Märten, Angela: Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation im Fach Biologie
Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Dipl.-Ing. (FH) Angela Märten,
geboren am 20.03.1968 in Berlin

Dekan Prof. Dr. Jürgen P. Rabe

Gutachter:
1.Prof. Dr. R. Lucius
2.Prof. Dr. I. Schmidt-Wolf
3.Prof. Dr. D. Huhn

eingereicht: 01.02.2000

Datum der Promotion: 31.05.2000

Schlagwörter:
Immuntherapie, Gastrointestinale Tumore, Dendritische Zellen, CIITA

Keywords:
Immunotherapy, colorectal cancer, dendritic cells, CIITA

Zusammenfassung

Die Rationale für immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung maligner Neoplasien geht davon aus, daß Tumore über spezifische Tumorantigene verfügen. Dendritische Zellen als die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen sind in der Lage, Tumorantigene naiven T-Zellen zu präsentieren und spezifische zytotoxische T-Zellen zu stimulieren. In der vorliegenden Arbeit wurden dendritische Zellen durch Stimulation mit Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten/Makrophagen Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) aus peripheren mononukleären Blutzellen gesunder Spender und an Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems erkrankter Patienten generiert. Mit den dendritischen Zellen cokultivierte immunologische Effektorzellen (Zytokin-induzierte Killerzellen, CIK-Zellen) wurden im Zytotoxizitätstest gegen kolorektale und pankreatische Karzinomzellen eingesetzt. CIK-Zellen sind zytototoxische Zellen, die durch Stimulation mit Zytokinen aus peripheren Blutlymphozyten erzeugt werden. Durch die Cokultivierung der Effektorzellen mit dendritischen Zellen konnte eine signifikante Steigerung der unspezifischen zytotoxischen Wirkung der CIK-Zellen bewirkt werden. Zur Steigerung der spezifischen Zytotoxizität wurden dendritische Zellen mit dem Gesamtprotein der tumor-assoziierten Antigene cancer associated antigen (CA 19-9) und carcinoembryonic antigen (CEA) gepulst. Effektorzellen zeigten nach der Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen zytotoxische Wirkung gegen Targetzellen, die das zum Pulsen verwendete Tumorantigen auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Antigenspezifität der zytotoxischen Wirkung konnte durch eine signifikant verminderte Zellyse nach Blockade des Tumorantigens auf den Targetzellen belegt werden. Erstmals beschrieben ist hier das Pulsen dendritischer Zellen mit sowohl autologen als auch allogenen Seren von Patienten mit erhöhten Tumormarkerspiegeln. Eine Kultivierung dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigem Serum bewirkte dosisabhängig eine verstärkte zytotoxische Wirkung cokultivierter Effektorzellen gegen Tumorzellen. Die verstärkte Zellyse zeigte sich unabhängig vom allogenem oder autologem Charakter des Serums. Der immunstimulierende Effekt des Patientenserums konnte durch eine vorhergehende Hitzeinaktivierung des Serums neutralisiert werden. Die höchsten Zellysen wurden durch eine Kultivierung dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigem Serum und zusätzlichem Pulsen mit exogenem Tumorantigen erreicht. Untersuchungen an komplett autologen Systemen reproduzierten die an Zellkulturen erhobenen Befunde. Hierfür wurden erfolgreich Primärkulturen kolorektaler Tumore etabliert. Aus dem Blut von Tumorpatienten wurden dendritische Zellen generiert, die mit autologem Serum kultiviert wurden. Die cokultivierten autologen Effektorzellen erwiesen sich im Zytotoxizitätstest gegen autologe Tumorzellen als zytotoxisch. Die Cokultivierung der Effektorzellen mit den dendritischen Zellen bewirkte bei beiden Zellpopulationen Veränderungen. Dendritische Zellen zeigten nach der Cokultur eine verstärkte Expression antigenpräsentierender und costimulatorischer Moleküle. Bei den CIK-Zellen kam es zu einem Anstieg der Proliferationsrate. Bei Untersuchungen zur Antigenspezifität von T-Zellrezeptoren konnte vermehrt antigenspezifischer T-Zellrezeptor nachgewiesen werden. Des weiteren stieg das Verhältnis zwischen zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen zugunsten der zytotoxischen T-Zellen. In ELISpot-Untersuchungen wurde eine Zunahme Interferon-gamma sezernierender CIK-Zellen nachgewiesen. Dendritische Zellen ließen sich erfolgreich mit inaktiviertem Adenovirus, an das kovalent Poly-L-Lysin gekoppelt ist, transfizieren. Die für den adenoviralen Gentransfer benötigten Oberflächenstrukturen konnten auf dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Zur Verbesserung der Zytotoxizität wurden dendritische Zellen erfolgreich mit dem Gen für den Transaktivator CIITA transfiziert. CIITA-transfizierte dendritische Zellen exprimierten vermehrt MHC Klasse II-Moleküle. Die transduzierten dendritischen Zellen induzierten bei cokultivierten Effektorzellen eine erhöhte unspezifische Zytotoxizität. Mit Tumorantigen gepulste dendritische Zellen können bei der Entwicklung immuntherapeutischer Protokolle bei malignen Neoplasien von Bedeutung sein.

Abstract

The immunotherapeutic approach against malignant neoplasias appreciates that tumours encode tumour rejection antigens, that enable them to induce protective immunity. Dendritic cells are major antigen-presenting cells and are able to present tumour antigens to naive T-cells and stimulate cytotoxic T-cells in a specific manner. In the present graduation-manuscript dendritic cells were generated in the presence of Interleukin-4 and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) from peripheral mononuclear blood cells of healthy donors and tumour-patients. Immunological effector cells termed cytokine-induced killer cells (CIK cells) were co-cultured with dendritic cells and tested for their cytotoxic capacity against colorectal and pancreatic cancer cell-lines in a LDH-release assay. CIK cells are cytotoxic lymphocytes generated by incubation of peripheral blood lymphocytes with different cytokines. Co-culture of effector cells with dendritic cells led to a significant increase of the cytotoxic effect of CIK cells. For a further increase of specific cytotoxicity dendritic cells were pulsed with total protein of the tumour-associated antigens cancer associated antigen CA 19-9 and carcinoembryonic antigen (CEA). Co-cultured effector cells showed an increase in cytotoxicity against tumour-antigen expressing target cells, after co-culture with pulsed dendritic cells. The specificity of the cytotoxic effect could be shown by blocking the tumour-antigens with a monoclonal antibody. Autologous and allogenec untreated serums from patients with elevated tumour-marker levels were also used for pulsing of dendritic cells. Similar to the results when using total protein for pulsing, a cultivation in serum of patients with elevated tumour marker levels caused an intensified cytotoxic effect of effector cells against tumour cells in a dose-dependent manner. The intensified cytotoxicity was seen independent of the allogenec or autologous character of the serum. The immuno-stimulating effect of the patient serum could be neutralized by preceding heat inactivating. The highest cytotoxicity was achieved by a cultivation of dendritic cells in serum from patients with elevated tumour marker levels and additional pulsing with exogenous tumour antigen. Experiments with completely autologous systems reproduced the results made with cell-lines. Primary cultures of colorectal tumours were established. Dendritic cells were generated from the blood of tumour patients and were cultivated in autologous serum. Co-cultured autologous effector cells showed cytotoxicity when used against autologous tumour cells. Co-culturing of effector cells with dendritic cells caused modifications at both cell populations. Dendritic cells showed an increase expression of antigen-presenting and co-stimulatory molecules. CIK cells showed a higher proliferation-rate when co-cultured. They express more antigen-specific T-cell receptor, and the cytotoxic T-cells to T-helper cells ratio increased. ELISpot-assays showed an increase of interferon gamma producing cells. Dendritic cells were successfully transduced by using an inactivated adenovirus, which covalently binds poly-L-lysine. Dendritic cells express the molecules that enables adenoviral gene delivery on their surface. For the improvement of cytotoxicity dendritic cells were transduced with the gene encoding for the transactivator CIITA. CIITA transduced dendritic cells increases expression of MHC class II molecules. Cytotoxicity experiments with transduced dendritic cells resulted in an increased induction of non-specific cytolysis from co-cultured effector cells. DC pulsed with tumour-antigens may have a major impact on immunotherapeutic protocols for cancer patients.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteTumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems
Widmung
Danksagung
1 Einleitung
1.1.Dendritische Zellen
1.2.Immunologische Effektorzellen
1.3.Tumore des gastroenteropankreatischen Systems
1.4.Tumor-assoziierte Antigene
1.5.Gentransfer in dendritische Zellen
1.6.CIITA
2 Zielsetzung
3 Material und Methoden
3.1.Material
3.1.1.Chemikalien und Reagenzien
3.1.2.Zytokine und Stimulanzien
3.1.3.Antikörper
3.1.4.Zellinien
3.1.5.Bakterien, Plasmide, Primer
3.1.6.Lösungen und Puffer
3.1.7.Kulturmedien
3.2.Methoden
3.2.1.Zellkultur
3.2.1.1.Gewinnung peripherer mononukleärer Zellen
3.2.1.2.Herstellung von CIK-Zellen
3.2.1.3.Generierung und Pulsen von dendritischen Zellen
3.2.1.4.Cokultivierung von CIK-Zellen mit dendritischen Zellen
3.2.1.5.Einzelzellisolierung von Tumorzellen
3.2.2.Molekularbiologische Techniken
3.2.2.1.Herstellung kompetenter Bakterien
3.2.2.2.Transformation von Bakterien
3.2.2.3.Gentransfer in dendritische Zellen
3.2.2.4.Plasmidherstellung
3.2.2.5.RNA-Isolierung
3.2.2.6.RT-PCR
3.2.2.7.Gel-Elektrophorese
3.2.3.Analytik
3.2.3.1.Zytotoxizitätsnachweis
3.2.3.2.Durchflußzytometrie
3.2.3.3.Dimeruntersuchungen
3.2.3.4.ELISpot-Analytik
3.2.3.5.Nachweis transfizierter Zellen
3.2.3.6.Tumormarkerbestimmung
4 Ergebnisse
4.1.Generierung von dendritischen Zellen
4.1.1.Durchflußzytometrische Untersuchung dendritischer Zellen
4.2.Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen nach Cokultivierung mit gepulsten dendritischen Zellen
4.2.1.Bestimmung der Tumorantigenexpression der Targetzellen
4.2.2.Zytotoxizitätsuntersuchungen zum Pulsen von dendritischen Zellen mit CA 19-9
4.2.3.Titration von CA 19-9 Protein
4.2.4.Pulsen von dendritischen Zellen mit CEA -Protein und CEA -Peptid (CAP-1)
4.2.5.Antikörperblockade von Tumorantigenen auf den Targetzellen
4.3.Einfluß tumormarkerhaltigen Serums von Karzinompatienten bei der Kultivierung dendritischer Zellen auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen
4.3.1.Kultivierung dendritischer Zellen mit Seren von Patienten mit erhöhtem Tumormarkerspiegel
4.3.2.Titration tumormarkerhaltigen Patientenserums
4.3.3.Einfluß der Serumhitzeinaktivierung
4.3.4.Pulsen von dendritischen Zellen mit definierten Tumormarkerkonzentrationen, enthalten im Serum von Karzinompatienten
4.3.5.Kultivierung in tumormarkerhaltigen Serum und zusätzliches Pulsen mit exogenem Protein
4.4.Einsatz immunologischer Effektorzellen von Patienten mit kolorektalen Tumoren im Zytotoxizitätsassay gegen autologe Tumorzellen
4.4.1.Immunologische Zellen von Patienten mit erhöhtem CA 19-9 Spiegel
4.4.2.Immunologische Zellen von Patienten mit erhöhtem CEA Spiegel
4.5.Phänotypische und funktionelle Veränderungen von CIK-Zellen durch die Cokultivierung mit dendritischen Zellen
4.5.1.Expression von T-Zellmarkern auf CIK-Zellen
4.5.2.Blockade von MHC -Molekülen auf dendritischen Zellen
4.5.3.Durchflußzytometrische Daten zur T-Zellrezeptorspezifität cokultivierter CIK-Zellen
4.5.4.Nachweis IFN-gamma produzierender CIK-Zellen mittels der ELISpot-Technik
4.6.Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen
4.6.1.Integrinexpression auf dendritischen Zellen
4.6.2.Effizienz der Transfektion dendritischer Zellen mit Poly-L-Lysin (AdV-PLL) gekoppeltem Adenovirus
4.6.3.Nachweis von CIITA- RNA mittels RT-PCR
4.6.4.Expression von MHC -Molekülen auf dendritischen Zellen nach Transfektion mit dem CIITA-Gen
4.6.5.Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CIITA-transfizierten dendritischen Zellen
5 Diskussion
5.1.Etablierung des Modells
5.2.Gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen
5.2.1.Pulsen dendritischer Zellen mit CA 19-9
5.2.2.Pulsen von dendritischen Zellen mit CEA -Protein und CAP-1
5.2.3.Kultivierung dendritischer Zellen mit tumormarkerhaltigem Serum von Patienten mit Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems
5.2.4.Immunologische Zellen von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren
5.2.5.Zusammenfassung: Pulsen dendritischer Zellen
5.3.Veränderungen der Oberflächenmerkmale von CIK-Zellen durch die Cokultivierung mit dendritischen Zellen
5.3.1.Expression von T-Zellmarkern auf CIK-Zellen
5.3.2.Bedeutung der T-Helferzellen bei der Cokultivierung von CIK-Zellen
5.3.3.Spezifität von T-Zellrezeptoren
5.3.4. Interferon-gamma Produktion cokultivierter CIK-Zellen
5.3.5.Zusammenfassung: Veränderungen cokultivierter CIK-Zellen
5.4.Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen
5.4.1.Transfektion dendritischer Zellen
5.4.2.Eigenschaften CIITA transfizierter dendritischer Zellen
5.4.3.Zusammenfassung: Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen
5.5.Ausblick
Bibliographie Bibliographie
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Expression von Oberflächenmarkern auf dendritischen Zellen
Tabelle 2: Expression von Tumorantigenen
Tabelle 3: Tumormarkerhaltiges Serum in einer Endkonzentration von 100 U/ml CA 19-9 im Kultivierungsmedium von DC . Gemessen wurde die Zytotoxizität von cokultivierten CIK-Zellen gegen CA 19-9 positive Targetzellen. Angegeben ist die prozentuale Targetzellyse.
Tabelle 4: Anteil der CIK-Zellen mit peptidspezifischen T-Zellrezeptor an der Lymphozytensubpopulation nach Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen. Die in Klammern angegebenen Zahlen entsprechen der Expression nach Subtraktion der Kontrollmessung. Die Daten zeigen die Mittelwerte von zwei voneinander unabhängigen Messungen.
Tabelle 5: Nachweis IFN-gamma produzierender CIK-Zellen im ELISpot
Tabelle 6: Expressionsmuster von MHC -Molekülen auf CIITA transfizierten dendritischen Zellen
Tabelle 7: Auswahl an CD -Antigenen
Tabelle 8: Auswahl an Zytokinen

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Merkmale dendritischer Zellen
Abbildung 2: Vektorkarte des pCR2.1-TOPO-HSCIITA
Abbildung 3: Dendritische Zellen an Tag +6 der Kultivierung (fotografiert bei 400facher Vergrößerung)
Abbildung 4: Durchflußzytometrische Darstellung dendritischer Zellen (Tag +5)
Abbildung 5: Zytotoxische Aktivität von CIK-Lymphozyten gegen Pankreaskarzinomzellen (DAN-G) nach Cokultivierung mit CA 19-9 -Protein gepulsten dendritischen Zellen
Abbildung 6: Zytotoxische Aktivität von CIK-Lymphozyten gegen DAN-G Zellen nach Cokultivierung mit DC , die mit steigenden CA 19-9 Proteinkonzentrationen gepulst wurden
Abbildung 7: Zytotoxizität von CIK-Zellen gegen Colo 201 Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten dendritischen Zellen
Abbildung 8: Zytotoxizität von CIK-Zellen gegen 293 Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten dendritischen Zellen
Abbildung 9: Blockade von CA 19-9 auf DAN-G Zellen zum Nachweis einer spezifischen Aktivierung mit gepulsten DC cokultivierter CIK-Zellen
Abbildung 10: Einfluß tumormarkerhaltigen Serums bei der Kultivierung von DC auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen Colo 205 Zellen
Abbildung 11: Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen DAN-G Zellen, nach Titration tumormarkerhaltigen Serums bei der Kultivierung dendritischer Zellen (Effektor zu Target Verhältnis 10:1)
Abbildung 12: Einfluß einer Serumhitzeinaktivierung auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen von Patienten mit Pankreaskarzinom gegen DAN-G Zellen nach Kultivierung autologer dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigen Serum
Abbildung 13: Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen Colo 201 Zellen, nach zusätzlichem Pulsen der DC mit exogenem CEA und Kultivierung in Serum von Patienten mit CRC
Abbildung 14: Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CA 19-9 gepulsten autologen dendritischen Zellen gegen autologe Tumorzellen von Patienten mit Rektumkarzinom
Abbildung 15: Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten autologen dendritischen Zellen gegen autologe Tumorzellen von Patienten mit CRC
Abbildung 16:Einfluß einer Cokultivierung mit DC auf den Quotienten CD8+CD3+/CD4+CD3+ bei CIK-Zellen
Abbildung 17: Blockade der MHC -Expression auf DC durch Antikörperzugabe an verschiedenen Tagen. Cokultivierte CIK-Zellen wurden im Zytotoxizitätstest in einem 20fachen Überschuß gegen Colo 205 Zellen eingesetzt
Abbildung 18: Durchflußzytometrische Bestimmung der T-Zellrezeptorspezifität mit gepulsten dendritischen Zellen cokultivierter CIK-Zellen . Zytotoxische T-Zellen, mit dem Phänotyp CD8+ wurden durch FITC -Färbung ermittelt. Es wurde die in ‚A‘ isolierte Lymphozytenpopulation untersucht. Das rechte Bild in der ersten Zeile entspricht dem Nullwert und zeigt CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CAP-1 gepulsten dendritischen Zellen. Bestimmt wurde die Expression des T-Zellrezeptors für ein irrelevantes Peptid (hier Pep CD 19). Im linken Bild der zweiten Zeile werden CIK-Zellen nach Cokultur mit CEA -Protein gepulsten DC gezeigt, bestimmt wurde der Anteil spezifischer CAP-1 T-Zellrezeptoren. Das rechte Bild in der zweiten Zeile zeigt CAP-1 spezifische T-Zellrezeptoren auf CIK-Zellen nach Cokultur mit CEA -Peptid (CAP-1) gepulsten dendritischen Zellen.
Abbildung 19: Nitrozellulosemembran mit IFN-gamma Spots
Abbildung 20: Expression von Integrin und CAR auf dendritischen Zellen in Abhängigkeit vom Alter der DC
Abbildung 21: Effizienz der adenoviralen Transfektion dendritischer Zellen. Mit dem lacZ-Gen transfizierte Zellen wurden durch Blaufärbung nach X-gal Zugabe detektiert
Abbildung 22: Fünf Tage alte dendritische Zellen nach Transfektion mit dem lacZ-Gen und Anfärbung positiver Zellen durch Zugabe von X-gal (fotografiert bei 100 × Vergrößerung)
Abbildung 23: Agarosegel nach RT-PCR zum Nachweis von CIITA- RNA in CIITA-transfizierten DC (Transfektion an Tag +5)
Abbildung 24: Zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen gegen Pankreaskarzinomzellen nach Cokultur mit CA 19-9 gepulsten und mit dem CIITA-Gen transfizierten dendritischen Zellen

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