7 Zusammenfassung

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Bei immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern mit chronischer Hepatitis B können nach häufig langer asymptomatischer Phase schwere Verläufe der Lebererkrankung mit Leberzirrhose und Leberversagen auftreten. In diesen Fällen ist die übliche, immunvermittelte HBV-Pathogenese als Ursache für den Krankheitsverlauf eher unwahrscheinlich. Dagegen wurde gezeigt, dass die Entwicklung von Leberzirrhose in den Nierentransplantierten in engem Zusammenhang mit der Akkumulation und Persistenz von HBV-Varianten mit Mutationen im Core-Promotor/X-Gen, Deletionen im C-Gen und teilweise zusätzlichen Deletionen im präS-Bereich steht. Diese komplexen Varianten könnten eine Rolle in der Pathogenese spielen.

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In Vorarbeiten wurde bereits bei Viren mit Hybridgenomen, die entweder typische Core-Promotor-Mutationen oder C-Gendeletionen der komplexen Varianten in einem Wildtypgenomkontext enthielten, ein veränderter Phänotyp gegenüber dem Wildtypvirus im in-vitro-Transfektionssystem festgestellt. Es war jedoch unklar, ob sich dieser Phänotyp auch bei den natürlich auftretenden Varianten mit verschiedenen komplexen Mutationskombinationen zeigen würde. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals funktionelle Analysen der vollständigen komplexen Varianten durchgeführt, um Hinweise auf ihren potentiellen Beitrag zur speziellen Pathogenese der Leberzirrhose bei Immunsupprimierten zu erlangen.

Die Analysen erfolgten durch transiente Transfektion der humanen Hepatomazelllinie HuH7 mit HBV-Gesamtgenomen, die aus 2 repräsentativen Patienten während des Krankheitsverlaufs von einer asymptomatischen Infektion hin zur Leberzirrhose isoliert und kloniert worden waren. Da den komplexen Varianten aufgrund der C-Gendeletion funktionelles Core-Protein zur Replikation fehlt, wurden sie für Analysen der Replikation mit dem Core-Expressionsplasmid pCore oder einem Wildtypgenom zur Komplementation kotransfiziert.

Zunächst wurde ein Überblick über die phänotypischen Veränderungen aller replikationskompetenten Klone aus den zu verschiedenen Zeitpunkten vorliegenden HBV-Populationen erstellt. Anschließend wurden 6 repräsentative komplexe Varianten ausgewählt, die in den beiden Patienten vor und während der Entwicklung der Leberzirrhose auftraten und akkumulierten, und im Vergleich zu Referenz-Wildtypgenomen und Wildtyp-ähnlichen Genomen der Patienten aus der frühen Infektionsphase detailliert funktionell charakterisiert.

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Trotz einiger Variationen im Ausmaß der phänotypischen Veränderungen wiesen die komplexen Varianten einen gemeinsamen, drastisch vom Wildtyp abweichenden Phänotyp auf. Sie zeigten eine veränderte Transkription mit reduzierten präC- und Oberflächen-mRNAs und verstärkter Expression der prägenomischen RNA. Der Level des häufigsten Spleißprodukts der prägenomischen RNA, SP1, und die von der SP1-RNA revers transkribierten replikativen DNA-Intermediate waren stark vermindert. Weiterhin demonstrierten die Varianten eine extrem reduzierte oder fehlende Expression und/oder Sekretion aller Oberflächenproteine, des Core-Proteins und des HBeAg. Für eine komplexe Variante und ein Wildtyp-ähnliches Genom war eine anormale, perinukleäre Akkumulation der Oberflächenproteine im Endoplasmatischen Retikulum nachweisbar, die mit einem unterschiedlich stark ausgeprägten Sekretionsdefekt einher ging. Daneben führte die Kotransfektion von Varianten mit pCore oder einem Wildtypgenom zu einer veränderten, perinukleären Lokalisation des Wildtyp-Core-Proteins.

Parallel zu diesen breiten Defekten zeigten die komplexen Varianten nach Kotransfektion mit einem Wildtypgenom in verschiedenen Verhältnissen eine in ihrem Ausmaß variierende erhöhte Replikation und Anreicherung gegenüber dem Wildtyp. Diese resultierten aus einer verstärkten reversen Transkription der prägenomischen RNA der Varianten. Die erhöhte Replikation und Anreicherung konnten nach Kotransfektion mit Wildtyp auch bei Mischungen von Variantengenomen derselben Patientenprobe nachgewiesen werden, die in ihrer Zusammensetzung den Viruspopulationen der Patienten zu bestimmten Zeitpunkten nach Diagnose der Leberzirrhose entsprachen.

Durch Konstruktion und Analyse von Hybridvarianten, die den Core-Promotor, das C-Gen oder beide mutierten Bereiche der komplexen Varianten im Kontext eines (vom selben Patienten stammenden) Wildtyp-ähnlichen Genoms enthalten, konnten einige funktionelle Veränderungen der komplexen Varianten auf die Auswirkungen ihrer Mutationen in Core-Promotor und/oder C-Gen zurückgeführt werden.

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Jedoch zeigte sich deutlich, dass zusätzlich Mutationen in den anderen Genomabschnitten einen starken Einfluss, z. B. auf das Ausmaß des Replikationsvorteils, hatten. Besonders auffällig war dies bei den Varianten des Patienten, der auch insgesamt eine heterogenere HBV-Population aufwies. Der Phänotyp der komplexen Varianten war folglich deutlich vielschichtiger als aufgrund der Analysen der Hybridgenome mit nur den Core-Promotor-Mutationen oder C-Gendeletionen im Wildtypkontext zu erwarten gewesen wäre. So war auch die im Einklang mit früheren Untersuchungen während der Koreplikation beobachtete Hemmung des Wildtyps durch Hybridvarianten mit lediglich C-Gendeletionen bei den meisten komplexen Varianten und bei den Hybridvarianten mit C-Gendeletionen und Core-Promotor-Mutationen nicht mehr vorhanden. Bei den komplexen Varianten handelt es sich daher nicht um defekte interferierende Partikel, wie in der Literatur generell für HBV mit C-Gendeletionen postuliert wurde. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass besonders bei heterogenen Viruspopulationen die funktionelle Analyse kompletter Varianten zur Klärung ihres Phänotyps, ihrer potentiellen Pathogenität und ihres Zusammenhangs zum Verlauf der Hepatitis B notwendig ist.

Die Daten legen nahe, dass die komplexen Varianten z. B. durch die aberrante intrazelluläre Lokalisation von Core- und Oberflächenproteinen, durch ihre gleichzeitig starke Replikation und Anreicherung, durch die starke Reduktion der gespleißten SP1-RNA oder durch veränderte transaktivierende Eigenschaften der mutierten X-, Core- oder Oberflächenproteine zytotoxisch wirken oder die Wirtszellphysiologie stören und damit einen Beitrag zur Pathogenese leisten.


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14.11.2006