Die in dieser Arbeit verwendeten HBV-Klone der Patienten liegen kloniert im Vektor pZErO^TM-2.1 (Invitrogen) vor, der eine Kanamycinresistenz vermittelt. Die zur Klonierung der Gesamtgenome verwendete Methode wurde detailliert von Günther et al. [182] beschrieben. Nach der Extraktion der DNA aus dem Patientenserum bzw. der Leber wurden komplette HBV-Genome der im Serum vorliegenden Population mittels Gesamtgenom-PCR amplifiziert. Dazu wurden Primer verwendet, die in der nick-Region des HBV-Genoms binden und Restriktionsschnittstellen für HindIII, SacI und SapI enthalten. Über die SacI-Schnittorte wurden die Genome in den Vektor ligiert. Die meisten der in dieser Arbeit verwendeten Klone wurden mit dem ALFexpress Sequenzierer (Pharmacia) komplett sequenziert. Für die Transfektion wurden die HBV-Genome durch Restriktion mit SapI ohne Sequenzverlust aus dem Vektor herausgeschnitten und dann als lineare doppelsträngige DNA eingesetzt, die nach Rezirkularisierung replizieren kann. Mutationen der Patientengenome wurden durch Vergleich mit der Sequenz des Genotyp-A-Referenzgenoms (nach Valenzuela [43]) ermittelt.

Als Referenz-Wt-Genome in Transfektionen wurden grundsätzlich ein Wt-HBV-Genom des Genotyps D, Subtyp ayw („WtD“, GenBank-Nr. V01460, Galibert [201]) im Vektor pUC und/oder ein Wt-Genom des Genotyps A, Subtyp adw2 („WtA“, GenBank-Nr. X02763, Valenzuela [43]) im Vektor pZErO verwendet. Zur Transfektion wurden die Referenzgenome wie die Patientenklone mit SapI aus dem Plasmid geschnitten.

Das Core-Expressionsplasmid pCore basiert auf einem von M. Nassal (Freiburg) konstruierten Plasmid [202] und enthält ein HBV-C-Gen des Genotyps D (nach Galibert [201]) hinter einem CMV-Promotor. Es wurde freundlicherweise von Stephan Günther (Hamburg) zur Verfügung gestellt.

Das CMV-SEAP-Plasmid basiert auf dem ca. 5,2 kb großen Plasmid pBC12/PL/SEAP [203]. Es enthält das Gen der humanen plazentalen alkalischen Phosphatase, nach dessen Codon 489 ein Stoppkodon eingeführt wurde, so dass das normalerweise membranständige Genprodukt effizient und in aktiver Form sezerniert wird. Diese sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) wird mithilfe des dem Gen vorgeschalteten CMV-Promotors exprimiert.

Zur Herstellung der C/Cp-Varianten wurden je 10 µg der „Wt“- und Varianten-HBV-Genome, die über das nick (nt 1820) in den Vektor pZErO kloniert waren, mit je 20 U der Restriktionsendonukleasen Kpn2I und Cfr42I (Fermentas, St. Leon-Rot) 4 h bei 37 °C an den nt-Positionen 1450 und 2331 gespalten. Dadurch entstanden 2 Fragmente, von denen das eine (4081 bp) den Vektor mit C-Gen und Cp und das andere (2319 bp) das restliche HBV-Genom enthielt. Das Vektor-C-Cp-Fragment der Varianten sowie das Rest-Genom des Patienten-„Wt“-Klons wurden nach Elektrophorese des Restriktionsansatzes aus einem 1%igen Agarosegel (20 min bei 40 V, 2 h bei 80 V) ausgeschnitten, aufgereinigt (Qiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen, nach Herstellerangaben) und in 30 µl eluiert. Die Eluate wurden mittels Gelelektrophorese und Massen-Standards (MassRuler DNA Ladder, High Range, Fermentas) quantifiziert. Zwei Teile (100 ng) „Wt“-Fragment und 1 Teil (100 ng) Vektor-C-Cp-Fragment der Varianten wurden mit 2,5 U T4-DNA-Ligase (Fermentas) und 2 µl 10x-Puffer in einem 20-µl-Ansatz 1 h bei 22 °C ligiert, gefolgt von 10 min bei 65 °C zur Inaktivierung der Ligase. Zur Transformation von E.-coli-Zellen wurden 10 µl des Ligationsansatzes eingesetzt (4.2.2.4). Zur Testung der transformierten E.-coli-Kolonien wurde zunächst aus Einzelkolonien Plasmid-DNA mittels des Miniprep Kits (NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben präpariert und in 50 µl aufgenommen. 5 µl wurden mit 5 U Kpn2I 1 h bei 37 °C verdaut und in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Positive C/Cp-Klone, die die erwartete Bande des linearisierten Plasmids von ca. 6400 bp zeigten, wurden schließlich zur Kontrolle am ALFexpress-Sequenzierer sequenziert und im Transfektionssystem auf Replikationskompetenz getestet.

Zur Herstellung der Cp-Hybridgenome mit dem Cp von Varianten des Patienten A im „Wt“-Genom A-S1 wurden zunächst die HBV-Genome von „Wt“ und Variante aus dem Vektor pZErO geschnitten und der Cp vom übrigen HBV-Genom getrennt. Dies erfolgte durch gleichzeitige Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen SacI (Fermentas) und Cfr42I ü. N. bei 37 °C:

„Wt” A-S1

Variante

HBV-Plasmid

3 µg

10 µg

SacI

2,0 µl (20 U)

4,0 µl (40 U)

Cfr42I

1,0 µl (10 U)

4,0 µl (40 U)

Puffer B

4,0 µl

4,0 µl

Aqua bidest.

ad 40 µl

ad 40 µl

Der Ansatz wurde mit 5 µl Gelladepuffer versetzt und in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Sowohl das Cp-Fragment der Variante (370 bp) als auch das restliche Genom ohne Cp des „Wt“ (2830 bp) wurden ausgeschnitten und aufgereinigt (siehe Abschnitt 4.2.2.1). Möglichst im Doppelansatz wurden 400 ng des „Wt“-Stücks und 100 ng des Varianten-Cp-Fragments (molares Verhältnis 1:2) mit 5 U T4-DNA-Ligase in einem 20-µl-Ansatz ü. N. bei 4 °C ligiert, gefolgt von 20 min Inaktivierung bei 65 °C. Dieses erste Ligationsprodukt wurde durch Zugabe von 10 U SacI und 2 µl 10x Puffer B und 2 h Inkubation bei 37 °C linearisiert. Nach Zugabe von 3 µl Gelladepuffer wurde die DNA in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und die Bande der korrekt ligierten, kompletten Hybrid-HBV-Genome von 3200 bp wurde ausgeschnitten. Es folgte die Aufreinigung der gesamten DNA über eine Säule des MinElute Gel Extraction Kits (Qiagen) nach Herstellerprotokoll und die Eluation in 10 µl Aqua bidest. Der Vektor pZErO wurde ebenfalls mit 10 U SacI pro µg DNA geschnitten. Nach der Quantifizierung im Gel erfolgte eine 2. Ligation von 150 ng des 1. Ligationsproduktes mit 25 ng pZErO (molares Verhältnis 6:1) mit 0,1 U T4-DNA-Ligase von Invitrogen in einem 20-µl-Ansatz ü. N. bei 14 °C und 10 min Inaktivierung bei 70 °C. Der gesamte Ansatz wurde zur Transformation der E.-coli-Zellen verwendet (siehe Abschnitt 4.2.2.4). Zur Testung der Kolonien wurden je 3 µl einer Mini-Plasmidpräparation mit 5 U Cfr42I und in einem 2. Ansatz mit 10 U EcoRI (Fermentas) 1 h bei 37 °C gespalten. Positive Klone zeigten im 1%igen Agarosegel die erwarteten Banden von 6400 bp nach Cfr42I-Verdau, bzw. von 1850 und 4550 bp nach EcoRI-Verdau und wurden zur Kontrolle sequenziert.

Das C-Gen-Hybridgenom des Patienten A wurde analog zur Klonierung der Cp-Varianten hergestellt, indem zunächst das „Wt“-Genom A-S1 und das Varianten-Genom A-L1k mittels SacI-Verdau aus dem Vektor geschnitten und das C-Gen mittels des Restriktionsenzyms Kpn2I vom übrigen Genom getrennt wurde. In folgendem Ansatz erfolgte der Verdau 4 h bei 37 °C:

„Wt” A-S1

Variante

HBV-Plasmid

3 µg

15 µg

SacI

2,0 µl (20 U)

10,0 µl (100 U)

Cfr42I

1,0 µl (10 U)

5,0 µl (50 U)

Puffer Y

4,0 µl

4,0 µl

Aqua bidest.

ad 40 µl

ad 40 µl

Nach Agarosegelelektrophorese des Verdaus wurden das C-Gen-Fragment der Variante (500 bp) und das Fragment des restlichen „Wt“-HBV-Genoms (2700 bp) ausgeschnitten, aufgereinigt und quantifiziert. Alle weiteren Schritte von der 1. Ligation bis zur Kontrolle der Klone durch Sequenzierung erfolgten wie zur Cp-Klonierung.

Zur Transformation wurden 10 µl der Ligationsprodukte mit 50 µl kompetenter Top10 E.-coli-Zellen (Invitrogen) gemischt, 30 min auf Eis inkubiert und nach 30 s Hitzeschock bei 42 °C (Wasserbad) 2 min auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 250 µl SOC-Medium (Invitrogen) wurde die Mischung 1 h 15 min bei 37 °C und 225 rpm geschüttelt, vollständig auf antibiotikahaltigem Agar ausplattiert (für Vektor pZErO mit 50 mg/ml Kanamycin) und ü. N. bei 37°C inkubiert.

Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in 60 x 15 mm großen Zellkulturschalen mit einer Dichte von 9 x 10⁵ Zellen pro Schale ausgesät. Dazu wurden die Zellen aus mehreren großen Zellkulturflaschen trypsinisiert und gepoolt. Zur Entfernung des Trypsins wurden die Zellen bei Raumtemperatur (RT) für 10 min bei 800 rpm zentrifugiert. Nach dem Abgießen des Mediums wurden die Zellen in 10–20 ml frischem Medium resuspendiert. Durch eine dünne Kanüle wurden die Zellen vereinzelt und während der darauf folgenden Zellzählung ständig aufgeschüttelt. Zur Zellzählung wurden 160 µl PBS, 20 µl Trypanblau und 20 µl Zellsuspension gemischt. Davon wurden 20 µl in die Rosenthal-Zählkammer gegeben. Vier Quadrate wurden ausgezählt und die Summe der Zellen wurde mit 12.480 multipliziert, um die Zellzahl pro ml zu ermitteln. Die Zellsuspension wurde mit Medium auf die gewünschte Konzentration von 9 x 10⁵ Zellen pro Schale gebracht, und 5 ml der Gesamtsuspension pro Schale wurden schneckenförmig ausgesät. Vor der Überführung in den Brutschrank blieben die Schalen noch mindestens 15 min ruhig stehen.

Für die Transfektion wurden die linearen Gesamtgenom-HBV-DNA-Monomere mit 2 U/µg DNA des Restriktionsenzym SapI (New England Biolabs) für 7 h bei 37 °C im Eppendorf Mastercycler aus dem Vektor herausgeschnitten. Nach Kontrolle der vollständigen Restriktion im 1%igen Agarosegel wurde der ungereinigte Restriktionsansatz zur Transfektion eingesetzt.

3–4 h vor der Transfektion wurde das Medium durch frisches Medium mit 2 % FKS ersetzt und das Zellwachstum kontrolliert. Dabei sollte die Konfluenz der Zellen 60–80 % betragen. Zwei Mikrogramm HBV-DNA wurden mithilfe des Polyethylenimins ExGen500 (Fermentas) nach Herstellerangaben transfiziert (HuH7: 2,2 µl pro µg DNA, HepG2: 6,6 µl pro µg DNA). Die Transfektion von 2 µg der leeren pZErO Vektor-DNA diente als Negativkontrolle. Zur Analyse der Replikation wurden die Genome der Varianten mit C-Gendeletion mit 1,6 µg pCore oder dem WtD-Genom zur Komplementation des Core-Proteins kotransfiziert, wobei die Menge transfizierter HBV-Gesamtgenom-DNA immer konstant blieb (2 µg). Ausschließlich bei den HepG2-Zellen erfolgte 1 Tag nach Transfektion ein weiterer Mediumwechsel. Nach 4 (HuH7) oder 5 Tagen (HepG2 und zur Analyse der RNA aus Core-Partikeln) wurden die Zellen geerntet.

Zum Vergleich der Transfektionseffizienz wurde in jeder Schale 1 µg des SEAP-Reporterplasmids kotransfiziert, das für die sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) kodiert [203]. Die SEAP-Enzymaktivität, die proportional zur in die Zelle gelangten DNA ist, wurde im Zellkulturüberstand gemessen. Das geerntete Medium wurde 5 min bei 65 °C erhitzt, um selektiv die endogenen Phosphatasen der Zelle zu inaktivieren, und dann 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert. 50 µl des 1:10 verdünnten Überstandes wurden mit 100 µl SEAP-Puffer (1 mM MgCl₂, 2 M Diethanolamin, 4,5 mg/ml L-Homoarginin) in einer Mikrotiterplatte gemischt. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden 50 µl des frisch angesetzten Substrats p-Nitrophenol-Phosphat (50 mM) dazu gegeben, und anschließend wurde die Lichtabsorption bei 405 nm im Photometer über eine halbe Stunde alle 5 min gemessen. Zwischen den Messungen wurde die Platte immer wieder bei 37°C inkubiert. Die Einzelwerte der Kinetik wurden graphisch über die Zeit dargestellt, wobei die SEAP-Aktivität sich als Änderung der Lichtabsorption pro Minute ausdrückt. Die Steigung im linearen Bereich der Kurve spiegelt die Enzymaktivität und damit die Transfektionseffizienz wider. Nur Transfektionen mit vergleichbaren SEAP-Werten der Proben wurden ausgewertet.

Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen mit 1 ml frisch sterilfiltriertem Lysispuffer (50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, 1 % Nonidet P40) 15 min auf Eis lysiert. Das homogene Lysat wurde in Eppendorf-Gefäße überführt und nach kurzem Vortexen wiederum 15 min auf Eis inkubiert. Zum Abtrennen der Zellkerne wurde die Suspension nochmals gevortext, und nach 10-minütiger Zentrifugation bei RT mit 14000 rpm wurden die Zytoplasma-Überstände sorgfältig abgenommen. Zur weiteren Aufarbeitung der DNA aus zytoplasmatischen Core-Partikeln wurde zunächst ein DNase-Verdau mit 200 µg/ml DNase I und 20 mM MgCl₂ für 30 min bei 37 °C durchgeführt, um die zur Transfektion eingesetzte Input-DNA zu entfernen. Die Reaktion wurde nach Zugabe von EDTA, pH 8, (Endkonzentration 25 mM) für 5 min bei RT gestoppt. Daran schloss sich ein Proteinverdau mit 1 mg/ml Proteinase K und 2 % SDS für 2 h bei 37 °C zur Freisetzung der HBV-DNA aus dem Nukleokapsid an. Die Nukleinsäuren wurden mittels Phenol-Chloroform-Extraktion (1:1) aufgereinigt und aus der wässrigen Phase mit 1/10 Volumen 3 M NaCl und 1 Volumen Isopropanol über Nacht bei −20 °C gefällt. Nach einer Zentrifugation von 40 min bei 14000 rpm und 4 °C wurde das Pellet mit 700 µl eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen (10 min Zentrifugation, 14000 rpm, 4°C), unter Vakuum getrocknet und in 24 µl Tris/EDTA (TE, 10/10 mM) aufgenommen.

Die während des Prozesses der DNA-Isolierung aus zytoplasmatischen Core-Partikeln pelletierten Kerne wurden mit dem Verfahren der alkalischen Lyse zur Isolierung von zirkulärer DNA weiterbehandelt. Das Pellet wurde in 100 µl Lösung I (50 mM Glucose, 25 mM Tris/HCl, pH 8, 10 mM EDTA) resuspendiert, mit 200 µl Lösung II (0,2 N NaOH, 1 % SDS) gemischt und 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III (3 M Kaliumacetat, 11,5 % Essigsäure) und 10 min Inkubation auf Eis wurden Zellkernbruchstücke 10 min bei 14000 rpm abzentrifugiert. Mit dem Überstand wurde ein Proteinverdau wie für die Zytoplasma-DNA, aber ohne Zugabe von SDS durchgeführt, da im Puffer der alkalischen Lyse SDS ausreichend vorliegt. Dann wurden die Nukleinsäuren mittels Phenol-Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung aufgereinigt (siehe Abschnitt 4.2.5). Die Kern-DNA wurde als Kontrolle zur Pyrosequenzierung eingesetzt (siehe Abschnitt 4.2.5.7).

Zur DNA-Isolierung aus extrazellulären Viruspartikeln wurde zunächst das Zellkulturmedium für 30 min bei 8000 rpm (Sorvall SS-34 Rotor) und 4 °C zentrifugiert. Dann wurden 3 ml des Überstandes auf 1 ml 20 % Sucrose in TNE (100 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) geschichtet und für 4 h bei 45000 rpm (TST 60.4 Rotor) und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 µl Tris (50 mM, pH 8) gelöst. Anschließend wurde die DNA analog zur Aufarbeitung aus dem Zytoplasma mit DNase und Proteinase behandelt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und gefällt.

Zur Ernte von Gesamt-RNA wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS in 1 ml TRIZOL® Reagent (Invitrogen) lysiert und nach Herstellerprotokoll aufgearbeitet. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform, 10 s vortexen und 3 min Inkubation bei RT wurde das Lysat bei 12000 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Die RNA im wässrigen Überstand wurde mit Glykogen (20 mg/ml) und 500 µl Isopropanol präzipitiert, durch Zentrifugation pelletiert, mit 75 % und 100 % Ethanol gewaschen und in 100 µl DEPC-Wasser gelöst. Daraufhin wurde das RNA-Isolat bis zur Konzentrationsmessung und zur Analyse im Northern Blot bei −70 °C aufbewahrt. Die Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA erfolgte durch Messung der Absorption bei 260 nm in einer 1:100-Verdünnung in DEPC-Aqua-bidest. im Photometer.

Für die Aufreinigung der prägenomischen HBV-RNA aus intrazellulären Core-Partikeln für die Pyrosequenzierung wurde zunächst das Zytoplasma der Zellen 5 Tage nach Transfektion wie oben beschrieben gewonnen. Die Isolierung der Core-Partikel erfolgte nach Yuan et al. [209] mit kleinen Veränderungen. Die Zytoplasma-Probe wurde auf 20 mM MgCl₂ und 8 mM CaCl₂ eingestellt und mit 30 U Micrococcus-Nuklease (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, USA) und 200 µg DNase I pro ml für 1 h bei 37 °C behandelt. Die Core-Partikel wurden mit 330 µl 26 % PEG 8000 in 1,5 M NaCl und 60 mM EDTA für 1 h bei 4 °C gefällt. Nach 4-minütiger maximaler Zentrifugation in einer Tischzentrifuge wurde der Überstand sorgfältig abgenommen und der Schritt mit einer weiteren 30-s-Zentrifugation wiederholt. Das Pellet wurde in 100 µl TE-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde die RNA mittels TRIZOL® isoliert und mit 3,4 U RNAse-freier DNase (Qiagen) 10 min bei RT verdaut, gefolgt von ihrer Inaktivierung für 10 min bei 65 °C und 2 mM EDTA. Für die Pyrosequenzierung wurden 10 µl der RNA-Probe in einem 20-µl-Ansatz mit 0,375 mM dNTP, 0,5 mM DTT, 15 ng/µl N6 Primer, 1 U/µl Rnasin und 5 U/µl MLV Reverser Transkriptase für 10 min bei 25 °C, 10 min bei 42 °C und 6 min bei 96 °C revers transkribiert.

Die Analyse der viralen Replikation wurde u. a. mittels Southern Blot [210] der aus zytoplasmatischen Core-Partikeln isolierten replikativen Intermediate durchgeführt.

Die aufgereinigten replikativen Intermediate der Hälfte der Ernte einer Schale (HuH7) bzw. von 5/6 der Ernte (HepG2) wurden in einem 1,5%igen Agarosegel mit autoklaviertem TBE als Laufpuffer elektrophoretisch über Nacht bei 20–35 V aufgetrennt. Als Molekulargewichtsmarker wurde der Digoxigenin (Dig)-markierte DNA-Marker VII (Roche) verwendet. Als HBV-spezifischer Marker diente ein 1:1000 verdünntes Reaktionsprodukt aus einzel- und doppelsträngiger linearer HBV-DNA, das durch asymmetrische PCR eines HBV-Gesamtgenoms hergestellt worden war.

Der Elektrophorese folgte die Denaturierung der DNA im Gel durch 2 x 15 min Schütteln in Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) und anschließend die Neutralisierung für 2 x 15 min in Neutralisierungslösung (0,5 M Tris, 3 M NaCl, pH 7,4) und kurz in Aqua bidest. Mittels Kapillarblot mit 20 x SSC wurde die DNA auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche) geblottet und dort nach Spülen mit 2 x SSC mit einem UV-Crosslinker fixiert. Entweder wurde der Blot nun getrocknet und staubfrei aufbewahrt oder es wurde gleich mit der Hybridisierung, basierend auf dem DIG Luminescent Detection Kit (Roche), fortgefahren.

Die Membran wurde mit der Oberseite nach innen in eine Hybridisierungsflasche überführt und mit 20 ml frisch angesetzter sterilfiltrierter und vorgewärmter Hybridisierungslösung (5 x SSC, 0,1 % [w/v] N-Lauroylsarcosin, 1 % [w/v] Blocking Reagenz [Test-Kit, Roche], 0,02 % [w/v] SDS) mindestens 4 h bei 68 °C im Hybridisierungsofen prähybridisiert. Danach fand über Nacht bei 68 °C die Hybridisierung mit der HBV-Gesamtgenomsonde statt, die folgendermaßen hergestellt wurde: 20 µg der HBV-Gesamtgenom-DNA eines Genotyp-A-Wt-Genoms (EMBL-Nr. L13994) wurden in einem 200-µl-Ansatz mit 6 µl EcoRI (10 U/µl, MBI Fermentas) bei 1 h Verdau (22 °C) und 5 min Inaktivierung (65 °C) aus dem Vektor pUC geschnitten. Die gesamte Restriktion wurde durch Gelextraktion (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen) nach dem Herstellerprotokoll aufgereinigt und die Konzentration des Eluats in 10 µl EB-Puffer (Kit) wurde in einem 1%igen Agarosegel mit Hilfe von 2, 4 und 8 µl der High DNA Mass Ladder (GibcoBRL) bestimmt. Die gewonnene DNA wurde mit der random-priming-Methode (DIG DNA Labeling Kit, Roche) nach dem Herstellerprotokoll in einer 20-h-Reaktion Dig-markiert. Die Sensitivität der Sonde wurde in einem Dot Blot getestet. 400–500 ng der Sonde in 10 ml Hybridisierungslösung wurden vor jeder Hybridisierung durch 10-minütiges Kochen im Wasserbad denaturiert. Danach kam die nun einzelsträngige Sonde sofort auf Eis und so schnell wie möglich in die Hybridisierungsflasche zur Membran, nachdem die Hybridisierungslösung zur Prähybridisierung entfernt worden war. Nach der Hybridisierung wurde die Sonde abpipettiert, eingefroren und bis zu 15-mal wiederverwendet.

Überschüssige und unspezifisch an der Membran gebundene Sonde wurde durch Behandlung der Membran für 2 x 5 min mit 60 ml Waschlösung 1 (2 x SSC, 0,1 % SDS) bei RT und für 2 x 20 min mit 30 ml vorgewärmter Waschlösung 2 (0,1 x SSC, 0,1 % SDS) bei 68 °C im Hybridisierungsofen entfernt. Danach folgte die Detektion in einer Plastikschale auf einem Wiegeschüttler bei RT. Nach einem 5-minütigen Waschschritt mit Waschlösung 3 (0,03 % Tween-20 in P1-Puffer [0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5]) wurde die Membran 30 min in P2-Puffer (1 % Blocking-Reagent in P1) geschüttelt. Dann folgten 30 min bis 1 h Inkubation mit dem 1:10000 in 20 ml P2-Puffer verdünnten, mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper (Anti-DIG-AP, Roche), der die Dig-markierte Sonde erkennt. Nach weiteren 2 x 15 min in Waschlösung 3 erfolgte die Äquilibrierung der Membran in Substratverdünnungspuffer (0,1 M Diethanolamin, 1,0 mM MgCl_2, pH 9,5) für 5 min. Die Membran wurde dann im Hybridisierungsbeutel mit 60 µl CDP-Star (1,2-Dioxetan, Tropix), eines Substrats der alkalischen Phosphatase, in 3 ml Subtratverdünnungspuffer benetzt. Nach 5–10-minütiger, lichtgeschützter Inkubation bei 37 °C wurde die Lösung abpipettiert und nach zwischenzeitlichem Einfrieren bis zu 3-mal wiederverwendet. Die resultierende Chemilumineszenz wurde in der DIANA-CCD-Kamera detektiert, und die Intensität der Banden, dargestellt als (optische Dichte – Hintergrund)/mm², mit dem dazugehörigen Programm „TINA 2.0“ (Raytest) bestimmt.

Die Analyse der viralen RNA-Transkripte erfolgte im Northern Blot, der bis auf RNA-bedingte Veränderungen analog zum Southern Blot durchgeführt wurde. Wie auch bei der RNA-Ernte wurden alle Lösungen mit DEPC-Wasser angesetzt.

Um Kontaminationen durch RNasen zu verhindern, wurden Elektrophoresekammer und -zubehör (Schlitten, Kamm) mit 0,5 % SDS gewaschen, anschließend mit DEPC-Wasser und Ethanol gespült und dann getrocknet. Das 1,2%ige Formaldehyd (FA)-Agarosegel (1,2 g Agarose in FA-Puffer [200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, pH 7, sterilfiltriert], Zugabe von 12,3 M FA nach dem Schmelzen) wurde vor der Elektrophorese mindestens 30 min in 1 x FA-Laufpuffer (12,3 M FA in FA-Puffer) äquilibriert. 10 µg RNA wurden mit Ladepuffer (5 x Ladepuffer: 16 µl gesättigte Bromphenolblaulösung, 80 µl EDTA [500 mM, pH 8], 720 µl Formaldehyd [FA, 12,3 M], 2 ml 100%iges Glycerol, 3,08 ml Formamid, 4 ml 10 x FA-Puffer) 10 min bei 65 °C inkubiert, dann auf Eis gestellt und aufgetragen. Als Marker dienten 20 ng des Dig-markierten RNA-Längenstandards II (Roche). Das Gel lief 3 h bei 85 V unter einem Abzug.

Für den Blot wurde das Gel 2 x 15 min in 20 x SSC gewaschen. Der Northern Blot, Hybridisierung, stringente Waschschritte und Detektion wurden wie beim Southern Blot durchgeführt (Abschnitt 4.2.5.5). Die HBV-spezifische RNA-Sonde wurde mit Hilfe des DIG RNA Labeling Kits (Roche) aus dem gleichen Genotyp-A-Wt-Genom (EMBL-Nr. L13994) wie die Southern-Blot-Sonde hergestellt. 10 µg Plasmid-DNA wurden mit 0,2 U des Restriktionsenzyms HindIII geschnitten (Verdau 7 h 37 °C, Inaktivierung 10 min 65 °C), so dass das HBV-Genom mit dem das Genom flankierenden T7-Promotor des Vektors freigesetzt und linearisiert wurde. Die DNA wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigt, ihre Konzentration im Agarosegel bestimmt und 1 µg der gereinigten DNA für die Dig-Markierung mit der T7-Polymerase verwendet. Die Sensitivität der Sonde wurde im Dot Blot getestet. Zum Einsatz gelangten 2 µg markierter Sonde pro 10 ml Hybridisierungslösung. Zur Kontrolle, dass gleiche Mengen an RNA auf das Gel aufgetragen wurden, erfolgte parallel der Nachweis von β-Aktin mittels einer Dig-markierten Aktin-Sonde (Roche) in der Konzentration von 1 µg Sonde pro 10 ml Hybridisierungslösung. Da die Bande der β-Aktin-mRNA auf gleicher Höhe wie die der HBV-mRNA läuft, wurde der Nachweis auf einem zweiten, identisch behandelten Blot geführt.

Der Nachweis der häufigsten gespleißten RNA vom Typ 1 (SP1) erfolgte nach der von Ehlers et al. beschriebenen Methode [60]. 10 µg Gesamt-RNA wurden in einem 1%igen FA-Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran (Osmonics, Westborough, USA) geblottet. Die Northern Blots wurden ü. N. bei 68 °C mit einer ³²P-markierten RNA-Sonde hybridisiert, die die nt 2021–2755 des HBV-Genoms umfasst, und somit die pgRNA, präC und SP1-RNA, aber nicht die subgenomischen Oberflächen-RNAs detektiert. Die Sonde wurde durch in-vitro-Transkription von einem mittels PCR generierten DNA-Fragment mit T7-RNA-Polymerase-Promotor synthetisiert. Dabei diente das HBV-Expressionsplasmid pCH-9/3091 (H. Schaller, Heidelberg) als Ausgangsmaterial für die PCR mit dem antisense-Primer (5'-ccatcga taa tac gac tca cta tag GGT GTA AAT AGT GTC TAG TTT GG'), der die T7-RNA-Polymerase-Promotor-Sequenz (fett gedruckt) und die HBV-Sequenz von nt 2734–2755 (Großbuchstaben) enthält, sowie dem sense-Primer mit der HBV-Sequenz von nt 2021–2041 (5'-AAG CCT TAG AGT CTC CTG AGC-3'). Das Auftragen gleicher RNA-Mengen wurde zusätzlich durch Hybridisierung der Blots mit einer ³²P-markierten, in-vitro-transkribierten antisense Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)- oder antisense Histon-2A-Sonde kontrolliert [60]. Die Blots wurden auf Fuji-Imager-Platten entwickelt. Die Signale wurden mit dem Fujix BAS 2000 Bio-Imaging Analyzer (Fuji, Japan) quantifiziert und mit der TINA-Software analysiert.

Um in den Kotransfektionsexperimenten den Anteil von WtD und Variante an den während der Replikation synthetisierten viralen Nukleinsäuren zu bestimmen, wurde eine quantitative Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP)-Analyse mittels Pyrosequenzierung etabliert. Zur Differenzierung diente ein SNP an Nukleotidposition 1850 der HBV-Sequenz, an der das WtD-Genom ein T, Genome des Genotyps A und somit auch der Varianten dagegen ein A tragen (Abb. 4.1). Die Analyse wurde mit pgRNA und replikativen Intermediaten aus zytoplasmatischen Core-Partikeln (zur Isolierung siehe Abschnitte 4.2.5.4 und 4.2.5.1), mit HBV-DNA aus extrazellulären Partikeln (Abschnitt 4.2.5.3) sowie mit DNA aus den Zellkernen (Abschnitt 4.2.5.2) durchgeführt.

Das Prinzip der Methode [211] beruht auf der Detektion von während einer Sequenzierreaktion freigesetztem Pyrophosphat (PPi), das durch eine Kaskade enzymatischer Reaktionen in einen zur Anzahl der inkorporierten Nukleotide proportionalen, messbaren Lichtblitz umgewandelt wird (Abb. 4.2). Nach Bindung des Sequenzierprimers an ein einzelsträngiges PCR-Produkt entsteht durch Einbau eines passenden Nukleotids mittels der DNA-Polymerase das PPi, welches durch die ATP-Sulfurylase im Ansatz in ATP umgewandelt wird. ATP liefert der Luciferase die nötige Energie zur Oxidierung von Luciferin zu Oxyluciferin. Das dadurch erzeugte Lichtsignal wird mit einer CCD-Kamera detektiert und als Peak im Pyrogramm dargestellt. Die Nukleotide in Form von Desoxynukleosid-Triphosphaten werden dem Reaktionsansatz nacheinander in einer durch die Sequenz bestimmten Reihenfolge zugegeben. Vor dem Zufügen des nächsten Nukleotids werden nicht eingebaute Nukleotide durch das Enzym Apyrase abgebaut, so dass das Lichtsignal tatsächlich proportional zur inkorportierten Menge eines bestimmten Nukleotids ist.

Abbildung 4.1: Aufbau des quantitativen SNP-Assays zur Differenzierung von WtD und Varianten.

A: Schematisch sind Teile des Cp- und C-Gen-Bereichs des HBV-Genoms dargestellt. Die quantitative Analyse basiert auf einem Nukleotidpolymorphismus zwischen HBV-Genomen des Genotyps D (wtD = T) und des Genotyps A (Varianten = A) bei nt 1850 (grüne Ellipse). Zunächst wird in einer PCR mit den angegebenen Vorwärts- und Rückwärts-Primern ein Fragment von ca. 200 bp amplifiziert. Eine Amplifkation der zur Transfektion verwendeten linearen Input-HBV-DNA ist nicht möglich, da diese am nick (rot) in den Vektor kloniert war und dort zerschnitten wurde. Nur rezirkularisierte DNA (wie z. B. im Kern oder als replikative Intermediate) kann amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird in die quantitative Pyrosequenzierung mit dem Sequenzierprimer (hellblau) eingesetzt, der direkt vor dem Polymorphismus bindet. B: Die Positionen der für die PCR verwendeten Primer sind nochmals an einem Ausschnitt der partiell doppelsträngigen rcDNA dargestellt. Im Gegensatz zur linearen Input-DNA werden neben rezirkularisierten Genomen auch replikative DNA-Intermediate trotz des nicks im Genom aufgrund des durchgängigen DNA-Plusstrangs amplifiziert. Direct repeats DR1 und DR2 und nick sind gekennzeichnet.

Zur quantitativen Analyse der HBV-DNA wurde 1 µl der Probe (replikative Intermediate: 1:20-Verdünnung der halben Ernte einer Zellkulturschale, pgRNA und extrazelluläre DNA: unverdünnte Probe aus einer Zellkulturschale, Kern-DNA: 1:20-Verdünnung der Ernte einer Zellkulturschale) in eine PCR mit dem Vorwärtsprimer 5'-AGCAATGTCAACGACCGAC-3' (nt 1676–1690) und dem Biotin-markierten Rückwärtsprimer 5'-Biotin-CACAGCTTGGAGGCTTGAAC-3' (nt 1862–1881) eingesetzt.

Abbildung 4.2: Prinzip der Pyrosequenzierung (A) und resultierendes Pyrogramm (B).

A: Bei der Pyrosequenzierung führt das beim Nukleotid-Einbau freiwerdende Pyrophosphat (PPi) durch eine enzymatische Reaktionskaskade zu einem Lichtblitz, der proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide ist. Die Apyrase sorgt für den schnellen Abbau nicht inkorporierter Nukleotide. Für detaillierte Erklärungen siehe Text. (aus www.pyrosequencing.com). B: Die Lichtblitze der Pyrosequenzierung werden mit einer CCD-Kamera detektiert und in einem Pyrogramm dargestellt. Gezeigt ist beispielhaft das Pyrogramm einer beliebigen Pyrosequenzierung von replikativen Intermediaten des HBV mit dem entwickelten SNP-Assay. Im Diagramm sind die Intensitäten der Lichtblitze bei aufeinanderfolgender Zugabe von Enzym (E), Substrat (S) und den Nukleotiden in der festgelegten Reihenfolge zu sehen. Aus der Höhe der beiden Peaks des T/A-SNPs (gelb unterlegt) werden von der integrierten Software die prozentualen Anteile von T (WtD) und A (Variante) in der DNA-Mischung berechnet, die über dem Diagramm angegeben sind. Die vor und nach dem T/A-SNP zugegebenen Nukleotide C und G können nicht an die DNA binden und dienen somit zur Kontrolle unspezifischer Bindungen. Die letzten 5 Nukleotide werden dagegen entsprechend der tatsächlichen Basensequenz zugegeben und fungieren als Kontrolle der gesamten Pyrosequenzierreaktion.

Diese PCR schließt eine Amplifikation der linearen HBV-Input-DNA aus, die zur Transfektion aus dem Vektor geschnitten wurde, da die Primer auf unterschiedlichen Seiten des nicks liegen, über den die monomeren HBV-Genome in den Vektor kloniert wurden. Nur rezirkularisierte Genome (z. B. im Kern), die von diesen transkribierte pgRNA (nach Umschreibung in cDNA) oder die replikativen Intermediate können amplifiziert werden (Abb. 4.1). Die Reaktion in 25µl-Ansätzen (0,5 U Taq, 2 mM MgCl₂, 0,2 µM Vorwärtsprimer, 0,2 µM Rückwärtsprimer, 0,48 mM dNTPs) lief 5 min bei 95 °C, 40 Zyklen mit 15 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 30 s bei 72 °C und abschließend 5 min bei 72 °C. Der Erfolg der PCR wurde in einem 2%igen Agarosegel kontrolliert. Nur bei einer starken Bande von 205 nt und somit einer großen Menge des gewünschten PCR-Produkts wurde mit der Pyrosequenzierung fortgefahren.

Für die anschließende Pyrosequenzierung wurde der SNP Reagent Kit 5 x 96 (Biotage, Uppsala, Schweden) und entweder das Pyrosequencing PSQ^TM 96 System oder das PSQ^TM HS 96 System (Biotage) mit den entsprechenden Geräten verwendet, bei denen sich hauptsächlich die Art der Aufreinigung des Biotin-markierten PCR-Einzelstrangs unterschied. Beim PSQ^TM 96 System wurden, wie bei Uhlmann et al. [212] beschrieben, die DNA-Stränge des PCR-Produkts mit magnetischen, Streptavidin-gekoppelten Dyna-Beads (Dynal A.S., Oslo, Norwegen) getrennt. Dazu wurden die gesamten 25 µl des PCR-Produkts, 33 µl 2 x Binding-Washing-Puffer (BW-Puffer, siehe Kit) und 8 µl Dyna-Beads in den Wells einer 96er-Platte gemischt und bedeckt mit einer Thermowell-Matte 15 min bei 65°C in einem Thermomixer inkubiert. Dies diente der Anlagerung der Streptavidin-gekoppelten Dyna-Beads an den biotinylierten Primer/DNA-Strang. Mithilfe eines speziellen Magneten (PSQ 96 Sample Prep Tool) wurden die Beads und die angelagerten PCR-Produkte zum 1-minütigen Denaturieren der DNA in eine zweite Platte mit 50 µl 0,5 M NaOH transferiert. Danach wurde der an die Beads gekoppelte DNA-Einzelstrang auf gleiche Weise zum Waschen in eine Platte mit 100 µl Annealing-Puffer (AB-Puffer, siehe Kit) überführt. Schließlich erfolgte in einer weiteren Platte die Hybridisierung des biotinylierten DNA-Strangs mit 1 µl des 10 µM Sequenzierprimers (5'-CTGCCTAATCATCTCTTGT-3', nt 1831–1849) in 40 µl AB-Puffer pro Well für 2 min bei 80 °C. Der Sequenzierprimer bindet direkt vor dem zur Differenzierung verwendeten SNP bei nt 1850 an die HBV-DNA (Abb. 4.1). Nach dem Abkühlen auf RT wurde diese Platte in die Pyrosequenzierung eingesetzt.

Für das PSQ^TM HS 96 System wurden die DNA-Stränge durch Kopplung an Sepharose und die Anwendung einer Vakuum-Apparatur getrennt. 15 µl PCR-Produkt wurden in einer 96-well-Platte mit 2 µl Sepharose-Beads, 40 µl 2 x BW-Puffer und 28 µl Aqua bidest. 5 min bei 1000 rpm geschüttelt, so dass eine Anlagerung der Proben an die Beads erfolgte. Anschließend wurden die Beads mit einer an eine Vakuumpumpe angeschlossenen Filtervorrichtung (PyroMark Vacuum Prep Tool) angesaugt und jeweils 5 s in 70%igen Ethanol, 0,2 M NaOH und Waschpuffer gehalten. Daraufhin wurde die Vakuumpumpe abgeschaltet, und die Beads mit dem biotinylierten DNA-Einzelstrang wurden in einer Platte mit 11,64 µl AB-Puffer und 0,36 µl Sequenzierprimer (10 µM) pro Well durch leicht kreisende Bewegungen abgeschüttelt. Die Hybridisierung erfolgte wie beim PSQ^TM 96 System für 2 min bei 80 °C.

Für beide Systeme wurden gleichermaßen Enzym und Substrat des SNP Reagent Kits bei RT in je 620 µl Reinstwasser gelöst und mit je 200 µl der 4 Desoxynukleosid-Triphosphate in die vorgesehene Kartusche des Pyrosequenzier-Automaten gefüllt. Während des Laufs wurden der Sequenzierreaktion zunächst Enzym und Substrat und anschließend die Nukleotide in der Reihenfolge CTAGCATGT zugegeben. Im resultierenden Pyrogramm (Bsp. in Abb. 4.2) wurden aus der Höhe der entscheidenden, beiden Peaks des T/A-SNPs (fett gedruckt) von der integrierten Software die prozentualen Anteile von T (WtD) und A (Variante) in der Mischung berechnet. Die Zugabe der übrigen Nukleotide vor und nach dem eigentlichen SNP diente zur Funktionskontrolle des Assays. Für jede Probe wurden 3 unabhängige PCR-Ansätze und Pyrosequenzierreaktionen durchgeführt, deren Mittelwerte an einer Eichgerade normalisiert wurden. Die Eichgerade wurde für jedes PSQ-System mit bekannten Mischungen der PCR-Produkte von nur WtD- und nur Variante-transfizierten Zellen erstellt.

Nach Kotransfektion von Variante und WtD wurde die Höhe der Varianten-Replikation in der Mischung der replikativen Intermediate im Vergleich zum allein transfizierten WtD (100 %) berechnet, indem die Höhe der Gesamtreplikation relativ zum WtD (Southern Blot) mit dem Anteil der Variante an den replikativen Intermediaten (Pyrosequenzierung) multipliziert wurde.

Die so ermittelte Varianten-Replikation wurde weiter verwendet, um den Level der replikativen Intermediate der Varianten in Relation zur Menge der ursprünglich transfizierten Varianten-DNA im Gemisch zu betrachten und folgendermaßen zu berechnen:

(% Varianten-Replikation relativ zum WtD alleine) / (% transfizierte Varianten-DNA)

Auf die gleiche Weise wurden die Replikation des WtD im Gemisch und der Level der replikativen Intermediate des WtD im Vergleich zur transfizierten WtD-DNA bestimmt.

Die Anreicherung der replikativen Intermediate der Variante im Vergleich zum WtD wurde ermittelt, indem das Verhältnis von Variante zu WtD in replikativen Intermediaten (erhalten durch Pyrosequenzierung) mit dem transfizierten Verhältnis verglichen wurde:

Entsprechend wurde die Anreicherung der Varianten in der verpackten pgRNA aus intrazellulären Core-Partikeln und in der DNA aus extrazellulären Viruspartikel im Zellkulturmedium berechnet. Durch Pyrosequenzierung von nukleärer DNA wurde sicher gestellt, dass die im Kern vorhandenen Anteile von WtD- und Varianten-DNA tatsächlich den transfizierten DNA-Anteilen entsprachen.

Die Primer-Extension-Analysen wurden zur Differenzierung der beiden Cp-Transkripte pgRNA und präC-mRNA durchgeführt, die sich an ihrem 5'-Ende um 30 nt unterscheiden. Das Prinzip der Methode beruht darauf, einen ca. 100–200 nt vom 5'-Ende der RNA entfernt bindenden Primer mittels Reverser Transkriptase bis zum 5'-Ende zu verlängern. Die doppelsträngigen Reaktionsprodukte, deren Größe sich je nach Position des 5'-Endes unterscheidet, werden dann in einem hochauflösenden Gel aufgetrennt und detektiert. Im vorliegenden Fall wurde das Assay für die Auftrennung und Detektion der Produkte im ALFexpress-Sequenzierer etabliert. Zehn Pikomol eines Cy5-markierten Primers (nt 1974–1950, 5'-Cy5-GGA AAG AAG TCA GAA GGC AAA AAC G-3') wurden 1 h lang mit 20 µg Gesamt-RNA von transfizierten HuH7-Zellen bei −70 °C in 0,1 Volumen Natrium-Actetat (3 M, pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol kopräzipitiert und 10 min bei 14000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge) bei 4 °C zentrifugiert. Nach Waschen des Pellets mit 70%igem Ethanol, nochmaliger Zentrifugation und sorgfältigem Entfernen des Ethanols wurde das Kopräzipitat in 8 µl TE (10/10 mM, pH 7,6) resuspendiert. Es wurden 2,2 µl KCl (1,25 M) zugegeben, und einer Denaturierung bei 85 °C für 10 min im Thermoblock folgte die Hybridisierung durch langsames Abkühlen auf 45°C (ca. 2 h). Die Primer wurden nach Zugabe von 24 µl Primer-Extension-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 10 mM MgCl₂, 4,8 mM dNTPs, 50 µg/ml Actinomycin D, 10 mM DTT, 0,1 U/µl RNasin (Roche, Mannheim), 6 U/µl M-MLV Reverse Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) für 1 h bei 42 °C elongiert. Die Reaktionsprodukte wurden zum Verdau der einzelsträngigen RNA 10 min bei RT mit 1 µl 10 M NaOH inkubiert, mit 3,5 µl Natrium-Acetat (3 M) neutralisiert und nach Zugabe von 150 µl TE und 0,1 M NaCl mit 200 µl Phenol-Chloroform extrahiert. Dazu wurde die Lösung 30 s gevortext, 5 min bei RT und 14000 rpm zentrifugiert. Der oberen, wässrigen Phase wurden zur Fällung der Nukleinsäuren 50 µl 10 M Ammonium-Acetat und 700 µl Ethanol 1 h bei −70 °C zugegeben, gefolgt von 10 min Zentrifugation bei 4 °C bei 14000 rpm. Das Pellet wurde nach dem Waschen mit 70 % Ethanol in Ladepuffer (Stop-Lösung, ALFexpress AutoRead Sequencing Kit) gelöst, 8 min bei 95 °C denaturiert und in einem 8%igen Polyacrylamid-Gel mit 5,8 M Harnstoff (auf 60 ml: 21 g Harnstoff, 25 ml H₂O, 5 ml 10 x TBE, 11,4 ml RapidGel-XL-40 % Konzentrat [USB, Cleveland, Ohio, USA]) im ALFexpress-Sequenzierer aufgetrennt. Als Längenstandard wurde ein HBV-Referenz-Genom des Genotyps A (EMBL-Nr. L13994), das nicht über die nick-Region, sondern über die EcoRI-Schnittstelle in den Vektor pUC kloniert wurde, mit denselben Primern und dem AutoRead Sequencing Kit sequenziert und aufgetragen. Die Signalintensitäten der Banden von pgRNA und präC-mRNA im Gelbild wurden mit der TINA 2.0 Software quantitativ ausgewertet.

Zur Analyse des Verhältnisses von replikativen DNA-Intermediaten, die durch reverse Transkription von gespleißter SP1-RNA bzw. ungespleißter pgRNA entstanden, wurden Wt-Genome, Wt-ähnliche Klone, komplexe Varianten der Patienten A und B sowie eine C/Cp-Hybridvariante in HuH7-Zellen transfiziert. Komplexe Varianten und Hybridvariante wurden mit pCore kotransfiziert. Nach 4 Tagen wurde die DNA aus zytoplasmatischen Core-Partikeln isoliert (siehe Abschnitt 4.2.5.1) und mittels PCR analysiert.

Mit den Primern p6 (nt 2363–2386, 5'-GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT-3') und p15 (nt 716–738, 5'-ATAACTGAAAGCCAAACAGTGGG-3') wurde ein Stück der replikativen Intermediate amplifiziert, das das Intron der SP1-RNA enthielt. Die PCR lief in 50-µl-Ansätzen (25 µl Tempase Hot Start Mix [Biomol], jeweils 5 µl der beiden Primer [10 µM], 1 µl Betain Enhancer Solution [Biomol], 9 µl Aqua bidest.) mit 5 µl verschiedener DNA-Verdünnungen (1:10 bis 1:50) 15 min bei 94 °C, 30 Zyklen mit 1 min bei 94 °C, 1 min bei 68 °C und 3 min bei 72 °C und abschließend 6 min bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden in einem 1%igen Agarosegel mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid (Roth) aufgetrennt. Dabei wurde in allen Proben zusätzlich zu den erwarteten Banden der von ungespleißter pgRNA umgeschriebenen DNA (1596 bp) und der SP1-abgeleiteten DNA (340 bp) eine weitere Bande bei ca. 550 bp nachgewiesen. Die Bandenintensitäten wurden im digitalen Gelbild mit dem TINA-Programm ausgewertet.

Um die Herkunft des PCR-Produkts von ca. 550 bp zu klären, wurde die Bande aufgereinigt, kloniert und sequenziert. Dazu wurden zunächst 10 µl der PCR-Reaktion des A-L1k-C/Cp-Hybridgenoms, bei dem die Bande am stärksten war, in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, die entsprechende Bande wurde ausgeschnitten und mit dem MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Die DNA wurde in 10 µl Aqua bidest. eluiert.

Dann erfolgte die Klonierung der DNA in den TOPO-Vektor mit dem TOPO-TA-Klonierungskit (Invitrogen) nach Herstellerangaben. Diese Klonierung nutzt die Tatsache, dass in einer normalen PCR die Taq-Polymerase an den 3'-Enden des Produkts einen Überhang eines A’s produziert, zur Integration des Produkts in einen Vektor mit dem Überhang eines T’s. Drei Mikroliter der gereinigten DNA wurden in einem 5-µl-Ansatz (inklusive 1 µl Salzlösung und 1 µl Aqua bidest.) 5 min bei RT mit 1 µl des TOPO-Vektors ligiert. Zur Transformation wurden 2 µl des Ligationsprodukts mit 50 µl kompetenter Top10 E.-coli-Zellen (Invitrogen) gemischt, 5 min auf Eis inkubiert und nach 30 s Hitzeschock bei 42 °C (Wasserbad) 2 min auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 250 µl SOC-Medium (Invitrogen) wurde die Mischung 1 h bei 37 °C und 225 rpm geschüttelt. 150 µl wurden auf Kanamycin-haltigem Agar ausplattiert (50 mg Kanamycin/ml) und ü. N. bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA aus Einzelkolonien wurde mit dem Miniprep Kit (NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben präpariert und in 50 µl Aqua bidest. aufgenommen. Zur Testung der transformierten E.-coli-Kolonien wurden 3 µl der Plasmidpräparation mit 5 U EcoRI 1 h bei 37 °C verdaut und in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Positive Klone zeigten 2 Fragmente von 3900 bp und 600 bp.

Die Sequenzierung des PCR-Produktes von 550 bp in positiven Klonen erfolgte in einem LI-COR-DNA-Sequenzierer mit den im Vektor ansetzenden Primern „universal“ und „revers“. Für die Sequenzierreaktion wurde der Thermosequenase DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit (Amersham) nach Herstellerangaben mit je 2 pmol der Primer, 3 µl DMSO und 2 µl der Mini-Plasmidpräparation verwendet. Die Produkte wurden in einem 4%igen Polyacrylamid-Gel mit 5,8 M Harnstoff (auf 60 ml: 21 g Harnstoff, 25 ml H₂O, 5 ml 10 x TBE, 5,7 ml RapidGel-XL-40 % Konzentrat [USB, Cleveland, Ohio, USA]) aufgetrennt. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit der Lasergene Software (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin, USA).

Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die transfizierten HuH7-Zellen in 1,5 ml PBS mit einem Zellschaber von der Schale gelöst, in ein Eppendorf-Gefäß überführt und 5 min bei 3000 x g und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 5 Volumen Suspensions-Puffer (0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,001 M EDTA (pH 8), 1 µg/ml Aprotinin, 100 µg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]) aufgenommen. Gleiche Proteinkonzentrationen in jeder Probe wurden mit der Bradford-Methode nachgewiesen. Die gleiche Menge 2 x SDS-Gelladepuffer (100 mM Tris-HCl (pH 6,8), 200 mM Dithiothreitol, 4 % SDS, 0,2 % Bromphenolblau, 20 % Glyzerol) wurde zugegeben, die Proben 10 min gekocht und 10 min bei 14000 rpm und RT zentrifugiert. Der proteinhaltige Überstand wurde abgenommen und bei −20 °C bis zur Western-Blot-Analyse gelagert.

Zum Nachweis der HBV-Oberflächenproteine und des Core-Proteins im Zellysat wurden 30 µl der Proteinproben in einem 15%igen Polyacrylamid-SDS-Gel aufgetrennt (8–9 cm ins Trenngel gelaufen, 175 V, ca. 4 h) und mittels Semi-Dry-Blotting auf eine Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membran (Roche) transferiert. Dazu wurde das Gel zunächst einige Minuten in Kathodenpuffer (25 mM Tris [pH 9,4], 20 % Methanol, 150 mM Glycin) getränkt und die PVDF-Membran kurz in Methanol, anschließend 1–2 min in Wasser und schließlich einige Minuten in Anodenpuffer II (25 mM Tris [pH 10,4], 20 % Methanol) gespült. In einer Elektroblotting-Apparatur wurde das Gel auf 3 Lagen in Kathodenpuffer getränkter Filterpapiere positioniert, mit der PVDF-Membran, 2 Lagen in Anodenpuffer II (25 mM Tris [pH 10,4], 20 % Methanol) und 2 Lagen in Anodenpuffer I (0,3 M Tris [pH 10,4], 20 % Methanol) getränkter Filterpapiere bedeckt und nach dem Auflegen der Deckplatte mindestens 1 h bei 1 mA pro cm² geblottet. Danach wurde die Membran mindestens 2 h in 4%iger Magermilch in PBS/0,05 % Tween geschüttelt und 3 x in PBS/Tween gewaschen. Zum Nachweis der HBV-Oberflächenproteine LHBs, MHBs und SHBs und von β-Aktin zur Ladekontrolle folgten 4 h Inkubation auf dem Schüttler mit dem primären Antikörper in 1 % Magermilch in PBS/Tween (siehe Tab. 4.3, MA 18/7 2 µg/ml, F6 1 µg/ml, Anti-HBs 1 µg/ml und Anti-β-Aktin 1:10000), während zum Nachweis des Core-Proteins der Primär-Antikörper (Anti-CoreSN, nativ 1:2000) 2 x 1 h jeweils im Wechsel mit dem 2. Antikörper inkubiert wurde. Nach 3 x Waschen in PBS/Tween wurde die Membran 1 h mit dem Peroxidase-markierten, zweiten Antikörper inkubiert (Tab. 4.4, Verdünnungen: Anti-Maus 1:1000, Anti-Ziege 1:2000, Anti-Kaninchen 1:3000) sowie 2 x in PBS/Tween und 2 x in PBS gewaschen. Die Detektion erfolgte nach Herstellerangaben mittels des Lumi-Light^PLUS Western Blotting Substrats (Roche Diagnostics) in der Diana CCD-Kamera.

Für immunzytochemische Färbungen der intrazellulären HBV-Oberflächenproteine und des Core-Proteins wurden transfizierte HuH7-Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber von der Zellkulturschale gelöst, durch 10-minütige Zentrifugation bei 800 rpm pelletiert und in 4 % Formalin fixiert. Das Pellet wurde in 2 % Agarose eingebettet. Es folgte eine Dehydrierung durch Inkubation in 70 %, 80 %, 96 % und absolutem Alkohol sowie in Xylol und 2 x in 60 °C warmem Paraffin. Nach Aushärtung des Paraffins bei RT wurden von dem Block 2–3 µm dicke Schnitte angefertigt, auf SuperFrost Plus Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig) aufgebracht und 2 Tage bei 40 °C im Brutschrank getrocknet. Zur Entparaffinierung wurden die Schnitte 3 x 10 min in Xylol inkubiert und nacheinander in absolutem (3 x), 96 %, 80 % und 70 % Alkohol sowie destilliertem Wasser gespült. Um die Antigene innerhalb der Zelle zu demaskieren, wurden die Schnitte 5 min in 0,01 M Citratpuffer (2 mM Citronensäure-Monohydrat, 8 mM Natriumcitrat, pH 6) im Schnellkochtopf gekocht und anschließend in TBS (7 mM Tris, 0,04 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl) gespült. Die Schnitte wurden mit einem Wachsstift umrandet und zur Reduzierung von unspezifischen Antikörperbindungen und Hintergrund mit Blocking Reagent (Biocare Medical, Concord, CA, USA) betropft. Nach 10 min Inkubation wurde die Blockierungslösung ohne Spülen durch Ablaufen entfernt. Die Schnitte wurden mit 100 µl der in hintergrundreduzierendem Antibody Diluent (DakoCytomation) verdünnten Primärantikörper (siehe Tab. 4.3, MA 18/7 8 µg/ml, F6 20 µg/ml, Q19/10 2 µg/ml, RF18 34 µg/ml, Anti-CoreSN 1:250) 60 min bei RT inkubiert. Die Detektion basierte auf der konventionellen Methode mit markiertem Streptavidin und Biotin (4plus ALP 1000 Universal Kit, Biocare Medical). Die Schnitte wurden dazu zunächst mit Leitungswasser, TBS-Tween (0,025 % Tween20 in TBS) und gründlich mit TBS gespült. Dann folgten 20 min Inkubation mit biotinyliertem Sekundärantikörper (aus dem Kit, entspechend Anti-Maus oder Anti-Kaninchen, Tab. 4.4) und, nach weiterem Spülen mit TBS, 20 min Inkubation mit Streptavidin-gekoppelter AP. Wieder wurden die Schnitte mit TBS gespült. Zur Darstellung wurden sie 7 min mit frisch angesetztem Fast Red (Sigma) als Chromogen inkubiert und in Leitungswasser sowie destilliertem Wasser gespült. Zur Gegenfärbung der Zellkerne wurden die Schnitte ca. 60–90 s in Hämalaun (sauer nach Meyer, Dr. K. Hollborn & Söhne, Leibzig) getaucht und ca. 5 min unter fließendem Wasser gebläut. Aus dem Wasser wurden die Schnitte schließlich mit Aquatex (Merck) eingedeckt und mit einer Olympus-Kamera in 100facher Originalvergrößerung fotografiert.

Für die Immunfluoreszenz-Färbungen wurden zunächst maximal 3 abgeflammte Deckgläser (18 x 18, Menzel-Gläser) nebeneinander in einer 55 cm-Zellkulturschale positioniert. 200000 HuH7 Zellen wurden darauf ausgesät (siehe Abschnitt 4.2.4.1) und am nächsten Tag wie üblich transfiziert (siehe Abschnitt 4.2.4.3). Vier Tage später wurden die bewachsenen Deckgläser in 6-well-Platten mit je 1 Deckglas pro Well umgelagert, mit 2 ml PBS vorsichtig gewaschen und mit 1 ml Methanol 15 min bei −20 °C fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden je 50 µl 5%iges Eselserum (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA, Spezies des 2. Antikörpers) in PBS zum Blockieren auf den Deckgläsern verteilt, die dann 30 min in einer feuchten Kammer (mit PBS befeuchtetes Filterpapier im Deckel der 6-Well-Platte) bei RT inkubiert wurden. Es folgte ein kurzer Waschschritt und 1 h Inkubation mit 50 µl der Verdünnung des 1. Antikörpers in PBS bei 37° C in der feuchten Kammer. Die Primär-Antikörper zur Detektion der HBV-Proteine und zellulärer Kompartimente (siehe Tab. 4.3) wurden in den folgenden Verdünnungen verwendet. Maus MA 18/7 (präS1), Maus F6 (präS2), Maus RF18 (S), Kaninchen Anti-CoreSN (HBV-Core) und Maus Anti-58K (Golgi-Kompartiment): 1:250, Maus Anti-Hsp/c 70 (Zytoplasma), Maus Anti-PDI (ER-Lumen): 1:500, Kaninchen Anti-Calnexin (ER-Membran): 1:200, Kaninchen Anti-Rab2 (Post-ER/Prä-Golgi intermediäres Kompartiment): 1:100. Nach 3 x kurzem und 3 x 10-minütigem Waschen auf dem Wiegeschüttler wurden die Deckgläser mit 50 µl der 1:1000-Verdünnung der beiden sekundären Antikörper (Tab. 4.4, Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 [rot] und Anti-Maus Alexa Fluor 488 [grün]) in der feuchten Kammer 1 h bei 37 °C inkubiert. Dieser und alle folgenden Schritte erfolgten möglichst lichtgeschützt. Die Deckgläser wurden 3 x kurz und 3 x 10 min gewaschen, zur Kernfärbung 15 min bei 37 °C mit 50 µl einer 1:25000 Verdünnung von DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid, Molecular Probes) inkubiert und nochmals 2 x mit PBS gewaschen. Schließlich wurden die getrockneten Deckgläser mit Fluoreszenz-Eindeckmedium (DAKO) auf Objektträger eingedeckt und dunkel und kühl gelagert. Die Untersuchungen und Aufnahmen der Färbungen wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (Zeiss LSM 510) durchgeführt.

Zur Kofärbung der HBV-Proteine mit F-Aktin wurde das Protokoll leicht verändert. Die Fixierung der Zellen erfolgte 20 min bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd in PBS. Für Blockierung sowie Antikörperverdünnungen wurden 10 % BSA in PBS mit 0,05% Tween verwendet. Zur Detektion des F-Aktin wurden die Zellen zusammen mit dem 2. Antikörper zur HBV-Färbung mit einer 1:800 Verdünnung von FITC-markiertem Phalloidin (Sigma) inkubiert.

HBsAg und HBeAg wurden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Test-Kits (DiaSorin) im Zellkulturüberstand nachgewiesen. Zur Auswertung wurde die S/C-Ratio, d. h. die Extinktion der Probe, dividiert durch die Extinktion des Grenzwertes, herangezogen. Um im aussagekräftigen linearen Bereich der Tests zu bleiben, wurden die Proben je nach Bedarf pur, 1:10 oder 1:50 verdünnt eingesetzt.