5 Ergebnisse

↓48

In dieser Arbeit wurde der Phänotyp von komplexen HBV-Varianten mit Mutationen im Cp bzw. X-Gen, Deletionen im C-Gen und zum Teil Deletionen im präS-Bereich untersucht, die bei Langzeit-immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern mit schwerer Lebererkrankung akkumulierten. Von einem im Vergleich zu Wt-HBV veränderten Phänotyp wurden dabei Hinweise auf die Rolle der komplexen Varianten bei der Entwicklung der LZ erhofft. Zur funktionellen Analyse wurden aus Serum und Leber isolierte und in voller Länge klonierte HBV-Genome von 2 repräsentativen Patienten verwendet. Die klinischen Daten der Patienten und die Evolution der Viruspopulationen im Krankheitsverlauf von einer milden chronischen Hepatitis zur LZ sind in Abschnitt 3 zusammengefasst.

↓49

Zellen der humanen Hepatomazelllinie HuH7 wurden mit der HBV-Gesamtgenom-DNA transfiziert. Nur wo ausdrücklich erwähnt, wurden zusätzlich Zellen einer weiteren Hepatomazelllinie, HepG2, verwendet. Dabei wurde die Transfektionseffizienz in jedem Ansatz durch Kotransfektion mit dem SEAP-Plasmid kontrolliert (siehe Abschnitt 4.2.4.4). Nach 4–5 Tagen wurden Transkription, Proteinexpression und Replikation der komplexen Varianten im Vergleich zu Referenz-Wt-Genomen analysiert. Bei Veränderungen in jedem dieser Schritte des Replikationszyklus wären Auswirkungen auf zelluläre Prozesse und/oder zytotoxische Folgen denkbar. Als Referenz dienten ein Wt-Genom des Genotyps D (WtD), mit dem ein Großteil früherer funktioneller Analysen durchgeführt wurde und das daher gut charakterisiert war, und zusätzlich ein Wt-Genom des Genotyps A (WtA), da die Patienten mit HBV des Genotyps A infiziert waren. Um festzustellen, wie sich der Phänotyp der komplexen Varianten von dem der Genome der ursprünglichen Viruspopulation vom Stadium der asymptomatischen chronischen Hepatitis unterscheidet, wurden außerdem Wt-ähnliche Genome ohne Deletionen und Insertionen aus einer frühen Serumabnahme der Patienten funktionell charakterisiert.

5.1  Screening und Überblick über phänotypische Veränderungen in den HBV-Populationen

Aus früheren Untersuchungen war bekannt, dass nur ein Teil der mit der in Abschnitt 4.1.4.1beschriebenen Methode hergestellten Gesamtgenom-Klone in vitro replikationsfähig ist, hauptsächlich aufgrund von während der PCR eingeführten Mutationen [151]. Daher musste zunächst die Replikationskompetenz der verfügbaren klonierten HBV-Genome der beiden Patienten überprüft werden. Für die replikationskompetenten Genome wurden anschließend auch Transkription und Expression von HBsAg und HBeAg im Zellkulturüberstand analysiert, um einen Überblick über die phänotypischen Veränderungen in den HBV-Populationen der Patienten während des Krankheitsverlaufs zu erhalten. Die Klone wurden je nach Patient mit den Buchstaben „A“ oder „B“ sowie je nach ihrer Herkunft aus Serum oder Leber mit den Buchstaben „S“ oder „L“ und fortlaufenden Nummern bezeichnet. Außerdem erhielten komplexe Varianten zur einfacheren Identifizierung am Ende der Bezeichnung ein zusätzliches „k“ (Bsp. A-S1 und A-S15k).

5.1.1  Replikation

Der Nachweis der Replikation erfolgte durch Southern Blots der aus zytoplasmatischen Core-Partikeln isolierten replikativen Intermediate. Wie aus früheren Arbeiten bekannt, benötigen HBV-Genome mit Deletionen im C-Gen zur Replikation die Komplementation mit funktionellem Wt-Core-Protein. Die entsprechenden Genome der Patienten wurden daher mit dem Core-Expressionsplasmid pCore kotransfiziert.

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Bei Patient A erwiesen sich 15 von 33 untersuchten Klonen als replikationskompetent (vgl. Abb 5.1 und 5.2). Diese repräsentieren 5 häufige Variantentypen (vgl. Abschnitt 3.1.2 und Abb. 5.2) und stammen aus 5 verschiedenen Serumabnahmen und der zirrhotischen Leber. Von den 3 replikationskompetenten Klonen aus sehr frühen Serumproben ist einer Wt-ähnlich ohne Deletionen oder Insertionen (Typ A: A-S1) und 2 tragen Punktmutationen im Cp und eine kleine Deletion im präS2 (Typ B: A-S4, A-S7). Die 12 übrigen Klone aus späteren Abnahmen zeichnen sich dagegen durch komplexe Mutationsmuster mit C-Gendeletionen, Deletionen im präS-Bereich und verschiedenen Mutationen im Cp aus (Variantentypen E, F und J, Abb. 5.2).

Im Falle von Patient B replizierten 10 von 43 getesteten Klonen 4 verschiedener Variantentypen (Abschnitt 3.2.2, Abb. 5.3 und 5.4) aus 3 Serumabnahmen. Die 3 der 10 replikationskompetenten Klone, die zu einem frühen Zeitpunkt vor LZ isoliert wurden, sind Wt-ähnliche Klone ohne Deletionen/Insertionen und nur einer Punktmutation im Cp (Typ A: B-S1, B-S2, B-S3). Die 6 replizierenden komplexen Varianten mit C-Gendeletion und Deletion oder Punktmutationen im Cp (Typen D und E) stammen dagegen wiederum aus späten Serumabnahmen während der LZ. Eine Variante aus der letzten Serumprobe des Beobachtungszeitraums trägt Deletionen im präS1 und Cp, aber nicht im C-Gen (B-S9, Typ C, vgl. Abb. 5.4).

Abbildung 5.1: Phänotypische Analyse von 15 HBV-Genomen des Patienten A im Vergleich zu den Wt-Genomen.

Für die Analysen wurden mit HBV-Gesamt-Genom-DNA transfizierte HuH7-Zellen eingesetzt. Dabei wurden Genome mit C-Gendeletion zur Wiederherstellung der Replikationskompetenz mit pCore kotransfiziert (+ pCore). Später im Detail analysierte Klone sind fett gedruckt und unterstrichen. A: Die Analyse der replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln erfolgte im Southern Blot (oben). Als HBV-Marker diente das 1:1000 verdünnte Produkt einer asymmetrischen PCR von HBV-Gesamtgenom mit einem 3,2-kb-Doppelstrang (ds)- und einem 3,2-kb-Einzelstrang (ss)-Fragment. Rechts sind die Positionen zweier Fragmente des Dig-markierten DNA-Längenstandard VII (Roche) gezeigt. Unter dem Blot sind die Abnahmedaten der Patientenproben angegeben, aus denen die Klone jeweils isoliert wurden. Unten: Die quantitative Auswertung der HBV-Einzelstrang-Bande im Vergleich zu WtD erfolgte mit dem TINA-Programm. Für die später detailliert analysierten Genome (dunkle Balken) sind Mittelwerte ± Standardabweichungen (StA) von mindestens 6 unabhängigen Experimenten gezeigt. Für die übrigen Klone wurde nur ein Experiment durchgeführt.
B: Analyse der Transkription. Oben: Northern Blots von Gesamt-RNA wurden mit einer HBV-Gesamtgenom-Sonde hybridisiert. Die Banden der auf gleicher Höhe laufenden pgRNA und präC-mRNA, der präS1-mRNA und präS2/S-mRNA sind zu erkennen. Links sind die Positionen der Fragmente des Dig-markierten RNA-Längenstandards II (Roche) angegeben. Als Ladekontrolle wurde β-Aktin-RNA mit einer entsprechenden Sonde auf den verschiedenen Blots detektiert. Unten: Die quantitative Auswertung der 3,5-kb-Bande der pgRNA und präC-mRNA ist relativ zum WtD dargestellt. Für die später detailliert analysierten Genome (dunkle Balken) sind Mittelwerte ± StA von mindestens 3 unabhängigen Experimenten gezeigt. Für die übrigen Klone wurde nur ein Experiment durchgeführt. C: Die Analyse von HBsAg und HBeAg im Zellkulturüberstand erfolgte mittels ELISA. Dargestellt sind S/C-Ratios (Probe : Grenzwert) von 1:10-Verdünnungen der Proben relativ zum WtD in Mittelwerten ± StA von mindestens 4 Experimenten. Als Kontrolle wurde auch pCore alleine transfiziert und zeigte schwache Signale im HBeAg-ELISA. NK = Negativkontrolle, Material von nur mit leerem Vektor pZErO transfizierten Zellen.

↓51

Die densitometrische Auswertung der HBV-Einzelstrangbanden im Southern Blot ergab zwischen den Klonen stark variierende Replikationslevel, von unter 20 % (z. B. A-S4, B-S11k) bis zu über 200 % (z. B. A-S15k, A-L6k, B-S7k) im Vergleich zum WtD (Abb. 5.1A und 5.3A). Die Replikation des WtA lag bei ca. 76 % des WtD. Bei Patient A zeigte die Mehrzahl der komplexen C-Gendeletionsvarianten nach Komplementation mit pCore eine höhere Replikation als WtD, WtA und die 3 Genome ohne C-Gendeletion. Bei Patient B replizierten hauptsächlich die Genome des Variantentyps D, der im Beobachtungszeitraum akkumulierte, verstärkt im Vergleich zu den beiden Wt-Genomen WtD und WtA.

5.1.2 Transkription

Zum Nachweis der viralen RNAs wurden Northern Blots mit der gesamten RNA der transfizierten HuH7-Zellen und einer das gesamte HBV-Genom umfassenden Sonde durchgeführt. So wurden die 3,5 kb große Bande von pgRNA und präC-mRNA sowie die beiden Banden der Oberflächen-mRNAs (präS1- und präS2/S-mRNA) detektiert (Abb. 5.1B, 5.3B). WtD und WtA unterschieden sich nicht in ihrer Transkription. Die komplexen Varianten der Patienten zeigten im Vergleich zu den Wt-Genomen und zu den Wt-ähnlichen Klonen (jeweils Typ A: A-S1 und B-S1, -S2, -S3) ein stark verändertes Transkriptionsmuster. Dabei fielen zwischen den Varianten des Patienten A auch deutliche Unterschiede im Ausmaß der Veränderungen (Abb. 5.1B) auf, während die komplexen Varianten des Patienten B ein einheitlicheres Bild zeigten (Abb. 5.3B). Häufig, insbesondere bei Patient A, präsentierten die komplexen Varianten relativ zu den Wt-Genomen eine erhöhte Expression der 3,5-kb-RNAs (pgRNA + präC-mRNA, quantitative Auswertung in Abb. 5.1B und 5.3B unten). Des Weiteren wurden für die meisten komplexen Varianten der beiden Patienten stark reduzierte Oberflächen-mRNAs gefunden. Bei vielen komplexen Varianten des Patienten A führte dies auch zu einem erhöhten Verhältnis von präS1- zu präS2/S-mRNA. Bei den Varianten des Patienten B waren jedoch meist beide Oberflächen-mRNAs gleichermaßen reduziert.

Abbildung 5.2: Schematische Darstellung der 15 untersuchten HBV-Genome des Patienten A.

Zur Orientierung ist das HBV-Genom oben schematisch gezeigt. Auf der horizontalen Linie, die das Genom des jeweiligen Klons repräsentiert, sind die großen Mutationen, die zur Einteilung der Variantentypen dienten (Deletionen = Rechtecke, Insertionen = kleine Dreiecke), und Nukleotidaustausche im Cp (Ellipsen) eingezeichnet. Wenn nicht anders bezeichnet, handelt es sich im C-Gen bzw. Core-Protein um die Deletion der nt 2130–2219 bzw. AS 77–106 und im präS2 der nt 50–55 bzw. AS 140–141. Erwartete Veränderungen der Genexpression durch Start- oder Stoppkodonmutationen (Kreuz bzw. Stern) sind unter dem Genom dargestellt. Die mutierte AS ist darunter angegeben. Die vermutlich exprimierten Proteinsequenzen sind durch graue Rechtecke, die vermutlich nicht exprimierten Sequenzen durch gepunktete Linien dargestellt. Links sind die Abnahmedaten der Patientenproben angegeben, aus denen die Genome jeweils isoliert wurden. Rechts sind die Variantentypen der Genome angegeben. Alle Genome tragen weitere Punktmutationen im gesamten Genom (siehe Anhang, Tab. A.1). Die zur detaillierten, funktionellen Analyse verwendeten 5 Genome sind fett gedruckt und unterstrichen.

↓52

Abbildung 5.3: Phänotypische Analyse der 10 HBV-Genome des Patienten B im Vergleich zu den Wt-Genomen.

Für die Analysen wurden mit HBV-Genomen transfizierte HuH7-Zellen eingesetzt. Später detailliert charakterisierte Klone sind fett gedruckt und unterstrichen. In mit Stern markierte Balken ging der Wert nur eines Experiments ein. A: Die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden im Southern Blot (oben) analysiert. Genome mit C-Gendeletion wurden zur Wiederherstellung der Replikationskompetenz mit pCore kotransfiziert. HBV-Marker und Dig-markierter DNA-Längenstandard VII (Roche) sind gezeigt. Unten: Im Diagramm sind Mittelwerte ± StA der quantitativen Auswertung der HBV-Einzelstrang-Bande im Vergleich zum WtD von 2–6 unabhängigen Experimenten aufgeführt. Die 3 detailliert analysierten Genome sind mit dunklen Balken dargestellt. B: Analyse der Transkription. Oben sind exemplarische Northern Blots von Gesamt-RNA gezeigt, die mit einer HBV-Gesamtgenom-Sonde bzw. einer β-Aktin-Sonde als Ladekontrolle hybridisiert wurden. Der Dig-markierte RNA-Längenstandard II (Roche) diente
als Marker. Unten sind im Diagramm Mittelwerte ± StA der quantitativen Auswertung der 3,5-kb-Bande von pgRNA und präC-mRNA relativ zu WtD von 2–3 unabhängigen Experimenten gezeigt. Die 3 detailliert analysierten Genome sind mit dunklen Balken dargestellt. C: Die Analyse von HBsAg und HBeAg im Zellkulturüberstand erfolgte mittels ELISA. Die S/C-Ratio (Probe : Grenzwert) bei 1:50-Verdünnung der Proben ist relativ zu WtD dargestellt. Mittelwerte ± StA von 2–5 (HBsAg) bzw. 2 (HBeAg) Experimenten sind gezeigt. Für weitere Erklärungen siehe Abb. 5.1.

5.1.3 Proteinexpression

Die Level von HBeAg und HBsAg wurden im Zellkulturüberstand mittels ELISA bestimmt. WtD und WtA wiesen nahezu identische Werte auf.

Alle komplexen Varianten mit Deletion im C-Gen zeigten keine HBeAg-Expression (Abb. 5.1C und 5.3C). Für die Genome ohne C-Gendeletion wurden bei Patient A meist annähernd Wt-HBeAg-Level (A-S4, A-S1), bei Patient B überraschenderweise jedoch nur eine sehr geringe HBeAg-Expression nachgewiesen.

↓53

Auch die HBsAg-Expression aller komplexen Varianten des Patienten B und der meisten komplexen Varianten des Patienten A war komplett gestört (Abb. 5.3C und 5.1C). Lediglich einige Klone aus den frühen Serumabnahmen und einige Varianten aus der Leber von Patient A zeigten eine geringe bis normale HBsAg-Expression. Die Abwesenheit von HBsAg korrelierte meist mit Stoppkodonmutationen im S-Bereich (z. B. L216* bei Varianten von Patient A, W74* bei Varianten von Patient B) und/oder fehlenden Oberflächen-mRNAs (z. B. A-L7k). Eine verringerte HBsAg-Expression lag bei Genomen mit verschiedenen Kombinationen von Mutationen (inklusive der präS1-Stoppkodonmutation W77* bei Patient A) und niedrigen mRNA-Leveln vor.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Varianten der beiden Patienten einen im Vergleich zu den Wt-Genomen stark veränderten Phänotyp aufwiesen, der im Detail und Ausmaß insbesondere bei Patient A von Genom zu Genom deutlich variieren konnte. Insgesamt zeigten viele Varianten eine erhöhte Replikation, eine erhöhte Expression von pg/präC-RNA, eine reduzierte Expression von Oberflächen-mRNAs und einen Defekt in HBeAg und HBsAg-Expression bzw. -Sekretion. Die zu sehr frühen Zeitpunkten isolierten Wt-ähnlichen Genome (Typ A) waren dagegen bis auf Defekte in HBsAg- und HBeAg-Expression durch einen eher Wt-ähnlichen Phänotyp charakterisiert.

Abbildung 5.4: Schematische Darstellung der 10 untersuchten HBV-Genome des Patienten B.

Zur Erklärung siehe Abb. 5.2. Die Deletion im C-Gen der Genome von Patient B liegt bei nt 2129–2179 (AS 77–93 des Core-Proteins). Weitere Punktmutationen im gesamten Genom aller Klone sind im Anhang in Tab. A.2 aufgeführt.

5.2 Analyse von komplexen Varianten

↓54

Nach Feststellung der Replikationskompetenz und dem phänotypischen Überblick über die HBV-Populationen der Patienten folgte die eigentliche detaillierte funktionelle Analyse ausgewählter Genome. Von jedem Patienten wurden repräsentative Varianten der Typen charakterisiert, die vor Verschlechterung der Leberfunktion auftraten und während der Entwicklung der LZ im jeweiligen Patienten akkumulierten.

Für den Patienten A waren dies nacheinander die Typen E im Serum und J in der Leber (Abschnitt 3.1.2, Abb. 3.1), von denen 4 Varianten zur Analyse ausgewählt wurden: A-S15k, A-S18k, A-S24k und A-L1k. Die Varianten des Typs E (A-S15k, A-S24k) sind im Cp durch

Abbildung 5.5: Detaillierte schematische Darstellung der genauer analysierten Wt-ähnlichen Genome und komplexen Varianten der Patienten A und B.

Oben auf jeder Seite ist zur Orientierung das HBV-Genom mit seinen regulatorischen Sequenzen dargestellt: S1-Promotor (S1p), S2/S-Promotor (S2/Sp), Enhancer I/X-Promotor (EnhI/Xp), Enhancer II/Core-Promotor (EnhII/Cp) mit basalem Core-Promotor (BCP), Core stromaufwärts regulierender Sequenz (CURS) und dem negativ regulatorischen Element (NRE), das posttranskriptionell regulatorische Element (PRE) und das Verpackungssignal Epsilon (E). Darunter sind die HBV-Proteine mit den Unterteilungen von Präcore-Protein, Oberflächenproteinen und Polymerase in die einzelnen Regionen gezeigt. Für jeden Patienten sind beim jeweiligen Wt-ähnlichen Genom (A-S1 und B-S3) auf der horizontalen Linie alle Mutationen im Vergleich zum Referenz-Genom des Genotyps A (Valenzuela [43], GenBank-Nr. X02763) mit ihrer Position angegeben. Mit Ausnahme der fett gedruckten Austausche, die nur individuell bei A-S1 bzw. B-S3 auftraten, lagen die Mutationen bei allen Klonen des gleichen Patienten vor. Striche repräsentieren Nukleotidaustausche, graue Rechtecke Deletionen und schwarze Dreiecke Insertionen. Darunter sind die Konsequenzen der Mutationen auf AS-Ebene in den verschiedenen Proteinen gezeigt. In den Oberflächenproteinen wurden die AS dabei vom Startkodon des LHBs bzw. SHBs an gezählt, im C-Gen vom Start des Core-Proteins an. In den Schemata der 4 komplexen Varianten des Patienten A und der 2 komplexen Varianten des Patienten B wurden nur die Austausche angegeben, die zusätzlich zu den bereits im jeweiligen Wt-ähnlichen Genom A-S1 oder B-S3 bzw. bei allen Varianten des Patienten vorhandenen auftraten.

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Punktmutationen (nt 1762 A>T, 1764 G>A; A-S24k auch 1753 T>C und 1767 T>C) und die Varianten des Typs J (A-S18k, A-L1k) durch eine 11-nt-Insertion an Nukleotidposition 1776/1777 gekennzeichnet, die jeweils auch im X-Protein in Punktmutationen (z. B. K130M und V131I) bzw. Punktmutationen und einem verfrühten Stoppkodon (R138*) resultieren (detaillierte Mutationsschemata in Abb. 5.5). Des Weiteren tragen all diese Varianten eine Deletion von 90 nt im C-Gen (nt 2130–2219) bzw. 30 AS im Core-Protein (AS 77–106) und eine 2-AS-Deletion im präS2-Bereich (AS 140–141, nt 50–55). Bei allen Varianten befinden sich außerdem weitere Punktmutationen überall im Genom, die u. a. zu verschiedenen Stoppkodons in den Oberflächengenen führen. Die Varianten A-S15k und A-S18k wurden vor Entwicklung der LZ zu Zeitpunkten isoliert, als die Variantentypen E und J erst jeweils ca. 20 % der Viruspopulation ausmachten. Die Varianten A-S24k und A-L1k stammen von späteren Zeitpunkten während der LZ, als die Typen E und J mit ca. 50 % nacheinander jeweils die Hauptviruspopulation bildeten (Abb. 3.1).

Im Patienten B akkumulierten Varianten des Typs D, die zum Zeitpunkt der Diagnose der LZ (12/95) bereits ca. 70 % der Viruspopulation stellten (Abb. 3.2). Die beiden ausgewählten, zu diesem Zeitpunkt isolierten, komplexen Varianten des Typs D (B-S7k, B-S8k, alle Mutationen in Abb. 5.5) tragen eine Deletion von 51 nt im C-Gen (nt 2130–2180) bzw. 17 AS im Core-Protein (AS 77–93), eine 8-nt-Deletion (nt 1763–1770) und eine Punktmutation (nt 1753 T>C) im Cp sowie eine Stoppkodonmutation bei AS 74 im S-Bereich. Die Cp-Deletion führt ebenfalls zu Punktmutationen und einem verfrühten Stoppkodon im X-Protein. Im Unterschied zu Varianten des Patienten A hat keine der Varianten von Patient B Deletionen im präS-Bereich. Außerdem befinden sich in den Varianten des Patienten B deutlich weniger zusätzliche Punktmutationen im gesamten Genom. Neben den komplexen Varianten wurde zum Vergleich, stellvertretend für die ursprüngliche Viruspopulation während der milden chronischen Hepatitis, jeweils ein Wt-ähnliches Genom der Patienten ohne Deletionen oder Insertionen (Typ A) charakterisiert (A-S1 und B-S3, alle Punktmutationen in Abb. 5.5). Diese stammen aus sehr frühen Serumproben (Abb. 3.1A, 3.2A) des Beobachtungszeitraums.

5.2.1  Transkription

Die Transkription der viralen RNAs, die von der cccDNA im Kern sofort nach deren Komplettierung erfolgt, wurde wieder mit Northern Blots von Gesamt-RNA und deren densitometrischer Auswertung analysiert. Alle komplexen Varianten zeigten eine verstärkte 3,5-kb-mRNA-Bande im Vergleich zu den Wt-Genomen und den Wt-ähnlichen Genomen A-S1 und B-S3 (Abb. 5.6A und B). Bei den Varianten von Patient A war dies mit über 170 % von WtD und WtA besonders deutlich. Diese Bande enthielt sowohl die pgRNA als auch die am 5'-Ende nur ca. 30 nt längere, HBeAg-kodierende präC-mRNA, die sich im Northern Blot nicht unterscheiden lassen.

↓56

Daher wurden zur Differenzierung von pgRNA und präC-mRNA zusätzliche Primer-Extension-Analysen durchgeführt (Abb. 5.6C). Mithilfe dieser Methode können RNAs mit unterschiedlichen 5'-Enden präzise in einem hochauflösenden Gel aufgetrennt werden. Das Mitführen einer Sequenzierreaktion als Marker ermöglicht außerdem die nukleotidgenaue Bestimmung der Transkriptionsstartpositionen. Wie erwartet, zeigten sich im Gel bei beiden Wt-Genomen 2 präC-mRNAs mit heterogenem Transkriptionsstart zwischen nt 1781 und 1785 und die pgRNA mit einem Transkriptionsstart bei nt 1812–1816 (Abb. 5.6C, links). Bei den Varianten waren im Vergleich zu den Wt-Genomen die präC-mRNA-Signale stark vermindert. Das aus den Bandenintensitäten ermittelte Verhältnis der präC-mRNAs zur pgRNA war für alle komplexen Varianten im Vergleich zu WtD mindestens 2,4fach, im Vergleich zu WtA mindestens 2,6fach reduziert (Abb. 5.6C, rechts). A-S1 und B-S3 dagegen zeigten ein eher WtD/WtA-ähnliches Verhältnis. Aus der Primer-Extension-Analyse folgte, dass die verstärkten 3,5-kb-Banden der komplexen Varianten im Northern Blot aus einer erhöhten Expression von pgRNA resultierten.

Im Gegensatz zu den Wt-ähnlichen Genomen A-S1 und B-S3 mit unveränderten Oberflächen-mRNAs im Vergleich zu den beiden Referenz-Wt, zeigten die Northern Blots für die komplexen Varianten größtenteils reduzierte Oberflächen-mRNAs (Abb. 5.6A und D). Nur die präS1-mRNA-Expression der Varianten A-S15k und A-S24k mit Punktmutationen im Cp war unvermindert. Die beiden Varianten A-S18k und A-L1k mit Cp-Insertion demonstrierten eine leicht, auf 50 bzw. 70 % reduzierte präS1-mRNA. Bei A-L1k lag die präS2/S-mRNA-Expression ebenfalls bei ca. 70 % der Wt-Genome und damit auf gleichem Niveau wie die präS1-mRNA-Expression. Dagegen war bei der Mehrheit der Varianten von Patient A (A-S15k, A-S18k und A-S24k) eine Reduktion der präS2/S-mRNA auf 40–50% der präS1-mRNA zu beobachten, die folglich zu einem erhöhten Verhältnis von präS1- zu präS2/S-mRNA führte. Dies korrelierte mit dem Auftreten einer G>A Punktmutation bei nt 3084. Bei den beiden Varianten B-S7k und B-S8k des Patienten B mit Cp-Deletion war die Expression der präS1- und präS2/S-mRNA gleichermaßen auf 40–50 % der Wt-Werte reduziert.

Abbildung 5.6: Analyse der RNA-Transkripte der komplexen Varianten.

Vier Tage nach Transfektion von HuH7-Zellen mit HBV-DNA der Varianten-, Wt-ähnlichen und Wt-Genome wurde die Gesamt-RNA der Zellen präpariert und in Northern Blots und Primer-Extension-Assays analysiert. A: Die exemplarisch dargestellten Northern Blots wurden mit einer HBV-Gesamt-Genom-Sonde und zur Ladekontrolle mit einer β-Aktin-Sonde hybridisiert (siehe auch Abb. 5.1). B: Die quantitative Auswertung der 3,5-kb-Bande von pgRNA und präC-mRNA in Northern Blots erfolgte mit dem TINA-Programm. Gezeigt sind Mittelwerte ± StA relativ zu WtD von 3 unabhängigen Experimenten. C: Primer-Extension-Analysen der 5'-Enden von präC-mRNA und pgRNA wurden zur Differenzierung der beiden RNAs durchgeführt. Links sind Gelbilder repräsentativer Experimente zu sehen. Die Positionen der 2 präC-mRNAs und der pgRNA sind angegeben. Als Marker für die nt-Positionen, und somit der Transkriptionsstarts der RNAs, diente eine Sequenzierreaktion eines HBV-Wt-Genoms (Genotyp A, EMBL-Nr. L13994). Rechts ist die quantitative Auswertung der Signale mit dem TINA-Programm aufgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte ± StA des Verhältnisses von präC-mRNAs zur pgRNA von 4–14 unabhängigen Experimenten. D: Von der quantitativen Auswertung der präS1- und präS2/S-mRNAs in Northern Blots sind Mittelwerte ± StA von 3 unabhängigen Experimenten relativ zu den Werten des WtD gezeigt. NK = Negativkontrolle, Material von nur mit leerem Vektor pZErO transfizierten Zellen.

↓57

Alles in Allem waren die komplexen Varianten der Typen, die im Verlauf akkumulierten, durch eine stark veränderte Transkription mit verminderter Expression von präC- und Oberflächen-mRNAs sowie erhöhter Expression von pgRNA gekennzeichnet, wie es sich bereits im Überblick bei der Mehrzahl der komplexen Varianten gezeigt hatte. Dagegen wurden für die beiden Wt-ähnlichen Genome A-S1 und B-S3 unveränderte präC- und Oberflächen-mRNAs und für A-S1 eine leicht erniedrigte pgRNA nachgewiesen. Ebenso hatten die anderen Wt-ähnlichen Genome des Patienten B (B-S1 und B-S2) eine normale Transkription gezeigt (Überblick, Abschnitt 5.1.2).

5.2.2 Proteinexpression

Im nächsten Schritt wurde die Expression viraler Proteine von den teilweise stark veränderten mRNAs im Vergleich zu den Wt-Genomen untersucht. Es erfolgte eine Analyse der intrazellulären Expression der für die Replikation bzw. Morphogenese wichtigen Core- und Oberflächenproteine sowie der sekretierten viralen Proteine HBeAg und HBsAg im Zellkulturüberstand.

5.2.2.1  HBeAg im Zellkulturüberstand

Der Nachweis des nicht-strukturellen HBeAg im Zellkulturüberstand mittels ELISA war für alle 6 komplexen Varianten sowohl mit 30- als auch mit 17-AS-Deletion im HBeAg/HBcAg nahezu negativ (Abb. 5.7A). Dies hatte sich auch im Überblick für alle anderen C-Gendeletionsvarianten gezeigt. Die HBeAg-Werte der Wt-ähnlichen Genome A-S1 und B-S3 ohne C-Gendeletion waren auf ca. 70 bzw. 30 % der beiden Referenz-Wt reduziert. Keines der Genome der beiden Patienten trug Mutationen in der präC-Region, die z. B als Stoppkodonmutationen häufig für HBeAg-Negativität verantwortlich sind.

5.2.2.2 Core-Proteinexpression

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Die intrazelluläre Core-Proteinexpression wurde in Immunfärbungen exemplarisch für den WtD und die komplexen Varianten des Patienten A untersucht. Das um 30 AS deletierte Core-Protein der Varianten A-S18k, A-S24k und A-L1k war in den HuH7-Zellen mittels immunzytochemischer Färbungen mit einem polyklonalen Anti-Core-Antikörper nachweisbar, allerdings nur in sehr geringen Mengen (Abb. 5.7B). Nur für Variante A-S15k wurde kein Core-Protein detektiert, im Einklang mit einer zusätzlichen frameshift-Mutation und einem verfrühten Stoppkodon bei AS 62 des Core-Proteins (vgl. Abb. 5.5). Interessanterweise wurde, im Gegensatz zur Lokalisation des WtD-Core-Proteins in
Abbildung 5.7: Analyse des HBeAg im Zellkulturüberstand (A) und der intrazellulären Core-Proteinexpression (B, C).

Die Analysen wurden mit HuH7-Zellen, 4 Tage nach Transfektion mit HBV-DNA der Varianten- und Wt-Genome, durchgeführt. A: HBeAg im Zellkulturüberstand wurde mittels ELISA untersucht. Die S/C-Ratios der Proben in Verdünnungen von 1:10 (WtA, Patient A) bzw. 1:50 (Patient B) sind als Mittelwerte ± SA von 3–5 unabhängigen Experimenten relativ zu WtD dargestellt. NK = Negativkontrolle, nur Plasmid pZErO transfiziert. B: In den dargestellten immunzytochemischen Färbungen wurde das Core-Protein mit dem polyklonalen Antikörper Anti-CoreSN detektiert. Die Zellen wurden mit Hämalaun gegengefärbt. Positive Signale wurden exemplarisch mit einem Pfeil gekennzeichnet. Ein zweites, unabhängiges Experiment bestätigte die Ergebnisse. Vergrößerung: 100 x. C: Doppel-Immunfluoreszenz-Färbungen des Core-Proteins mit Antikörper Anti-CoreSN (rot) und des Zytoplasmas mit Antikörper Anti-Hsp70 (grün) wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert. Dargestellt sind Färbungen von Zellen, die mit WtD, Variante A-L1k und pCore bzw. A-L1k und WtD im Verhältnis 20:80 transfiziert wurden. Die Färbungen wurden im jeweils rechten Bild überlagert dargestellt, so dass kolokalisierende Proteine eine gelbe Färbung zeigen. Die Ergebnisse wurden in einem weiteren, unabhängigen Experiment bestätigt.

Zytoplasma und Kern, das Core-Protein der Varianten nur im Zytoplasma gefunden (Abb. 5.7B). Zur präziseren, subzellulären Lokalisation des Varianten-Core-Proteins wurden Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen von Core-Protein und zellulären Proteinen durchgeführt. Die Färbungen wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert. Mit dieser Methode war das Core-Protein der Varianten jedoch nicht nachweisbar, vermutlich aufgrund einer unzureichenden Sensitivität. Das Core-Protein des WtD war meist diffus im Kern oder Zytoplasma der Zellen verteilt und kolokalisierte, wie erwartet, teilweise mit dem Zytoplasma (bzw. dem Zytoplasmaprotein Hsp70,Abb. 5.7C), jedoch nicht mit Markern für das ER-Lumen (Protein-Disulfid-Isomerase [PDI], nicht gezeigt) oder das Golgi-Kompartiment (58K-Protein, nicht gezeigt). Wurde der WtD jedoch mit der Variante A-L1k kotransfiziert (20 % Variante, 80 % WtD) oder A-L1k mit pCore, so zeigte sich überraschenderweise in der Mehrzahl der Zellen eine verstärkte perinukleäre Anordnung des Core-Proteins. Dieses perinukleäre Core-Protein kolokalisierte ebenfalls nur teilweise mit Zytoplasma, aber nicht mit ER, Golgi oder F-Aktin (Abb. 5.7C, ER und Golgi nicht gezeigt). Das F-Aktin ist Teil der Mikrofilamente des Zytoskeletts und spielt möglicherweise eine Rolle im zellulären Transport von Core-Partikeln. Auch nach Kotransfektion von WtD oder pCore mit der Variante A-S15k, die aufgrund der frameshift- und Stoppkodonmutationen kein Core-Protein exprimieren kann, trat in verstärktem Maße das perinukleäre Muster des Core-Proteins auf, aber seltener als bei A-L1k (nicht gezeigt).

5.2.2.3 Oberflächenproteinexpression

Der Nachweis der intrazellulär vorliegenden Oberflächenproteine SHBs, MHBs und LHBs erfolgte durch Western Blots aus Zelllysat und immunzytochemische Färbungen. Das HBsAg wurde im Zellkulturüberstand mittels ELISA detektiert. In den Western Blots wies WtA im Vergleich zu WtD schwächere LHBs-, vergleichbare MHBs- und etwas stärkere SHBs-Signale auf (Abb. 5.8A). Diese Unterschiede zeigten sich jedoch nicht beim Nachweis von HBsAg im Zellkulturüberstand (Abb. 5.8C). Die immunzytochemischen Färbungen wurden exemplarisch nur mit WtD als Referenzgenom durchgeführt (Abb. 5.8B).

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Für die Varianten A-S15k, B-S7k und B-S8k war keines der Oberflächenproteine im Western Blot nachweisbar (Abb. 5.8A). A-S18k und A-S24k zeigten lediglich sehr geringe Mengen von SHBs, das aufgrund der L216 Stoppkodonmutation verkürzt war (Abb. 5.8A). Auch die exemplarischen immunzytochemischen Färbungen von A-S15k-transfizierten Zellen mit spezifischen Antikörpern gegen die 3 Oberflächenproteine (Anti-präS1, 2 verschiedene Anti-präS2, Anti-S) waren negativ, mit Ausnahme eines sehr schwachen Signals für MHBs
Abbildung 5.8: Analyse von intrazellulären HBV-Oberflächenproteinen (A, B) und HBsAg im Zellkulturüberstand (C).

Die Analysen wurden mit HuH7-Zellen durchgeführt, 4 Tage nach Transfektion mit HBV-DNA der Varianten-, Wt-ähnlichen und Wt-Genome. NK = Negativkontrolle, nur Plasmid pZErO transfiziert. A: Gezeigt sind die Nachweise der intrazellulären Oberflächenproteine in Western Blots von Zelllysat mit den primären, monoklonalen Antikörpern MA 18/7 (Anti-präS1), F6 (Anti-präS2), polyklonalem Anti-HBs (Anti-S) und einem Anti-β-Aktin-Antikörper zur Ladekontrolle. Als Marker wurden 60 ng aufgereinigtes HBsAg aufgetragen. p24 und p39 sind nicht-glykosilierte Proteine, während die Proteine gp27, gp33 und gp42 einfach und ggp36 zweifach glykosiliert sind. Die Ergebnisse wurden in mindestens einem weiteren, unabhängigen Experiment bestätigt. B: In den dargestellten immunzytochemischen Färbungen wurden die Oberflächenproteine mit den Antikörpern MA 18/7 (Anti-präS1), F6 (Anti-präS2), Q19/10 (Anti-präS2, MHBs-spezifisch) und RF18 (Anti-S) detektiert. Die Zellen wurden mit Hämalaun gegengefärbt. Positive Signale wurden exemplarisch mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die Ergebnisse wurden in einem zweiten, unabhängigen Experiment bestätigt. Vergrößerung: 100 x. C: HBsAg im Zellkulturüberstand wurde mittels ELISA untersucht. Die S/C-Ratios der Proben in Verdünnungen von 1:10 (WtA, Patient A) bzw. 1:50 (Patient B) sind als Mittelwerte ± SA von 3–5 unabhängigen Experimenten relativ zu WtD dargestellt.

(Abb. 5.8B). Im Einklang mit den Ergebnissen für die intrazellulären Oberflächenproteine wurden für diese 5 Varianten auch kein oder nur sehr geringe Mengen an HBsAg (A-S15k, 2 % von WtD) im Zellkulturüberstand detektiert (Abb. 5.8C).

Im Vergleich zum alleinigen HBsAg-Nachweis im Überblick (Abschnitt 5.1.3) ließ die zusätzliche Analyse der intrazellulären Proteine detailliertere Aussagen über den Grund der defekten Oberflächenproteinexpression zu. Die fehlende intrazelluläre LHBs-Synthese der 5 Varianten korrelierte mit der niedrigen Expression der präS1-mRNA bei A-S18k, B-S7k und B-S8k sowie der Stoppkodonmutation W77* im präS1 von A-S15k, A-S18k und A-S24k. Auch die fehlende bzw. sehr schwache intrazelluläre MHBs- und SHBs-Expression lässt sich durch die stark reduzierte präS2/S-mRNA all dieser Varianten erklären. Bei den Varianten des Patienten B sorgte zusätzlich die Stoppkodonmutation W74* in der S-Region intrazellulär für die komplette Abwesenheit aller 3 Oberflächenproteine. Dagegen machte das Beispiel der Varianten A-S18k und A-S24k deutlich, dass bei Vorliegen der Stoppkodonmutation L216* im S-Bereich eine Expression der verkürzten Form des SHBs möglich war (aufgrund der reduzierten mRNA bei A-S18k und A-S24k nur schwach), eine Sekretion des HBsAg aber ausblieb.

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Im Gegensatz zu den meisten komplexen Varianten zeigten die beiden Wt-ähnlichen Genome A-S1 und B-S3 dem WtA entsprechende Level der Oberflächenproteine im Western Blot (Abb. 5.8A). Nur die MHBs-Expression von A-S1 fehlte aufgrund der präS2- Startkodonmutation (vgl. Abb. 5.5). Trotz der beträchtlichen intrazellulären Expression an Oberflächenproteinen, wiesen jedoch sowohl A-S1 als auch B-S3 im Vergleich zu den Wt-Genomen deutlich reduzierte Mengen an HBsAg im Zellkulturüberstand auf (Abb. 5.8C). Auch für die komplexe Variante A-L1k wurde intrazellulär eine sehr deutliche, nur leicht abgeschwächte Expression der 3 Oberflächenproteine in Western Blots und immunzytochemischen Färbungen sichtbar (Abb. 5.8A und B). Selbst das 2-AS-deletierte MHBs von A-L1k wurde immunzytochemisch mit dem Anti-präS2-Antikörper F6 und in sehr geringen Mengen im Western Blot mit einem polyklonalen Anti-HBs-Antikörper nachgewiesen. Dass es sich auch in den immunzytochemischen Färbungen um das MHBs und nicht um Reaktionen des Anti-präS2-Antikörpers mit der präS2-Region des LHBs handelte, wurde durch die intensive Färbung einer ähnlichen Anzahl von Zellen mit dem monoklonalen Anti-präS2-Antikörper Q19/10 bestätigt, der spezifisch das N-glykosylierte MHBs bindet (Abb. 5.8B). Das sezernierte HBsAg der Variante A-L1k war mit ca. 30 % der Wt-Werte stärker reduziert, als es aufgrund der intrazellulären Expression zu erwarten war (Abb. 5.8C).

Abbildung 5.9: Doppel-Immunfluoreszenzfärbungen von HBV-Oberflächenproteinen und dem Endoplasmatischen Retikulum.

Die Doppel-Immunfluoreszenz-Färbungen der Oberflächenproteine (grün) mit den Antikörpern MA 18/7 (Anti-präS1), F6 (Anti-präS2) und RF18 (Anti-S) und des Endoplasmatischen Retikulums (ER, rot) mit Antikörper Anti-Calnexin wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert. Dargestellt sind repräsentative Färbungen von Zellen, die mit WtD, A-S1, A-S15k oder A-L1k transfiziert wurden. Die Färbungen wurden im jeweils rechten Bild überlagert dargestellt, so dass kolokalisierende Proteine eine gelbe Färbung zeigen. Die Ergebnisse wurden in einem weiteren, unabhängigen Experiment bestätigt.

Um herauszufinden, ob die Diskrepanz zwischen intra- und extrazellulären Oberflächenproteinmengen bei den Wt-ähnlichen Genomen und A-L1k auf eine veränderte Lokalisation und mögliche Retention der Proteine in der Zelle zurückzuführen ist, wurden Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit zellulären Proteinen des ER, des Intermediären Kompartiments und des Golgi-Kompartiments durchgeführt. Eine intrazelluläre Retention der HBV-Oberflächenproteine kann eine zytotoxische Wirkung zur Folge haben [213,214]. Exemplarisch wurden A-S1, A-S15k und A-L1k im Vergleich zu WtD untersucht. WtD zeigte eine diffuse Verteilung der 3 Oberflächenproteine im gesamten Zytoplasma, deren Färbung, wie erwartet, teilweise mit der des ER-Membran-Proteins Calnexin überlappte (Abb. 5.9). Dagegen waren die Oberflächenproteine von A-L1k sowie LHBs und SHBs von A-S1 in der perinukleären Region konzentriert und kolokalisierten mit dem ER. Diese abweichende Verteilung deutet auf eine Retention und/oder Akkumulation der Oberflächenproteine im perinukleären ER hin. Von A-S15k wurden, wie erwartet, keine Oberflächenproteine nachgewiesen.

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Insgesamt zeigten die komplexen Varianten also einen partiellen oder vollständigen Defekt in der Oberflächenproteinexpression und -sekretion. Wie im Überblick dargestellt, trat die fehlende HBsAg-Sekretion bei den meisten Genomen der beiden Patienten, inklusive der Wt-ähnlichen Genome, auf (Abschnitt 5.1.3). Bei den Wt-ähnlichen Genomen (zumindest bei A-S1), die zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Beobachtungszeitraums im Stadium der milden chronischen Hepatitis isoliert wurden, erfolgte eine Retention der größtenteils normal exprimierten Oberflächenproteine im ER. Die komplexe Variante A-L1k – eine der wenigen, die überhaupt deutlich Oberfächenproteine produzierte – zeigte ebenfalls eine veränderte Lokalisation und eine leicht gehemmte Sekretion der Oberflächenproteine.

5.2.3 Replikation der komplexen Varianten

5.2.3.1  Replikative Intermediate in HuH7-Zellen

Zur Analyse der Replikation wurde, wie im Screening und Überblick, der Level der replikativen DNA-Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln mithilfe von Southern Blots und Auswertung der Bandenintensitäten bestimmt (Abb. 5.10A und B). Aufgrund der C-Gendeletion waren die komplexen Varianten allein replikationsinkompetent (Abb. 5.10A, Bahn „Var“). Durch Komplementation mit Wt-Core-Protein (Genotyp D), exprimiert vom kotransfizierten Plasmid pCore, konnte die Replikation wieder hergestellt werden (Abb. 5.10A, Bahn „Var + pCore). Nach Kotransfektion mit pCore zeigten 5 der 6 komplexen Varianten eine erhöhte Replikation im Vergleich zu beiden Wt-Genomen und A-S1 bzw. B-S3 (Abb. 5.10B). Nur Variante A-S18k replizierte schwächer als WtD (ca. 65 %) und WtA (ca. 86 %), aber auf etwa gleichem Niveau wie das Wt-ähnliche Genom A-S1. Um einen Einfluss von pCore auf die verstärkte Replikation auszuschließen, wurden zur Kontrolle auch die Wt-Genome WtD und WtA mit pCore kotransfiziert. Hier zeigte sich keine erhöhte, sondern eine jeweils leicht abgeschwächte Replikation (Abb. 5.10A, rechts unten, und B). Während im Überblick über alle Genome der Patienten die Replikationshöhe noch stark variiert hatte (Abschnitt 5.1.1), waren die Varianten, die akkumulierten, überwiegend durch verstärkte Replikation charakterisiert (131–208 % von WtD bzw. 172–274 % von WtA).

Abbildung 5.10: Analyse der replikativen Intermediate im Southern Blot.

Die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden 4 Tage nach Transfektion von HuH7-Zellen mit 2 µg Gesamtgenom-HBV-DNA im Southern Blot analysiert. A: Gezeigt sind repräsentative Southern Blots für Transfektionen mit den Wt-, Wt-ähnlichen- und Varianten (Var)-Genomen. Varianten wurden alleine, mit 1,6 µg pCore oder mit WtD in verschiedenen Verhältnissen (Variante zu WtD: 50:50, 20:80 oder 70:30, Gesamtmenge der transfizierten Gesamtgenom-HBV-DNA immer 2 µg) transfiziert. Transfektionen von 2 µg WtD bzw. WtA mit pCore dienten als Kontrolle der Auswirkungen des Core-Expressionsplasmids pCore. NK = Negativkontrolle, Material aus nur mit Plasmid pZErO transfizierten Zellen. B: Im Diagramm ist die quantitative Auswertung der Einzelstrang-Bande der replikativen Intermediate im Southern Blot von Transfektionen der Wt-ähnlichen und Wt-Genome (mit und ohne pCore) sowie der komplexen Varianten + pCore relativ zu WtD allein dargestellt. In die Mittelwerte ± StA gingen Ergebnisse von 4–13 unabhängigen Experimenten ein.

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In vivo sind die Varianten durch die Notwendigkeit der Komplementation zur gemeinsamen Replikation mit dem Wt innerhalb einer Zelle gezwungen. Um diese kompetitiven Bedingungen zu simulieren und ihre Auswirkungen auf Wt- und Variantenreplikation zu untersuchen, wurden die Varianten mit dem WtD Referenz-Genom kotransfiziert. Der WtD wurde für die Kotransfektionen gewählt, um Vergleichbarkeit der Experimente mit den Vorarbeiten zu gewährleisten, in denen das WtD-Genom bereits erfolgreich zur Komplementation von deletiertem Core-Protein des Genotyps A eingesetzt wurde [188]. Darüber hinaus ermöglichte die Kotransfektion der Varianten-Genome des Genotyps A mit WtD die problemlose Differenzierung der Wt- und Varianten-DNA im Gemisch der replikativen Intermediate durch Pyrosequenzierung (s. u.). Die Kotransfektionen erfolgten in verschiedenen Verhältnissen mit 20, 50 und 70 % Varianten-DNA im Transfektionsgemisch, da auch in den Patienten der Anteil des Wt mit fortschreitender Krankheit immer weiter abnahm und der Anteil der Varianten zunahm (Abschnitt 3, Abb. 3.1C und 3.2C). Die insgesamt transfizierte DNA-Menge blieb dabei immer konstant. Zur Auswertung diente die Replikation des in gleicher Menge allein transfizierten WtD stets als Referenz (= 100 %).

Die Gesamtreplikation der unterschiedlichen Mischungen von Varianten und WtD im Vergleich zum allein transfizierten WtD wurde durch die Southern Blots von replikativen Intermediaten (Abb. 5.10A) und die densitometrische Auswertung der Banden ermittelt (Bsp. Abb. 5.11A, obere Linie).

Um den Beitrag von WtD und Variante zur Gesamtreplikation aufzuklären, wurde der Anteil von WtD- und Varianten-DNA in den replikativen Intermediaten durch quantitative single nucleotide polymorphism (SNP)-Analyse mittels Pyrosequenzierung gemessen. Hierfür wurde ein Assay entwickelt, das auf einem SNP bei nt 1850 (Genotyp A, Varianten = A; Genotyp D, WtD = T) basiert und dessen Ergebnisse nicht durch die ungewollte Analyse der transfizierten, linearen Input-DNA verfälscht werden. Durch Kombination der Ergebnisse aus Pyrosequenzierung zum Prozentsatz der Varianten-Intermediate und aus Southern Blot zur Gesamtreplikation konnte die Variantenreplikation in den verschiedenen transfizierten Mischungen relativ zum allein transfizierten WtD ermittelt werden (Bsp. Abb. 5.11A, untere Linie).

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Außerdem wurde der Level der replikativen Intermediate der Variante im Verhältnis zur ursprünglich transfizierten Varianten-DNA-Menge bestimmt (Variantenreplikation relativ zu WtD allein [%] / Variantenanteil an transfizierter DNA [%]; Bsp. Abb. 5.11B, dunkle Balken), um zu erfahren, ob die Variante nach Kotransfektion mit dem WtD stärker repliziert als erwartet, oder nicht. Eine dem transfizierten Anteil entsprechende Replikation hat danach den Wert 1. Gleichermaßen wurde die Replikation des WtD in Relation zur transfizierten WtD-DNA-Menge ermittelt, um eine mögliche Unterdrückung der Wt-Replikation durch die Variante nachweisen zu können (Bsp. Abb. 5.11B, helle Balken). Diese war in früheren Studien für reine C-Gendeletionsvarianten gezeigt worden [188,189].

Abbildung 5.11: Analyse der Replikation in HuH7-Zellen nach Kotransfektion der komplexen Varianten mit WtD.

Die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden 4 Tage nach Kotransfektion der 6 komplexen Varianten mit WtD in verschiedenen Verhältnissen (20, 50 und 70 % Varianten-DNA im Gemisch) untersucht. A: Die Gesamtreplikation von Variante und WtD wurde im Southern Blot ermittelt. In den gezeigten Diagrammen wurden die relativen Bandenintensitäten im Vergleich zur Replikation des allein transfizierten WtD (= 100 %) gegen den Anteil der Variante an der transfizierten DNA aufgetragen (obere, schwarze Linie mit Karo). Der prozentuale Anteil der Variante an den gesamten replikativen Intermediaten wurde mittels Pyrosequenzierung bestimmt. Dadurch ließ sich die Replikation der Variante im Gemisch relativ zum allein transfizierten WtD ermitteln (untere, graue Linie mit Quadrat). B: Die dargestellte Replikation von WtD (hellgrau) und Variante (dunkelgrau) im Verhältnis zur jeweils transfizierten DNA-Menge wurde durch folgende Gleichung errechnet: Replikation von Variante bzw. WtD relativ zum WtD allein (vgl. A) / jeweiligen Anteil der Variante bzw. des WtD an der transfizierten DNA. Bei einem Wert von 1 würde die Replikation also in der nach dem transfizierten Anteil erwarteten Höhe erfolgen. C: Die präsentierte Anreicherung der replikativen Intermediate der Variante gegenüber dem WtD wurde folgendermaßen bestimmt: Anreicherung (x-fach) = (% Variante / % WtD) in den replikativen Intermediaten bestimmt durch Pyrosequenzierung / (% Variante / % WtD) in der transfizierten DNA. In allen Diagrammen sind Mittelwerte ± StA von mindestens 3 unabhängigen Experimenten gezeigt. Genauere Erklärungen zu den Berechnungen befinden sich im Abschnitt Material und Methoden 4.2.5.8.

Weiterhin wurde mithilfe der Pyrosequenzierungsdaten untersucht, ob die Variante den WtD während der Koreplikation durch ihre Anreicherung überwächst. Zur Bestimmung der Anreicherung der Variante wurde das Verhältnis von Variante zu WtD in replikativen Intermediaten zum ursprünglich transfizierten Verhältnis in Relation gesetzt (Bsp. Abb. 5.11C). Dabei wurde durch Pyrosequenzierung der nukleären DNA sichergestellt, dass das Verhältnis von Variante und WtD im Zellkern tatsächlich dem transfizierten Verhältnis entspricht. Für genauere Erklärungen zu den Berechnungen siehe Abschnitt Material und Methoden, 4.2.5.8.

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Nach Kotransfektion von HuH7-Zellen mit WtD und jeder der 6 komplexen Varianten zeigte sich eine mit dem transfizierten Varianten-WtD-Verhältnis variierende Gesamtreplikation (Abb. 5.11A, obere Linien). Dabei führte bei jeder der Varianten mindestens eines der Kotransfektions-Verhältnisse zu einer erhöhten Gesamtreplikation relativ zum allein transfizierten WtD. Diese basierte hauptsächlich auf einer erhöhten Variantenreplikation (Abb. 5.11A, untere Linien). Außerdem ließ sich für alle Varianten eine Anreicherung der replikativen Intermediate gegenüber dem WtD nachweisen, die allerdings für Variante A-S24k mit höchstens 1,3fach nur sehr schwach war (Abb. 5.11C). Abgesehen von diesen Gemeinsamkeiten zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in den detaillierten Replikationsmustern der komplexen Varianten. Lediglich die der beiden Varianten des Patienten B wiesen große Ähnlichkeiten auf. Die maximale Replikation der einzelnen Varianten reichte von 2fach (A-S18k, A-S24k) bis zu über 13fach (A-L1k) höheren Werten als von der transfizierten Varianten-DNA-Menge erwartet (Abb. 5.11B). In gleichem Maße variierten auch maximale Gesamtreplikation und Anreicherung zwischen den Varianten. Weiterhin fanden maximale Gesamt- und Variantenreplikation je nach Variante bei unterschiedlichen Kotransfektions-Verhältnissen von Variante und WtD statt (Abb. 5.11A).

Bei 4 der 6 Varianten, die entweder eine schwach (ca. 2fach: A-S18k, A-S24k) oder mittelmäßig (ca. 4–6fach: B-S7k, B-S8k) erhöhte Replikation präsentierten, führte die Koreplikation auch bei hohem transfizierten Variantenanteil nicht zur gleichzeitigen Unterdrückung der WtD-Replikation (Abb. 5.11B). Dies zeigte sich unabhängig von der Art der Cp-Mutation und der Länge der C-Gendeletion bei Varianten beider Patienten. Die WtD-Replikation blieb relativ zur transfizierten WtD-DNA-Menge durch die Varianten unverändert (also bei einem Wert von ca. 1) oder war im Fall der Varianten A-S24k, B-S7k und B-S8k sogar 1,4- bis fast 3fach erhöht (Abb. 5.11B). Die Höhe der Replikation dieser 4 Varianten war nahezu unabhängig vom kotransfizierten Variante-zu-WtD-Verhältnis (Abb. 5.11B).

Im Gegensatz dazu war bei den Varianten A-S15k und A-L1k, die bei einem transfizierten Variantenanteil von 20 % eine extrem verstärkte Replikation zeigten, eine Unterdrückung der WtD-Replikation zu beobachten, wenn der transfizierte Variantenanteil mindestens 50 % ausmachte (Abb. 5.11B). Gleichzeitig sank die Replikation der Variante, was auch zu einer abnehmenden Gesamtreplikation führte. Dieser Effekt war besonders drastisch für Variante A-L1k. Er deutet darauf hin, dass die übermäßig starke Variantenreplikation bei hohem transfizierten Variantenanteil auf Kosten des WtD stattfand und eine negative Rückwirkung auf Varianten- und Gesamtreplikation zur Folge hatte. Die Anreicherung der Varianten gegenüber dem WtD war meist unabhängig vom Variantenanteil an der transfizierten DNA (Abb. 5.11C). Sie resultierte aus der erhöhten Variantenreplikation, und nur im Falle von A-S15k und A-L1k trug die Unterdrückung der WtD-Replikation bei hohem transfizierten Variantenanteil zur Anreicherung der Varianten bei. Bei Variante A-L1k führte die überaus starke Replikation und WtD-Hemmung mit extrem reduzierter Gesamtreplikation jedoch mit steigendem transfizierten Variantenanteil auch zu einer verminderten Anreicherung der Variante.

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Zusammengefasst zeigten die komplexen Varianten beider Patienten nach Kotransfektion mit dem WtD-Genom eine klar erhöhte Replikation, die zu erhöhter Gesamtreplikation und zur Anreicherung der Varianten führte. Die detaillierten Replikationseigenschaften variierten sowohl zwischen den Varianten der beiden Patienten als auch zwischen Varianten des gleichen Patienten (A). Je nach Variante wurde während der Koreplikation die WtD-Replikation nicht beeinflusst, gehemmt oder sogar gefördert.

5.2.3.2 Replikative Intermediate in HepG2-Zellen

Um den Einfluss der Wirtszelle auf den Replikationsvorteil der Varianten zu untersuchen, wurden Kotransfektionen von WtD und Varianten des Patienten A in verschiedenen Verhältnissen auch in einer weiteren Hepatomazelllinie, HepG2, durchgeführt. Bei der Mehrzahl der Varianten konnten in den HepG2-Zellen, wie schon in den HuH7-Zellen, eine erhöhte Gesamtreplikation im Vergleich zu WtD allein (Abb. 5.12A), eine erhöhte Variantenreplikation (Abb. 5.12A und B) und eine Anreicherung der Varianten (Abb. 5.12C) nachgewiesen werden. Das Replikationsmuster der Varianten entsprach generell dem in HuH7 beobachteten, jedoch war in HepG2-Zellen die Replikation relativ zu WtD allein meist stärker. Nur die Replikation der Variante A-S18k war in HepG2 niedrig und sogar schwächer als die des WtD, so dass die Variante vom WtD überwachsen wurde (0,5fache Anreicherung, Abb. 5.12B und C). In den Kotransfektionen aller Varianten außer A-L1k wurde die Replikation des WtD nicht gehemmt. Sie war bei 20 % Variantenanteil an der transfizierten DNA weitgehend unbeeinflusst und stieg bei höheren Variantenanteilen auf das bis zu 3fache der erwarteten Replikation an (Abb. 5.12B). Dieser Anstieg war ausgeprägter als in den HuH7-Zellen und führte zu einer abgeschwächten Anreicherung der Varianten bei hohen transfizierten Variantenanteilen (Abb. 5.12C). Bei Variante A-S15k stand dies im Gegensatz zur Replikation in HuH7, wo sie den WtD in der Koreplikation hemmte und unabhängig vom transfizierten Verhältnis anreicherte. Nur Variante A-L1k verursachte in HepG2- wie auch in den HuH7-Zellen eine Unterdrückung der WtD-Replikation bei 50 % oder mehr Variante in der transfizierten DNA (Abb. 5.12B).

Abbildung 5.12: Analyse der Replikation in HepG2-Zellen nach Kotransfektion der komplexen Varianten des Patienten A mit WtD.

Die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden 5 Tage nach Kotransfektion von HepG2-Zellen mit den 4 komplexen Varianten von Patient A und WtD in verschiedenen Verhältnissen untersucht. A: Gesamtreplikation und Replikation der Variante relativ zu WtD allein. B: Replikation von Variante und WtD im Verhältnis zur jeweils transfizierten DNA-Menge. C: Anreicherung der Variante gegenüber WtD. Siehe auch Abb. 5.11. Gezeigt sind jeweils Mittelwerte ± Minimum/Maximum von 2 unabhängigen Experimenten.

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Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass der Replikationsvorteil der Varianten auch in HepG2-Zellen und daher an sich unabhängig von der Wirtszelle vorlag. Die Koreplikation schien generell in HepG2-Zellen im Vergleich zu HuH7-Zellen zu stärkerer Replikation relativ zu WtD allein zu führen, sowohl bei WtD als auch bei den Varianten.

5.2.3.3 Anreicherung der verpackten prägenomischen RNA

Als Ursache für den Replikationsvorteil der Varianten kommen mehrere Möglichkeiten in Betracht. Schon aufgrund der C-Gendeletion könnte eine schnellere reverse Transkription der in die Core-Partikel verpackten pgRNA zu replikativen DNA-Intermediaten eine Rolle spielen. Daneben könnte auch bereits die pgRNA der Varianten vermehrt im Core-Partikel verpackt vorliegen, worauf die erhöhten pgRNA-Werte der Varianten in der Gesamt-RNA von transfizierten Zellen (vgl. Abschnitt 5.2.1) hinweisen. Zur Klärung dieser Annahme wurde nach Kotransfektion von HuH7-Zellen mit WtD und komplexen Varianten des Patienten A die pgRNA aus intrazellulären Core-Partikeln isoliert, in cDNA umgeschrieben und in die Pyrosequenzierung eingesetzt. Aus dem ermittelten Anteil von WtD und Varianten an der pgRNA konnte analog zu den replikativen Intermediaten die Anreicherung der Variante in der verpackten pgRNA bestimmt werden (Abb. 5.13A).

Trotz der erhöhten gesamtzellulären pgRNA-Level im Vergleich zu WtD, wiesen die Varianten gegenüber WtD keine oder eine nur sehr marginale (A-S24k und A-L1k) Anreicherung der Core-Partikel-assoziierten pgRNA auf. Somit sollten die erhöhte Replikation und Anreicherung der replikativen Intermediate der Varianten (Abb. 5.11 und 5.13B) aus einem Vorteil der Varianten während der reversen Transkription resultieren. Vermehrt verpackte pgRNA der Varianten scheint keine entscheidende Rolle zu spielen.

5.2.3.4 Anreicherung der Varianten in extrazellulären Partikeln

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Auch aus extrazellulären viralen Partikeln im Zellkulturüberstand isolierte DNA wurde pyrosequenziert und zur Bestimmung der Anreicherung der Varianten verwendet. Es zeigte sich bei 3 der 4 Varianten eine Anreicherung gegenüber WtD (Abb. 5.13C), die im Vergleich zur Anreicherung der intrazellulären replikativen Intermediate (Abb. 5.13B) leicht reduziert war. Bei Variante A-S15k betrug sie etwa die Hälfte, bei A-S18k und A-L1k meist über 80 % der intrazellulären Anreicherung. Lediglich bei Variante A-S24k, deren replikative Intermediate nur eine schwache Anreicherung zeigten, wurde keine Anreicherung im Zellkulturüberstand nachgewiesen. In der Mehrzahl der Varianten verließ jedoch nach Kotransfektion mit dem WtD ein erhöhter Anteil der Varianten die Zelle, was mit ihrer beobachteten Akkumulation in vivo übereinstimmt.

Neben der Pyrosequenzierung wurden auch diverse andere Methoden angewandt, um das ausgeschleuste Virus im Zellkulturüberstand nach Transfektion des WtD und/oder der Varianten zu quantifizieren und zu charakterisieren. Leider gelang es jedoch mit keinem der Ansätze, zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Southern Blots der aus extrazellulären viralen
Abbildung 5.13: Anreicherung der Varianten des Patienten A gegenüber WtD in verpackter pgRNA (A), replikativen Intermediaten (B) und extrazellulären viralen Partikeln (C).

Die 4 komplexen Varianten von Patient A wurden mit WtD in verschiedenen Verhältnissen (20, 50 und 70 % Varianten-DNA im Gemisch) in HuH7-Zellen kotransfiziert. Die Anreicherung der Varianten gegenüber WtD wurde in während verschiedener Stadien des Replikationszyklus vorliegenden Nukleinsäure-Spezies bestimmt. Sie wurde folgendermaßen berechnet (vgl auch Abb. 5.11): Anreicherung (x-fach) = (% Variante / % WtD) in den verschiedenen partikelassoziierten Nukleinsäure-Spezies bestimmt durch Pyrosequenzierung / (% Variante / % WtD) in der transfizierten DNA. A: Die pgRNA wurde 5 Tage nach Transfektion aus zytoplasmatischen Core-Partikeln isoliert, in cDNA umgeschrieben und pyrosequenziert. Gezeigt sind Mittelwerte ± StA der Anreicherung der Variante in der pgRNA von mindestens 2 unabhängigen Experimenten. B: Die dargestellte Anreicherung der replikativen Intermediate der Varianten entspricht der Abb. 5.11C. C: 4 Tage nach Transfektion wurden Viruspartikel aus dem Zellkulturüberstand pelletiert, die DNA daraus isoliert und pyrosequenziert. Zur Anreicherung der Variante gegenüber WtD in der extrazellulären HBV-DNA sind Mittelwerte ± StA von mindestens 2 unabhängigen Experimenten dargestellt.

Partikeln isolierten HBV-DNA scheiterten vermutlich an der geringen Menge der nachzuweisenden Moleküle. Es wurden verschiedene Methoden zur Aufreinigung des Virus aus dem Zellkulturüberstand getestet und optimiert (Ultrazentrifugation, PEG-Fällung, Immunpräzipitation und Kombinationen dieser Methoden), und zur Erhöhung der Virusmenge wurden die Überstände vieler Transfektionsansätze gepoolt. Dennoch waren die Ergebnisse im Southern Blot, insbesondere in der Quantifizierung, nicht reproduzierbar. Gleiches galt, wenn aus dem Medium aufgereinigte virale Partikel direkt in einer nativen Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und auf verschiedene Membranen (Nylon, Nitrocellulose, PVDF) geblottet wurden. Durch Detektion mit verschiedenen Antikörpern gegen HBV-Core und -Oberflächenproteine konnten zwar nach Transfektion von WtD- oder WtA-DNA umhüllte Partikel und in geringerem Maße nackte Core-Partikel nachgewiesen werden, eine reproduzierbare Quantifizierung und der wiederholte Nachweis der HBV-DNA in den auf der Membran aufgebrochenen Partikeln gelang jedoch nicht. Auch die versuchten Nachweise der extrazellulären Partikel im Elektronenmikroskop und durch quantitative PCR im LightCycler führten zu keinem reproduzierbaren Ergebnis.

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Eine das C-Gen umfassende PCR von DNA aus ultrazentrifugierten oder immunpräzipitierten viralen Partikeln lieferte dann ergänzend zur Pyrosequenzierung den qualitativen Beweis dafür, dass nach Kotransfektion von WtD und Varianten des Patienten A in allen getesteten Verhältnissen sowohl Partikel mit viraler DNA der Varianten als auch des WtD die Zellen verließen. Im Agarosegel war neben der Wt-Bande auch immer die kleinere Bande des verkürzten C-Gens der Varianten zu sehen (Ergebnisse nicht gezeigt). Auch nach Transfektion der Varianten mit pCore, jedoch nicht nach deren alleiniger Transfektion, war das C-Gen der Varianten auf diese Weise nachweisbar. Dies deutet, zumindest im Fall der Varianten A-S18k und A-S24k ohne HBsAg-Expression im Medium, auf die Ausschleusung nackter Core-Partikel aus den transfizierten HuH7-Zellen hin.

5.3 Replikation von Variantenpools

Unklar war, ob der Replikationsvorteil der Varianten auch bei Einsatz der gesamten zu einem Zeitpunkt vorliegenden Viruspopulation bestehen würde. Um die Viruspopulationen der Patienten im späten Stadium während der LZ nachzustellen und deren Replikation zu untersuchen, wurden Pools von gleichen Teilen aller replikationskompetenten Klone einer Serum- bzw. Leberprobe zusammen mit dem WtD kotransfiziert. Es kamen Variantenpools von 3 Abnahmen der beiden Patienten zur Anwendung, die in ihrer Zusammensetzung und Häufigkeit der einzelnen Variantentypen die jeweiligen HBV-Populationen repräsentierten. Pool A-I enthielt die 3 komplexen Varianten A-S22k, A-S23k und A-S24k, isoliert aus einer späten Serumabnahme von 05/96 während der LZ des Patienten A (Abb. 5.2). Pool A-II setzte sich aus den 6 Varianten A-L1k, A-L2k, A-L3k, A-L6k, A-L7k und A-L8k aus der zirrhotischen Leber von 07/96 des Patienten A zusammen (Abb. 5.2). Pool B umfasste 4 komplexe Varianten aus der späten Serumabnahme von 12/95 des Patienten B (B-S4k, B-S5k, B-S7k und B-S8k, Abb. 5.4). Die Kotransfektion der Pools mit WtD in HuH7-Zellen erfolgte in den Verhältnissen 20:80 und 50:50. Die Analyse der replikativen Intermediate aus intrazellulären Core-Partikeln mittels Southern Blots und Pyrosequenzierung ergab für alle 3 WtD-Pool-Mischungen eine erhöhte Gesamtreplikation im Vergleich zum WtD allein (Abb. 5.14A), eine 2–6fach erhöhte Replikation des Variantenpools relativ zur eingesetzten DNA-Menge (Abb. 5.14B) und eine 2–13fache Anreicherung der Variantenpools gegenüber dem WtD (Abb. 5.14C). Selbst Variantenpool A-I, der mit A-S24k eine Variante mit nur sehr schwach verstärkter Replikation enthielt (Abb. 5.11), zeigte einen klaren Replikationsvorteil gegenüber dem WtD. Die Replikation und Anreicherung war am höchsten bei Pool A-II, der sich aus den überwiegend auch einzeln sehr stark replizierenden Varianten der Leber von Patient A (Abb. 5.1A) zusammensetzte.

Abbildung 5.14: Analyse der Replikation nach Kotransfektion von Variantenpools mit WtD.

HuH7-Zellen wurden mit Variantenpools und WtD in verschiedenen Verhältnissen kotransfiziert (20 oder 50 % Pool im Gemisch). Die Variantenpools bestanden zu gleichen Teilen aus den replikationskompetenten komplexen Varianten des Serums von 05/96 (Pool A-I: A-S22k, -S23k, -S24k) und der Leber 07/96 (Pool A-II: A-L1k, -L2k, -L3k, -L6k, -L7k, -L8k) von Patient A und des Serums von 12/95 (Pool B: B-S4k, -S5k, S7k, -S8k) von Patient B. Sie repräsentierten in ihrer Zusammensetzung die Viruspopulationen der jeweiligen Zeitpunkte nach Diagnose der LZ. A: Gesamtreplikation und Replikation der Variantenpools relativ zum WtD allein. B: Replikation der Variantenpools und des WtD im Verhältnis zur jeweils transfizierten DNA-Menge. C: Anreicherung der Variantenpools gegenüber WtD. Siehe auch Abb. 5.11. Gezeigt sind jeweils Mittelwerte ± StA von 3 unabhängigen Experimenten.

↓69

Grundsätzlich war die Anreicherung der Variantenpools bei Transfektion von 50 % Variantenpool stärker als bei nur 20 %, im Gegensatz zur Anreicherung der Einzel-Varianten, die entweder gleichbleibend war oder mit höherem Variantenanteil sank (A-L1k, Abb. 5.11C). Der transfizierte WtD- und Variantenpoolanteil von 50 % lag dabei deutlich näher an dem sehr niedrigen Anteil der Genome mit Wt-C-Gen, der in den jeweiligen HBV-Populationen zum Zeitpunkt der Isolierung der Pool-Varianten vorlag (Pool A-I: 37,5 %, Pool A-II: 8 %, Pool B: 10 %). Keiner der Variantenpools der beiden Patienten replizierte auf Kosten des WtD, dessen Replikation weitgehend den von der transfizierten WtD-DNA-Menge erwarteten Werten entsprach (Abb. 5.14B). Die Hemmung der WtD-Replikation durch einzelne komplexe Varianten, wie z. B A-L1k (Abb. 5.11B), kam im Kontext der Variantenpools also nicht zum Tragen.

5.4 Analyse von Hybridgenomen

5.4.1  Replikation der C/Cp-Hybridvarianten

Es ist bekannt, dass Mutationen im Cp und C-Gen die HBV-Replikation stark beeinflussen können. Verschiedene Studien haben bereits eine verstärkte Replikation für Varianten mit entweder C-Gendeletionen oder Cp-Mutationen nachgewiesen, die denen der komplexen Varianten sehr ähnlich sind. Daher sollte untersucht werden, welche Rolle die Mutationen in Cp und C-Gen in ihrer Kombination für die erhöhte Replikation der komplexen Varianten spielen. Cp und C-Gen der Wt-ähnlichen Klone der Patienten (A-S1 und B-S3) wurden durch die entsprechenden Regionen der komplexen Varianten des gleichen Patienten ersetzt. So entstanden 6 sogenannte C/Cp-Varianten (Schema Abb. 5.15, oben), die analog zu den komplexen Varianten in Kotransfektionen mit dem WtD in verschiedenen Verhältnissen auf ihre Replikation hin untersucht wurden.

Die C/Cp-Varianten zeigten eine erhöhte Replikation und meist auch Anreicherung gegenüber dem WtD (Abb. 5.15A, B und C). Die WtD-Replikation wurde außer bei Variante A-S15k-C/Cp nicht gehemmt, sondern eher leicht gefördert (1,5- bis 3fach, Abb. 5.15B). Sowohl A-S18k-C/Cp und A-L1k-C/Cp als auch B-S7k-C/Cp und B-S8k-C/Cp, die jeweils gleiche Cp-Mutationen (Insertion oder Deletion) und C-Gendeletionen (90 oder 51 nt lang) tragen, wiesen jeweils ein sehr ähnliches Replikationsmuster mit ca. 3facher Anreicherung auf. Bei den ersten beiden sank die WtD-Replikation mit steigendem Variantenanteil in der transfizierten DNA (allerdings nie unter die dem transfizierten WtD-Anteil entsprechenden Werte), während sie bei den letzteren beiden leicht anstieg (Abb. 5.15B). Bei Variante A-L1k-C/Cp waren also nicht die starke Hemmung der WtD-Replikation und die daraus folgende extreme negative Rückkopplung auf Varianten- und Gesamtreplikation der komplexen Variante zu finden.

↓70

Die Hybridvarianten A-S15k-C/Cp und A-S24k-C/Cp mit Cp-Punktmutationen (z. B. nt 1762/1764) und der 90-nt-Deletion im C-Gen zeigten im Vergleich zu den 4 anderen Hybridvarianten eine nur leicht verstärkte Replikation (maximal 2,2- und 1,6fach). Im Gegensatz zu A-S15k-C/Cp reicherte A-S24k-C/Cp aber nicht auf Kosten des WtD an, sondern wurde vom WtD überwachsen (Abb. 5.15B und C). Die beiden Hybridgenome unterscheiden sich durch zusätzliche Punktmutationen bei nt 1753 und 1767 im Cp von A-S24k-C/Cp und durch verschiedene Punktmutationen im C-Gen (u. a. der frameshift- und Stoppkodonmutation von A-S15k-C/Cp). Die korrespondierende komplexe Variante A-S24k wurde bei hohem transfizierten Variantenanteil nicht vom WtD überwachsen (Abb. 5.11).

Abbildung 5.15: Replikation der C/Cp-Hybridvarianten nach Kotransfektion mit WtD.

Die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden 4 Tage nach Kotransfektion von HuH7-Zellen mit C/Cp-Hybridvarianten und WtD in verschiedenen Verhältnissen untersucht. Zur Konstruktion der C/Cp-Varianten wurden Cp und C-Gen der jeweiligen Wt-ähnlichen Genome (Patient A: A-S1, Patient B: B-S3) durch die entsprechenden Regionen der komplexen Varianten ersetzt. A: Gesamtreplikation und Replikation der Variante relativ zu WtD allein. B: Replikation von Variante und WtD im Verhältnis zur jeweils transfizierten DNA-Menge. C: Anreicherung der Variante gegenüber WtD. Siehe auch Abb. 5.11. Gezeigt sind jeweils Mittelwerte ± StA von 3 unabhängigen Experimenten.

Bei der Mehrzahl der C/Cp-Varianten waren, unabhängig von der Länge der C-Gendeletion, Replikation und Anreicherung schwächer als bei den entsprechenden komplexen Varianten. Nur die C/Cp-Variante von A-S18k zeigte eine viel stärkere Replikation und Anreicherung als die komplexe Variante. Dies weist auf einen replikationshemmenden Effekt von Mutationen hin, die ausschließlich in der komplexen Variante vorhanden sind (z. B. eine X-Gen-Startkodonmutation oder verschiedene Austausche im EnhI, PRE oder der Polymerase, Abb. 5.5).

↓71

Im Gegensatz zu den Varianten des Patienten A lagen bei Patient B zwischen der Replikation der C/Cp- und der komplexen Varianten nur geringfügige Unterschiede vor. Tatsächlich unterscheidet sich das Mutationsmuster der komplexen Varianten des Patienten B auch deutlich weniger von dem ihrer C/Cp-Varianten, als dies bei den Varianten des Patienten A der Fall ist, da sie außerhalb von Cp und C-Gen nur sehr wenige zusätzliche Punktmutationen tragen, die im Wt-ähnlichen B-S3 nicht vorhanden sind (Abb. 5.5).

In der Zusammenfassung waren also die Mutationen in Cp und C-Gen der komplexen Varianten ausreichend, um eine erhöhte Replikation und meist auch Anreicherung ohne Hemmung des WtD zu bewirken. Mutationen außerhalb dieser beiden Regionen beeinflussten jedoch deutlich die Replikationsstärke der Varianten und des koreplizierenden WtD. Auf die Variantenreplikation hatten sie hauptsächlich einen positiven Effekt, im Einzelfall aber auch negative Auswirkungen (A-S18k).

5.4.2 Replikation der Cp- und C-Gen-Hybridvarianten

Um den Beitrag der Mutationen in Cp und C-Gen zum Phänotyp der erhöhten Replikation einzeln zu untersuchen, wurden exemplarisch der Cp mit Punktmutationen bei nt 1762 und 1764 von A-S15k, ein Cp mit der 8-nt-Deletion 1763–1770, der Cp mit der 11-nt-Insertion 1776/1777 von A-L1k sowie das C-Gen mit 90-nt-Deletion von A-L1k in das Wt-ähnliche Genom A-S1 des Patienten A eingebracht.

↓72

Die replikativen Intermediate der Cp-Hybridvarianten wurden im Southern Blot im Vergleich zu WtD und zu A-S1 analysiert und densitometrisch ausgewertet (Abb. 5.16A). Hybridvariante A-S15k-Cp mit den Punktmutationen 1762/1764 replizierte etwa wie der WtD (118 % von WtA, vgl. Abb. 5.10) und mit ca. 150 % von A-S1. Die Cp-Varianten mit Insertion (A-L1k-Cp) und Deletion (A-Cp-Del) im A-S1-Kontext zeigten dagegen eine gegenüber dem WtD ca. 2fach (WtA: ca. 2,4fach) und gegenüber A-S1 ca. 3fach erhöhte Replikation.

Die C-Gen-Hybridvariante A-L1k-C wurde zur Komplementation des defekten Core-Proteins mit WtD kotransfiziert. Die Analyse der Replikation in Southern Blot und Pyrosequenzierung ergab, wie für die komplexen Variante, eine erhöhte Replikation und Anreicherung von
A-L1k-C, jedoch in einem deutlich geringeren Maße (Abb. 5.16B, C und D). Die maximale Replikation betrug das 2fache der von der transfizierten DNA-Menge erwarteten Replikation (gegenüber dem 13fachen der komplexen Variante, Abb. 5.11B) und die Anreicherung das 3fache. Dennoch wurde die WtD-Replikation bei hohem transfizierten Variantenanteil gleichermaßen wie bei der komplexen Variante gehemmt, was das Absinken der Varianten- und Gesamtreplikation zur Folge hatte.

Abbildung 5.16: Replikation der Cp-Hybridvarianten (A) und der C-Gen-Hybridvariante nach Kotransfektion mit WtD (B, C, D).

Replikative Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurden 4 Tage nach Transfektion von HuH7-Zellen mit Cp-Hybridvarianten bzw. nach Kotransfektion mit der C-Gen-Hybridvariante und WtD in verschiedenen Verhältnissen untersucht. Zur Konstruktion der Cp- und der C-Gen-Varianten wurden der Cp bzw. das C-Gen des Wt-ähnlichen Genoms A-S1 durch die entsprechende Region von komplexen Varianten des Patienten A ersetzt. Dargestellt sind die Ergebnisse für 3 Cp-Varianten mit Punktmutationen bei nt 1762/64 (A-S15k-Cp), der 11-nt-Insertion (A-L1k-Cp) oder der 8-nt-Deletion (A-Cp-Del) sowie für eine C-Genvariante mit dem 90-nt-deletierten C-Gen von A-L1k im A-S1-Kontext. Für die Hybridvariante A-Cp-Del wurde der Cp einer bisher nicht erwähnten Variante (A-3/25) isoliert, der bis auf die Abwesenheit der 1753-Punktmutation mit dem deletierten Cp der Varianten des Patienten B identisch ist.
A: Quantitative Auswertung der replikativen Intermediate der Cp-Varianten im Southern Blot relativ zu WtD.
B: Gesamtreplikation und Replikation der C-Gen-Variante relativ zu WtD allein. C: Replikation von C-Gen-Variante und WtD im Verhältnis zur jeweils transfizierten DNA-Menge. D: Anreicherung der C-Gen-Variante gegenüber WtD. Siehe auch Abb. 5.11. Gezeigt sind jeweils Mittelwerte ± StA von mindestens 4 unabhängigen Experimenten.

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Die Cp- und C-Genmutationen der komplexen Varianten führten also auch allein in einem Wt-ähnlichen Genom-Kontext schon zur erhöhten Replikation. Allerdings zeigte sich am Beispiel der Variante A-L1k, dass die Effekte von Cp- und C-Genmutationen (je 2fache Erhöhung gegenüber WtD) in der Summe nicht das Niveau der erhöhten Replikation der C/Cp-Variante (6fache Erhöhung, Abb. 5.15B) erreichten. Die Mutationen im C-Gen vermittelten eine Hemmung der WtD-Replikation, die mit der zusätzlichen Anwesenheit einer Cp-Insertion nicht mehr vorhanden war (A-L1k-C/Cp, Abb. 5.15B). Bei der komplexen Variante A-L1k mit einer nochmals drastisch gesteigerten Replikationsfähigkeit wurde diese Hemmung des WtD jedoch wieder beobachtet (Abb. 5.11B).

5.4.3 Transkription

Auch die Transkription der Hybridgenome wurde nach Transfektion von HuH7-Zellen analysiert, um den Einfluss der Mutationen in Cp und/oder C-Gen auf die veränderte RNA-Expression der komplexen Varianten zu untersuchen.

Die Analyse der 3,5-kb-RNA-Bande (pgRNA + präC-mRNA) in Northern Blots von Gesamt-RNA demonstrierte, dass die bei den komplexen Varianten beobachtete verstärkte Expression dieser RNAs nur teilweise auf die Mutationen in Cp und C-Gen zurückzuführen war (Abb. 5.17A und B). Zur Differenzierung der präC-mRNA und pgRNA wurden wieder ergänzend Primer-Extension-Analysen durchgeführt (vgl. auch Abschnitt 5.2.1). Bei den C/Cp- und Cp-Hybridvarianten war das Verhältnis von präC-mRNA zu pgRNA wie bei den komplexen Varianten durch verminderte Expression der präC-mRNA stark reduziert (Abb. 5.17B). Daher bestand auch hier die 3,5-kb-Bande im Northern Blot hauptsächlich aus pgRNA, und ein verstärktes Signal dieser Bande ließ sich mit verstärkter Expression der pgRNA gleichsetzen. Bei der C-Gen-Hybridvariante A-L1k-C war das Verhältnis von präC-mRNA zu pgRNA dagegen nahezu unverändert.

↓74

Im Gegensatz zu den Cp-Punktmutationen (A-S15k-Cp), der Cp-Deletion (A-Cp-Del) und dem deletierten C-Gen (A-L1k-C), die die pgRNA-Level im Vergleich zum entsprechenden Wt- ähnlichen Genom A-S1 nicht veränderten, bewirkte die Cp-Insertion (A-L1k-Cp) eine leichte Erhöhung der pgRNA-Expression (Abb. 5.17B). Die pgRNA-Level der C/Cp-Varianten waren im Fall der Varianten A-S15k mit Cp-Punktmutationen und der Varianten des Patienten B mit Cp-Deletion nahezu unverändert oder nur marginal erhöht und entsprachen damit dem Niveau der korrespondierenden Cp-Varianten. Bei Variante A-L1k-C/Cp mit Cp-Insertion lag die pgRNA-Expression zwischen dem erhöhten Level der Cp- und dem unveränderten Level der C-Gen-Variante.

Abbildung 5.17: Transkription der Hybridvarianten im Vergleich zu WtD, den Wt-ähnlichen Genomen und den komplexen Varianten.

Vier Tage nach Transfektion von HuH7-Zellen mit HBV-DNA der Cp-, C-Gen- und C/Cp-Hybridvarianten, der komplexen Varianten und der Wt-(ähnlichen) Genome wurde die Gesamt-RNA der Zellen präpariert und in Northern Blots und Primer-Extension-Assays analysiert. Die Auswertungen der Northern Blots sind einheitlich relativ zu WtD dargestellt. A: Die exemplarisch dargestellten Northern Blots wurden mit einer HBV-Gesamt-Genom-Sonde und zur Ladekontrolle mit einer β-Aktin-Sonde hybridisiert. B: Von der quantitativen Auswertung der 3,5-kb-Bande (pgRNA + präC-mRNA) der Northern Blots sind Mittelwerte ± StA von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt.
C: Ergebnisse der Primer-Extension-Analysen von präC-mRNA und pgRNA. Das im Diagramm präsentierte Verhältnis der präC-mRNAs zur pgRNA wurde nach quantitativer Auswertung der Signale mit dem TINA-Programm berechnet. Für die Hybridvarianten sind Mittelwerte + StA von 2–3 unabhängigen Experimenten dargestellt. In den mit einem Stern gekennzeichneten Balken ging nur das Ergebnis eines Experiments ein. D: Von der quantitativen Auswertung der präS1- und präS2/S-mRNAs in Northern Blots sind Mittelwerte ± StA von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt. (Siehe auch Abb. 5.6.)

Wie auch die Replikation war die pgRNA-Expression bei C/Cp-Varianten des Patienten A meist weniger ausgeprägt als die der entsprechenden komplexen Varianten und bei den C/Cp-Varianten des Patienten B etwa gleich stark. Nur bei Variante A-S18k war die pgRNA-Expression der C/Cp-Variante deutlich erhöht und, wie auch die Replikation, stärker als die der komplexen Variante. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass bei den Varianten des Patienten A auch Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen einen deutlichen Einfluss auf die Expression der pgRNA haben.

↓75

Bei der Auswertung der Oberflächen-mRNAs im Northern Blot zeigte sich, dass die Cp-Punktmutationen allein (A-S15k-Cp) und auch in Kombination mit den C-Genmutationen (A-S15k-C/Cp, A-S24k-C/Cp) keinen Einfluss auf die Expression von präS1- und präS2/S-mRNA hatten (Abb. 5.17C). Die 11-nt-Insertion im Cp (A-L1k-Cp) verursachte allein nur eine schwache Senkung der präS2/S-mRNA, in Kombination mit zusätzlichen Mutationen im C-Gen (A-L1k-C/Cp, A-S18k-C/Cp) aber eine geringe Erniedrigung beider Oberflächen-mRNAs. Die Mutationen im C-Gen allein bewirkten bei Hybridvariante A-L1k-C eine leichte Reduktion der präS1-mRNA, jedoch nicht der präS2/S-mRNA.

Die Cp-Deletion senkte im Kontext des Wt-ähnlichen Genoms A-S1 die Expression der beiden Oberflächen-mRNAs auf ca. 50 % (A-Cp-Del). In Kombination mit den C-Genmutationen im Wt-ähnlichen Genom des Patienten B B-S3 (B-S7k-C/Cp, B-S8k-C/Cp) führte die Cp-Deletion ebenfalls zu einer auf ca. 65 % reduzierten präS1-mRNA, die präS2/S-mRNA war in diesem Kontext jedoch kaum betroffen. Dagegen wiesen die komplexen Varianten des Patienten B wiederum eine deutlichere, 40–50%ige Reduktion beider Oberflächen-mRNAs auf. Da die Klonierung der Cp-Deletion allein im Kontext des B-S3-Genoms nicht gelang, kann über den Grund der weniger ausgeprägten Reduktion insbesondere der präS2/S-mRNA der C/Cp-Genome von Patient B im Vergleich zu den korrespondierenden komplexen Varianten und zu Hybridvariante A-Cp-Del nur spekuliert werden. Entweder hoben Mutationen im C-Gen der C/Cp-Varianten den bei A-Cp-Del beobachteten reduzierenden Effekt der Cp-Deletion teilweise auf oder er kam im genomischen Kontext des Patienten B weniger zum Tragen. Für die Reduktion bei den komplexen Varianten sind also möglicherweise Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen wichtig. Da die komplexen Varianten in den regulatorischen Bereichen der Oberflächen-RNA-Expression (S1p und S2/Sp) keine anderen Mutationen als B-S3 tragen (Abb. 5.5), kämen dafür nur andere Nukleotidaustausche wie z. B. 1227 T>C im EnhI in Frage. Auch die meisten komplexen Varianten des Patienten A zeigten eine viel stärker reduzierte Expression der präS2/S-mRNA als die Hybridvarianten. Hier wurde dieser Effekt vermutlich durch eine Punktmutation bei nt 3084 G>A im S2/S-Promotor verursacht (vgl. Abschnitt 5.2.1 und Abb. 5.5).

Zusammengefasst macht die Analyse der Transkription der Hybridvarianten deutlich, dass die veränderte RNA-Expression der komplexen Varianten nur teilweise auf die Mutationen in Cp und C-Gen zurückzuführen ist. Die Mutationen im Cp waren verantwortlich für die verringerte präC-mRNA-Expression. Dagegen hatten die Cp- und C-Gen-Mutationen (mit Ausnahme der Cp-Deletion) keinen oder im Fall der Cp-Insertion nur einen geringen Einfluss auf die Oberflächen-mRNAs. Erstaunlich ist jedoch, dass auch die erhöhte pgRNA-Expression bei Varianten des Patienten A teilweise auf Mutationen in anderen Bereichen beruht. Unklar ist, welche dies sein könnten.

5.5 Auswirkungen auf das Spleißen der pg/präC-RNAs

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Während der HBV-Replikation findet partielles Spleißen der 3,5-kb-pg/präC-RNAs statt, das vermutlich eine zur Zeit noch unklare Rolle im Replikationszyklus spielt. In Zellkulturexperimenten enthalten bis zu 80 % der intrazellulären Core-Partikel und 20 % der extrazellulären Viruspartikel verkürzte Genome, die von gespleißter pgRNA abstammen [215]. Die vorherrschende gespleißte pgRNA ist die SP1-RNA mit einem Spleißdonor bei nt 2453/2454 (Genotyp D: nt 2447/2448) und einem Spleißakzeptor bei nt 488/489 (Abb. 5.18A). Sie macht neben 10 anderen bekannten gespleißten RNAs ca. 60 % aller Spleißprodukte aus [215,15]. Um die Auswirkungen der komplexen Mutationsmuster der Varianten auf das Spleißen zu analysieren, wurde die SP1-RNA im Verhältnis zur ungespleißten 3,5-kb-pg/präC-RNA untersucht. Dazu wurden Northern Blots von Gesamt-RNA der transfizierten Zellen mit einer Sonde hybridisiert, die ausschließlich die pg + präC-RNAs und die SP1-RNA, jedoch nicht die subgenomischen Oberflächen-mRNAs bindet (Abb. 5.18A). In Northern Blots mit Sonden, die das gesamte Genom umspannen (wie z. B. in Abschnitt 5.2.1), wird die ca. 2 kb große SP1-RNA im Allgemeinen von den deutlich stärker exprimierten Oberflächen-mRNAs überdeckt.

5.5.1  Gespleißte SP1-RNA der HBV-Genome der Patienten A und B

Zunächst wurden Genome der beiden Patienten A und B hinsichtlich der gespleißten SP1-RNA untersucht. Die Wt-Genome WtD und WtA sowie diejenigen Klone der beiden Patienten, die ein C-Gen ohne Deletion tragen und meist vom Beginn des Beobachtungszeitraums vor LZ stammen (A-S1, A-S4, A-S7, B-S3, B-S9), zeigten eine klare SP1-Bande im Northern Blot (Abb. 5.18B). Dagegen war die SP1-Bande bei den komplexen Varianten kaum noch oder gar nicht mehr zu erkennen. Das aus der Intensität der Banden

Abbildung 5.18: Analyse der häufigsten gespleißten RNA SP1.

Zur Analyse der gespleißten RNA SP1 wurden HuH7-Zellen mit den Wt-Genomen, verschiedenen HBV-Genomen von 5 Patienten (A-E) und Hybridvarianten transfiziert. Nach 4 Tagen wurde die Gesamt-RNA aus den Zellen aufgereinigt und im Northern Blot untersucht. A: Schematische Darstellung der ungespleißten pgRNA, der gespleißten RNA SP1 mit dem Spleißdonor (SD) bei nt 2453 (Genotyp A; Genotyp D: nt 2447) und dem Spleißakzeptor (SA) bei nt 489 sowie der subgenomischen Oberflächen-RNAs. Die Position der verwendeten Northern-Blot-Sonde (nt 2021–2755) ist angegeben. B: Gezeigt sind Northern Blots mit der Sonde, die SP1 und pg+präC-RNAs detektiert, jedoch nicht an die subgenomischen RNAs bindet (vgl. A). C:. Nach quantitativer Auswertung der Northern-Blot-Banden wurde das Verhältnis der SP1-RNA zur pg+präC-RNA berechnet und im Diagramm aufgetragen. Der deutliche Nachweis von SP1-RNA bei den C/Cp-Varianten und C-Gen-Hybridvariante A-L1k-C zeigt, dass die Bindung der Sonde durch die C-Gendeletionen nicht behindert wurde. Die Ergebnisse wurden exemplarisch für einige Genome der Patienten A und B in 3 unabhängigen Experimenten bestätigt.

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berechnete Verhältnis von SP1 zu ungespleißten pg + präC-RNAs der komplexen Varianten beider Patienten war im Vergleich zu den Wt-Genomen und den anderen Klonen erheblich reduziert (Abb. 5.18C), obwohl keine der komplexen Varianten an den Spleißorten mutiert ist (vgl. Abb. 5.5).

Um die für die drastische Reduktion des Spleißprodukts SP1 verantwortlichen Genomveränderungen einzugrenzen, wurden einige der Hybridgenome mit Cp, C-Gen und Cp + C-Gen der Varianten im Kontext der Wt-ähnlichen Genome auf ihr Spleißen getestet. Alle Hybridgenome zeigten hohe SP1-RNA-Level (Abb. 5.18B und C). Daher sind also weder die Cp- oder C-Gen-Mutationen einzeln noch ihre Kombination für das Phänomen der reduzierten SP1-RNA allein verantwortlich.

5.5.2 Gespleißte SP1-RNA der HBV-Genome weiterer Patienten

Um sicher zu gehen, dass es sich bei dem verminderten Spleißen zur SP1-RNA tatsächlich um eine allgemeine Eigenschaft der komplexen mit LZ assoziierten Varianten handelte, wurden HBV-Genome aus 3 weiteren Nierentransplantatempfängern mit chronischer Hepatitis B untersucht. Die Patienten C und D hatten wie auch Patient A und B nach Auftauchen und Akkumulation der komplexen HBV-Varianten eine LZ entwickelt (beschrieben als Patienten 13 und 10 in Preikschat et al. [134]). Patient E gehörte dagegen zur Vergleichsgruppe und hatte weder komplexe Varianten noch LZ.

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Beide Klone des Patienten E, die lediglich wenige Punktmutationen tragen, zeigten ähnlich hohe SP1-RNA-Level wie die Referenz-Wt-Genome und die Wt-ähnlichen Klone der Patienten A und B (Abb. 5.18B und C). Bei den 3 Varianten des Patienten D fand sich das gleiche Bild wie bei den ersten beiden Patienten: Der Klon D-19/03 ohne C-Gendeletion wies normale SP1-RNA-Level auf, während bei den komplexen Varianten D-19/08k und D-5/19k die SP1-RNA stark reduziert war. Die beiden komplexen Varianten gehören zu dem Variantentyp, der während der Entwicklung der LZ in diesem Patienten die Hauptpopulation bildete. Lediglich bei Patient C fanden sich eine Variante ohne C-Gendeletion (C-5/17), die kaum SP1-RNA zeigte, und 2 komplexe Varianten (C-5/01k und C-5/18k), die im Vergleich zu den Wt-Genomen nur schwach reduzierte SP1-RNA-Level aufwiesen (Abb. 5.18B und C). Klon C-5/01k hat jedoch nur eine sehr kleine C-Gendeletion, die deutlich weiter C-terminal liegt als die der anderen komplexen Varianten (nt 2394–2420, siehe Anhang Abb. A.1), während die C-Gendeletion des Klons C-5/18k um einiges größer ist als die der anderen Genome (nt 2068–2304, 237 nt).

Insgesamt, mit Ausnahme des Patienten C, bestätigte sich eine Korrelation zwischen komplexem Mutationsmuster mit C-Gendeletion und drastisch verminderter SP1-RNA. Neun von 10 Genomen mit reduziertem Spleißprodukt SP1 tragen eine C-Gendeletion und 9 von 11 Genomen mit normalen SP1-RNA-Leveln haben keine C-Gendeletion. Da jedoch die Analyse der Hybridgenome demonstrierte, dass C-Gendeletionen alleine und auch zusammen mit Cp-Mutationen die SP1-RNA nicht herunterregulieren, sind zusätzlich weitere Mutationen außerhalb dieser Bereiche in das Phänomen involviert.

5.5.3 Gespleißte replikative Intermediate in Core-Partikeln

Alle 11 bekannten Spleißprodukte der pgRNA des HBV werden in Core-Partikel verpackt, revers transkribiert und sind in viralen Partikeln im Serum von Patienten zu finden [15]. Um auszuschließen, dass der Level der SP1-RNA bei den komplexen Varianten aufgrund einer verstärkten Umschreibung in DNA reduziert war, wurde das Verhältnis der SP1-abgeleiteten und ungespleißten replikativen Intermediate im Vergleich zu den Wt-Genomen bestimmt. Dazu wurde nach Transfektion der Referenz-Wt-Genome, der Wt-ähnlichen Genome der Patienten A und B, der komplexen Varianten + pCore und des C/Cp-Hybridgenoms A-L1k-C/Cp + pCore ein Fragment der replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln mittels einer PCR amplifiziert, die das in der SP1-RNA entfernte Intron einschloss (schematische Darstellung der Primer-Positionen in Abb. 5.19A). Für die von ungespleißter pgRNA umgeschriebene DNA war somit eine Bande von 1596 bp und für die SP1-abgeleitete DNA eine Bande von 340 bp im Agarosegel sichtbar (Abb. 5.19B). Bei der zur Kontrolle amplifizierten DNA des WtD-Plasmids war, wie erwartet, nur die Bande des ungespleißten Produkts zu finden.

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Die quantitative Auswertung der Banden zeigte, dass auch die von der SP1-RNA revers transkribierte DNA bei den komplexen Varianten relativ zur ungespleißten DNA stark reduziert war im Vergleich zu WtD, WtA und den Wt-ähnlichen Genomen (Abb. 5.19C). Bei A-S15k war das Verhältnis im Einklang mit der auch im Northern Blot etwas stärkeren Bande der SP1-RNA etwa doppelt so hoch wie das der übrigen komplexen Varianten, aber immer noch deutlich niedriger als das der Wt-Genome und des korrespondierenden Wt-ähnlichen Genoms A-S1. Erstaunlicherweise war das Verhältnis der SP1-abgeleiteten zur ungespleißten DNA bei Hybridvariante A-L1k-C/Cp im Vergleich zum Wt extrem erhöht und auch wesentlich stärker als das auf RNA-Ebene beobachtete Verhältnis.

Im Agarosegel war zusätzlich eine weitere Bande auf der Höhe von ca. 550 bp zu sehen. Um ihre Herkunft zu klären, wurde die DNA der Bande aus dem Gel ausgeschnitten, aufgereinigt, kloniert und sequenziert. Sie stammte von replikativen Intermediaten, die durch Umschreibung der seltenen Spleißprodukte SP9 und SP11 entstanden waren. Bei diesen beiden gespleißten pgRNAs wird im Unterschied zur SP1-RNA ein anderer Spleißakzeptor
Abbildung 5.19: Analyse gespleißter und ungespleißter replikativer Intermediate.

HuH7-Zellen wurden mit den Wt-Genomen, den Wt-ähnlichen Genomen, den komplexen Varianten und einer Hybridvariante der Patienten A und B transfiziert. Komplexe Variantengenome wurden mit pCore kotransfiziert. Nach 4 Tagen wurden die replikativen Intermediate aus zytoplasmatischen Core-Partikeln aufgereinigt. Von ungespleißter oder gespleißter pgRNA revers transkibierte DNA-Intermediate wurden mittels PCR detektiert. A: Schematische Darstellung der ungespleißten pgRNA sowie der gespleißten pgRNAs SP1, SP9 und SP11. Die jeweils verwendeten Spleißdonoren (SD) bei nt 2453 bzw. nt 2477 (Genotyp A; Genotyp D: nt 2447 bzw. 2471) und dem Spleißakzeptoren (SA) bei nt 282 bzw. nt 489 sind angegeben. Unter den RNAs sind die Positionen der PCR-Primer (nt 2363–2386 und nt 716–738) zur Detektion der ungespleißten und gespleißten replikativen Intermediate als Pfeile gezeigt. B: Die PCR-Produkte wurden im 1%igen Agarosegel aufgetrennt und mittels Ethidiumbromid visualisiert. Als Marker dienten die 100-bp- und 1-kb-DNA-Leitern (GeneRuler, Fermentas). Als Negativkontrolle (NK) wurde DNA aus nur mit Vektor pZErO transfizierten Zellen und als Positivkontrolle für ungespleißte DNA wurde DNA des WtD-Plasmids in die PCR eingesetzt. C: Die Banden im Gel wurden quantitativ mit dem TINA-Programm ausgewertet. Im Diagramm aufgetragen wurde das Verhältnis der SP1-abgeleiteten DNA zur ungespleißten DNA. D: Außerdem ist das Verhältnis der SP9/SP11-abgeleiteten DNA zur ungespleißten DNA im Diagramm gezeigt.

bei nt 282 verwendet. Bei der SP11-RNA kommt außerdem ein anderer Spleißdonor bei nt 2477 zum Einsatz (Abb. 5.19A). Das Verhältnis der SP9/SP11-Bande zur Bande der ungespleißten DNA entsprach bei den komplexen Varianten weitgehend dem Verhältnis der Wt-Genome und Wt-ähnlichen Klone (Abb. 5.19D). Es war außerdem unabhängig von der Produktion der SP1-RNA. Die Hybridvariante A-L1k-C/Cp zeigte, wie auch bei SP1, einen deutlich verstärkten Level der SP9/SP11-abgeleiteten DNA.

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Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass sowohl die SP1-RNA als auch die SP1-abgeleiteten replikativen Intermediate der komplexen Varianten im Vergleich zum Wt und den Wt-ähnlichen Genomen stark reduziert waren. Dagegen war der Anteil der SP9- und SP11-abgeleiteten DNA-Intermediate nicht verändert und unabhängig vom SP1-DNA-Level.


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14.11.2006