden. Der präC/Core (C)-ORF kodiert für das Präcore- und das Core-Protein, der präS/S-ORF für die 3 Oberflächenproteine, der P-ORF für die virale Polymerase (auch P-Protein genannt) und der X-ORF für das X-Protein (HBx). Vier Promotoren und 2 Enhancer, deren Sequenzen ebenfalls mit denen der ORFs überlappen, regulieren die Genexpression.

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Abbildung 1.2: Genomorganisation des HBV.

Die Koordinaten des Genoms (Genotyp A) sind relativ zur einzigen EcoRI-Schnittstelle angegeben. Dargestellt ist die partiell doppelsträngige DNA mit der Polymerase am 5’-Ende des vollständigen Minusstrangs und dem RNA-Oligomer mit Cap-Struktur am unvollständigen Plusstrang sowie den Positionen der direct repeats (DR1 und 2). Die regulatorischen cis-Elemente der Transkription sind als rechteckige und kreisförmige Symbole gezeigt. Die inneren Pfeile repräsentieren die ORFs mit ihren Startkodons (AUG). Die äußeren Pfeile stellen die viralen Transkripte in 5'-3'-Orientierung mit ihren teilweise heterogenen Transkriptionsstartorten (Pfeilspitzen) dar. Alle Transkripte haben ein gemeinsames 3'-Ende am Polyadenylierungssignal. Modifiziert nach Moolla et al. [5].

Gegenwärtig werden, basierend auf Sequenzabweichungen von mindestens 8 %, 8 Genotypen (A–H) von HBV unterschieden, die eine charakteristische geographische Verteilung aufweisen [6]. In Deutschland wie auch im restlichen Nordwesteuropa und Nordamerika sind die Genotypen A und D am häufigsten. Genotyp-A-Genome sind durch eine Insertion von 6 Nukleotiden (nt) am 3'-Ende des C-Gens charakterisiert, während Genotyp-D-Genomen 33 nt in der präS1-Region fehlen. Anhand der Antigenität der Oberflächenproteine wird HBV außerdem in 4 Serotypen (ayw, adw, adr, ayr) eingeteilt.

1.1.2 Replikation

Die ersten Schritte des Replikationszyklus sind aufgrund eines mangelnden Modellsystems für deren Untersuchung nicht gut charakterisiert. Das Virus gelangt durch Endozytose über einen noch unbekannten Rezeptor in die Leberzelle. Dabei spielen die viralen Oberflächenproteine und insbesondere das myristoylierte LHBs mit den N-terminalen Aminosäuren (AS) 2–48 eine Rolle [7,8,9,10,11,12,13]. Nach dem Eintritt des Nukleokapsids ins Zytoplasma wird es zum Kern transportiert und entlässt die partiell doppelsträngige virale DNA in den Nukleus [14] (Abb. 1.3). Diese wird nach Entfernung des gecapten RNA-Oligomers und der viralen Polymerase durch die zelluläre DNA-Polymerase zu einem kovalent geschlossenen, zirkulären (ccc) DNA-Doppelstrang komplettiert.

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Die cccDNA dient als Matrize für die anschließende Transkription der viralen mRNAs (0,7 kb, 2,1 kb, 2,4 kb, 2 x ca. 3,5 kb) durch die zelluläre RNA-Polymerase II, wobei jede mRNA von ihrem eigenen Promotor transkribiert wird und alle an einem gemeinsamen Polyadenylierungsort enden. Alle RNAs werden anschließend durch eine 5'-Cap-Struktur und durch 3'-Prozessierung sowie Polyadenylierung modifiziert. Ein Teil der 3,5-kb-RNAs und nach neuesten Erkenntnissen auch der subgenomischen präS2/S-mRNA wird gespleißt [15,16]. Die Rolle dieses Spleißens im HBV-Replikationszyklus ist bisher unbekannt, da die Translation aller essentiellen viralen Proteine im Zytoplasma von ungespleißten mRNAs stattfindet. Von der subgenomischen präS2/S-mRNA (2,1 kb) werden das MHBs und SHBs, von der präS1-mRNA (2,4 kb) das LHBs und von der X-mRNA (0,7 kb) das HBx synthetisiert. Zur Transkription der beiden ca. 3,5 kb großen RNAs wird das Polyadenylierungssignal beim ersten Passieren überlesen und erst in der zweiten Runde benutzt, so dass terminal redundante RNAs mit Übergenomlänge entstehen. Sie unterscheiden sich in ihrer Größe am 5'-Ende um ca. 30 nt. Die längere präC-mRNA kodiert ausschließlich für das HBeAg. Dagegen dient die kürzere der beiden, die prägenomische RNA (pgRNA), nicht nur zur Translation des Core-Proteins und der Polymerase, sondern auch als Matrize für die Replikation des viralen Genoms durch reverse Transkription.

Abbildung 1.3: Der Replikationszyklus des HBV.

Das infektiöse Virion bindet über einen noch unbekannten Rezeptor an den Hepatozyten. Das Nukleokapsid tritt ins Zytoplasma ein und gibt die relaxiert zirkuläre (rc), virale DNA in den Nukleus frei, wo sie zu ihrer ccc-Form komplettiert wird. Die cccDNA dient als Matrize für die Transkription der genomischen und subgenomischen RNAs, die im Zytoplasma translatiert werden. Core-Protein und Polymerase, die von der prägenomischen RNA (pgRNA) exprimiert werden, interagieren mit dem Prägenom und assemblieren zu neuen Nukleokapsiden. Durch reverse Transkription der pgRNA wird der komplette DNA-Minusstrang synthetisiert. Durch die virale DNA-Polymeraseaktivität wird anschließend die DNA-Plusstrang-Synthese gestartet. Die reifen Kapside entlassen ihre DNA entweder zurück in den Nukleus oder sie werden exportiert, wobei sie im endoplasmatischen Retikulum (ER) mit den Oberflächenproteinen interagieren und umhüllt werden. Leere Hüllen (subvirale Partikel) werden im Überschuss zu den Viria sekretiert. Modifiziert nach „www.biology.kenyon.edu/slone/bio38/scuderi/parti.html“.

Zur Initiation der reversen Transkription bindet die virale Polymerase im Zytoplasma nach Interaktion mit zellulären Chaperonen (z. B. Hsp90 und Hsp60 [17,18]) an die Haarnadel-Struktur (stem loop) des sogenannten Verpackungssignals ε am 5'-Ende des Prägenoms. Dadurch wird die Verpackung des Komplexes in das sich aus Dimer-Untereinheiten des Core-Proteins bildende Nukleokapsid ausgelöst und die reverse Transkription der pgRNA initiiert [19,20,21]. In ca. 90 % der Fälle wird die Polymerase mit ihrer eigenen mRNA verpackt [22].

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Die reverse Transkription und Bildung der zirkulären, partiell doppelsträngigen DNA sind detailliert in Abb. 1.4 erklärt (siehe auch Übersichtsarbeiten [23] und [3]). Das terminale Protein der Polymerase (beim DHBV die OH-Gruppe des Tyrosins an AS-Position 63) dient als Proteinprimer für die Synthese eines 3–4 nt langen DNA-Primers mit einem Teil der Schlaufe von ε als Matrize (Abb. 1.4A). Danach wird dieser Initiationskomplex aus Polymerase und DNA-Primer an eine aufgrund der terminalen Redundanz des Prägenoms am 3'-Ende vorhandene komplementäre Region (r) verlagert (Abb. 1.4B), wo der Primer an DR1 bindet.

Abbildung 1.4: Modell der reversen Transkription und der DNA-Plusstrang-Synthese des HBV.

A) Initiation der DNA-Minusstrang-Synthese. Die Polymerase (P) bindet an die Schlaufe von ε am 5'-Ende der pgRNA (dünne Linie) und synthetisiert 3–4 nt mit der ε-Sequenz als Matrize. B) Das Tetranukleotid mit der Polymerase wird zur komplementären Sequenz im direct repeat (DR) 1 am 3'-Ende der pgRNA transferiert. Von hier aus erfolgt die DNA-Minusstrang-Synthese (dicke Linie). C) Während der Minusstrang-Synthese wird die pgRNA-Matrize durch die RNaseH-Aktivität der Polymerase verdaut. D) Am 3'-Ende des komplett synthetisierten Minusstrangs verbleibt ein nicht verdauter Rest der pgRNA als Primer. E) Der RNA-Primer wechselt vom DR1 zum DR2 am 5'-Ende des DNA-Minusstrangs und initiiert von dort die Plusstrang-Synthese (Doppellinie). F) Der Plusstrang wird bis zum 5'-Ende des Minusstrangs verlängert. Die End-Region ist terminal redundant und findet sich daher sowohl am 5'- (5'r) als auch am 3'-Ende (3'r). G) Durch Bindung des Plusstrangs an die komplementäre 3'r-Region zirkularisiert das Genom. Die Plusstrang-Synthese wird vom 3'r aus weiter geführt. H) Die Elongation des Plusstranges führt zur relaxiert zirkulären (RC) DNA-Form des HBV-Genoms. I) Wird die Plusstrang-Synthese ohne Primer-Translokation vom DR1 aus initiiert (in situ priming) entsteht eine doppelsträngige, lineare (DL) DNA. Nach Liu et al. [24].

Von hier aus erfolgt die Synthese des DNA-Minusstrangs durch die Reverse-Transkriptase-Aktivität der Polymerase, wobei zeitgleich die pgRNA durch deren RNaseH-Aktivität abgebaut wird (Abb. 1.4C). Nur die letzten 17–18 nt am 5'-Ende der pgRNA inklusive DR1 und Cap-Struktur bleiben erhalten (Abb. 1.4D). Diese dienen nach ihrer Verlagerung an die komplementäre Sequenz des DR2 am 5'-Ende des DNA-Minusstrangs als Primer für die Synthese des DNA-Plusstrangs durch die DNA-Polymerase-Aktivität der viralen Polymerase (Abb. 1.4E). Gelangt die Elongation dabei an das 5'-Ende des Minusstrangs, erfolgt eine weitere Translokation der Polymerase an die redundante komplementäre Region r an dessen 3'-Ende und die Fortsetzung der Plusstrang-Synthese von dort. Dies bewirkt die Zirkularisierung des Genoms zur relaxiert zirkulären (rc) DNA (Abb. 1.4G, H). Bleibt der Matrizenwechsel von DR1 zu DR2 aus, kann die Synthese des Plusstrangs auch von DR1 erfolgen (sogenanntes in situ priming), so dass ein doppelsträngiges, lineares DNA-Molekül entsteht (Abb. 1.4I). Die Bedeutung dieser DNA-Form für die Replikation in vivo ist noch ungeklärt. Abgesehen von ε, DR1, DR2 und r wurden kürzlich weitere in cis agierende Regionen identifiziert, die für die Synthese des Minus- oder Plusstrangs und die korrekte Bildung der rcDNA eine wichtige Rolle spielen [24,25,26,27]. Vermutlich tragen sie dazu bei, die für die verschiedenen Translokationen entscheidenden Bereiche der pgRNA bzw. des DNA-Minusstrang in die richtige Konformation und räumliche Nähe zu bringen. Ihre genaue Charakterisierung steht jedoch noch aus.

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Nur reife Nukleokapside mit einem partiell doppelsträngigen DNA-Genom werden in einem post-Endoplasmatischen-Retikulum (ER)-/prä-Golgi-Kompartiment mit den in der ER-Membran eingelagerten Oberflächenproteinen umhüllt und über den konstitutiven sekretorischen Weg aus der Zelle freigesetzt [28,29,30] (Abb. 1.3). Während für die Verpackung der pgRNA und die DNA-Synthese eine Phosphorylierung des Core-Proteins nötig ist [31,32,33], dient wahrscheinlich die Dephosphorylierung der reifen Nukleokapside als Signal für deren Umhüllung und Sekretion [34]. Zur Umhüllung ist außerdem die spezifische Interaktion von bestimmten LHBs- und SHBs-Regionen mit dem Nukleokapsid essentiell [35,36]. Leere, nicht infektiöse subvirale Partikel (HBsAg), die aus den drei Oberflächenproteinen bestehen, können im Vergleich zu infektiösen Viren in 10000fachen Überschuss ins Blut ausgeschüttet werden. Besonders in der frühen Phase der Infektion entlassen reife Kapside ihre DNA auch wieder in den Nukleus, was zu einem Anstieg an cccDNA führt [37] (Abb. 1.3). Dieser Prozess wird vermutlich durch die Oberflächenproteine, insbesondere durch LHBs, reguliert, da das Fehlen von LHBs zu einem deutlichen Anstieg der cccDNA im Kern führt [38,39].

1.1.3 Regulatorische Elemente

Die virale Genexpression wird durch vier Promotoren kontrolliert, die ihrerseits durch zwei Enhancer (Enh) und diverse Transkriptionsfaktoren reguliert werden [5] (Abb. 1.2).

Der Core-Promotor (Cp) reguliert die Transkription der beiden 3,5 kb langen RNAs, der präC-mRNA und der pgRNA. Damit spielt er einerseits eine zentrale Rolle für die Steuerung der Virusreplikation und Translation von Core-Protein und Polymerase von der pgRNA und regelt andererseits die Synthese des HBeAg von der präC-mRNA. Der Initiationsort der längeren präC-mRNA liegt ca. 30 nt stromaufwärts vom Startpunkt der kürzeren pgRNA. Innerhalb des Cp werden beide RNAs von überlappenden, aber genetisch distinkten Promotorsequenzen getrennt reguliert [40,41]. Der Cp besteht aus dem basalen Core-Promotor (BCP, nt 1742–1849; gezählt von der einzigen EcoRI-Schnittstelle), der für die Initiation der Transkription beider mRNAs ausreichend ist, und den Core stromaufwärts regulierenden Sequenzen (CURS, nt 1634–1742), die die Aktivität der Transkription beider mRNAs bestimmen [42] (Abb. 1.5A). Die CURS kann weiter in 2 Domänen unterteilt werden. Die CURS-A (nt 1636–1703) hat mit den Sequenzmotiven α (nt 1644–1666), γ (nt 1671–1686) und δ (nt 1687–1703) einen positiven, die CURS-B mit der β-Box (nt 1702–1713) einen negativen regulatorischen Effekt auf den BCP.

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Abbildung 1.5: Core-Promotor (Cp) / EnhancerII (EnhII): Bindungsorte für Transkriptionsfaktoren.

A: Der Aufbau des Cp/EnhII mit dem basalen Cp (BCP), den α- und β-Boxen der core upstream regulatory sequence (CURS) und dem negativ regulierenden Element (NRE) sind mit Ausschnitten aus der Genotyp-A-Sequenz (Valenzuela [43]) schematisch dargestellt. B: Die bekannten Bindungsorte für leberspezifische und ubiquitäre Transkriptionsfaktoren sind mit ihren Positionen angegeben. COUP-TF1, ARP1 (Apolipoprotein A1 regulatorisches Protein 1), RXR und PPAR binden im BCP am selben Ort wie HNF4. Für Abkürzungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis. Modifiziert nach Preikschat [4].

Weiterhin kann ein negativ regulierendes Element (NRE, nt 1611–1634 [44] bzw. NRE γ nt 1576–1626 laut [45]) die Aktivität des Cp Zelltyp-abhängig unterdrücken. Die BCP-Region enthält Bindungsorte für ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, wie Sp1 und das TATA-bindende Protein (TBP), und für viele leberspezifische Transkriptionsfaktoren der Kernrezeptor-Superfamilie, wie z. B. die Leberzellkernfaktoren (HNF) 3 und 4, Retinoid-X-Rezeptor (RXR), Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor α (PPARα) oder den chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 1 (COUP-TF1, Abb. 1.5B) [46]. Diese sind wichtig für die leberspezifische Promotoraktivität [47] und für die Feinabstimmung der Transkription der pgRNA und der präC-mRNA, die durch die Bindung der verschiedenen Faktoren sehr unterschiedlich beeinflusst wird [46,41,48]. Die aktivierende CURS-α-Box bindet zusätzlich u. a. das leberspezifische CCAAT/Enhancer-bindende Protein (C/EBP) oder verwandte Transkriptionsfaktoren (z. B. E4BP4) [49], den Fetoprotein-Transkriptionsfaktor (FTF) und den Hepatozyten-Leukämiefaktor (HFL, Abb. 1.5B) [5].

Die Transkription der LHBs-kodierenden 2,4-kb-präS1-mRNA wird durch den S1-Promotor (S1p, Genotyp A: nt 2716–2806) gesteuert (Abb 1.2). Er enthält als einziger HBV-Promotor eine klassische TATA-Box, hat Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren HNF1, TBP, Sp1, NF1 und HNF3 und wird durch Sequenzen im stromabwärts liegenden S2/S-Promotor negativ reguliert [5]. Der S2/S-Promotor (S2/Sp, Genotyp A: nt 2989–3216) reguliert die von allen HBV-RNAs am stärksten transkribierte präS2/S-mRNA, von der MHBs und SHBs translatiert werden. Er enthält ein CCAAT-Motiv, das die Produktion der präS2/S-mRNA stimuliert und die der präS1-mRNA unterdrückt. Sieben transkriptionelle Elemente mit teilweise funktioneller Redundanz binden Transkriptionsfaktoren, wie z. B. Sp1 [5]. Des Weiteren wird der S2/S-Promotor durch Akkumulation von LHBs im ER und die resultierende Induktion von ER-Stress stimuliert [50].

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Die Synthese der 0,7-kb-mRNA für HBx erfolgt unter der Kontrolle des X-Promotors (nt 1171–1361), der mit dem 3'-Ende des EnhI überlappt [51]. Er enthält u. a. Bindungsorte für die Transkriptionsfaktoren NF1, C/EBP, ATF, AP1/Jun-Fos und das regulatorische X-Promotor-Binde-Protein (X-PBP) [5]. Das Tumorsuppressorprotein p53 kann ebenfalls binden und die Funktion des Promotors unterdrücken [52].

Der EnhI (nt 957–1361) [53] stimuliert insbesondere den X-Promotor und den Cp, in geringerem Maße aber auch die Transkription der beiden Oberflächen-mRNAs, und wird durch die Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren reguliert [5]. Er besteht aus 3 Domänen: dem 5' modulatorischen Element (ca. nt 957–1050), der zentralen Core-Domäne (nt 1050–1171) und der 3'-Domäne (nt 1171–1361), die mit dem X-Promotor überlappt. In der Core-Domäne, die starken Einfluss auf die HBV-Replikation hat [53], befinden sich u. a Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren HNF3, NF1, HNF4, RXRα-PPARα, COUP-TF1 und STAT3. Die 5'- und 3'-Elemente können durch Bindung weiterer Faktoren (z. B. C/EBP und HNF1) die Aktivität der Core-Domäne ca. 10fach steigern. Der EnhII überlappt stromaufwärts des BCP mit der CURS des Cp und hat einen stimulierenden Einfluss auf alle vier Promotoren (Abb. 1.5). Er setzt sich aus der α-Box (siehe oben, nt 1644–1666) und β-Box (nt 1702–1713) der CURS zusammen und funktioniert nur bei Kooperation der beiden Regionen [54]. Wie beim Cp wird seine Funktion durch die Interaktion diverser Transkriptionsfaktoren bestimmt, die an die CURS-Boxen binden. Noch stärker als der Cp wird die Aktivität des EnhII durch die NRE negativ beeinflusst [44]. Neuere Daten weisen auf eine wichtige Rolle der beiden Enh in der globalen und zeitlichen Regulation der HBV-Transkription hin [55]. Erst nach der Aktivierung des EnhI und der durch ihn regulierten frühen Genexpression des HBx beginnt die durch den EnhII regulierte Expression der späten (aller übrigen) Gene. Somit ist der EnhI autonom und essentiell für EnhII-Aktivität [55].

Neben den Promotoren und den Enh spielt auch das posttranskriptionell regulatorische Element (PRE, nt 1203–1515) eine Rolle in der HBV-Genexpression [56]. Es agiert in cis auf RNA-Level und fördert den Export ungespleißter Transkripte, die das PRE enthalten, vermutlich durch die Bindung zellulärer Proteine [57,58,59]. Die Bindung des Autoantigens La an das PRE ist entscheidend für die Stabilität der RNAs [60,61].

1.1.4 Virale Genprodukte

1.1.4.1  Produkte des C-ORF

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Der C-ORF kodiert für das Core-Protein und das HBeAg. Er hat zwei in frame befindliche Startkodons, wobei die Region zwischen dem ersten (präC-ATG) und zweiten (C-ATG) Startkodon als präC-Region bezeichnet wird (Abb. 1.2).

Ausgehend vom C-ATG wird von der pgRNA im Zytoplasma das Core-Protein (21 kD) synthetisiert, das je nach Genotyp 183 bzw. 185 AS (Genotyp A: 185 AS) lang ist. Es ist N-terminal durch eine Assemblierungsdomäne (AS 1–144) und C-terminal ca. ab AS 150 durch eine argininreiche, nukleinsäurebindende Region charakterisiert, die für die Verpackung der pgRNA und Replikation benötigt wird [62]. Nach Expression bildet das Core-Protein sofort Homo-Dimere [63], die durch Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an Position 61 stabilisiert werden [64,65]. Neunzig oder 120 Dimere assemblieren spontan zusammen mit dem Prägenom-Polymerase-Komplex zum ikosaedrischen Partikel (Nukleokapsid), in dem auch zelluläre Faktoren, wie Chaperone und eine Proteinkinase, mitverpackt werden [33,66,67]. Basierend auf elektronenmikroskopischen Daten wurde ein Strukturmodell erarbeitet, nach dem das Core-Protein aus vier α-Helices besteht, wobei die beiden inneren eine antiparallele Haarnadelstruktur bilden [68]. Die aus den Haarnadelstrukturen bestehenden Spikes liegen an der Oberfläche des Nukleokapsids und tragen das immunodominante HBcAg-B-Zellepitop (AS 74–89) [69]. Aufgrund der porösen Struktur der Kapsidoberfläche können Nukleotide frei ins und aus dem Kapsidlumen diffundieren.

Von der präC-mRNA wird, vom präC-ATG ausgehend, das Präcore-Polypeptid synthetisiert, das mit seinen im Vergleich zum Core-Protein N-terminal zusätzlichen 29 AS ein Vorläufer des HBeAg ist. Die in diesem Bereich lokalisierte Signalpeptidsequenz vermittelt den Transport des Proteins in das ER-Lumen [70], wo 19 AS am N-Terminus durch eine Signalpeptidase entfernt werden. Verbleibende AS der präC-Region verhindern eine Multimerisierung des Proteins. Durch weitere Abspaltung von AS am C-Terminus entsteht das 17 kD große HBeAg. Dieses wird von der Zelle sezerniert und zirkuliert im Blut, wo es serologisch nachweisbar ist [71]. Es wird weder für die Replikation noch für die Morphogenese oder Infektion benötigt. Aufgrund der ähnlichen Sequenzen von HBeAg und Core-Protein, haben beide überlappende T- und B-Zellepitope. Vermutlich hat das HBeAg eine duale Rolle. Während zytosolisches HBeAg Ziel einer inflammatorischen Immunantwort ist, scheint HBeAg im Serum eine immunregulatorische Funktion auszuüben, indem es T-Zell-Toleranz auslöst und damit auch eine HBcAg-spezifische zytotoxische T-Zell (CTL)-Antwort hemmt [72,73].

1.1.4.2 Produkte des S-ORF

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Die Translation der 3 C-terminal identischen HBV-Oberflächenproteine LHBs, MHBs und SHBs wird in frame an drei verschiedenen ATGs initiiert, die den S-ORF in die 3 Domänen präS1, präS2 und S teilen (Abb. 1.2). Das große LHBs (400 AS) besteht aus der präS1-Region (AS 1–119), der präS2-Region (AS 120–174, gezählt vom Start der präS1-Domäne fortlaufend bis zum Start der S-Domäne) und der S-Region (AS 1–226). Das mittlere MHBs (281 AS) enthält die präS2- und S-Domänen, und das kleine SHBs (226 AS) besteht lediglich aus der S-Domäne. Die Gesamtheit der Oberflächenproteine bildet das so genannte HBs-Antigen (HBsAg), das Bestandteil der Virushülle ist, aber zum Großteil als sphärische oder filamentöse nichtinfektiöse HBsAg-Partikel von der infizierten Zelle sezerniert wird. Die sphärischen Partikel enthalten nur wenige Moleküle des LHBs, während ihr Anteil in den Filamenten höher, in den Viria aber am höchsten ist.

Die S-Domäne aller 3 Oberflächenproteine ist am Asparagin 146 und die präS2-Domäne im MHBs, aber nicht im LHBs, am Asparagin 124 N-glykosyliert [74,75]. Das LHBs ist am Glycin 2 myristoyliert [76]. Die Oberflächenproteine werden am ER synthetisiert und zeigen eine komplexe Membrantopologie [28].

Das SHBs bzw. die S-Domäne verfügt über 4 Transmembranregionen [77], wobei der N-Terminus zur luminalen Seite, die AS 23–79 als Schleife zur zytosolischen Seite, die AS 99–169 als Schleife wiederum zur luminalen Seite der ER-Membran zeigen und die C-terminalen AS 170–226 eingebettet in die Membran vorliegen. Die luminale Schleife wird nach dem Budding auf der externen Oberfläche des Virions exponiert und trägt das Hauptepitop des HBsAg, die sogenannte „a“-Determinante, und 2 Subtypdeterminanten (d oder y bzw. w oder r).

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Beim MHBs liegen die N-terminal zusätzlichen 55 AS im ER-Lumen, und die Transmembranorganisation der S-Domäne ist mit der des SHBs identisch. Die Funktion des MHBs ist noch nicht gut verstanden, da das Protein an sich nicht essentiell für die Virusinfektion, Replikation, Morphogenese oder Sekretion zu sein scheint [78]. Gleichzeitig wird jedoch das für das MHBs spezifische N-Glykan für die Virion-Sekretion benötigt [79].

Bei der LHBs-Synthese wird zunächst nur die S-Domäne zum Teil in die ER-Membran inseriert, während die präS1- und präS2-Domänen sowie der N-Terminus des S auf der zytosolischen Seite verbleiben. Erst posttranslational werden bei etwa der Hälfte der Moleküle die präS-Regionen in das ER-Lumen transloziert [80,81,82]. Aufgrund der dualen Topologie des LHBs kann sich im Virion also die auf der Oberfläche exponierte präS-Region an Infektion und Rezeptorbindung beteiligen [11,12,83], während die präS-Domäne im Inneren des Virions zur Morphogenese mit dem Nukleokapsid interagieren kann [35,36,84]. Außerdem kann die präS2-Region bei zytosolischer Orientierung in der Zelle, wie im LHBs oder bei einer trunkierten Form des MHBs, als transkriptioneller Aktivator auf eine Reihe von Promotoren wirken [85,86,87,88,89]. Weiterhin enthält die präS2-Region ein Zell-Permeabilitäts-Motiv (TLM), dem eine Rolle bei der Fusion und Internalisierung der Viruspartikel zugeschrieben wird [90].

1.1.4.3 Polymerase

Das beginnend von einem internen Startkodon auf der pgRNA translatierte Polymerase-Protein ist je nach Genotyp 834–845 AS lang (Genotyp A: 845 AS) und hat ein Molekulargewicht von 90 kD. Es vermittelt die Verpackung des Prägenoms in das Nukleokapsid und synthetisiert darin das HBV-Genom. Das Protein, dessen ORF mit allen anderen des HBV-Genoms überlappt, setzt sich aus vier funktionellen Domänen zusammen [91]. N-terminal befindet sich die bei der Initiation der reversen Transkription als Proteinprimer fungierende Domäne des terminalen Proteins (AS 1–179) [92]. Sie wird gefolgt von einer Spacer-Region ohne enzymatische Aktivität (AS 180–348). An diese schließt sich die zentrale Domäne an, die bei der Minusstrangsynthese als Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) und bei der Elongation des Plusstranges als DNA-abhängige DNA-Polymerase aktiv ist (AS 349–692). Die virale Polymerase besitzt keine Proof-reading-Aktivität. Das hochkonservierte katalytische Zentrum ist das YMDD-Motiv (Tyrosin-Methionin-Aspartat-Aspartat). Strukturmodelle konnten bisher nur begrenzt anhand der Homologie zur retroviralen Reversen Transkriptase erstellt werden [93,94]. C-terminal ist die RNaseH-Domäne lokalisiert (AS 693–845), die für die Entfernung der pgRNA nach der reversen Transkription sorgt.

1.1.4.4 X-Protein

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Das nicht-strukturelle X-Protein des HBV (17 kD, 154 AS) agiert sowohl im Zytoplasma als auch im Kern infizierter Zellen. Ihm werden vielfältige, regulatorische Funktionen zugeschrieben, aber seine tatsächliche Rolle im HBV-Replikationszyklus ist nach wie vor ungeklärt. Grund hierfür sind Schwierigkeiten, das Protein im Kontext eines replizierenden Genoms (ohne Überexpression) nachzuweisen, und die Nutzung unterschiedlichster Testbedingungen. Zusammenfassend sind folgende Erkenntnisse festzuhalten: In einigen Systemen wie transgenen Mäusen und der humanen Hepatomazelllinie HepG2 wurde eine Steigerung der Replikation durch HBx beobachtet [95,96,97,98,99]. HBx wirkt als Transaktivator auf diverse Promotoren, u. a. indem es mit Komponenten der Transkriptionsmaschinerie oder Transkriptionsfaktoren wie dem TATA- oder dem cAMP-response-element-bindenden Protein TBP bzw. CREB interagiert, oder Transkriptionsfaktoren wie NFκB und AP1 beeinflusst [100,101]. Es hat selbst keine DNA-bindenden Eigenschaften. HBx kann verschiedene zytoplasmatische Signaltransduktionswege stimulieren, wobei vermutlich die Modulation des Kalziumspiegels im Zytosol durch HBx eine größere Rolle spielt [96,101]. Des Weiteren beeinflusst HBx Prozesse wie Apoptose, Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur [102,100,99]. Aufgrund von Sequenzhomologien des X-ORF zu Kunitztyp-ähnlichen Serinprotease-Inhibitoren wird vermutet, dass das HBx als Proteasehemmer wirken könnte [103]. Es wurde gezeigt, dass HBx sowohl als Substrat als auch als Inhibitor des Proteasoms agiert [104]. Auch eine Rolle bei der Entstehung des hepatozellulären Karzinoms wird diskutiert [105,106].

Die AS 52–148 sind essentiell für die diversen, beobachteten Eigenschaften des HBx [107]. Insbesondere liegen Transaktivierungsdomänen bei den AS 60–76 und AS 110–139 [108], während die AS 1–20 eine negativ regulierende Funktion für die Transaktivierung ausüben [109,110].

1.2  Die HBV-Infektion

1.2.1  Klinische Formen der Hepatitis B

Das HBV wird durch Blut und Blutprodukte bzw. durch sexuellen Kontakt über virushaltige Körperflüssigkeiten übertragen. Eine HBV-Infektion kann abhängig vom Alter bei Infektion, dem Infektionsmodus und dem Immunstatus inapparent, akut, fulminant oder chronisch verlaufen. Bei immunkompetenten Erwachsenen heilt die akute Hepatitis meist aus und resultiert in einer lebenslangen Immunität. In weniger als 1 % der Fälle kommt es zur fulminanten Hepatitis B, die in ca. 70 % in rasantem Tempo zum Leberversagen führt. Ca. 5 % der infizierten immunkompetenten Erwachsenen entwickeln eine chronische Hepatitis B, d. h. eine länger als 6 Monate andauernde Persistenz von HBsAg. Sie kann von einer asymptomatischen Form bis zur chronisch-aktiven Hepatitis mit fortschreitender Leberschädigung und Entwicklung einer Leberzirrhose (LZ) reichen. Häufig kommt es auch bei milden Verläufen mit niedriger Virämie immer wieder zu Schüben mit erhöhten Alaninaminotransferase (ALAT)-Werten, die eine Leberschädigung anzeigen. In allen Fällen ist die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC) möglich. Eine vertikale Übertragung des Virus, meist perinatal von der Mutter auf das Kind, resultiert in etwa 90 % der Fälle, häufig ohne Auftreten einer akuten Phase, in einer chronischen Hepatitis, die nach vielen Jahren ohne Symptome über eine LZ zum HCC führen kann.

1.2.2 Pathogenese der HBV-Infektion

↓12

Das Wildtyp (Wt)-HBV selbst ist nicht zytopathogen, was erklärt, warum viele chronische HBV-Träger trotz starker viraler Replikation keine Symptome zeigen [111]. Die Pathogenese der Hepatitis B wird vielmehr durch das wirtseigene Immunsystem hervorgerufen. Es wurde gezeigt, dass die antigenspezifische antivirale zelluläre Immunantwort eine Reihe von unspezifischen Effektorsystemen auslöst, die in ihrer Gesamtheit sowohl zur Viruselimination als auch zur Leberzellschädigung führen können (siehe Übersichtsarbeit [112]). Dennoch ist die Immunantwort auf HBV und ihre Rolle in der Pathogenese noch nicht vollständig verstanden.

Die Heilung einer akuten selbstlimitierenden Hepatitis B ist typischerweise mit einer starken T-Zellantwort assoziiert. Dabei liegt sowohl eine starke MHC-Klasse-II-restringierte CD4+ T-Helfer (Th)-Zellantwort gegen HBc/HBeAg, Polymerase und eine schwächere gegen die Oberflächenproteine vor als auch eine ausgeprägte polyklonale MHC-Klasse-I-restringierte CD8+ CTL-Anwort gegen multiple Epitope aller viralen Proteine [113,114]. Die HBV-spezifischen CTLs erkennen und vernichten infizierte Zellen. Die Viruselimination erfolgt vermutlich jedoch hauptsächlich durch einen nichtzytolytischen Mechanismus, bei dem eine durch HBV-spezifische T-Zellen vermittelte Ausschüttung inflammatorischer Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNFα) und Interferon γ (IFNγ) die Hemmung der viralen Genexpression und Replikation bewirkt [115,116,117,118,119]. Da das Ausmaß der Leberzellschädigung nicht mit dem Auftreten und der Zerstörung durch CTLs korreliert [120], sind wahrscheinlich auch sekundäre, durch CTLs ausgelöste nichtantigenspezifische Nebenprodukte der inflammatorischen Antwort, wie z. B. TNF, freie Radikale oder Proteasen, und/oder andere Immunzellen, wie natürliche Killerzellen, darin involviert [121,113].

Bei chronisch Infizierten ist eine CTL-Antwort kaum nachweisbar [114]. Eine ineffektive Immunantwort und insbesondere fehlende oder mangelhafte T-Zell- und CTL-Antworten gegen HBcAg/HBeAg sind wahrscheinlich entscheidend für die Viruspersistenz [122]. Die hohe Chronifizierungsrate nach einer vertikalen Mutter-Kind-Übertragung lässt sich mit der neonatalen Immuntoleranz erklären [123]. Bei Erwachsenen können Faktoren wie eine hohe Viruslast zu Beginn der Infektion, der HLA-Typ, eine Immunsuppression, eine gehemmte Präsentation viraler Antigene oder das Auftreten von Virusmutanten, die sich der Antigenerkennung durch T-Zellen und Antikörper entziehen, zu einem chronischen Verlauf beitragen.

↓13

Antikörper werden (auch bei chronischer Infektion) gegen alle viralen Proteine produziert. Die Antikörper gegen HBsAg wirken neutralisierend, d. h. sie blockieren die Virusausbreitung im Blut und können vor einer Reinfektion schützen. Die bereits in der frühen Phase der Infektion auftretenden und lebenslang nachweisbaren Antikörper gegen HBcAg sind dagegen nicht virusneutralisierend. Ihre Bedeutung ist unklar, genauso wie die der Antikörper-Antwort gegen Epitope des P- und des X-Proteins. Antikörper gegen HBeAg treten meist mit oder nach dem Verschwinden von HBeAg aus dem Serum auf und können dann über Jahre persistieren. In einer chronischen Infektion ist die Serokonversion zu Anti-HBeAg meist mit einem starken Abfall der Viruslast, Abnahme der Entzündungsaktivität und daher mit einer guten Prognose assoziiert [124]. Reaktivierungen sind aber nicht ausgeschlossen.

1.2.3 Besonderheiten der HBV-Infektion bei immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern

Niereninsuffiziente Patienten, die Dialyse benötigen, gehören zu den Hochrisikogruppen für eine HBV-Infektion, obwohl das Infektionsrisiko in Westeuropa und Nordamerika durch verbesserte Diagnostik und Hygienemaßnahmen bereits deutlich reduziert werden konnte [125]. Bei ihnen verlaufen HBV-Infektionen meist mild, werden aber aufgrund einer stark veränderten T-Zell-vermittelten Immunität zu einem hohen Prozentsatz chronisch (80 % im Vergleich zu 15 % bei nichturämischen Patienten) [126,127,128]. Auch HBV-Impfungen schlagen in diesen Patienten nur schlecht an [129]. Erfolgt eine Nierentransplantation, wird der Patient zur Verhinderung von Abstoßungsreaktionen permanent immunsupprimiert. Meist werden verschiedene Immunsuppressiva mit synergistischem Effekt kombiniert. Neben Glukokortikoiden (Prednisolon, Methylprednisolon) werden inzwischen häufig u. a. Azathioprin, Mycophenolat Mofetil, Ciclosporin A, FK506 und Rapamycin eingesetzt. Nach der Nierentransplantation und Immunsuppression besteht bei Transplantierten mit chronischer HBV-Infektion ein deutlich erhöhtes Risiko für die Entwicklung schwerer Lebererkrankungen [130]. Nach einer langen Phase sehr milder Hepatitis kommt es häufig zu einer fortschreitenden Verschlechterung der Leberfunktion, Entwicklung einer LZ mit Leberversagen und erhöhter Letalität [131,132,133]. Es konnte gezeigt werden, dass die schweren Verläufe mit einer Akkumulation und Persistenz von HBV-Varianten mit komplexen Mutationen im Cp, Deletionen im C-Gen und zum Teil mit zusätzlichen Deletionen in der präS-Region assoziiert waren (siehe unten) [134]. Da eine Immunpathogenese in diesen Patienten äußerst unwahrscheinlich ist, könnten die komplexen Varianten eine Rolle bei der Entwicklung der schweren Lebererkrankung spielen. Außerdem ist bekannt, dass Glukokortikoide die HBV-Replikation und -Proteinexpression steigern können, indem sie über ein zytoplasmatisches Rezeptorprotein an ein glucocorticoid responsive element (GRE) [135] auf dem HBV-Genom binden [136,137]. Auch dies könnte zur negativen Entwicklung des Krankheitsverlaufs beitragen. Generell ist der Einfluss der Immunsuppression auf HBV und Pathogenese jedoch nach wie vor wenig untersucht [138].

Eine weitere besondere Verlaufsform der chronischen Hepatitis bei Nierentransplantatempfängern [139] und anderen stark immunsupprimierten Patienten (z. B anderen Transplantatempfängern [140] oder HIV-Koinfizierten [141]) ist die fibrosierende cholestatische Hepatitis (FCH). Sie ist charakterisiert durch ein plötzlich einsetzendes, rasantes Leberversagen bei starker Virusreplikation, aber nur moderater Entzündungsreaktion und kaum immunvermittelter Leberschädigung [142]. Daher wird auch hier ein Zusammenhang der Pathogenese mit einem direkten zytopathischen Effekt durch bestimmte HBV-Varianten vermutet, die eine Überexpression und intrazelluläre Akkumulation von HBV-Proteinen zeigen [142,143,144].

1.2.4  Therapie

↓14

Da eine chronische Hepatitis B mit Entzündungsaktivität, insbesondere bei HBeAg-positiven Patienten, mit einem stark erhöhten Risiko für die Entwicklung einer LZ oder eines HCC einhergeht [145,146], werden solche Patienten mit dem Ziel der Verbesserung der Leberwerte, einer Reduzierung der Viruslast und einer Serokonversion zu Anti-HBeAg therapiert. Eine komplette Heilung der Infektion mit dauerhaftem Verschwinden der HBV-DNA und Serokonversion von HBsAg zu Anti-HBs wird zur Zeit nur sehr selten (1–5 % der Patienten) erreicht.

Für die Behandlung steht zum einen das immunstimulatorische Zytokin Interferon α (IFNα) zur Verfügung. Es ist in ca. 30 % der Fälle wirksam und führt zur anhaltenden Unterdrückung der Virusreplikation, verbunden mit einer Serokonversion von HBeAg zu Anti-HBeAg und einer Verbesserung der Leberfunktionswerte [147]. Allerdings geht die IFNα-Therapie mit starken Nebenwirkungen einher und ist für Immunsupprimierte (wie z. B. Nierentransplantierte) und Patienten mit schwerer Lebererkrankung aufgrund der Immunstimulation ungeeignet.

Seit einiger Zeit wird daher das Nukleosidanalogon Lamivudin (3TC), und seit 2002/2003 auch das Nukleotidanalogon Adefovir (ADV), zur Therapie eingesetzt [113]. Diese Substanzen bewirken eine direkte, starke Hemmung der Virusreplikation durch Kettenabbruch bei der Synthese der viralen DNA durch die Reverse Transkriptase. Beide führen zu einem schnellen Absinken der Viruslast, sind gut verträglich und für alle Patientengruppen einsetzbar [148]. Problematisch ist jedoch die Selektion von Resistenzmutationen, die nach einem Jahr bei ca. 18–20 % der mit 3TC und bei ca. 2 % der mit Adefovir behandelten Patienten auftreten. Außerdem findet keine Eliminierung der viralen cccDNA im Kern statt, so dass auf die Beendigung der Therapie Rezidiven der chronischen Infektion folgen. Das früher verwendete Nukleosidanalogon Famciclovir (FCV) wird aufgrund seiner geringen Wirksamkeit, der notwendigen hohen Dosierung und der häufigen Entwicklung von Resistenzen heute nicht mehr eingesetzt. Seit März 2005 ist ein zusätzlicher, hochwirksamer Hemmstoff der HBV-Polymerase, das Nukleosidanalogon Entecavir, von der U.S.-amerikanischen Food and Drug Administration FDA zur Behandlung von HBV-Infektionen freigegeben [149]. Entecavir wirkt auch bei 3TC-resistenten HBV, und bisher wurden nach einem Jahr Therapie keine Entecavir-Resistenzmutationen beobachtet. Weitere Nukleosid-/Nukleotidanaloga wie Tenofovir und Emtricitabine befinden sich in unterschiedlichen Phasen der klinischen Erprobung.

1.3 HBV-Varianten

1.3.1  Entstehung und Selektion von HBV-Varianten

↓15

Während der HBV-Replikation entstehen durch fehlerhaften Nukleotideinbau der HBV-Polymerase bei der reversen Transkription aufgrund der abwesenden Proof-reading-Funktion in hohem Maße Punktmutationen im gesamten Genom. Die Fehlerrate der HBV-Polymerase ist dabei vergleichbar mit anderen bekannten Reversen Transkriptasen der Retroviren [150]. Auch Fehler der zellulären RNA-Polymerase bei der Synthese der pgRNA tragen zur Mutationsrate bei. Da durch die überlappenden Leserahmen im komplexen HBV-Genom jedoch viele Nukleotidaustausche nicht toleriert werden und zu Polymerase- und replikationsdefekten Viren führen [151], liegt die Häufigkeit von Punktmutationen bei HBV in vivo zwischen der anderer DNA- und RNA-Viren [150,152]. Zusätzlich entstehen Deletionen und Insertionen, vermutlich durch Prozesse wie template-switching der Polymerase während der reversen Transkription, Spleißen der pgRNA, TopoisomeraseI-Spaltung und Ligation der HBV-DNA oder nicht-homologe Rekombination linearer HBV-DNA-Moleküle [153].

Somit bestehen HBV-Populationen in vivo aus einer Mischung verschiedenster Varianten (Quasispezies), die sich individuell innerhalb des Wirtes entwickelt hat und durch Faktoren wie immunselektiven Druck oder antivirale Therapie beeinflusst werden kann. Verschiedene Stadien einer chronischen Hepatitis scheinen durch Varianten mit unterschiedlichen Mutationsmustern charakterisiert zu sein [124]. Im Verlauf einer Infektion können Varianten selektiert und angereichert werden, die der Situation im Wirt besser angepasst sind und gegenüber dem Wt Vorteile wie eine verstärkte Replikation, Immun-escape- oder Resistenzmutationen haben. Allerdings können sich Varianten in der Population nur halten, wenn ihre Replikationsfähigkeit erhalten bleibt. Viele Varianten, die aufgrund defekter Core- oder Oberflächenproteine nicht eigenständig replizieren oder keine kompletten Viren bilden können, benötigen zum Überleben die trans-Komplementation durch den Wt. Dabei werden defekte Varianten-Proteine durch die funktionstüchtigen Proteine eines Wt, der dieselbe Zelle infiziert hat, ersetzt [154]. Nur die Trans-Komplementation der Polymerase ist ineffizient, da diese bevorzugt mit der eigenen pgRNA verpackt wird [22]. Daher führen Mutationen, die die Funktion der Polymerase beeinträchtigen, häufig zu vollständig replikationsunfähigen Varianten. Gleiches kann für ungünstige Sequenzveränderungen in anderen, nichtkodierenden, für die pgRNA-Synthese oder Replikation essentiellen Bereichen, wie z. B. dem Verpackungssignal ε oder den DR, gelten. Grundsätzlich ist die Variabilität des HBV-Genoms durch die Überlappung der verschiedenen ORFs und regulatorischen Sequenzen stark eingeschränkt, da ein Nukleotidaustausch meist mehr als nur eine Funktion beeinflusst.

1.3.2 Häufig auftretende Varianten

In natürlich auftretenden HBV-Varianten sind Mutationen in allen Genabschnitten und regulatorischen Sequenzen beschrieben worden, von denen einige mit bestimmten Verlaufsformen der Hepatitis in Verbindung gebracht wurden (für eine umfassende Übersicht siehe Referenzen [124,155,153]).

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Varianten, die aufgrund von Mutationen in der präC-Region kein HBeAg synthetisieren, treten besonders bei chronischer Hepatitis während der Serokonversion zu Anti-HBeAg auf. Gleiches gilt für Punktmutationen im C-Gen, die meist in den immundominanten Epitopen außerhalb der Sequenzen für Dimerisierung und Assemblierung lokalisiert sind. Deletionen im C-Gen liegen vorwiegend in frame in der zentralen Region, so dass die Funktion der Polymerase nicht zerstört wird. Die häufigsten Mutationen im Cp/EnhII stellen Nukleotidaustausche bei nt 1762 (A>T) und 1764 (G>A) dar. Sie führen, wie auch andere Cp-Mutationen, zu verminderter HBeAg-Synthese und wurden vermehrt bei Patienten mit aktiver chronischer bzw. fulminanter Hepatitis nachgewiesen. Mutationen im Cp, insbesondere Deletionen und Insertionen, resultieren meist auch in einer Verschiebung des Leserasters und Trunkierung des X-Proteins. Die Oberflächenproteine mutieren u. a. in der immunogenen a-Determinante und entgehen damit dem selektiven Druck durch protektive und neutralisierende Anti-HBs-Antikörper, die während einer natürlichen Infektion oder nach einer Impfung gebildet werden. Deletionen im präS-Bereich wurden mit fulminanter Hepatitis, FCH und/oder HCC in Verbindung gebracht. Sie können die Balance der stark regulierten Oberflächenproteinexpression stören und damit eine intrazelluläre Akkumulation und zytotoxische Wirkung der Oberflächenproteine verursachen. In der Polymerase werden während antiviraler Therapie Resistenzmutationen selektiert. Klassische Resistenzmutationen gegen 3TC sind AS-Austausche im hochkonservierten aktiven Zentrum (YMDD-Motiv) der reversen Transkriptase.

1.3.3 HBV-Varianten bei Immunsupprimierten, insbesondere bei Nierentransplantierten

Viele dieser HBV-Varianten treten auch oder sogar bevorzugt in immunsupprimierten Patienten auf. Dazu zählen u. a. Mutationen im Cp/X-Gen, die dort z. B. neue HNF1-Bindungsorte schaffen [156,157,158], Deletionen im C-Gen [159] und präS-Bereich [140,156] sowie Punktmutationen im S-Gen [160] bzw. Stoppkodonmutationen im präS- und S-Bereich [134].

In Langzeit-immunsupprimierten Nierentransplantierten konnte gezeigt werden, dass die Akkumulation und Persistenz von komplexen Varianten mit Deletionen/Insertionen im Cp/X-Gen, Deletionen im C-Gen und teilweise zusätzlichen Deletionen in der präS-Region signifikant mit schwerer Lebererkrankung und der Entwicklung von LZ assoziiert waren [134]. Die Deletionen und Insertionen im Cp traten im Verlauf der Infektion zuerst auf und waren allein noch nicht mit LZ assoziiert. Später im klinischen Verlauf reicherten dann zusätzlich Deletionen im C-Gen und/oder präS-Bereich an. Die Akkumulation der komplexen Varianten ging der Diagnose einer LZ in der Regel um 0,5 bis 1,5 Jahre voraus. Die genaue Größe und Position der Deletionen/Insertionen konnte sich von Patient zu Patient deutlich unterscheiden. Generell waren zu Beginn des Verlaufs Cp-Deletionen am häufigsten, die später durch zusätzliche Insertionen ergänzt wurden. Die C-Gendeletionen waren in frame und lagen meist im zentralen Bereich des Core-Proteins (AS 77–114). Obwohl in einem Patienten mehrere verschiedene Typen von Deletionen in C-Gen und präS-Region auftraten, akkumulierte davon meist nur einer in späteren Stadien der Erkrankung. In allen Patienten koexistierten jedoch zu nahezu allen Zeitpunkten Genome mit den verschiedensten Kombinationen von Mutationen und verursachten eine große Heterogenität der HBV-Population. Da aufgrund der Immunsuppression in diesen Patienten eine ausschließlich immunvermittelte Pathogenese der LZ unwahrscheinlich ist (vgl. Abschnitt 1.2.3), ist eine direkte Rolle der HBV-Varianten in der Pathogenese zu vermuten. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass ein günstigerer Verlauf der Lebererkrankung zu beobachten war, wenn die komplexen Varianten selektiv nach antiviraler Therapie mit 3TC oder nach Absetzen der Immunsuppression verschwanden [159]. Letzteres macht außerdem deutlich, dass die komplexen Varianten offensichtlich während der Immunsuppression einen Selektionsvorteil haben.

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Generell wurden Varianten mit Deletionen im C-Gen über längere Zeit hauptsächlich in Patienten mit einer verminderten Immunantwort gefunden. So wurden sie neben den Transplantierten unter medikamentöser Immunsuppression [159,161] auch bei chronisch Infizierten in der Immuntoleranzphase [124], in durch vertikale Übertragung infizierten Patienten [162] und in Patienten ohne Anti-HBcAg [163,164] nachgewiesen. Nach Transplantationen scheinen C-Gendeletionsvarianten insbesondere bei seit langem HBV-infizierten Nierentransplantierten ohne vorhergehenden Leberschaden, aber (abgesehen von seltenen Ausnahmen) nicht bei de novo infizierten Herztransplantierten oder bei aufgrund von Leberversagen Lebertransplantatierten aufzutreten [161]. In immunkompetenten chronisch infizierten Patienten waren C-Gendeletionsvarianten, im Gegensatz zu den Immunsupprimierten, zunächst mit einer Aktivierung der Hepatitis, dann aber mit verbesserter Leberfunktion und sinkender Viruslast (d. h. einer guten Prognose) assoziiert und verschwanden während der HBe-/Anti-HBe-Serokonversion [162].

Auch Deletionen und Insertionen im Cp, die neue HNF1-Bindungsorte schaffen, akkumulierten grundsätzlich besonders in Patienten mit reduzierter Immunantwort, wie z. B. in Herz-, Leber- oder Nierentransplantierten [156,165,157] oder anderen Immunsupprimierten [166,167]. Eine 11-nt-Insertion im Cp war dabei mit dem Auftreten von fulminanter Hepatitis verbunden [166,156]. Bei Stimulation der Immunantwort, Serokonversion zu Anti-HBeAg oder in der HBeAg-negativen Phase in immunkompetenten Patienten verschwanden die HNF1-Varianten[168], was den Vorteil auch dieser Varianten bei unterdrückter Immunantwort demonstriert.

Varianten mit verschiedensten Deletionen in der präS-Region können sowohl in immunsupprimierten als auch in immunkompetenten Patienten auftreten und akkumulieren [153,124]. Dabei waren Varianten mit präS1-Deletionen bei Immunsupprimierten nach Herztransplantation mit fulminanter Hepatitis [156] und nach Lebertransplantation mit FCH [140] und intrazellulärer Virusretention [169] assoziiert. In einem lebertransplantierten Patienten mit fulminanter Hepatitis trat eine ungewöhnliche Kombination verschiedener AS-Austausche im S-Gen auf, die zur Retention der Oberflächenproteine im ER und einer stark reduzierten Virussekretion führte [160].

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Im Gegensatz zur Studie von komplexen Varianten in Nierentransplantierten wurden in vielen der zitierten Arbeiten zu Mutationen in Cp, C-Gen und präS-Region nur Teilbereiche des HBV-Genoms analysiert. Daher bleibt in diesen Fällen unklar, ob neben den untersuchten noch weitere Mutationen in anderen Genomabschnitten vorlagen.

1.4 Funktionelle Analyse von HBV-Genomen

Zur Untersuchung der Rolle von HBV-Varianten in der Pathogenese der chronischen Hepatitis B sind funktionelle Analysen, d. h. die Charakterisierung ihrer Replikation, Transkription, Proteinexpression etc., erforderlich. Vor allem die Evaluierung der Replikation ist nur bei in voller Länge eingesetzten HBV-Genomen möglich.

1.4.1  Modellsysteme

Zurzeit steht für funktionelle Analysen von HBV-Genomen oder komplexen HBV-Populationen kein zufriedenstellendes Tiermodell zur Verfügung. Aufgrund des engen Wirtsspektrums des HBV sind Schimpansen und die nahe mit Primaten verwandten Spitzmäuse Tupaia belangeri die einzigen bekannten mit HBV infizierbaren Tiere. Schimpansen kommen jedoch wegen hoher Kosten und eingeschränkter Verfügbarkeit (Ethik, Tierschutz) nicht für diese Untersuchungen in Frage, während eine niedrige Infektionseffizienz die Einsetzbarkeit der Tupaias beeinträchtigt [170,171]. Tiermodelle wie die Ente oder das Waldmurmeltier, die sich mit den animalen Hepadnaviren DHBV und WHV infizieren lassen, sind nur eingeschränkt auf das humane System übertragbar. Es wurden diverse transgene Maus-Modelle entwickelt, bei denen HBV entweder über in Mauschromosomen integrierte HBV-DNA produziert wird [172] oder immundefizienten Mäusen menschliche oder Tupaia-Hepatozyten transplantiert wurden [173,174,175,176]. Dies erlaubt die Untersuchung spezifischer Fragestellungen, z. B. der Immunpathogenese, spiegelt jedoch nicht die natürliche Infektion wider. Ein großes Problem dieser Modelle ist außerdem der Mangel an gesunden primären menschlichen Hepatozyten für die Transplantation der Mäuse. Daher wurden kürzlich erstmals auch Tupaia-Hepatozyten dafür verwendet [177].

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Aber auch in-vitro -Zellkultur-Experimenten sind Grenzen gesetzt, da nur primäre Hepatozyten direkt mit HBV infizierbar sind und auch diese in Zellkultur sehr schnell nonpermissiv für die HBV-Infektion werden. Als Alternative zu den schwer verfügbaren humanen Hepatozyten werden auch hier inzwischen Tupaia-Hepatozyten eingesetzt [178,13,179,180]. Zusätzlich kann die natürliche Variabilität der primären Hepatozyten für konstante Ergebnisse zum Problem werden. Erst seit kurzem existiert eine infizierbare Hepatozyten-Zelllinie (HepaRG), die inzwischen für erste Untersuchungen insbesondere der frühen Schritte des HBV-Replikationszyklus eingesetzt wird [12,181]. Funktionelle Analysen werden gegenwärtig am häufigsten mittels Transfektion von HBV-DNA in humane Hepatomazelllinien (meist HuH7 oder HepG2) durchgeführt. Die Zelllinien produzieren nach Transfektion wie in vivo replikative Intermediate, alle RNA-Transkripte und Proteine sowie subvirale und infektiöse Viruspartikel. Große Vorteile des in-vitro-Transfektionssystems sind die Verfügbarkeit und die kostengünstige Haltung der Zellen sowie die relativ unkomplizierte Durchführung der Experimente. Nachteile sind die niedrige Effizienz der Transfektion im Vergleich zur Infektion und die daraus resultierenden Probleme beim Nachweis der viralen Proteine, Nachkommen-Viren etc. Außerdem ist nach wie vor unklar, ob sich, wie in der natürlichen Infektion, im Zellkern cccDNA anreichert. Da keine Infektion der Zellen erfolgt, ist das in-vitro-Transfektionssystem für Untersuchungen zur Aufklärung der ersten Schritte des Replikationszyklus ungeeignet.

Die HBV-DNA wird üblicherweise kloniert, entweder in Form von monomeren Genomen [182], als Tandem-Dimer [183,184] oder als HBV-Genom mit 1,3facher Länge, für die Transfektion eingesetzt. In beiden letzteren Fällen ist keine Rezirkularisierung des Genoms zur Transkription der RNAs und Replikation nötig. Um Speziesbarrieren zu umgehen, Replikation und Genexpression zu steigern und das Feld der Untersuchungsmöglichkeiten zu erweitern, wurden Systeme wie z. B Adenovirusvektoren [185,171] oder das rekombinante Baculovirussystem [186,187] entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Ein entscheidender Vorteil der nach einer Methode von Günther et al. [182] hergestellten HBV-Monomer-Klone ist die Möglichkeit, sie direkt aus Patienten-Proben zu klonieren und ohne weitere zeitaufwendige Manipulation für die Transfektion einzusetzen. Dies lieferte die Voraussetzung für strukturelle und funktionelle Analysen von großen Anzahlen natürlich auftretender HBV-Genome aus heterogenen Populationen, wie sie in der vorliegenden Arbeit an den mit LZ in Nierentransplantierten assoziierten Varianten [134] durchgeführt wurden.

1.4.2 Funktionelle Analysen von künstlich generierten Hybridgenomen

Die meisten funktionellen Analysen von in Patienten beobachteten HBV-Varianten wurden durchgeführt, indem mutierte Abschnitte oder auffällige individuelle Mutationen einzeln in ein Wt-Genom eingebracht wurden. Auf diese Weise konnten gezielt die Auswirkungen genau dieser Mutationen auf den Phänotyp im Vergleich zum Wt-HBV untersucht werden. Auch im Falle der komplexen Varianten bei Nierentransplantierten wurden bereits solche Hybridgenome funktionell charakterisiert, die entweder den Cp [157] oder das C-Gen mit Deletion [188] der Varianten im Kontext eines Wt-Genoms enthielten. Sie zeigten einen deutlich vom Wt abweichenden Phänotyp. Hybridvarianten mit C-Gendeletionen, die aufgrund des defekten Core-Proteins allein nicht replikationsfähig waren, replizierten bei Komplementation mit ausreichend Wt-Core-Protein verstärkt [188] und reicherten sich nach Kotransfektion mit einem Wt-Genom an [189,188]. Die im Cp verschiedene neue HNF1-Bindungsorte schaffenden Mutationen, wie z. B. eine 11-nt-Insertion bei nt 1776/1777 oder eine 8-nt-Deletion bei nt 1763-1770, führten ebenfalls zu verstärkter Replikation, häufig in Kombination mit reduzierter Expression der Oberflächen-mRNAs, der Oberflächenproteine LHBs und MHBs sowie verminderter Sekretion von HBsAg [156,190,157].

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Es ist jedoch inzwischen bekannt, dass die Auswirkungen von Mutationen durch weitere Mutationen im selben oder in anderen Genomabschnitten stark beeinflusst, z. B. kompensiert oder verstärkt, werden können [191,192,193,194]. Daher bleibt unklar, ob sich die phänotypischen Konsequenzen einzeln analysierter Mutationen oder mutierter Regionen auch im Kontext eines komplexen Mutationsmusters wiederfinden. Um den Beitrag viraler Faktoren zur Pathogenese und ihre Interaktion mit der Zelle verstehen zu können und um Zusammenhänge zwischen klinischen Verläufen und bestimmten HBV-Varianten aufzuklären, sind also funktionelle Analysen von kompletten HBV-Genomen, wie sie im Patienten vorliegen, erforderlich.

1.4.3 Funktionelle Analysen von kompletten, natürlich auftretenden Genomen

Trotz der Erkenntnis, dass komplette Genome mit vielen Mutationen einen anderen Phänotyp als konstruierte Hybridgenome haben können, wurden bisher nur wenige funktionelle Analysen von in voller Länge klonierten und sequenzierten, natürlich auftretenden HBV-Varianten durchgeführt (für eine kurze Übersicht siehe Referenz [195]). Gründe dafür sind sicherlich der enorme experimentelle Aufwand und die Schwierigkeit, konkrete Schlussfolgerungen aus den komplexen Ergebnissen zu ziehen.

In einigen Studien wurde ausschließlich die Replikationseffizienz von kompletten Varianten untersucht [156]. Dabei wurden bei der strukturellen und funktionellen Analyse von HBV-Isolaten aus chinesischen Patienten mit HCC Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen stark replizierenden Varianten und der Pathogenese gefunden [196]. Die umfassende funktionelle Charakterisierung von HBV-Varianten aus 2 Patienten mit Reaktivierung nach latenter, HBsAg-negativer HBV-Infektion konnte dagegen deren verminderte Replikationskompetenz und teilweise defekte HBsAg-Expression nachweisen [16]. Eine große Anzahl natürlich vorkommender Varianten mit verschiedenen Cp-Punktmutationen (insbesondere bei nt 1762/1764 plus weiterer Punktmutationen, z. B. bei nt 1753 und/oder 1766) wurden aus Seren chronischer HBeAg-positiver HBV-Träger untersucht [192]. Replikationseffizienz, HBeAg- und HBsAg-Expression sowie Virussekretion schwankten, abhängig vom detaillierten Mutationsmuster im Cp, erheblich. Der Einfluss der zusätzlich außerhalb des Cp vorliegenden Mutationen wurde jedoch nicht diskutiert. Um den Zusammenhang zwischen viralen Veränderungen und dem Fortschreiten der Erkrankung zu klären, sequenzierten und transfizierten Kajiya et al. direkt die Produkte einer Gesamtgenom-PCR aus mehreren Serumproben eines chronisch infizierten Patienten [197]. Dabei war das Auftreten von Mutationen im präS-Bereich und im Cp mit einer erhöhten Replikation und vermindertem HBsAg und HBeAg sowie mit dem Aufflammen der Hepatitis assoziiert.

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Die bisher intensivsten funktionellen Analysen kompletter Genome wurden an HBV aus Patienten mit fulminanter Hepatitis durchgeführt [198,199,200,160,156]. Jedoch wurden kein spezifisches Mutationsmuster und kein gemeinsamer Phänotyp, der für die Entwicklung der fulminanten Hepatitis verantwortlich gemacht werden konnte, gefunden. Es wurden lediglich bei vielen Genomen verschiedene Cp-Mutationen nachgewiesen.


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14.11.2006