6 Diskussion

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In dieser Arbeit wurde erstmals eine funktionelle Analyse der kompletten komplexen HBV-Varianten mit spezifischen Mutationen im Cp/X-Gen, C-Gen und z. T. in der präS-Region durchgeführt, deren Akkumulation und Persistenz mit schweren Leberschäden in Nierentransplantatempfängern assoziiert sind. Dazu wurden ausgewählte repräsentative Genome der Variantentypen, die vor und während der Entwicklung der LZ in 2 Patienten auftraten und akkumulierten, durch Transfektion von Hepatomazellen untersucht.

6.1  Replikationskompetenz der klonierten HBV-Genome

Wie vermutet, erwies sich im Screening nur ein Teil der aus Patientenmaterial klonierten HBV-Genome im in-vitro-Transfektionssystem als replikationskompetent. Grund für dieses Phänomen sind hauptsächlich während der PCR eingeführte Mutationen [151]. Es wurde gezeigt, dass nach der Amplifikation und Klonierung noch replizierende Genome im Schnitt nur 0,9 eingeführte Punktmutationen aufwiesen, während die Anzahl bei replikationsinkompeteten Klonen weit höher lag (>5) [151]. Dies verdeutlicht, wie wenige zufällig durch PCR und Klonierung eingeführte Punktmutationen das HBV-Genom toleriert, ohne die Replikationskompetenz zu verlieren. Der Einfluss eingeführter Mutationen auf den Phänotyp der in dieser Arbeit analysierten, replikationskompetenten Genome sollte daher gering sein.

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In den HuH7-Zellen waren 45 % der getesteten HBV-Genome des Patienten A und 23 % der HBV-Genome des Patienten B replikationsfähig. Während der Anteil bei Patient A somit im aus der Literatur bekannten Bereich lag (41 %) [151], war er bei Patient B deutlich niedriger. Aus unbekannten Gründen replizierte keines der Genome, die ausschließlich die Deletion bei nt 1763–1770 im Cp, aber keine C-Gendeletion, tragen. Dieser Variantentyp (Typ B) repräsentierte 56 % aller getesteten HBV-Genome des Patienten B.

6.2 Phänotyp der komplexen Varianten

Die repräsentativen komplexen Varianten, die während der Entwicklung der LZ akkumulierten, zeigten im Vergleich zu Wt-HBV einen drastisch veränderten Phänotyp. Trotz einiger Unterschiede im Detail war dieser zusammenfassend gekennzeichnet durch

  1. eine veränderte Transkription mit reduzierten präC- und Oberflächen-mRNAs und verstärkter Expression der pgRNA,
  2. stark reduzierte Level des häufigsten Spleißprodukts der pgRNA, SP1, und der entsprechenden replikativen Intermediate,
  3. erhöhte Replikation und Anreicherung gegenüber Wt-HBV im Zytoplasma und Zellkulturüberstand aufgrund von verstärkter reverser Transkription,
  4. eine stark reduzierte oder fehlende Expression und/oder Sekretion aller Oberflächenproteine, des Core-Proteins und des HBeAg und
  5. eine aberrante, perinukleäre Lokalisation der exprimierten Oberflächenproteine und/oder des Wt-Core-Proteins nach Kotransfektion.

↓82

Eine veränderte Transkription, erhöhte Replikation und der Defekt in HBsAg- und HBeAg-Expression fanden sich, unabhängig vom Variantentyp, auch bei vielen der übrigen, nicht detailliert charakterisierten komplexen Varianten der beiden Patienten (Abb. 5.1 und 5.3). Aus unbekannten Gründen fielen die aus der Leber des Patienten A isolierten Varianten durch eine besonders starke Replikation (nach Kotransfektion mit pCore) und eine teilweise noch intakte Expression der Oberflächen-mRNAs und des HBsAg auf. Dies korreliert mit einer hohen Variabilität der präS-Sequenzen und der Anwesenheit von nur wenigen AS-Austauschen im S-Bereich. Die nur bei den Varianten des Patienten A vorhandene Deletion im präS2-Bereich schien den Phänotyp nicht wesentlich zu beeinflussen.

Im Gegensatz zu den komplexen Varianten zeigten die beiden Wt-ähnlichen Genome A-S1 und B-S3, wie auch die übrigen nicht-komplexen Genome der Patienten (Abb. 5.1 und 5.3), neben der zum Teil stark verminderten HBeAg- und HBsAg-Sekretion kaum weitere phänotypische Veränderungen im Vergleich zu Wt-HBV. Nur Replikation und pgRNA-Expression einiger dieser Genome, inklusive A-S1, waren leicht reduziert. Die defekte HBsAg-Sekretion ließ sich exemplarisch für A-S1 auf eine Retention der Oberflächenproteine im ER zurückführen. Somit waren in den Patienten bereits zu Beginn der Beobachtungszeit im Stadium der klinisch unauffälligen chronischen Hepatitis B keine HBV-Genome mit dem eindeutigen Phänotyp des Referenz-Wt mehr vorhanden.

6.3 Einfluss der Mutationen in Cp und C-Gen

In den früheren, ersten funktionellen Analysen zum Thema der komplexen Varianten wurden zunächst die Auswirkungen ihrer charakteristischen Mutationen in Cp bzw. C-Gen im Kontext eines Wt-Genoms untersucht [157,188]. Diese und andere Studien haben gezeigt, dass die typischen Mutationen im Cp von immunsupprimierten Patienten mit LZ meist verschiedene neue HNF1-Bindungsorte unterschiedlicher Qualität schaffen [157,156]. Während der durch die Deletion bei nt 1763–1770 entstandene HNF1-Ort eine mäßige Affinität aufweist [157], ist der durch die 11-nt-Insertion bei nt 1776/1777 gebildete deutlich stärker [157,156]. In den vorangegangenen Arbeiten führten die meisten dieser Cp-Mutationen zu einer verminderten Expression von präC-mRNA und HBeAg sowie teilweise zu reduzierten Oberflächen-mRNAs, präS-Proteinen und HBsAg, während pgRNA, replikative Intermediate, Core-Protein und Polymerase verstärkt gebildet wurden [157,156,190]. Auch für die häufig auftretenden Punktmutationen bei nt 1762/1764 im Cp wurden die Schaffung eines schwachen HNF1-Ortes und eine daraus folgende reduzierte präC-mRNA- und HBeAg-Expression sowie in manchen, aber nicht allen Studien auch eine leicht erhöhte Replikation und pgRNA-Expression nachgewiesen [216,217,218,192,219].

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Hybridgenome mit verschiedenen internen C-Gendeletionen im Kontext eines Wt-Genoms zeigten in den früheren Analysen einen Defekt in HBeAg- und Core-Protein-Expression, zum Teil auch leicht erhöhte Polymerase-Werte, aber unveränderte RNA- und Oberflächenprotein-Level [188,183]. Sie waren aufgrund des defekten Core-Proteins nicht allein replikationsfähig, wiesen jedoch bei ausreichend Komplementation mit Wt-Core-Protein eine erhöhte Replikation im Vergleich zum Wt auf [188]. Nach Kotransfektion mit Wt-HBV reicherten die Hybridgenome mit C-Gendeletion an und unterdrückten bei hohen Variantenkonzentrationen die Replikation des Wt [189,188], so dass sie als „defective interfering particles“ bezeichnet wurden [189].

Um einen Zusammenhang zum Phänotyp der kompletten komplexen Varianten herstellen und klare Aussagen zum Einfluss der Mutationen in diesen beiden Bereichen treffen zu können, wurden in dieser Arbeit nicht nur die Cp- und C-Genmutationen einzeln, sondern auch erstmals in Kombination in ein Wt-ähnliches Genom eingeführt und funktionell charakterisiert.

Die Ergebnisse der Cp- und C-Gen-Hybridgenomanalysen dieser Arbeit stehen größtenteils im Einklang mit den Resultaten der früheren Studien. Wie erwartet, führten die Cp- und C-Gen-Mutationen zu unterschiedlich stark erhöhter Replikation (Abb. 5.16,für weitere Ausführungen siehe Abschnitt „Replikation“ 6.8). Im Gegensatz zu den 1762/1764-Punktmutationen des Cp (A-S15k-Cp), die nur die präC-mRNA senkten, reduzierte die Cp-Deletion, in Übereinstimmung mit Referenz [157], zusätzlich zur präC-mRNA auch die beiden Oberflächen-mRNAs (Abb. 5.17). Die Cp-Insertion bewirkte, analog zu einer sehr ähnlichen Insertion [157], neben der Reduktion der präC-mRNA nur eine schwache Verminderung der präS2/S-mRNA-, aber nicht der präS1-mRNA-Expression. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen wurde ein verstärkender Einfluss auf die pgRNA-Synthese nur bei der Cp-Insertion (A-L1k-Cp) gefunden. Dies korreliert mit dem Befund, dass die Insertion im Vergleich zu Punktmutation und Deletion den stärksten HNF1-Bindungsort kreiert [157]. In der Kontroverse um eine erhöhte pgRNA-Synthese der Genome mit Cp-Punktmutationen bei nt 1762/1764 bestätigten sich in dieser Arbeit die Studien, die keinen Einfluss auf die pgRNA gesehen hatten [216]. Das C-Gen mit Deletion hatte, wie bereits beschrieben [188], keine relevanten Auswirkungen auf die Transkription (A-L1k-C).

↓84

Die Transkription der Hybridgenome mit kombinierten Cp- und C-Genmutationen wurde im Wesentlichen durch die phänotypischen Konsequenzen der einzelnen Cp-Mutationen bestimmt. Allerdings zeigten sich davon auch Abweichungen. So wurden eine im Vergleich zu den Auswirkungen der einzelnen Cp-Mutationen verstärkte Reduktion der Oberflächen-mRNAs bei kombinierter Cp-Insertion und C-Gendeletion (A-L1k-C/Cp), eine fast fehlende Reduktion der präS2/S-mRNA der C/Cp-Varianten des Patienten B und eine stärker erhöhte pgRNA-Expression der Variante A-S18k-C/Cp beobachtet.

Im Gegensatz zur Transkription war der Phänotyp der C/Cp-Hybridgenome auf der Ebene der replikativen Intermediate nicht vollständig aus den Effekten der einzelnen Cp- und C-Genmutationen herzuleiten. Die C/Cp-Genome zeigten eine stärkere Replikation und weniger Unterdrückung des Wt (für weitere Ausführungen siehe Abschnitt „Replikation“ 6.8).

Bei den komplexen Varianten lassen sich mehrere funktionelle Eigenschaften auf die beschriebenen Konsequenzen der Mutationen in Cp und/oder C-Gen zurückführen. Jedoch hatten zusätzlich auch die Mutationen in anderen Genombereichen einen starken Einfluss auf ihren Phänotyp, so dass dieser sich deutlich vielschichtiger präsentiert, als aufgrund der Einzelanalysen zu erwarten war. Eine detaillierte Diskussion dieser Beobachtungen und der funktionellen Bedeutung der einzelnen Mutationen für die komplexen Varianten folgt in den jeweiligen Abschnitten zu den verschiedenen Ebenen des Replikationszyklus.

6.4 präC-mRNA und pgRNA

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Die Primer-Extension-Analysen der verschiedenen Hybridgenome zeigten, dass die reduzierte Transkription der präC-mRNA der komplexen Varianten, wie erwartet [219,217], auf die Mutationen im Cp mit den neu geschaffenen HNF1-Bindungsorten und parallelen Veränderungen im X-Protein zurückzuführen war (Abb. 5.17C).

Überraschenderweise war die erhöhte Expression der pgRNA der komplexen Varianten nur zum Teil eine Folge der Mutationen im Cp, wie es aufgrund der Literatur zu erwarten gewesen wäre [157,218]. Bei den komplexen Genomen des Patienten A – mit Ausnahme von A-S18k – war die pgRNA-Expression deutlich stärker als bei den Cp- oder C/Cp-Genomen (Abb. 5.17B) und scheint daher noch zusätzlich durch Mutationen außerhalb von Cp (und C-Gen) beeinflusst zu werden. Da in den Enhancern keine gemeinsamen Mutationen der entsprechenden Varianten vorliegen, ist unklar, welche dies sein könnten.

6.5 HBeAg-Expression

Allein die in den komplexen Genomen vorliegenden Cp-Mutationen hätten aufgrund der reduzierten präC-mRNA schon zu erheblich verminderter HBeAg-Synthese geführt. Der vollständige Defekt in der HBeAg-Expression aller 16 komplexen Varianten beider Patienten ist aber hauptsächlich eine Konsequenz der C-Gendeletionen, wie vorangegangene Studien an Hybridgenomen mit verschiedenen C-Gendeletionen im Wt-Kontext demonstriert haben [188,183].

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Die bereits bei den Wt-ähnlichen Genomen (A-S1, B-S1, B-S2, B-S3) beobachtete verminderte HBeAg-Expression ist nicht zu erklären, da zumindest für A-S1 und B-S3 keine reduzierte präC-mRNA und keine relevanten Mutationen in der präC-Region nachweisbar waren. Bei B-S3 liegt dort nur ein Nukleotidaustausch bei nt 1850 (A>T) vor, der auch im WtD-Referenz-Genom auftritt. Möglicherweise spielen die AS-Austausche G63V der 3 Wt-ähnlichen Genome des Patienten B sowie E77Q und S178T bei A-S1 im HBcAg/HBeAg eine Rolle. Die ersten beiden gehören zu den am häufigsten auftretenden Austauschen in der HBcAg/HBeAg-Sequenz und liegen im dominanten T-Zell-Epitop bzw. im HBc/e1-B-Zell-Epitop [124]. Der Effekt auf HBeAg-Stabilität oder -Immunerkennung wurde bisher nicht funktionell getestet. Die weiteren Austausche von A-S1 und B-S3 bei AS 93 und 171 entsprechen ebenfalls der Sequenz des WtD-Referenz-Genoms.

6.6 Core-Proteinexpression

Wie die Replikationsanalysen dieser Arbeit und die früheren Studien von Hybridvarianten mit verschiedenen C-Gendeletionen [188] gezeigt haben, fehlt den komplexen Varianten aufgrund der Deletionen von 17 AS (Patient B, AS 77–93) oder 30 AS (Patient A, AS 77–106) funktionelles Core-Protein. Die Deletionen liegen in einem Bereich des Core-Proteins, der für Di- und Multimerisierung wichtig ist und zur immundominanten Region gehört.

Dennoch waren sehr geringe Mengen des 30-AS-deletierten Core-Proteins nachweisbar, was mit früheren Ergebnissen für eine Variante mit einer ähnlichen 30-AS-Deletion (AS 88–117) übereinstimmt [188]. Auch in E.-coli-Studien war eine sehr geringe Expression des Core-Proteins mit Deletion der AS 77–106 nachgewiesen worden, die unzureichend für eine Partikelbildung war [220]. Core-Protein mit der 17-AS-Deletion von AS 77-93 wurde in E. coli allein zwar besser exprimiert, führte aber ebenfalls nicht zur Partikelbildung. Bei Koexpression mit Wt-Core-Protein war jedoch eine deutlich verstärkte Synthese dieses deletierten Core-Proteins und die Bildung von Mosaikpartikeln aus Homo- und Heterodimeren des Wt- und Varianten-Core-Proteins beobachtet worden [221,222]. Für das Core-Protein mit der 30-AS-Deletion liegen dazu keine Ergebnisse vor. Bei ausreichender Expression wäre durch die Bildung von Heterodimeren und Mosaikpartikeln ein direkter Einfluss des deletierten Core-Proteins auf Verpackung und Replikation denkbar. Ebenso könnte die Anwesenheit von Varianten-Core-Protein die für Wt-HBcAg beschriebene positive Regulation der Cp-Aktivität, die aus seiner Wirkung auf die DNA-Bindung von NFκB resultiert [223], verändern.

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In immunzytochemischen Färbungen war das Core-Protein der Varianten des Patienten A ausschließlich im Zytoplasma und im Gegensatz zum Wt-Core-Protein nicht im Zellkern nachweisbar (Abb. 5.7B). Ähnliches wurde bereits nach Transfektion von HuH7- und HepG2-Zellen mit Cp-Punktmutationen (nt 1762/1764) tragenden Varianten beobachtet [224]. Auch in Hepatozyten aus Leberbiopsien war eine vorwiegend zytoplasmatische Verteilung des Core-Proteins signifikant mit dem Auftreten dieser HBV-Varianten assoziiert [224]. Zusätzlich korrelierte die zytoplasmatische HBcAg-Lokalisation in transfizierten Zellen mit der Akkumulation von Mutationen in den B-Zell-Epitopen und dem C-Terminus des Core-Proteins [225]. Mehrere Studien legten eine Verbindung zwischen zytoplasmatischer Core-Protein-Expression und einem schweren Verlauf der Lebererkrankung bzw. zwischen nukleärem HBcAg und geringerem Leberschaden nahe [224,225,226]. Folglich wäre es also denkbar, dass das mutierte, ausschließlich zytoplasmatisch lokalisierte Core-Protein der komplexen Varianten in die Pathogenese involviert ist.

Zusätzlich verursachten sowohl die Variante A-L1k als auch Variante A-S15k, bei der aufgrund zusätzlicher frameshift- und Stoppkodon-Mutationen keine Core-Protein-Synthese möglich ist, nach Kotransfektion mit pCore oder dem WtD-Genom anstelle der gleichmäßigen nukleären und zytoplasmatischen Verteilung eine vermehrt perinukleäre Akkumulation des Wt-Core-Proteins. Als Ursache für die veränderte Lokalisation erscheint ein direkter Einfluss des Varianten-Core-Proteins unwahrscheinlich, da sie ebenso, wenn auch in geringerem Maße, bei Variante A-S15k ohne Core-Protein-Expression auftrat. Möglicherweise ist sie auf eine Interaktion des Variantengenoms mit Wt-Core-Protein oder auf eine durch die Variante verursachte Veränderung der Wirtszellphysiologie zurückzuführen. Die genaue Lokalisation des akkumulierten Core-Proteins bleibt unklar. Aufgrund fehlender Kolokalisation in den Immunfluoreszenzfärbungen kommen weder das ER noch das Golgi-Kompartiment oder eine Assoziation mit dem F-Aktin des Zytoskeletts, das in den Transport der Core-Partikel involviert sein könnte [227], in Frage. Denkbar ist eine Assoziation des akkumulierten Core-Proteins mit perinukleären Mikrotubuli. Wie das F-Aktin sind Mikrotubuli Teil des Zytoskeletts und wurden ebenfalls kürzlich mit dem zellulären Transport der Core-Partikel in Verbindung gebracht [228]. Neueste Daten zeigten die Abhängigkeit des mikrotubulären Transports der Core-Partikel von der Phosphorylierung des C-terminalen Core-Proteins und löslichen, zytosolischen Faktoren [228]. Die Varianten könnten somit durch Beeinflussung des Phosphorylierungsstatus des Wt-Core-Proteins und/oder entscheidender Wirtszellfaktoren einen veränderten zellulären Transport bewirken. Die perinukleäre Akkumulation des Core-Proteins hat, wie auch die zytoplasmatische Verteilung des Varianten-Core-Proteins, möglicherweise eine pathogenetische Wirkung auf die Zelle [229] (siehe auch Abschnitt 6.11).

6.7 Oberflächen-mRNAs und -Proteine

Besonders auffällig war der starke Defekt der Oberflächenproteinexpression und HBsAg-Sekretion der großen Mehrheit aller komplexen Varianten der beiden Patienten A und B. Ähnliches war auch in der HBsAg-Expression von komplexen Varianten weiterer Patienten mit LZ (C und D) zu beobachten (Ergebnisse nicht gezeigt). Folglich benötigen die meisten komplexen Varianten in vivo nicht nur das Core-Protein, sondern auch die Oberflächenproteine des Wt zum Überleben.

↓88

Die reduzierten Oberflächenproteine waren zum einen bei vielen Varianten auf eine bereits verminderte Expression der entsprechenden mRNAs zurückzuführen (Abb. 5.6 und 5.17D). Lediglich die Expression der präS1-mRNA der Varianten A-S15k und A-S24k (Variantentyp E) war, im Einklang mit dem nicht vorhandenem Einfluss ihrer Cp-Punktmutationen auf die Oberflächen-mRNAs, unverändert (vgl. Abschnitt 6.3). Die unterschiedlich starke Reduktion der präS1-mRNA bei den übrigen 4 Varianten sowie der präS2/S-mRNA bei allen komplexen Varianten war nur zum Teil eine Konsequenz der Insertion (Variantentyp J: A-S18k, A-L1k) und Deletion (Variantentyp D: B-S7k, B-S8k) im Cp. So wurden die präS2/S-mRNA-Level aller Varianten des Patienten A mit Ausnahme von A-L1k deutlich durch Mutationen außerhalb des Cp und C-Gens beeinflusst (bei A-S18k zusätzlich zur moderaten Hemmung durch die Cp-Insertion). Unabhängig vom Variantentyp und den Cp-Mutationen korreliert die starke Reduktion der präS2/S-mRNA, die zu einem veränderten Verhältnis der beiden Oberflächen-mRNAs zueinander führt, mit dem Vorliegen der Mutation bei nt 3084 (G>A) im S2/S-Promotor. Sie befindet sich in einer Bindungsstelle für Transkriptionsfaktor Sp1 [230]. Diese und weitere, benachbarte Punktmutationen im S2/S-Promotor, von denen bisher keine funktionelle Analyse aus der Literatur bekannt ist, waren sehr häufig in den komplexen Varianten des Patienten A zu finden (siehe Anhang, Tab. A.1). Bei den komplexen Varianten des Patienten B waren die präS1- und präS2/S-mRNA-Expression gleichermaßen reduziert. Erstaunlicherweise war die Reduktion sowohl bei den komplexen Varianten als auch bei der Cp-Hybridvariante A-Cp-Del stärker als bei den entsprechenden C/Cp-Varianten (Abb. 5.17). Hier bleibt vorerst unklar, ob Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen, z. B. im EnhI (nt 1227 T>C), die Expression beeinflusst haben. In den S1- und S2/S-Promotoren direkt liegen meist keine Mutationen vor. Möglicherweise kamen die Auswirkungen der Cp-Deletion auch nur in den C/Cp-Hybridgenomen nicht zum Tragen, waren aber in den komplexen Varianten der Hauptgrund für die Reduktionen.

Zusätzlich zur mRNA-Expression hatten zum anderen weitere Mutationen in den Oberflächengenen drastischen Einfluss auf die Oberflächenproteinexpression. Diverse Stoppkodonmutationen im präS- oder S-Bereich verhinderten offensichtlich die entsprechende Proteinsynthese (W74* im S-Bereich bei B-S7k, B-S8k oder W77* im präS1-Bereich bei A-S15k, A-S18k, A-S24k) oder die HBsAg-Sekretion (L216* im S-Bereich bei A-S18k, A-S24k). Bei einigen HBV-Genomen des Patienten A verhinderte auch eine präS2-Startkodonmutation die Expression des MHBs (A-S1, A-L6k, A-L8k). Insgesamt war der Defekt der Oberflächenproteinexpression der komplexen Varianten also wesentlich stärker, als die Deletionen und Insertionen in Cp, C-Gen und teilweise präS-Bereich allein bewirkt hätten. Die bei vielen Varianten zusätzlich vorhandenen AS-Austausche (siehe Anhang, Tab. A.1 und A.2) liegen außerhalb der sonst häufig mutierten immundominanten a-Determinante der S-Region (AS 120–147) und wurden bisher nicht funktionell analysiert.

Die Oberflächenproteine der Variante A-L1k und des Wt-ähnlichen Genoms A-S1 zeigten eine aberrante, perinukleäre Lokalisation, die sehr an das Bild im ER zurückgehaltener Proteine erinnert [231,160,232]. Bei A-S1 ging die Akkumulation im ER mit einer deutlichen, bei A-L1k mit einer schwachen Hemmung der HBsAg-Sekretion einher. Beide Genome tragen keine der Deletionen in der präS1-Region oder der Punktmutationen in der S-Domäne, die bekanntermaßen mit einer Retention der Oberflächenproteine im ER assoziiert sind [233,169,231,160,232].

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Im Fall der komplexen Variante A-L1k könnte die 2-AS-Deletion im präS2-Bereich (AS 140–141) für die veränderte Lokalisation verantwortlich sein. Für Varianten mit größeren Deletionen in der zentralen präS-Region (AS 127–141 und 131–141) wurde bereits eine ähnliche Akkumulation der Oberflächenproteine beschrieben [234]. Auch hier wurde nur ein geringer reduzierender Effekt auf die HBsAg-Sekretion beobachtet. Als Ursache wurde anstatt der verminderten Sekretion z. B. über eine veränderte Transportroute des mutierten MHBs spekuliert. Da die perinukleäre Akkumulation der Oberflächenproteine bei A-L1k auch nach Kotransfektion der Variante mit pCore zu beobachten war, hat sie offensichtlich nichts mit dem Fehlen von funktionellem Core-Protein oder intrazellulärer Replikation zu tun.

Der Grund für die Retention bei A-S1 ist völlig unklar. Die aufgrund der Startkodonmutation fehlende MHBs-Expression sollte dafür nicht verantwortlich sein, da in einer früheren Studie bei Abwesenheit von MHBs in HuH7-Zellen keine Veränderungen in Morphologie, Proteinsekretion, Replikation und Infektiosität der Virusvarianten festgestellt wurden [78].

Der Nachweis von teilweise stark reduzierten HBsAg-Mengen im Zellkulturüberstand für die Wt-ähnlichen Genome des Patienten B (B-S1, B-S3, Abb. 5.3) bei einer gleichzeitig normalen intrazellulären Expression aller Oberflächenproteine (inklusive MHBs, nicht gezeigt) deutet auf eine ähnliche Retention der Oberflächenproteine wie bei A-S1 hin. Auch bei weiteren Varianten des Patienten A mit reduzierten HBsAg-Werten im Zellkulturüberstand und präS2-Deletionen ohne zusätzliche Stoppkodonmutationen (A-S4, A-S7, A-L3k) ist denkbar, dass sie eine aberrante Lokalisation der Oberflächenproteine zeigen. Die möglichen Konsequenzen für die Pathogenese werden in Abschnitt 6.11 diskutiert.

6.8 Replikation

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Die Replikationsanalysen der komplexen Varianten wurden nach Kotransfektion mit Core-Expressionsplasmid pCore oder mit dem WtD-Referenz-Genom durchgeführt. Wie bereits früher für Hybridgenome mit C-Gendeletion gezeigt [188], war das Core-Protein des Genotyps D zur Komplementation des defekten Cores der Varianten in der Lage und ermöglichte somit die Replikation der Variantengenome. Auch lieferte das WtD-Genom ausreichend Core-Protein zur gleichzeitigen Replikation von Wt und Varianten. Daher stellt die Kotransfektion von WtD und Varianten ein gutes Modell für die Koreplikation beider Genome in einer Zelle dar. Darüber hinaus gestattet sie eine leichte Unterscheidung von Wt- und Varianten-Nachkommen-DNA anhand eines Genotyp-spezifischen Nukleotidaustausches. Wie nach Kotransfektion des WtD-Genoms mit komplexen Varianten, wurde eine Anreicherung der komplexen Variante auch nach Kotransfektion des WtA-Genoms mit Variante B-S6k beobachtet, die an der analysierten Position das Genotyp-D-typische Nukleotid trägt. Verstärkte Replikation und Anreicherung der Varianten sollten daher nicht spezifisch für die Komplementation durch ein WtD-Genom sein. Die Akkumulation der komplexen Varianten in vivo spricht auch für die Übertragbarkeit der in-vitro-Ergebnisse auf das Geschehen im Patienten.

Die Differenzierung von Wt- und Varianten-DNA ist ein essentieller Teil und Voraussetzung für die eingehende Analyse von Replikation und Wt-Varianten-Interaktion während der Koreplikation. In früheren Studien wurde diese Aufgabe durch 3-malige Hybridisierung der selben Southern-Blot-Membran mit verschiedenen spezifischen Sonden [189] oder durch ein Assay gelöst, das einen Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus zwischen Wt und Varianten nutzt [188]. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und verwendete SNP-Analyse mittels Pyrosequenzierung hat gegenüber diesen anderen Methoden entscheidende Vorteile. Sie liefert sehr präzise Ergebnisse mit nur sehr geringen Standardabweichungen und erlaubt die Analyse vieler Proben in nur kurzer Zeit. Außerdem war zusätzlich die Untersuchung der Anteile von Wt und Variante an der verpackten pgRNA möglich.

Alle komplexen Varianten zeigten eine gegenüber Wt-HBV verstärkte Replikation und Anreicherung der replikativen Intermediate. Es bestanden jedoch auch deutliche Unterschiede, z. B. im Ausmaß der verstärkten Replikation und Anreicherung sowie in der Unterdrückung der Wt-Replikation. Auch auf der Ebene der Replikation ist der Phänotyp der Varianten daher vielschichtiger, als die bisherigen Studien mit einzelnen mutierten Cp- oder C-Gen-Abschnitten im Wt-Kontext hätten vermuten lassen.

6.8.1  Rolle von Mutationen in Cp, C-Gen und im restlichen Genom

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Wie erwartet, waren die Mutationen in Cp- und C-Gen allein ausreichend für eine verstärkte Replikation und Anreicherung der jeweiligen HBV-Hybridvarianten. Das in dieser Arbeit beobachtete Replikationsverhalten der Cp- und C-Gen-Hybridgenome steht somit im Einklang mit den Ergebnissen vorangegangener Studien [157,156,192,216,188,189]. Entsprechend der Bindungskraft der neu geschaffenen HNF1-Bindungsorte [156,157,235], war die Replikation der Cp-Variante mit Insertion am stärksten (A-L1k-Cp) und die der Cp-Variante mit den Punktmutationen bei nt 1762/1764 (A-S15k-Cp) im Vergleich zum Wt nur schwach erhöht. Auch das Ausmaß der erhöhten Replikation der C-Gen-Hybridvariante mit 30-AS-Deletion des Patienten A entsprach dem eines Hybridgenoms mit einer ähnlichen 30-AS-Deletion der Positionen 88–117 (2,5fach) [188].

Die Kombination der Mutationen auf einem Genom (C/Cp) führte ebenfalls zu erhöhter Replikation und Anreicherung. Deren Größenordung korrelierte bei den C/Cp-Genomen mit der Art der Cp-Mutation bzw. der Replikationsstärke der entsprechenden Cp-Variante. Dennoch erreichte bei Variante A-L1k die Summe der Replikationsvorteile durch Cp-Mutation und C-Gendeletion allein nicht das Ausmaß der C/Cp-Variante mit den Mutationen in beiden Regionen. Auch war die maximale Replikation der C/Cp-Varianten (und der komplexen Varianten) bzw. des gesamten Gemisches mit Wt je nach Variante bei unterschiedlichen Kotransfektionsverhältnissen zu finden. Im Gegensatz dazu fand die optimale Replikation und Anreicherung von verschiedenen C-Gendeletions-Hybridvarianten immer bei einem transfizierten Variante-Wt-Verhältnis von 20:80 statt (Referenz [188] und Abb. 5.16). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass noch andere Faktoren als die bisher für Cp- und C-Gendeletions-Varianten diskutierten am Replikationsvorteil der Varianten mit mehrfachen Mutationen beteiligt sein könnten.

Die komplexen Varianten, insbesondere des Patienten A, zeigten im Ausmaß des Replikationsvorteils, dem Verhältnis mit maximaler Replikation und der Interaktion mit dem Wt ein weiter verändertes Replikationsmuster im Vergleich zu den entsprechenden C/Cp-Varianten. Daher spielten auch Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen eine entscheidende Rolle für die Replikation. Meist hatten sie positive (A-S15k, A-S24k, A-L1k), und nur bei A-S18k auch negative Auswirkungen. Insgesamt demonstrieren die Analysen, dass die Ergebnisse der Hybridvarianten nur eingeschränkt auf die natürlichen Varianten mit komplexen Mutationsmustern übertragbar sind.

↓92

Besonders deutlich war der Effekt der Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen bei Variante A-L1k. Sie wies eine extrem starke Replikation jenseits aller anderen komplexen oder Hybridvarianten auf, während die Replikationskapazität der C/Cp-Variante A-L1k-C/Cp der von A-S18k-C/Cp mit identischer Cp-Mutation und C-Gendeletion entsprach. Die im Vergleich zum WtD über 13fach erhöhte Replikationseffizienz und Anreicherung von A-L1k betrug etwa das doppelte bzw. 3fache der entsprechenden C/Cp-Variante und das ca. 5fache der C-Gen-Hybridvariante. Während die Anreicherung bei den anderen komplexen Varianten und den früher analysierten C-Gen-Hybridvarianten weitgehend unabhängig vom transfizierten Variantenanteil war [188], führte die außergewöhnliche Replikationseffizienz von A-L1k sowohl in HuH7- als auch in HepG2-Zellen zu einem Abfall der Anreicherung bei einem transfizierten Variantenanteil von 50 % oder mehr. Offensichtlich war nur bei einem hohen Wt-Anteil die Wt-Proteinexpression ausreichend, um den großen Bedarf der Variante A-L1k zu decken. Der Grund für dieses Phänomen ist unklar, sollte jedoch auf Mutationen auf dem A-L1k-Genom zurückzuführen sein, die weder in der C/Cp-Variante noch in anderen komplexen Varianten vorhanden sind. Dazu gehören eine Punktmutation in der RNaseH-Domäne der Polymerase (R741W) und 3 Nukleotidaustausche (957 T>G, 1425 T>C, 2636 A>G), die nicht in AS-Austauschen resultieren und außerhalb aller bisher bekannten regulatorischen Sequenzen liegen. Des Weiteren trägt A-L1k, im Gegensatz zu allen anderen analysierten Patienten-HBV-Genomen, ein Cystein anstatt eines Tyrosins an AS-Position 6 des X-Proteins in dessen negativ regulierender Domäne [236]. Bislang wurde jedoch keine dieser Variationen mit einer erhöhten Replikation in Verbindung gebracht.

Im Fall der Variante A-S24k waren die Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen u. a. in der Lage, das Überwachsen der C/Cp-Variante durch den Wt zu kompensieren. Dabei könnte z. B. der Nukleotidaustausch bei nt 1034 (A>G) im modulatorischen Element des EnhI die Replikation der komplexen Variante gefördert haben (zur Struktur des EnhI siehe Referenz [5]). Der Replikationsnachteil der C/Cp-Variante hängt möglicherweise mit den im Vergleich zu A-S15k zusätzlich vorhandenen Cp-Mutationen bei nt 1753 und 1767 und/oder einzelnen AS-Austauschen im Core-Protein bei AS 46 und 59 zusammen.

Allein bei der komplexen Variante A-S18k hatten Mutationen außerhalb von Cp und C-Gen offensichtlich einen replikationshemmenden Effekt. Hier kommen Nukleotidaustausche an Position 1135 in der Core-Domäne des EnhI und an Position 1374 im PRE oder AS-Austausche in der Reversen Transkriptase (L430R) und im terminalen Protein (T120I) des Polymerase-Proteins in Frage, die jedoch bisher nicht getestet wurden. Außerdem fehlte der komplexen Variante aufgrund einer Startkodonmutation komplett die Expression des X-Proteins. Die potentiellen Auswirkungen dieses Defekts auf die Replikation werden auch im Zusammenhang mit dem Phänotyp in HepG2-Zellen in Abschnitt 6.8.3 diskutiert.

↓93

Die Varianten des Patienten B zeigten kaum Unterschiede im Replikationsverhalten zwischen den komplexen und C/Cp-Genomen, so dass die wenigen außerhalb von Cp und C-Gen liegenden Mutationen hier offensichtlich kaum eine Rolle spielten (vgl. auch Abschnitt 6.12).

Variante A-S15k ist ein Beispiel einer natürlich aufgetretenen out-of-frame C-Gendeletionsvariante, die das deletierte Core-Protein aufgrund der frameshift- und Stoppkodon-Mutation nicht exprimiert. Die Tatsache, dass sie trotzdem eine klar erhöhte Replikation, Anreicherung und Unterdrückung der WtD-Replikation zeigte, bestätigt frühere Ergebnisse mit einer künstlich generierten out-of-frame Hybrid-Deletionsvariante [237]. Das Core-Protein mit Deletion sollte daher nicht für Replikationsvorteil und Wt-Unterdrückung entscheidend sein.

6.8.2 Interaktion mit Wt-HBV

Wie bereits erwähnt, wiesen frühere funktionelle Kotransfektionsstudien von Wt und Hybridgenomen mit C-Gendeletionen und Punktmutationen im Cp bei nt 1762/1764 parallel zur Anreicherung der Variante grundsätzlich eine starke Unterdrückung der Wt-Replikation nach. Daraus schlossen die Autoren, dass sich Varianten mit internen C-Gendeletionen wie defekte interferierende Partikel verhalten [189]. Detailliertere Kotransfektionsanalysen von Hybridgenomen mit erhöhter Replikation und Anreicherung, die ausschließlich verschiedene andere C-Gendeletionen trugen, zeigten dagegen die Unterdrückung des Wt-Genoms nur bei hohem Anteil an transfizierter Varianten-DNA [188]. Dasselbe war in der vorliegenden Arbeit bei der C-Gen-Hybridvariante A-L1k-C zu beobachten, allerdings mit einer ausgeprägteren Wt-Hemmung bei gleicher Replikationsstärke.

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Interessanterweise unterdrückten jedoch nur 2 von 6 der komplexen Varianten (A-S15k und A-L1k) mit besonders starker Replikation den Wt bei hohem transfizierten Variantenanteil (in HepG2-Zellen sogar nur A-L1k). Bei den übrigen komplexen Varianten zeigten sich entweder keine Auswirkungen auf die Wt-Replikation (A-S18k) oder sogar deren Förderung (A-S24k, B-S7k, B-S8k). Daher können die Ergebnisse der C-Gen-Hybridvarianten und das Konzept der defekten interferierenden Partikel nicht ohne weiteres auf die komplexen Varianten mit zusätzlichen Deletionen/Insertionen im Cp, teilweise Deletionen im präS-Bereich und weiteren Punktmutationen im gesamten Genom übertragen werden. Außerdem legt die auch in der Koreplikation mit den verschiedenen Variantenpools fehlende Unterdrückung des Wt nahe, dass diese eher die Ausnahme als die Regel ist und im Kontext der gesamten Population nicht zum Tragen kommt.

Auch die Kotransfektion mit C/Cp-Genomen führte mit Ausnahme der Hybridvariante A-S15k-C/Cp nicht zur Hemmung des Wt. Folglich sind Anreicherung und Hemmung des Wt sowohl bei komplexen als auch bei C/Cp-Varianten keine gekoppelten Prozesse. Vielmehr scheint die zusätzliche Anwesenheit der Cp-Mutationen zu den C-Gendeletionen eine Senkung oder sogar Aufhebung der Kompetition zwischen Varianten- und Wt-Replikation sowie teilweise eine Förderung der Wt-Replikation bei hohen Variantenkonzentrationen zu bewirken.

Im Falle der Hybridvarianten mit C-Gendeletion wurde das Wt-Core-Protein als der limitierende Faktor der verstärkten Replikation vermutet [188]. Unterstrichen wurde die Verknüpfung von Wt-Core-Proteinmenge und Replikationsstärke der Hybridvariante durch die gute Korrelation zwischen dem Ausmaß ihrer Anreicherung gegenüber Wt-HBV und der Replikationsstärke nach Komplementation der Hybridvariante mit dem Core-Expressionsplasmid pCore. Diese Korrelation war weder für die komplexen Varianten (Abb. 5.10) noch für die C/Cp-Varianten (Ergebnisse nicht gezeigt) zu finden. Demzufolge ist hier das Wt-Core-Protein nicht der einzige limitierende und regulierende Faktor. Denkbar ist, dass weitere Wt-Proteine, wie das X-Protein oder die Oberflächenproteine mit transaktivierender Aktivität, während der Koreplikation einen Einfluss auf die Replikation und Anreicherung der Varianten haben.

↓95

Eine mögliche Ursache für die weniger kompetitive Replikation der komplexen und C/Cp-Varianten mit Wt könnte in der veränderten Bindung von Transkriptionsfaktoren durch den mutierten Cp liegen. Die Aktivität des Cp wird auf komplizierte Weise durch verschiedenste Transkriptionsfaktoren reguliert, die mehrere Bindestellen im EnhII/Cp haben [5] (z. B. COUP-TF, HNF4, PPAR-RXR, Sp1, vgl Abschnitt 1.1.3 und Abb. 1.5). Mutationen in diesem Bereich verändern dramatisch die Reaktion des Virus auf bestimmte Transkriptionsfaktoren. Alle Cp-Mutationen der in dieser Arbeit getesteten Varianten schaffen nicht nur neue HNF1-Bindungsorte, sondern verhindern wahrscheinlich gleichzeitig die Bindung anderer Transkriptionsfaktoren. Die Deletion der nt 1763–1770 sollte die Bindestellen diverser Kernfaktoren wie PPAR-RXR, COUP-TF und HNF4 zerstören, während die Punktmutationen bei nt 1762/1764 erwiesenermaßen die Bindung von PPARalpha-RXR, aber nicht die von HNF4 verhindern [235]. Außerdem ist anzunehmen, dass die 11-nt-Insertion bei nt 1776/1777 durch bevorzugte Bindung von HNF1 an den starken, neuen HNF1-Bindungsort die Bindung anderer Faktoren in der Nähe sterisch blockiert. Die im Detail variierenden Auswirkungen der einzelnen Mutationen auf die Bindungseigenschaften des Cp könnten das unterschiedliche Ausmaß der Verminderung der Wt-Hemmung bei den verschiedenen C/Cp-Varianten im Vergleich zur C-Gen-Hybridvariante erklären. So war die Hemmung bei A-S15k-C/Cp mit den Punktmutationen 1762/1764 noch am stärksten, während sie bei den C/Cp-Varianten von A-S24k, B-S7k und B-S8k gar nicht mehr vorhanden war.

Das Phänomen einer erhöhten Wt-Replikation parallel zur verstärkten Variantenreplikation bei hohem transfizierten Anteil verschiedener komplexer und C/Cp-Varianten (z. B. B-S7 und B-S8) ließe sich nachvollziehen, wenn man annimmt, dass generell auch die limitierte Verfügbarkeit bestimmter Transkriptionsfaktoren die HBV-Replikation einschränkt. In diesem Fall ließe die Bindung anderer zellulärer Faktoren durch den Varianten-Cp auch eine vermehrte Stimulation des Wt-Cp, z. B. durch PPARalpha-RXR, zu. Dies zöge eine erhöhte Expression der Wt-pgRNA, und damit auch eine erhöhte Wt-Core-Expression und Replikation nach sich. Und die vermehrte Wt-Core-Proteinexpression würde wiederum eine stärkere Variantenreplikation erlauben.

Am deutlichsten war die Förderung der Wt-Replikation bei Variante A-S24k-C/Cp, die trotz erhöhter Variantenreplikation in einer Anreicherung des Wt resultierte. Dies könnte eine Folge der beiden Nukleotidaustausche bei nt 1753 und 1767 zusätzlich zu den 1762/1764-Mutationen im Cp sein, die die Bindung der Transkriptionsfaktoren möglicherweise stärker verändern als die 1762/1764-Mutationen allein. Der Wt-Cp könnte somit besonders stark durch solche Faktoren aktiviert worden sein, die nicht mehr von der Variante gebunden wurden. Allerdings war der drastische Effekt, wie bereits erwähnt, in der komplexen Variante A-S24k nicht mehr zu beobachten. Letztendlich bleiben die Hypothesen zu den Auswirkungen der Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren im Cp auf die Koreplikation von Wt- und Varianten noch zu überprüfen.

↓96

In den Patienten könnten die Varianten durch die nicht vorhandene Hemmung der Wt-Replikation und teilweise gleichzeitig verstärkte Wt- und Variantenreplikation ein Gleichgewicht mit dem Wt erreichen, das die notwendige Komplementation durch Wt-Proteine auch bei starker Variantenreplikation und hohen Variantenanteilen in der HBV-Population ermöglicht. Die in-vitro-Daten der dadurch auch bei hohem Variantenanteil noch starken Gesamtreplikation stehen im Einklang mit der Tatsache, dass die Viruslast in den Patienten während der Akkumulation der komplexen Varianten nur leicht abnahm [134]. Außerdem ersetzten die komplexen Varianten den Wt in den Patienten niemals komplett, obwohl ihre Anreicherung in vitro meist unabhängig vom transfizierten Variantenanteil war. Die Kombination von Cp-Mutationen und C-Gendeletionen ist möglicherweise eine Voraussetzung für die Persistenz der komplexen Varianten, ohne den Wt zu eliminieren. Diese Vermutung stimmt mit der Beobachtung überein, dass die komplexen Varianten mit C-Gendeletion immer erst auftraten, wenn bereits Genome mit ausschließlich Cp-Mutationen vorhanden waren [134]. Bestätigen lassen sich diese Hypothesen jedoch nur durch Experimente im in-vivo-System.

6.8.3 Unterschiede der Replikation in HuH7- und HepG2-Zellen

Das Phänomen der verstärkten Replikation und Anreicherung der komplexen Varianten wurde in 2 verschiedenen Hepatomazelllinien, HuH7 und HepG2, beobachtet. Es ist somit unabhängig von Wirtszellfaktoren, die nur für eine der beiden Zelllinien spezifisch sind. Auffällig war jedoch, dass bei der Koreplikation die Level der replikativen Intermediate von Wt und Varianten im Vergleich zum Wt alleine in HepG2-Zellen meist höher waren als in HuH7-Zellen (einzige Ausnahme: A-S18k mit extrem schwacher Replikation in den HepG2-Zellen). Dabei erfolgte überwiegend eine stärkere Anreicherung der Varianten ohne Unterdrückung des Wt. Eine analoge erhöhte Anreicherung in HepG2- im Vergleich zu HuH7-Zellen war bereits bei Hybridvarianten mit C-Gendeletionen nachgewiesen worden [189].

Für Abweichungen in den beiden Zelllinien könnten u. a. Unterschiede in den Konzentrationen bestimmter Wirtzellfaktoren eine Rolle spielen, die z. B. vom Differenzierungsgrad der Zellen abhängen [238]. Der Einfluss dieser Unterschiede auf die Regulierung der Cp-Aktivität wurde bereits nachgewiesen [47]. Nach einer Hypothese von Suk et al. ist die von einem Hepatoblastom abstammende Zelllinie HepG2 noch stärker differenziert als die von einem hepatozellulären Karzinom abgeleitete HuH7-Zelllinie und weist daher höhere Konzentrationen an bestimmten, für die HBV-Replikation wichtigen Wirtszellfaktoren auf [239]. Je nach Variante könnte dies zum Replikationsvor- oder -nachteil gegenüber dem Wt werden.

↓97

Zum Beispiel scheint der Transkriptionsfaktor PPARalpha in größeren Mengen in HepG2-Zellen vorzuliegen [240]. In Kombination mit dem Faktor RXR fördert er bevorzugt die pgRNA-Synthese und somit Replikation des Wt im Vergleich zur 1762/1764-Cp-Variante [235], die kein PPARalpha-RXR binden kann [235,240]. Dagegen unterstützt der Transkriptionsfaktor HNF4 bevorzugt die Replikation dieser Variante [235]. Somit ist denkbar, dass die ebenfalls in HepG2-Zellen nachgewiesenen höheren Level an HNF4 und auch HNF1 (M. Quasdorff, U. Protzer, Universität Köln, persönliche Mitteilung) zur stärkeren Replikation und Anreicherung der komplexen Varianten beigetragen haben. Auf diese Weise und durch eine potentiell höhere Konzentration an Transkriptionsfaktoren, die sowohl für die Wt- als auch für die Variantenreplikation wichtig sind, ließen sich die verminderte Kompetition, die generell höhere Replikation und die erhöhte Anreicherung der Varianten erklären, die bei den meisten Wt/Variante-Kombinationen in HepG2-Zellen beobachtet wurden (vgl. auch Abschnitt 6.8.2). Auch für die Situation in vivo kann spekuliert werden, dass eine sich verändernde Zusammensetzung an zellulären Faktoren in der Leber der Nierentransplantierten die Selektion und Akkumulation der komplexen Varianten unterstützt.

Die in HepG2-Zellen erhöhte Replikation beider Genome und die verminderte Kompetition im Vergleich zu HuH7-Zellen war besonders deutlich nach Kotransfektion von WtD und der Variante A-S15k, die aufgrund der 1762/1764-Mutationen im Cp weder PPARalpha-RXR noch COUP-TF1 binden kann [235,240]. Dagegen zeigten sich bei der sehr hoch replizierenden Variante A-L1k mit starker Wt-Hemmung nur geringe Unterschiede zwischen den Zelllinien. Offensichtlich liegt diese extreme Varianten-Replikation auch in HepG2-Zellen weit über der Schwelle für eine gleichberechtigte Koreplikation mit dem Wt, so dass möglicherweise eine weitere Steigerung nicht erfolgen konnte.

Neben dem Effekt durch zelluläre Faktoren kann auch die Expression des X-Proteins Einfluss auf die Replikationsunterschiede in HepG2 und HuH7-Zellen gehabt haben. Es wurde mehrfach gezeigt, dass das HBx die HBV-Replikation in HepG2-Zellen [98,96,97], aber nicht in HuH7-Zellen [241,97] stimuliert. Für diesen Effekt ist eine funktionierende transkriptionelle Transaktivierung, u. a. durch die C-terminale Region des HBx, notwendig [242]. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der in HepG2-Zellen deutlich verstärkten Replikation und Anreicherung der Varianten A-S15k und A-S24k, die ein komplettes, funktionelles HBx exprimieren, und der kaum stärkeren Replikation der Variante A-L1k, die aufgrund der 11-nt-Insertion bei nt 1776/1777 ein C-terminal trunkiertes X-Protein mit einer zerstörten Transaktivierungsdomäne produziert. Außerdem legen sie nahe, dass die extrem niedrige Replikation der Variante A-S18k in HepG2-Zellen auf das vollständige Fehlen der HBx-Expression aufgrund einer X-Startkodonmutation zurückzuführen ist. Die Schlussfolgerungen setzen allerdings voraus, dass während der Koreplikation keine nennenswerte Komplementation durch das HBx des Wt erfolgt. Möglicherweise reichte die Menge des Wt-HBx dafür nicht aus, oder es ist nicht zur Stimulation des Variantengenoms in der Lage.

6.8.4 Replikation von Variantenpools

↓98

Im Patienten sind phänotypische Ausprägungen einzelner Varianten nur dann entscheidend, wenn sie sich auch im Kontext der gesamten HBV-Population zeigen. Daher wurden Mischungen von Varianten zusammen mit WtD transfiziert, die in ihrer Zusammensetzung der zu einem bestimmten Zeitpunkt im Patienten vorhandenen Viruspopulation entsprechen und so die Quasispezies simulieren sollten. Trotz des teilweise sehr heterogenen Replikationsmusters der einzelnen Varianten eines Zeitpunktes war bei allen Variantenpools eine erhöhte Replikation und Anreicherung gegenüber Wt-HBV ohne Unterdrückung der Wt-Replikation zu beobachten. Die replikativen Eigenschaften der komplexen Varianten und der gesamten Variantenpools stehen daher im Einklang mit der in vivo beobachteten Akkumulation der komplexen Varianten.

Interessanterweise kam es, im Gegensatz zu den Einzelanalysen der Varianten, zu einer verstärkten Anreicherung der Variantenpools bei einem höheren Variantenanteil im transfizierten DNA-Gemisch. Dies deutet darauf hin, dass im Patienten auch im späten Stadium der Erkrankung bei sinkendem Wt-Anteil noch eine Anreicherung dieser Quasispezies möglich war. Diese Beobachtung unterstützt umso mehr die bereits für die Einzelvarianten aufgestellte Hypothese, dass es den komplexen Varianten gelingt, durch Aufrechterhaltung der Wt-Replikation und -Komplementation den eigenen Anteil ohne Nachteil für die Variantenreplikation möglichst weit zu steigern (Abschnitt 6.8.2). Der Grund für die besonders hohe Replikation und Anreicherung der aus der zirrhotischen Leber des Patienten A isolierten Variantenpopulation (und der Einzelvarianten) verbleibt unklar.

Über funktionelle Analysen von gesamten HBV-Populationen liegen bisher nur wenige publizierte Daten vor [197,199,243]. Für die vermutlich einzige größere Untersuchung mit einer umfassenden funktionellen Charakterisierung wurden Gesamtgenom-PCR-Amplifikate der HBV-DNA aus Patientenseren ohne vorherige Klonierung direkt sequenziert und transfiziert [197]. Zwar ermöglichte diese Studie Aussagen über die phänotypischen Eigenschaften der HBV-Populationen, die Sequenzierung lieferte jedoch keine genauen Daten zur Anordnung von Mutationen auf einzelnen Genomen. Auch sollten unterrepräsentierte Varianten von dieser Art der Sequenzierung nicht erfasst werden. Ebenso waren ohne Klonierung parallel keine Einzelanalysen des Phänotyps bestimmter Varianten der Population mit definiertem Mutationsmuster möglich. Zur umfangreichen phänotypischen Charakterisierung von zu einem bestimmten Zeitpunkt vorliegenden Quasispezies erscheint daher der in dieser Arbeit gewählte Ansatz die klarsten Aussagen zu erlauben.

6.8.5 Mechanismus der verstärkten Replikation und Anreicherung

↓99

Obwohl die komplexen Varianten gesteigerte Level an pgRNA im Zytoplasma aufwiesen, war nach Kotransfektion mit WtD der Anteil des Varianten-Prägenoms in Core-Partikeln gegenüber dem transfizierten Anteil nicht klar erhöht. Die Anreicherung der replikativen Intermediate der Varianten resultiert also nicht aus einer bereits angereicherten verpackten pgRNA, sondern offensichtlich aus deren verstärkter reverser Transkription. Zum einen steht dies im Gegensatz zu einer einzelnen Studie, die über eine erhöhte Verpackung von pgRNA mit den 1762/1764-Punktmutationen im Cp berichtete [216]. Zum anderen stehen die Daten aber im Einklang mit einer der Hypothesen, die für eine erhöhte Replikation von Varianten mit C-Gendeletion geäußert wurde und von einer verstärkten reversen Transkription der Varianten-RNA ausgeht [188].

Da die erhöhte zytoplasmatische Expression der Varianten-pgRNA sich nicht in einem erhöhten Anteil in den Core-Partikeln niederschlug, wird die Varianten-pgRNA möglicherweise sogar schlechter verpackt als das Wt-Prägenom. Aufgrund der verstärkten reversen Transkription wird dies jedoch nicht zum Replikationsnachteil. Um jedoch mit Sicherheit eine schlechtere Verpackung festzustellen, wären ausführlichere Untersuchungen zum Anteil der Varianten-pgRNA im Kern, im Zytoplasma und in den Core-Partikeln notwendig. Möglicherweise ist der höchstens 2fache Anstieg der pgRNA-Expression im Vergleich zu den Referenz-Wt-Genomen auch nur zu gering, um sich in der verpackten RNA deutlich zu zeigen.

Als Ursache für die gesteigerte reverse Transkription der Varianten kommt die schnellere Umschreibung des durch Deletionen verkürzten Varianten-Prägenoms allein nicht in Frage, da erhebliche Unterschiede in der Replikationsstärke von Genomen mit identischen Deletionen vorlagen. Zusätzlich könnte eine erhöhte Expression der Varianten-Polymerase dazu beitragen. Diese ist bei den komplexen Varianten zum einen aufgrund der insgesamt erhöhten pgRNA-Level und zum anderen aufgrund der C-Gendeletionen zu erwarten, die 2 stromaufwärts des Polymerase-ATGs gelegene ATGs (J-ATG und C2-ATG) eliminieren, welche die Polymerase-Translation aufgrund des Ribosomen-Scanning-Mechanismus hemmen [244]. Bei Hybridgenomen mit den entsprechenden Cp-Mutationen sind bereits erhöhte Polymerase-Level nachgewiesen worden [157]. Da die Polymerase vorwiegend in cis agiert, würden sich jegliche Veränderungen der Varianten-Polymerase spezifisch auf die Replikation der Varianten auswirken. Zwar wurde eine theoretisch bei erhöhter Polymerase-Expression mögliche vermehrte Verpackung der pgRNA komplexer Varianten nicht nachgewiesen, jedoch liegen in der Literatur Hinweise auf eine über die direkte reverse Transkription hinausgehende Funktion einer zytoplasmatischen, nicht verpackten Form der Polymerase vor [245], die eine Rolle für die erhöhte Varianten-Replikation und/oder Pathogenese spielen könnte.

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Unabhängig von verstärkter Expression ist auch denkbar, dass die mutierte pgRNA durch eine veränderte Konformation während der Replikation effektivere Primertranslokationen oder Matrizenwechsel der Polymerase ermöglicht (vgl. Abschnitt 1.1.2 und Abb. 1.4). Oder die in allen Domänen des Polymerase-Proteins vorhandenen AS-Austausche der Varianten, wie z. B. F8L im terminalen Protein, I401F/V in der Reversen Transkriptase oder S800Y in der RNaseH, könnten zu dessen erhöhter Affinität oder Aktivität führen. Leider wurde keiner dieser Austausche bisher funktionell untersucht. Möglicherweise werden aber auch mit dem Prägenom und der Polymerase der Varianten für die Replikation wichtige Kofaktoren, wie z. B. Kinasen, Hsp90 oder Hsp60, in veränderter Weise verpackt, so dass diese für eine schnellere reverse Transkription sorgen.

6.9 Virus im Zellkulturüberstand

Die Analysen von PCR und Pyrosequenzierung mit HBV-DNA aus extrazellulären viralen Partikeln demonstrierten, dass die Variantengenome nach Kotransfektion mit WtD aus den Zellen ausgeschleust wurden und meist eine Anreicherung zeigten, die nur wenig schwächer war als in den zytoplasmatischen Core-Partikeln. Somit war auch in vitro die Basis für die im Patienten erfolgte Akkumulation der komplexen Varianten zu erkennen. Aufgrund ihres breiten Oberflächenproteindefekts ist davon auszugehen, dass die meisten Varianten zur Bildung infektiöser Viruspartikel nicht nur das Core-Protein, sondern auch die Oberflächenproteine des Wt benötigen. Bei einer anderen Variante mit mutierten Oberflächenproteinen und erhöhter Replikation wurde bereits nachgewiesen, dass schon die Anwesenheit von nur wenig Wt-HBV ihren Sekretionsdefekt aufhob und ihre Anreicherung erlaubte [246].

Erstaunlicherweise wurden jedoch auch nach Kotransfektion von Varianten-DNA mit pCore bei allen Varianten Partikel-assoziierte Varianten-Genome im Medium detektiert. Da bei den Varianten A-S18k und A-S24k intrazellulär nur wenig trunkiertes SHBs und im Zellkulturüberstand gar kein HBsAg nachweisbar war, wurden die Genome hier wahrscheinlich in nackten, nicht umhüllten Core-Partikeln aus der Zelle freigesetzt. Auch der Nachweis von aus dem Medium aufgereinigten viralen Partikeln mit Antikörpern gegen Core-Protein nach Transfektion von WtD und WtA zeigte, dass eine kleine Fraktion der extrazellulären Partikel nicht umhüllt war. Das Phänomen der Ausschleusung nackter Core-Partikel aus HuH7-Zellen, unabhängig von der Art des transfizierten Genoms, wurde bereits von anderen Gruppen beschrieben [160,192]. Bei einigen Varianten (z. B. mit verschiedenen Punktmutationen im Cp oder S-Gen) mit herabgesetzter Sekretion der umhüllten Viria war der Anteil der nackten Partikel im Vergleich zum Wt stark erhöht [160,192]. In vivo wurden im Serum jedoch bisher keine nackten Core-Partikel gefunden [247]. Daher handelt es sich vermutlich um eine Besonderheit des in-vitro-Zellkultursystems bzw. der HuH7-Zelle. Dabei ist nach wie vor unklar, ob die Freisetzung durch einen spezifischen Mechanismus oder einfach durch Zelltod erfolgt.

6.10 Auswirkungen auf das Spleißen

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Die große Mehrheit der komplexen Varianten (82 %) einer Gruppe von 5 Patienten zeigte im Vergleich zu Wt-Genomen und den Wt-ähnlichen Klonen eine starke Reduktion der häufigsten gespleißten pgRNA, SP1. In der Folge waren auch die von der SP1-RNA revers transkribierten replikativen Intermediate extrem vermindert. Dies ist der erste Nachweis eines veränderten Spleißmusters bei natürlich auftretenden, im Patienten selektierten HBV-Varianten.

Interessanterweise lagen replikative DNA-Intermediate von 2 seltenen, alternativen Spleißprodukten, SP9 und SP11, in unverändertem Maße bei den komplexen Varianten vor.

6.10.1  Molekulare Ursachen

Um den molekularen Ursachen der reduzierten SP1-RNA auf die Spur zu kommen, wurden die kompletten Sequenzen aller getesteten Genome auf auffällige Mutationen hin untersucht (Darstellung der Mutationen im Anhang Abb. A.1). Allgemein für das Spleißen essentielle Sequenzelemente auf der RNA umfassen die 5'- und 3'-Spleißstellen (Spleißdonor und
-akzeptor), den Verzweigungspunkt 20–50 nt stromaufwärts der 3'-Spleißstelle und einen Polypyrimidin-Trakt zwischen 3'-Spleißstelle und Verzweigungspunkt. Überraschenderweise ist keines der HBV-Genome mit stark dezimierter SP1-RNA an einer für die SP1-RNA essentiellen Spleißstelle (nt 2453/2454 und nt 488/489) mutiert. Auch hat nur eines der Genome, D-5/19k, einen Austausch (nt 457 A>G) am vermuteten Verzweigungspunkt (nt 452–458, Konsensus YNYYRAY) [15]. Offensichtlich führten also Mutationen in anderen Sequenzbereichen mit möglicherweise spleiß-regulatorischen Funktionen zur Reduktion der gespleißten SP1-RNA. Die gleichzeitig unveränderten Werte der SP9- und SP11-Spleißprodukte, die beide einen anderen Spleißakzeptor bei nt 282 nutzen, deuten darauf hin, dass diese Mutationen der komplexen Varianten möglicherweise eine stark verminderte Aktivität des Spleißakzeptors bei nt 488 verursachen.

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Gegenwärtig ist nur sehr wenig über die Regulation des Spleißens durch cis-Elemente des HBV-Genoms bekannt. Bisher wurde lediglich gezeigt, dass das posttranskriptionell regulatorische Element (PRE, nt 1253–1583) im HBV-Genom distinkte positiv und negativ Spleiß-regulatorische Elemente enthält und seine Deletion zur Reduktion des Spleißens führt [248]. In dieser Region tragen nur einzelne komplexe Varianten, aber auch nicht-komplexe Genome mit normalem Spleißmuster verschiedene Punktmutationen. Somit war kein Zusammenhang zur reduzierten SP1-RNA zu erkennen.

Auch im übrigen Genom war keine einzelne gemeinsame Mutation der Klone mit reduzierter SP1-RNA im Unterschied zu den Klonen mit normalen SP1-RNA-Leveln zu finden (vgl. Anhang Abb. A.1). Daher scheint die verminderte Produktion der SP1-RNA auf verschiedenen Einzelmutationen mit gleicher Wirkung oder auf einer Kombination von Mutationen zu beruhen. Eine verminderte SP1-RNA korrelierte zwar in den meisten Fällen mit dem Auftreten einer C-Gendeletion, diese war jedoch allein oder in Kombination mit Cp-Mutationen nicht ausreichend für die Reduktion.

Auf der Suche nach potentiell verantwortlichen Mutationsmustern waren bei den Varianten mit stark reduzierter SP1-RNA folgende gemeinsame Mutationen festzustellen, die nicht bei den Genomen mit normalen SP1-RNA-Werten vorliegen: Sie tragen eine C-Gendeletion im Bereich von ca. nt 2130–2200 und eine Punktmutation bei nt 2328 in Kombination mit verschiedenen Punktmutationen um nt 500 (Patienten A und D: nt 480 und/oder 514, Patienten B und C: nt 528), also in der Nähe des Spleißakzeptors der SP1-RNA. Die Punktmutation bei nt 480 tritt nur bei Variante A-S15k auf, die eine weniger drastische Verminderung der SP1-RNA und der korrespondierenden replikativen Intermediate zeigte. Sie befindet sich im Gegensatz zu den Mutationen bei nt 514 und 528 im herausgeschnittenen Intron der SP1-RNA. Der Grund für die verstärkte Umschreibung der SP1-, SP9- und SP11-RNA in DNA-Intermediate bei der Hybridvariante A-L1k-C/Cp im Vergleich zum Wt bleibt unklar. Bei Klon C-5/17 mit reduzierter SP1-RNA, aber ohne C-Gendeletion könnten Punktmutationen bei nt 2142 und 2143 die Wirkung der C-Gendeletion ersetzt haben. Den beiden komplexen Varianten C-5/01k und C-5/18k, die trotz C-Gendeletion eine kaum verminderte SP1-RNA zeigten, fehlen die zusätzlichen Mutationen im Bereich des nt 500. Außerdem liegt die C-Gendeletion der komplexen Variante C-5/01k möglicherweise zu weit C-terminal (nt 2394–2420), während die der Variante C-5/18k zu groß ist (nt 2068–2304).

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Die Mutationsanalyse deutet also darauf hin, dass sich in den Bereichen um nt 2100–2200 und nt 500 bisher unbekannte Sequenzelemente befinden könnten, die gemeinsam das Spleißen der pgRNA zur SP1-RNA fördern. Alternativ wäre denkbar, dass nur die Mutationen in der Nähe des Spleißakzeptors zu dessen verminderter Funktion führen, das komplexe Mutationsmuster mit C-Gendeletion aber für deren Selektion notwendig ist.

Es wurde versucht, diese mutierten Regionen mit Bindestellen für bekannte Spleißfaktoren zu korrelieren. Für den Spleißfaktor PSF (Spalt- und Polyadenylierungs-Spezifitätsfaktor) existieren 3 potentielle Bindestellen im Wt-HBV-Genom, bei nt 2231–2243, nt 200–216 und nt 1305–1323. Allerdings wurde bisher nur die letzte, im PRE liegende experimentell bestätigt (Tilman Heise, Hamburg, persönliche Mitteilung und Referenz [248]). In diesen Bereichen liegen jedoch keine gemeinsamen Mutationen der reduziert spleißenden Varianten.

Weiterhin kann die Erkennung und Auswahl von Spleißdonatoren bzw. -akzeptoren durch Bindung sogenannter SR-Proteine an regulatorische Sequenzen auf der RNA beeinflusst und somit das Spleißen reguliert werden. Dabei fördert die Bindung an „exonic splicing enhancer“ (ESE) das Spleißen, während Bindung an „exonic splicing silencer“ (ESS) das Spleißen hemmen kann. Da ESE-Sequenzen im Gegensatz zu ESS-Sequenzen relativ konserviert vorliegen, lassen sich potentielle ESE mithilfe des Computerprogramms ESEfinder [249] lokalisieren. Das Programm sagte für die Wt-HBV-Genome unzählige, über die gesamte Sequenz verteilte potentielle SR-Protein-Bindungsstellen voraus. Danach befinden sich 3 potentielle Bindungsstellen für den Spleißfaktor SC35 tatsächlich bei den in den reduziert spleißenden Varianten mutierten Positionen nt 480 (474–481), nt 514 (509–516) und in unmittelbarer Nähe von nt 528 (529–536). Zwei weitere potentielle Bindungsstellen für die Proteine SRp55 bei nt 2162–2167 und SRp40 bei nt 2188–2194 liegen im Bereich der C-Gendeletionen. Ob aber diese Bindungsstellen wirklich funktionell sind und die Mutationen in diesen Bereichen eine Rolle in der Reduktion der SP1-RNA spielen, ist erst durch weitere Experimente zu klären.

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Die Ergebnisse mit den unterschiedlichen aus Patienten isolierten Varianten demonstrieren, dass das Spleißen des HBV ein komplex regulierter Prozess ist, in den vermutlich auch dafür bisher unbekannte Bereiche des Genoms involviert sind. Die komplett sequenzierten natürlich auftretenden Varianten bieten einmalige Möglichkeiten zum weiteren Studium des Spleißens und seiner Regulation im HBV-Replikationszyklus.

6.10.2 Mögliche Rollen des Spleißens bzw. des Nicht-Spleißens

Die Rolle des Spleißens an sich und speziell der vorherrschenden gespleißten SP1-RNA im HBV-Replikationszyklus ist noch ungeklärt. Über das Spleißen von HBV-Varianten gibt es bisher keine gezielten Untersuchungen. Im Gegensatz zur Situation beim DHBV, wo das Spleißen für die Infektion und die Expression des großen Oberflächenproteins notwendig ist [250], werden alle HBV-Proteine von ungespleißten RNAs translatiert und SP1-RNA scheint in transfizierten Hepatomazellen nicht essentiell für die HBV-Replikation zu sein [251]. Dennoch werden alle 11 bekannten gespleißten pgRNAs des HBV revers transkribiert und sind in viralen Partikeln im Serum von Patienten zu finden [15]. Eine Funktion in vivo ist daher nicht ausgeschlossen.

Es wurden verschiedene Hypothesen zur Funktion des Spleißens aufgestellt. Grundsätzlich sind Transkription, mRNA-Prozessierung, nukleärer Export und Transport gekoppelte Vorgänge [252,253,254]. Daher könnten Veränderungen im Spleißmuster alle Ebenen des Replikationszyklus betreffen. Auch wäre denkbar, dass von gespleißten RNAs translatierte Fusionsproteine, wie das sogenannte HBSP der SP1-RNA, eine Funktion haben [255]. Da von den gespleißten RNAs vermutlich große Mengen an defekten Präcore- und Core-Proteinen translatiert werden, könnten diese auch den viralen Assemblierungsprozess negativ beeinflussen und somit als Hemmer einer zu starken Virusreplikation dienen [15]. Bei allen 11 bekannten Spleißprodukten der 3,5-kb-RNA bleiben dagegen X-Gen und X-Promotor, EnhI und II sowie das Polyadenylierungssignal intakt [15]. Daher wurde postuliert, dass die gespleißten RNAs wichtig für die Expression des X-Proteins sein könnten. Tatsächlich wurde für SP1-RNA-abgeleitete Genome bereits eine erhöhte Transkription der X-mRNA festgestellt [256]. Des Weiteren könnten defekte von der SP1-RNA revers-transkibierte Genome eine Rolle in der Viruspersistenz spielen, da sie hauptsächlich bei chronischen und weniger bei akut-selbstlimitierenden Verläufen der Hepatitis B gefunden wurden [256].

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Erst kürzlich wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass auch die präS2/S-mRNA gespleißt wird [16]. Bei Genomen aus einem immunsupprimierten HBsAg-negativen Patienten mit Reaktivierung verhinderte eine Punktmutation bei nt 458 (G>A) im S-Gen das Spleißen der präS2/S-mRNA. Nachfolgend kam es auch zur Reduktion des ungespleißten präS2/S-Transkripts und des HBsAg, vermutlich durch eine veränderte Interaktion der RNA mit RNA-bindenden Proteinen und daraus resultierender reduzierter RNA-Stabilität oder vermindertem Kernexport [16]. Diese Ergebnisse verdeutlichen den potentiellen Einfluss des Spleißens auf grundlegende Prozesse des Replikationszyklus.

Bei den komplexen Varianten überraschte das weitgehende Fehlen der SP1-RNA, die sonst den Hauptteil (60 %) aller Spleißprodukte darstellt und somit vermutlich die wichtigste Rolle im Replikationszyklus spielt. Zwar wurden die alternativen Spleißprodukte SP9 und SP11 noch unverändert gebildet, jedoch machen nach Literaturangaben von SP9- und SP11-RNA abgeleitete Genome im Serum von Patienten zusammen nur 15 % aller gespleißten Genome aus [15]. Sollte außerdem nicht nur die Produktion der SP1-RNA sondern insgesamt die Funktion des Speißakzeptors bei nt 488 gehemmt sein, wäre die Bildung von 7 der 11 bekannten Spleißtypen beeinträchtigt, die zusammen 79 % aller Spleißprodukte darstellen [15]. In diesem Fall könnte man von einem breiten Defekt des Spleißens der pgRNA sprechen.

Über den Grund für die Selektion von Varianten mit stark reduzierter gespleißter SP1-RNA (bzw. insgesamt drastisch verminderten Spleißprodukten) in Nierentransplantierten mit LZ und die mögliche Verbindung zur Pathogenese kann nur spekuliert werden. Da die komplexen Varianten selbst defekte Genome darstellen und den Wt zur Replikation benötigen, wäre es für ihre Selektion vermutlich von Nachteil gewesen, zusätzlich noch weitere defekte, gespleißte Genome zu produzieren, mit denen sie um den Wt konkurrieren müssen. Möglicherweise ist in den Nierentransplantierten auch die starke HBx-Expression von der gespleißten RNA nicht mehr notwendig. Damit übereinstimmend ist grundsätzlich die C-terminale Transaktivierungsdomäne des HBx der komplexen Varianten durch die überlappenden Mutationen im Cp mutiert oder sogar trunkiert, so dass eine von vorn herein veränderte und möglicherweise verminderte Aktivität des Varianten-HBx zu erwarten ist. Auch Varianten mit einer X-Startkodonmutation (A-S18k) und folglich komplett fehlender HBx-Expression traten auf. Andererseits könnte in den immunsupprimierten Patienten auch der Selektionsdruck für das von der SP1-RNA translatierte HBSP oder ein unbekanntes Translationsprodukt der gespleißten RNA wegfallen. Denkbar wäre, dass ein solches Protein oder die gespleißte RNA selbst in Prozesse der Immunabwehr des Wt-Virus involviert sind.

6.11 Mögliche Rolle der komplexen Varianten in der Pathogenese

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Die charakteristischen phänotypischen Veränderungen der komplexen Varianten, d. h. die Kombination erhöhter Replikation, reduzierter gespleißter SP1-RNA und des Defekts in Proteinexpression, -lokalisation und -sekretion, könnten auf vielen verschiedenen Wegen Zytotoxizität verursachen oder die Wirtszellphysiologie stören und somit eine Rolle in der Pathogenese der LZ bei Nierentransplantierten spielen.

Mehrfach wurde in vivo und in vitro nachgewiesen, dass eine gestörte Oberflächenproteinexpression mit Retention und Akkumulation von HBsAg einen direkten oder immunvermittelten Zellschaden verursachen kann. In transgenen Mäusen war die relative Überexpression von LHBs im Vergleich zu SHBs aufgrund verminderter Sekretion und fortschreitender intrazellulärer Akkumulation des HBsAg direkt toxisch für die Leberzellen [213,257]. Die Zellen hatten das Erscheinungsbild von „ground-glass“-Hepatozyten, die große Mengen von HBV-Oberflächenproteinen in ausgedehnten Vesikeln beherbergen und häufig auch in der Leber von Patienten mit chronischer Hepatitis B zu finden sind. Zusätzlich sensibilisierte die Retention von Oberflächenproteinen die Zellen für Schädigungen durch Immunsystem und Zytokine [214]. In Hepatomazellen führte die Überexpression von LHBs zu Zellveränderungen mit großen Vakuolen und Apoptose, die stark an die Zytopathologie in Patienten mit FCH erinnern [143]. Wie beschrieben (Abschnitt 1.2.3), tritt diese aggressive Form der Hepatitis B ohne nennenswerte Entzündungsreaktionen hauptsächlich bei Immunsupprimierten auf.

Intensiv wird ein Zusammenhang der Pathogenese mit der Präsenz verschiedener Varianten mit HBsAg-Retention/Akkumulation diskutiert. So ist bei FCH-Patienten die Überexpression von LHBs vermutlich auf Varianten mit Deletionen in der präS-Region zurückzuführen [169,144]. Auch in „ground-glass“-Hepatozyten wurden verschiedene präS-Deletions-Varianten nachgewiesen, deren HBsAg-Retention und -Akkumlation im ER die Aktivierung einer ER-Stress-Reaktion zur Folge hatte [258,259]. In einer weiteren Studie wurde bei präS2-Deletionsvarianten eine Retention bzw. Akkumulation von HBsAg im Zytoplasma oder an der Peripherie der Hepatozyten detektiert, wie sie auch in der Leber von Patienten in der nicht-replikativen Phase der chronischen Hepatitis B (häufig mit LZ) zu beobachten ist [260].

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Bei den Nierentransplantierten mit LZ trat eine intrazelluläre Akkumulation von Oberflächenproteinen bereits bei einem früh im Beobachtungszeitraum isolierten Wt-ähnlichen HBV-Genom (A-S1) auf. Wie beschrieben (Abschnitt 6.7), wiesen reduzierte HBsAg-Level bei normaler intrazellulärer Expression der Oberflächenproteine darauf hin, dass darüber hinaus vermutlich auch viele der übrigen im Screening analysierten Genome aus frühen Serumproben beider Patienten eine solche Akkumulation verursachen. Es wäre daher denkbar, dass das vermehrte Auftreten solcher Genome vor Anreicherung der komplexen Varianten zu einer Vorschädigung und/oder Sensibilisierung der Leberzellen führen könnte.

Bei den mit LZ assoziierten komplexen Varianten scheint die Akkumulation von Oberflächenproteinen im ER jedoch eher eine Ausnahme zu sein. Meist waren hier insgesamt keine oder wenig Oberflächenproteine nachweisbar. Die Situation hat Ähnlichkeit mit der eines aufgrund von FCH verstorbenen immunsupprimierten Patienten, der mit einer präS-Variante infiziert war, in dessen Leber jedoch nahezu keine Oberflächenproteine nachgewiesen wurden [144].

Möglicherweise spielen hier andere Faktoren eine größere Rolle für die Pathogenese. Experimente mit DHBV zeigten, dass vermindertes oder defektes LHBs zu verstärkter Ansammlung von cccDNA im Zellkern und daraus resultierender Leberzellschädigung führen kann [261,38]. Und auch intrazelluläre Akkumulation von Core-Protein, wie sie nach Kotransfektion mit den komplexen Varianten auftrat, wirkte in Zellkulturexperimenten zytopathogen [229]. Der potentielle Einfluss des zytoplasmatischen Core-Proteins der Varianten wurde bereits in Abschnitt 6.5 diskutiert. Ebenso könnten sich die starke Reduktion der gespleißten SP1-RNA (siehe Abschnitt 6.10.2) oder veränderte transaktivierende Eigenschaften der mutierten X-, Core- oder Oberflächenproteine der komplexen Varianten auf die Pathogenese auswirken. Darüber hinaus legte die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von HBV-Genomen aus chinesischen HCC-Patienten eine Verbindung zwischen hoch-replizierenden Varianten und der Pathogenese nah [196]. Letztendlich lässt der komplexe Phänotyp der Varianten vermuten, dass, eher als eine einzige Veränderung, die Kombination mehrerer Faktoren eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt.

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Obwohl der Phänotyp der Varianten diverse mögliche Arten der Beeinflussung und Schädigung der Wirtszelle offen legt, lassen die aktuellen Untersuchungen an Hepatomazellen leider keine endgültigen Aussagen zur tatsächlichen Zytopathogenität der Varianten zu. Für Analysen zu Auswirkungen wie Zytotoxizität oder Apoptose sind Studien mit primären Hepatozyten oder in einem Tiermodell erforderlich. Ein potentiell veränderter Einfluss der Varianten auf Komponenten des Immunsystems sowie die Frage, ob die Varianten wirklich für die Pathogenese verantwortlich sind, können nur in einem Tiermodell geklärt werden. Unter den gegenwärtigen Bedingungen sind solche Versuche jedoch schon alleine aufgrund der benötigten Mengen an infektiösem Virus kaum durchführbar.

6.12 Korrelation zwischen HBV-Population und Krankheitsverlauf

Im Detail betrachtet, demonstrierten die komplexen Varianten der 2 nierentransplantierten Patienten einen teilweise heterogenen Phänotyp, der jedoch immer eine erhöhte Replikation, veränderte Transkription und einen breiten Defekt der Proteinexpression beinhaltete. Dabei zeigten die Varianten des Patienten A deutlich stärkere phänotypische Variationen, z. B. im Ausmaß der Replikation und Anreicherung, der Hemmung des Wt, der RNA-Transkription oder der Oberflächenproteinexpression, als die Varianten des Patienten B, die ähnliche Eigenschaften aufwiesen. Gleichzeitig wurde der Phänotyp und insbesondere die Replikation bei Patient B hauptsächlich durch die Effekte der Mutationen in Cp und C-Gen bestimmt, während bei Patient A zusätzlich Mutationen außerhalb dieser beiden Regionen einen starken Einfluss hatten. Diese Beobachtungen korrelieren mit der Tatsache, dass bei Patient A deutlich mehr verschiedene Mutationsmuster von Deletionen/Insertionen in Cp, C-Gen und präS-Bereich in den Viruspopulationen vorlagen als bei Patient B (Referenz [134], Abschnitte 3.1.2 und 3.2.2). Auch unterscheiden sich die von Patient A isolierten HBV-Genome untereinander stärker in zusätzlichen Punktmutationen, sowohl innerhalb als auch außerhalb von Cp und C-Gen, und weichen mehr von der Sequenz des Referenzgenoms ab (Abb. 5.5). Eine hohe Sequenzheterogenität innerhalb einer HBV-Population scheint also eine gewisse Heterogenität der funktionellen Eigenschaften nach sich zu ziehen, auch wenn generell ein bestimmtes phänotypisches Bild hervorsticht.

Interessanterweise entwickelte sich die LZ in Patient B innerhalb von nur 8 Monaten nach dem ersten Nachweis und der Akkumulation der komplexen Varianten, und der Patient verstarb bereits 3 Monate später. Dagegen schritt die Erkrankung des Patienten A deutlich langsamer voran [134,4]. Die LZ wurde erst mehr als 2 Jahre nach dem Auftreten der komplexen Varianten diagnostiziert und der Patient überlebte dank einer erfolgreichen antiviralen Therapie mit 3TC und einer kombinierten Leber-Nierentransplantation.

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Damit drängt sich die Hypothese auf, dass ein Zusammenhang zwischen der Komplexität der Quasispezies, der Einheitlichkeit der funktionellen Eigenschaften der vorhandenen Virusvarianten und der Schwere des Krankheitsverlaufs bestehen könnte. Die Akkumulation von komplexen Varianten mit sehr einheitlichem Mutationsmuster und Phänotyp könnte eine besonders rasante Pathogenese verursachen, indem alle Varianten die Zellen in gleicher Weise schädigen. Dagegen könnten die Varianten einer heterogeneren HBV-Population mit stärker variierendem Ausmaß bestimmter phänotypischer Eigenschaften auf unterschiedliche Weise und/oder mit unterschiedlicher Stärke zur Pathogenese beitragen, so dass die Entwicklung einer schweren Lebererkrankung langsamer verläuft.

Andererseits ist aber auch denkbar, dass die Art der Cp-Mutation und/oder C-Gendeletion bzw. ihrer Kombination, den Krankheitsverlauf beeinflusst. So war möglicherweise das Auftreten der Cp-Deletion von nt 1763–1770 und/oder der C-Gendeletion von 51 nt (17 AS) entscheidend für den schnellen, drastischen Leberschaden des Patienten B. Darüber hinaus verhinderte vielleicht lediglich mangelnde Zeit die Entstehung und Selektion weiterer Mutationen auf dem Genom, die zu einer heterogeneren Population geführt hätten. Endgültig klären lassen sich diese potentiellen Zusammenhänge nur durch Untersuchungen in einem Tiermodell.

6.13 Notwendigkeit und Aussagekraft der funktionellen Analysen von HBV-Gesamtgenomen

Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die Annahme, dass die komplexen HBV-Varianten veränderte phänotypische Eigenschaften verglichen mit den zuvor analysierten Hybridgenomen zeigen könnten. Zwar waren die meisten bekannten Auswirkungen der Cp-Mutationen und C-Gendeletionen auch wiederzufinden, sie wurden jedoch im Kontext des komplexen Mutationsmusters durch weitere Effekte ergänzt und in ihrem Ausmaß stark moduliert. Ein entscheidendes Merkmal, die Hemmung der Wt-Replikation durch die C-Gendeletionen, war dagegen in den komplexen Genomen meist nicht mehr präsent. Gleichermaßen hatten bereits andere Gruppen gezeigt, dass schon die Effekte einzelner Punktmutationen, z. B. im S-Gen oder im C-Gen, sich gegenseitig beeinflussen, verstärken oder aufheben können [160,194].

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Die Daten machen deutlich, dass die funktionellen Analysen einzelner Mutationen bei der Charakterisierung des Phänotyps natürlicher Varianten, und folglich auch in der Frage ihrer Pathogenität und ihres Zusammenhangs mit dem klinischen Verlauf der Hepatitis B, nur begrenzt weiterhelfen können. Besonders bei sehr heterogenen Viruspopulationen ist die Untersuchung kompletter Genome, so, wie sie vom Patienten isoliert wurden, unumgänglich. Nur bei der Suche nach den molekularen Ursachen eines Phänotyps können, insbesondere im Falle einer hohen Komplexität der Mutationsmuster wie in dieser Arbeit, ergänzend gezielte Analysen von Hybridgenomen zu den Auswirkungen einzelner Mutationen sinnvoll sein.

Auch die Analyse gesamter Viruspopulationen ist wichtig. Neueste Untersuchungen an Polioviruspopulationen untermauern Aussagen der sogenannten Quasispezies-Theorie, die davon ausgeht, dass die Selektion auf der Ebene ganzer Populationen anstelle von Einzelvarianten stattfindet und dass der Phänotyp einer Quasispezies durch intensive Interaktion und Komplementation zwischen Virusvarianten bestimmt wird [262]. Übereinstimmend damit beeinflussen auch HBV-Genome sich innerhalb einer Viruspopulation gegenseitig, so dass bestimmte Eigenschaften von Varianten (z. B. ein Defekt der Virussekretion [246]) oder des Wt aufgehoben oder möglicherweise auch verstärkt werden können. Besonders deutlich wird dies am Beispiel der komplexen Varianten, die zur Replikation auf die Komplementation durch den Wt angewiesen sind. Wünschenswert wären daher phänotypische Analysen der gesamten komplexen HBV-Populationen, die im Zusammenhang mit der LZ in Nierentransplantierten auftreten, in einem Tiermodell. Wie bereits erwähnt, sind diese unter den gegenwärtigen Bedingungen jedoch kaum durchführbar. In einem ersten Schritt erfolgten in dieser Arbeit stattdessen Kotransfektionen von Variantenpools und Wt, die zeigten, dass sich auf der Ebene der Replikation der Phänotyp der Mehrheit der komplexen Varianten (erhöhte Replikation ohne Unterdrückung des Wt) durchsetzt.


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14.11.2006