3 Die Patienten und ihre HBV-Populationen

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Die Grundlage der vorliegenden Arbeit bilden im Rahmen der Dissertation von Petra Preikschat durchgeführte Untersuchungen der HBV-Populationen von 38 Langzeit-immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern über Zeiträume von 6 Monaten bis zu 6 Jahren [134,4]. Alle Patienten hatten eine chronische HBV-DNA-positive Hepatitis und waren HBeAg-positiv und Anti-HBe-negativ. Die HBV-Populationen wurden durch Sequenzierung einzelner klonierter Gesamt-Genome aus Seren und Lebergewebeproben charakterisiert. Varianten wurden anhand ihrer Hauptmutationen (Deletionen/Insertionen) verschiedenen Typen zugeordnet (Abb. 3.1D und 3.2D), deren Auftreten und Anteil an der gesamten HBV-Population im Zeitverlauf der Krankheit analysiert wurden. Basierend auf den von Petra Preikschat beschriebenen klinischen Daten und charakterisierten HBV-Populationen wurden für diese Arbeit 2 repräsentative Patienten ausgewählt, die unter der typischen Entwicklung der HBV-Populationen mit Akkumulation und Persistenz der komplexen Varianten eine LZ ausgebildet hatten. Die funktionelle Analyse wurde beispielhaft mit einigen dieser komplexen Varianten durchgeführt. Im Folgenden werden die Patienten und ihre HBV-Populationen kurz vorgestellt.

3.1  Patient A

3.1.1  Klinik

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Der Patient A („1D“ in Dissertation Preikschat [4] und „12“ in Preikschat et al. [134]) erwarb die Infektion mit HBV des Genotyps A während der Dialyse, die seit 12/83 infolge von Niereninsuffizienz bei der Grunderkrankung Glomerulonephritis nötig war. 05/95 erhielt er eine Nierentransplantation und entwickelte eine klinisch meist unauffällige chronische Hepatitis. Die immunsuppressive Therapie erfolgte mit Methylprednisolon, FK506 und Azathioprin. Nach einem starken Anstieg der Transaminasen 11/95 wurde sonographisch ein beginnender Leberumbau nachgewiesen und 02/96 eine LZ diagnostiziert. Die daraufhin 03/96 begonnene, nicht erfolgreiche FCV-Therapie wurde 04/96 auf 3TC umgestellt, mit dem Ergebnis einer drastischen Reduktion der Viruslast. Dies ermöglichte eine erfolgreiche kombinierte Leber-Nieren-Transplantation (07/96). Unter fortgesetzter 3TC-Therapie blieb der Patient im Beobachtungszeitraum bis 11/2001 klinisch unauffällig (Abb. 3.1A).

Abbildung 3.1: Klinische Parameter und Entwicklung der HBV-Populationen des Patienten A im Zeitverlauf.

A: Dargestellt sind im Beobachtungszeitraum von 01/93 bis 02/97 durch Hybridisierung bestimmte HBV-DNA-Titer, Alaninaminotransferase (ALAT)-Konzentrationen als Parameter für die Leberfunktion, Therapie mit Famciclovir (FCV) und Lamivudin (3TC) sowie die Zeitpunkte der Diagnose der LZ und kombinierten Leber-Nieren-Transplantation (LTx/NTx). Oben sind die Zeitpunkte der Isolierung der 5 detailliert untersuchten HBV-Genome gezeigt. B: Zusammensetzung der HBV-Populationen in den jeweiligen Serum- bzw. Leberproben aus den in D dargestellten Variantentypen. Die Hauptvarianten eines Zeitpunktes sind fett gedruckt. C: Schematische Darstellung der Häufigkeit (%) von Wt-ähnlichen Genomen (Typ A) und Variantentypen E und J, die akkumulierten und nacheinander die Hauptpopulation bildeten, in den Viruspopulationen im Zeitverlauf. D: Darstellung der durch Klonierung von Gesamtgenom und Sequenzierung der C-Gen-, präS- und Cp/EnhII-Bereiche charakterisierten HBV-Variantentypen. Oben ist zur Orientierung das HBV-Genom schematisch gezeigt. Deletionen sind durch Rechtecke dargestellt (nt 1763–1770 im Cp, nt 2130–2219 im C-Gen [AS 77–106 des Core-Proteins], AS 65–79, 108–124, 140–141 und 121–141 im präS1/2-Bereich). Kleine Dreiecke kennzeichnen eine Insertion von TTAATCATTAG bei nt 1776/1777 im BCP. Große Dreiecke zeigen eine Duplikation der α-Box im Cp/EnhII. Modifiziert nach Preikschat et al. [134].

3.1.2 HBV-Populationen

Ab 07/92 wurden 7 HBV-Populationen verschiedener Seren und der explantierten Leber des Patienten über einen Zeitraum von 5 Jahren charakterisiert (Abb. 3.1). Innerhalb der ersten 10 Monate des Untersuchungszeitraums traten bei noch milder Hepatitis zunächst Varianten mit Mutationen im Cp/EnhII auf, entweder mit Punktmutationen im BCP (Variantentyp A), u. a. an den Positionen 1762 (A>T) und 1764 (G>A), oder mit einer 8-nt-Deletion im BCP (nt 1763–1770), die nur vorübergehend akkumulierte (11/93, Variantentypen C, D, F). Zusätzlich trugen die Genome bereits in frühen Seren oft präS2-Deletionen (hauptsächlich AS 140–141, Variantentypen B, D, E, F, G, I, J), später oft in Kombination mit einer Stoppkodonmutation im präS1 (W77*). Über den gesamten Zeitraum wiesen einige Genome eine präS2-Startkodonmutation (M120T) auf. Ab 11/93 reicherten sich komplexe Varianten mit zusätzlichen Deletionen im C-Gen an, meist mit einer Länge von 90 nt (nt 2130–2219, AS 77–106 des Core-Proteins, Variantentypen E, F, J). Als 11/95 die ersten Anzeichen einer LZ sonographisch diagnostiziert wurden, hatten 70 % aller sequenzierten Genome diese C-Gendeletion, kombiniert mit präS2-Deletionen. Komplexe Varianten mit C-Gendeletionen, präS2-Deletionen und Cp-Punktmutationen (Variantentyp E) stellten fortan im Serum mit ca. 50 % aller Genome die Hauptpopulation (Abb. 3.1B und C). Die übrigen Klone trugen häufig eine 11-nt-Insertion (nt 1776/1777) im BCP. In der explantierten Leber (07/96) repräsentierten dann komplexe Varianten mit dieser 11-nt-Insertion, C-Gen- und präS2-Deletionen (Variantentyp J) bei fortgeschrittener LZ und unter 3TC-Therapie die Hauptviruspopulation (Abb. 3.1B und C). Im Vergleich zu den Serumproben wiesen die aus der Leber isolierten Genome eine hohe Variabilität an präS-Deletionen und im S-Bereich nur vereinzelt Nukleotidaustausche auf. Der Anteil von Genomen ohne C-Gendeletion bewegte sich ab 11/93 bei ca. 30–40 % und betrug in der Leber nur noch weniger als 10 %. Während der 3TC-Therapie wurde ein Verschwinden der Varianten beobachtet. Die in dieser Zeit entnommenen Seren (ab 05/96) waren in der Hybridisierung bereits HBV-DNA-negativ (experimentelle Nachweisgrenze ≤ 3 x 105 Genomkopien/ml). Kurz vor und während der Transplantation abgenommene Seren (07/96) wiesen wieder kurzzeitig Varianten auf, ab 08/96 waren die Seren jedoch anhaltend in der PCR HBV-DNA-negativ (Nachweisgrenze 10 Genome/ml).

3.2 Patient B

3.2.1  Klinik

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Patient B („1J“ in Dissertation Preikschat [4] und „8“ in Preikschat et al. [134]), der seit 05/84 aufgrund von terminaler Niereninsuffizienz durch Schrumpfnieren dialysepflichtig war, wurde vermutlich während einer Nierentransplantation 09/85 mit HBV (Genotyp A) infiziert. Die sich daraufhin entwickelnde chronische Hepatitis verlief 10 Jahre lang klinisch nahezu unauffällig. Erst nach einer kontinuierlichen Reduktion der immunsuppressiven Therapie mit Methylprednisolon, Cyclosporin A und Azathioprin ab 05/95 wurde nach 07/95 zunehmender Aszites und reduzierte Syntheseleistung der Leber festgestellt. 11/95 wurde eine LZ sonographisch bestätigt. Eine antivirale Therapie mit FCV ab 02/96 blieb erfolglos und der Patient verstarb 03/96 an Ösophagusvarizenblutung infolge terminaler Leberinsuffizienz (Abb. 3.2A).

3.2.2 HBV-Populationen

Über einen Zeitraum von 5 Jahren von 07/91 bis 02/96 wurden die HBV-Populationen aus 7 verschiedenen Seren des Patienten B untersucht (Abb. 3.2). Von Anfang an wurden Varianten mit Punktmutationen im Cp/EnhII an den Positionen 1753 (T>C) und/oder 1762 (A>T) und 1764 (G>A) detektiert (Variantentyp A). Varianten mit einer zusätzlichen 8-nt-Deletion (nt 1763–1770) im BCP tauchten 05/93 auf (Typ B) und akkumulierten im Verlauf. Zeitgleich mit ersten Anzeichen der LZ 09/95 wurden erstmals Genome mit einer Deletion im C-Gen von 51 nt (nt 2130–2180, AS 77–93 des Core-Proteins) detektiert, die sich anreicherten. Von diesem Zeitpunkt an bis zum Tod des Patienten 03/96 bildeten komplexe Varianten mit der 8-nt-Deletion im Cp und der C-Gendeletion die Hauptpopulation (Variantentyp D). 09/05 stellten Varianten des Typs D ca. 50 %, 12/95 bereits ca. 70 % und 02/96 ca. 80 % der Viruspopulation (Abb. 3.2C). Im gleichen Zeitraum betrug der Anteil von Genomen ohne C-Gendeletion nur noch ca. 25 % und sank ab 12/95 auf ca. 10 %. Alle untersuchten komplexen Varianten trugen auch Stoppkodonmutationen im S-Bereich (W74*, L95*). Jedoch wurden in HBV-Genomen des Patienten B zu keinem Zeitpunkt Deletionen in der präS-Region gefunden.

Abbildung 3.2: Klinische Parameter und Entwicklung der HBV-Populationen des Patienten B im Zeitverlauf.

A: Klinische und virale Parameter im Beobachtungszeitraum von 07/91 bis 03/96. Oben sind die Zeitpunkte der Isolierung der 3 detailliert untersuchten HBV-Genome gezeigt. B: Zusammensetzung der HBV-Populationen in den Serumproben aus den in D dargestellten Variantentypen. Die Hauptvarianten sind fett gedruckt. C: Schematische Darstellung der Häufigkeit (%) der Wt-ähnlichen Genome (Typ A) und des akkumulierenden Variantentyps D im Zeitverlauf in den Viruspopulationen. D: Darstellung der im Patient B charakterisierten HBV-Variantentypen. Die dargestellten Deletionen (Rechtecke) liegen bei nt 1763–1770 im Cp und nt 2130–2180 im C-Gen [AS 77–93 des Core-Proteins]. Das schwarze Dreieck zeigt eine Duplikation der α-Box im Cp/EnhII. Modifiziert nach Preikschat et al. [134], für weitere Erklärungen siehe Abb. 3.1.


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14.11.2006