Märten, Angela: Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

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Kapitel 1. Einleitung

Das Immunsystem ist ein hoch differenziertes Organ, das in der Lage ist, den Organismus sowohl unspezifisch, als auch spezifisch gegenüber fremden Antigenen zu schützen. Veränderte Zellen wie Tumorzellen können durch immunologische Effektorzellen, wie den zytotoxischen T-Zellen, abgetötet werden. T-Zellen verfügen über den T-Zellrezeptor, der spezifisch Antigene, die von einer antigenpräsentierenden Zelle ( APC ) präsentiert werden, erkennt. Antigene werden von APC aufgenommen, prozessiert, in Form von Peptiden am major histocompatibility complex ( MHC -Komplex) intrazellulär gebunden und anschließend an der Zelloberfläche präsentiert. Professionelle APC exprimieren costimulatorische Faktoren, wie die Differenzierungscluster ( CD ) CD80 und CD86 , diese werden von dem auf T-Zellen vorkommenden CD28 als Liganden gebunden (siehe Anhang, Tabelle 7: Auswahl an CD-Antigenen ). Nur bei Vorliegen der costimulatorischen Signale kommt es zu einer Proliferation und Differenzierung der T-Zellen zu bewaffneten T-Effektorzellen, fehlt ein Signal, können die Zellen anerg werden.

Tumoren entstehen durch das progressive Wachstum der Nachkommen einer einzigen transformierten Zelle, die der Kontrolle des Immunsystems entkommen ist. In Tierversuchen konnte gezeigt werden, daß es Immunreaktionen auf Tumoren gibt ( Van Der Bruggen et al., 1991 Boon et al., 1994), doch waren die Zusammenhänge über die Antigenpräsentation und die an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Moleküle für die Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes zu wenig erforscht. Erkenntnisse über tumorspezifische und tumor-assoziierte Antigene, die an der Zelloberfläche von Tumorzellen exprimiert werden ( Cheever et al., 1995; Rosenberg et al. 1996), und die Entwicklung von Methoden Tumorzellen und Komponenten des Immunsystems genetisch zu verändern, haben das Interesse an immuntherapeutischen Ansätzen verstärkt. In einer Vielzahl von Studien haben sich genmodifizierte Tumorvakzine, zytototoxische T-Zellen und dendritische Zellen als immunmodulatorisch erwiesen. Um eine effektive spezifische anti-Tumorantwort zu erreichen, werden mindestens drei synergistische Signale benötigt ( Bubenick , 1996):

  1. T-Zellrezeptoren auf zytotoxischen T-Zellen ( CD8 + Zellen) bzw. T-Helferzellen ( CD4 + Zellen), denen Tumorantigene im Zusammenhang mit MHC Klasse I bzw. MHC Klasse II-Molekülen präsentiert werden,
  2. nicht-antigenspezifische akzessorische/costimulatorische Signale, wie z.B. die Interaktion von CD80 und CD86 mit CD28 auf T-Zellen,
  3. proliferative Signale, hervorgerufen durch Zytokine oder Wachstumsfaktoren, um tumorreaktive Lymphozyten zu rekrutieren.

Der Verlust oder die Herunterregulierung von MHC -Molekülen, insuffiziente Antigenpräsentation oder unvollständige Signaltransduktion in T-Zellen kann zum Entkommen des Tumors aus der immunologischen Kontrolle führen ( Natali et al., 1989; Maeurer et al., 1996). Andere Faktoren, z.B. von Tumoren sezernierter immunsuppressiv wirkender transforming growth factor-beta (TGF-beta), die Bildung von vascular endothelial growth factor (VEGF) oder die Freisetzung von Interleukin-10 (siehe Anhang, Tabelle 8: Auswahl an Zytokinen ) durch den Tumor können die Kontrolle durch das Immunsystem verhindern ( Barth et al., 1996; Gabrilovich et al., 1998). So haben die Zellen des malignen Melanoms zwar ein antigenes Profil, das dem natürlicher APC stark ähnelt, sind aber dennoch für T-Zellen nur schwach immunogen ( Mackiewicz and Rose-John, 1998). Untersuchungen zur Häufigkeit von tumorantigenspezifischen T-Zellen in Melanompatienten konnten eine teilweise enorme Vermehrung von antigenspezifischen T-Zellen nachweisen, die aber dennoch nicht zytotoxisch waren. Diese T-Zellen waren selbst nach Stimulation mit Mitogenen nicht in der Lage, Zytokine zu produzieren und galten somit als anerg ( Lee et al., 1999).

Der Vorstellung der Immuntherapie liegt zugrunde, daß Tumore über Antigene verfügen, die eine Immunität bewirken können ( Van Pel and Boon, 1982). Die Entwicklung ging dabei von humoralen Ansätzen zu einem Schwerpunkt auf der zellulären Antwort über. Aufmerksamkeit erfuhr hierbei der Einsatz gentechnisch veränderter, meist autologer Tumorzellen als Vakzine ( Gilboa and Lyerly, 1994; Dranoff and Mulligan, 1995). Hierbei werden Tumorzellen mit Zytokingenen oder Genen für costimulatorische Signale transfiziert und in abgetöteter Form wiedergegeben ( Schmidt-Wolf et al., 1994b). Mittlerweile wird davon ausgegangen, daß weder mit einem Antigen infizierte Zellen, noch Tumorzellen in der Lage sind, Antigene korrekt CD8 + T-Zellen darzubieten. Die Fähigkeit, naive CD8 + Zellen zu aktivieren, ist den APC vorbehalten. Darauf basierend entwickelte sich ein immuntherapeutischer Ansatz, in dessen Mittelpunkt dendritische Zellen stehen ( Steinman , 1991).


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1.1. Dendritische Zellen

Dendritische Zellen ( DC ) sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen. Sie präsentieren Antigen naiven T-Zellen und sind in der Lage, spezifische zytotoxische Zellen nach einem vorhergehenden Kontakt mit T-Helferzellen ( Ridge et al., 1998) oder auch unmittelbar zu stimulieren ( Inaba et al., 1987). Dendritische Zellen DC sind ubiquitär in verschiedensten Geweben in niedriger Anzahl vorhanden, sie sind unregelmäßig geformt und verfügen über lange dendritische Ausläufer ( Steimle et al., 1993). DC stammen von noch nicht genau definierten Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ab (lymphoide DC nehmen eine Sonderstellung ein und werden hier nicht behandelt). DC gelangen über das Blut in die Gewebe, wo sie als immature Zellen vorkommen, die sehr gut Antigene aufnehmen und prozessieren können, aber nur über geringe T-zellstimulierende Fähigkeiten verfügen. Nach einem Antigenkontakt oder dem Einwirken inflammatorischer Stimuli siehe migrieren sie aus den Geweben in die afferente Lymphe (das sogenannte homing) und kommen in den Lymphknoten dann als interdigitierende retikuläre Zellen in den T-Zellbereichen vor ( Steinman , 1991; Cella et al., 1997). Zu diesem Zeitpunkt hat sich das Erscheinungsbild entscheidend geändert, die maturen DC sind jetzt nicht mehr in der Lage, Antigene aufzunehmen und zu prozessieren, verfügen nun aber über eine stark hochregulierte Fähigkeit zur T-Zellstimulation. Eine mature dendritische Zelle ist in der Lage, mehrere tausend T-Zellen zu stimulieren, hierbei bilden sich stabile Cluster zwischen den DC und den T-Zellen aus ( Bancherau and Steinman, 1998).

Da die Anzahl der zirkulierenden DC viel zu gering für einen Einsatz in der Immuntherapie ist (< 0,15% der mononukleären Zellen, Steinman , 1991), liegen mittlerweile eine Reihe von Protokollen vor, nach denen dendritische Zellen gewonnen werden. Als Ausgangsmaterial dienen dabei Knochenmark, Nabelschnurblut, Leukapherese-Produkte oder periphere mononukleäre Blutzellen. Die isolierten Zellen können nachfolgend depletiert bzw. angereichert werden ( CD34 +, CD1a +, CD14 -) ( Inaba et al., 1992; Saraya and Reid, 1996; Tarte et al., 1997; Sallusto and Lanzavecchia, 1994, Romani et al., 1996). Daran schließt sich eine Zytokinstimulation, die Interleukin-4 (IL- Granulozyten/Makrophagen Koloniestimulierender Faktor 4) ) Granulozyten/Makrophagen Koloniestimulierender Faktor ( GM-CSF ), Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNF-alpha), Stammzellfaktor (SCF), IL- 10 und andere Faktoren umfaßt ( Romani et al., 1994; Saraya and Reid, 1996; Morel et al. 1997). Die erzeugten Zellen unterscheiden sich phänotypisch wie funktionell in Abhängigkeit von der Generierungsmethode ( Hart , 1997). Romani entwickelte 1994 ein mittlerweile etabliertes Protokoll, das dendritische Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Zugabe von IL- 4 und GM-CSF generiert ( Romani et al., 1994). Die so gewonnenen DC entsprechen der von Hart 1997 vorgeschlagenen Arbeitsdefinition für DC ( Hart , 1997):

  1. Die Fähigkeit, primär eine T-Zellantwort zu stimulieren
  2. Das Vermögen durch Gewebe zu migrieren
  3. Relativ spezifische Phagozytoseaktivität
  4. Spontane Clusterbildung mit T-Zellen in vitro
  5. Oberflächenmarker, die sich deutlich von dem Phänotyp von Makrophagen, B-Zellen und anderer Immunzellen unterscheiden
  6. Expression DC -typischer Marker in Abhängigkeit vom Differenzierungszustand
  7. Zytochemische Vorgänge, die sich deutlich von makrophagenspezifischen Reaktionen unterscheiden

Phänotypisch fehlen den dendritischen Zellen Monozytenmarker wie CD14 , sie exprimieren costimulatorische Moleküle, Adhäsionsmoleküle und sehr hohe Spiegel an MHC -Molekülen. An spezifischen Markern sind bislang CD83 , CMRF-44 und CMRF-56 beschrieben, deren Funktion unbekannt ist (bei CD83 wird ein Einfluß auf die T-Zellproliferation vermutet). Das Expressionsprofil ist stark abhängig von dem Reifegrad der Zellen ( Hart , 1997). Dendritische Zellen sind in der Lage, Antigene durch Endo-, Pino- und Phagozytose aufzunehmen. Diese Fähigkeit ist stark abhängig vom Differenzierungszustand der Zellen. Für die Antigenaufnahme verfügen die DC über eine Reihe von Membranrezeptoren. Die Antigene werden durch intrazelluläre Proteasen und Peptidasen zu kleinen Peptidstücken abgebaut. Diese Peptide binden zytosolisch an Transporterproteine (Transporters associated with Antigen Processing, TAP) und werden in das MHC Klasse I-Kompartiment gebracht, wo sie in die Bindungsgrube der MHC -Moleküle binden, bevor diese human leukocyte antigen-Moleküle ( HLA -Moleküle) an die Zelloberfläche gelangen. DC sind befähigt auch extrazellulär vorliegende Peptide an MHC Klasse I-Moleküle zu binden. Für die Präsentation auf MHC Klasse II-Molekülen hingegen müssen die Antigene aufgenommen werden, damit sie


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nach einer Prozessierung präsentiert werden können ( Egner et al., 1993; Fanger et al., 1996; Wood et al., 1991). Der turn-over der dendritischen MHC -Moleküle ist sehr langsam und die Expressionsdichte sehr hoch, so daß Peptide über einen langen Zeitraum präsentiert werden können ( Steinman , 1991).

Abbildung 1: Merkmale dendritischer Zellen

Die geringe Immunogenität von Tumoren wird hervorgerufen durch die Unfähigkeit des Tumors, naive T-Zellen zu aktivieren, dies läßt den Einsatz von dendritischen Zellen in der Tumortherapie sinnvoll erscheinen. DC , die Tumorantigene präsentieren, können äußerst potent zytotoxische Zellen aktivieren ( Schuler and Steinman, 1997). Für den immuntherapeutischen Einsatz werden dendritische Zellen ex vivo mit Antigenen beladen (gepulst). Für das Pulsen können unterschiedliche Ansätze gewählt werden:

Eine Immunisierung mit definierten Tumorantigenen ist nur in seltenen Fällen möglich, da für viele Tumore keine Antigene beschrieben sind ( Boon et al., 1994), und die Gefahr besteht, daß Tumorantigene sich durch Mutation dem immunologischen Angriff entziehen. Das Pulsen mit tumorspezifischen Peptiden, deren Antigenität bekannt ist, bewirkt die extrazelluläre Bindung an MHC Klasse I-Molekülen. Dieser Ansatz erfordert die genaue Beschreibung von Tumorantigenen und HLA spezifischen Bindungsstellen ( Murphy et al., 1996).

Ähnliches gilt für das Pulsen mit tumorspezifischen Proteinen, die von den DC aufgenommen und prozessiert werden. Bei diesem Ansatz können allerdings auch noch unbekannte antigene Determinanten des Proteins nicht- HLA restriktiv präsentiert werden ( Inaba et al., 1990). Die Verwendung von Tumorlysat zum Pulsen kann eine weitaus größere Anzahl auch unbekannter Antigene abdecken, erfordert aber die operative Gewinnung größerer Mengen von Tumormaterial bzw. dessen Vermehrung in vitro ( Nair et al., 1997). Nachteilig hierbei ist die bislang noch nicht beschriebene, aber theoretisch mögliche Induktion einer Autoimmunität ( Parmiani , 1993).

Bei der Verwendung von Tumor messenger- RNA (oder c DNA ) zum Pulsen reicht die Entnahme weniger Tumorzellen, deren m RNA amplifiziert werden kann. Die RNA ( DNA ) wird aufgenommen, translatiert, das resultierende Protein wird prozessiert und an MHC Klasse I-Molekülen präsentiert. Eine tumorspezifische RNA kann durch subtraktive Hybridisierung mit RNA aus gesundem Gewebe angereichert werden, damit kann die Konzentration nicht-tumorspezifischer Antigene gesenkt werden ( Boczkowski et al., 1996).


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Im Vergleich zu Immuntherapien mit gentechnisch veränderten Tumorzellen sind Vakzinationen mit dendritischen Zellen leichter durchführbar und kostengünstiger ( Gilboa and Lyerly, 1994). Autologe dendritische Zellen können ex vivo generiert, mit Antigenen gepulst und im maturen Zustand zurückgegeben werden ( Gilboa and Lyerly, 1994). Im Tiermodell ergaben sich sehr vielversprechende Ergebnisse ( Nair et al., 1997; Boczkowski et al., 1996; Murphy et al., 1996), mehrere klinische Studien haben bereits begonnen ( Höltl et al., 1998; Brossart et al., 1999; Nestle et al., 1998).

1.2. Immunologische Effektorzellen

In der adoptiven Immuntherapie kommen zytotoxische Zellen zum Einsatz. Ein Hauptproblem hierbei stellt die Bereitstellung ausreichend großer Mengen reaktiver Zellen dar. Zytotoxische T-Lymphozyten mit dem Phänotyp CD3 CD8 erkennen Antigene, die ihnen in Zusammenhang mit MHC Klasse I-Molekülen präsentiert werden. Sie setzen bei der Bindung an eine Zielzelle Perforin, Granzym und oftmals auch Interferon-gamma frei. Die ebenfalls physiologisch vorkommenden natürlichen Killerzellen ( NK-Zellen ) sind große lymphatische Zellen, die über zytotoxische Aktivität verfügen. Neben der Lyse virusinfizierter Zellen sind sie in der Lage, ohne vorhergehende Sensibilisierung Tumorzellen zu zerstören.

Lymphokin-aktivierte Killerzellen ( LAK-Zellen ) wurden 1980 erstmals beschrieben ( Lotze et al., 1980). Hierbei handelt es sich um durch Interleukin-2 Gabe aktivierte NK-Zellen , die in der Lage sind, entartete Zellen zu erkennen, durch die Freisetzung von Granzymen und perforinhaltiger Granula zu lysieren und Apoptose zu induzieren. Die Mehrheit der LAK-Zellen stammen von NK-Zellen ab und stellen eine heterogene Population von Effektorzellen dar, die Tumore ohne MHC -Restriktion erkennen. Sie exprimieren mit dem Oberflächenphänotyp CD3 - CD16 + CD56 + NK-Zellmarker und sind negativ für T-Zellmarker. Problematisch ist die geringe antitumorale Wirkung in vivo ( Mule et al., 1984) und die Schwierigkeit bei der Gewinnung großer Zellzahlen.

Tumorinfiltrierende Lymphozyten ( TILs ) verfügen über eine stärkere zytotoxische Wirkung als LAK-Zellen und können durch Interleukin-2 Gabe aus Lymphozyten in Tumorgewebe generiert werden. Nach 2-3-wöchiger Kultur einer Tumoreinzelzellsuspension kann unter dem Einfluß von IL- 2 eine tumorfreie Lymphozyten-Kultur erhalten werden ( Rosenberg , 1992). TILs vermitteln ihre Zytotoxizität MHC -restriktiv ( Rosenberg et al., 1986). Da der Einsatz von tumorinfiltrierenden Lymphozyten limitiert ist durch die Schwierigkeiten bei der Gewinnung ausreichend großer Zellzahlen, wurden neuartige Protokolle für die Bereitstellung zytotoxischer Zellen entwickelt.

Durch die kombinierte Gabe von Interleukin-1beta , Interleukin-2 , Interferon-gamma (IFN-gamma) und monoklonalem Antikörper gegen CD3 (mAK CD3) können periphere Blutlymphozyten aktiviert werden. Diese zytokin-induzierten Killerzellen ( CIK-Zellen ) setzen sich zu 80-90% aus CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen und zu 10-15% aus CD3+CD56+ Zellen zusammen. Zellen mit dem Phänotyp CD3 + CD56 + haben eine wesentlich höhere Proliferationsrate als LAK-Zellen und vermitteln eine stärkere Zytotoxizität als diese ( Lanier et al., 1986, Schmidt et al., 1986). Der Anteil von CD3 + CD56 + Zellen ist in peripheren Blutlymphozyten mit 1-5% gering ( Schmidt-Wolf et al., 1991; Schmidt-Wolf et al., 1993), er nimmt in CIK-Zellkulturen im Laufe der Kultivierung zu und erreicht nach 1-2 Monaten ein Plateau ( Schmidt-Wolf et al., 1994). Die meisten der CD3 + CD56 + Zellen coexprimieren CD2 , die alpha- und die beta-Kette des T-Zellrezeptors ( TCR -alpha/beta), CD8 und sind negativ für CD4 und CD16 . CD3 + CD56 + Zellen, die unter diesen Kulturbedingungen gewonnen werden, stammen von T-Zellen und nicht von NK-Zellen ab ( Lu and Negrin, 1994). CIK-Zellen sezernieren IL- 2, IL- 6 und TNF-? . Ähnlich wie NK-Zellen exprimieren CIK-Zellen killer inhibitory receptors (KIRs) ( Margolin et al., 1997), bei fehlender Aktivierung von killer inhibitory receptors durch die Targetzellen kann es zur Lyse kommen. Die zellvermittelte Zytolyse der CIK-Zellen wird durch Exozytose zytoplasmatischer Granula, die die Zellmembran der gebundenen Tumorzelle penetrieren, hervorgerufen. Die Granula sezernieren das Enzym BLT-Esterase (BLT = N-alpha-Benzyl-oxycarbyonyl-L-Lysin Thiobenzolester). Die Stimulation der CIK-Zellen mit Tumorzellen oder mit mAK CD3 ist für die Exozytose erforderlich, ebenso die zelluläre Interaktion des lymphocyte function-associated antigen-1 ( LFA-1 ) mit seinem Liganden intracellular adhesion molecule-1 ( ICAM-1 ). Die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen kann durch Zugabe von mAK gegen LFA-1 oder ICAM-1 blockiert werden ( Lotze et al., 1980). CIK-Zellen vermitteln keine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (antibo


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dy-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), da keine Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche exprimiert werden. Die Antitumor-Effekte von LAK-Zellen und CIK-Zellen sind im Tiermodell mit schwer immundefizienten Mäusen ( SCID -Maus Modell) untersucht worden. In diesem Modell zeigten sich die CIK-Zellen gegenüber den LAK-Zellen überlegen ( Lu and Negrin, 1994).

Anstelle von Interleukin-2 können auch IL- siehe 7 oder IL- 12 zur Generierung von CIK-Zellen verwendet werden, allerdings proliferieren durch IL- 7 bzw. IL- 12-Stimulation gewonnene CIK-Zellen weniger im Vergleich zu IL- 2 induzierten. Die zytotoxische Wirkung von Interleukin-7 stimulierten Zellen ist gleich der von IL- 2 induzierten ( Csipai et al., 1996). Die Stimulation mit IL- 12 vermittelt eine höhere Zytotoxizität ( Zoll et al., 1998). Mit dem Interleukin-7 Gen transfizierte CIK-Zellen wurden bei der ersten deutschen Gentherapiestudie eingesetzt ( Schmidt-Wolf et al., 1994; Schmidt-Wolf et al., 1994b).

1.3. Tumore des gastroenteropankreatischen Systems

Karzinome des Kolons und des Rektums gehören zu den häufigsten Tumoren überhaupt, da ihre Heilungsrate ca. 50% beträgt, sind neue Therapieansätze gefragt. Ätiologisch weisen beim kolorektalen Karzinom ( CRC ) neben familiärer Disposition, Umweltfaktoren wie den Eßgewohnheiten auf eine wesentliche Rolle für die Entstehung hin. Das Risiko an einem CRC zu erkranken, steigt bei einer Kost, die reich an tierischen Fetten und rotem Fleisch, faser-, gemüse- und kalziumarm ist, sowie bei geringer körperlicher Bewegung und großem Bierkonsum. Ca 10% der kolorektalen Karzinome gehen auf eine besondere genetische Disposition zurück, auf derem Boden karzinogene Einflüsse besonders wirksam sein können ( Toribara and Sleisinger, 1995). Das kolorektale Karzinom breitet sich lokal in das perirektale oder perikolische Fettgewebe aus, daneben über die Lymphbahnen und bei Einbruch in die Gefäße auf hämatogenem Wege. Die Metastasen haben eine Prädilektion für Leber und Lunge, seltener Skelett und Gehirn. Die Prognose des CRC ist wesentlich abhängig von der primären Tumorausdehnung sowie von der biologischen Aggressivität der Tumorzellen. Prognostisch relevant ist, ob Mikrometastasen in ihrer jeweiligen Umgebung wachsen können. Therapeutisch werden die chirurgische Tumorresektion sowie beim Kolonkarzinom die adjuvante Chemotherapie, bzw. beim Rektumkarzinom die Radio-/Chemotherapie eingesetzt ( Schmoll et al., 1997).

Das Pankreaskarzinom ist eine hochmaligne Erkrankung mit der Eigenschaft, frühzeitig subklinische Metastasen auszubilden. Die Häufigkeit des Pankreaskarzinomes variiert in den westlichen Industrieländern, die Inzidenz liegt bei der männlichen Bevölkerung bei 10-12/100.000, bei der weiblichen Bevölkerung bei 7,5-9/100.000. Die Ätiologie ist unbekannt, sozioökonomische Faktoren sowie geographische Faktoren haben keinen signifikanten Einfluß auf die Inzidenz. Zigarettenrauchen konnte als Risikofaktor bestätigt werden, sowie einige Chemikalien (alpha-Naphtylamin, DDT und Ethylen). Bei ca. 80% der Pankreasmalignome handelt es sich um duktale Adenokarzinome. Das Pankreaskarzinom hat unter den gastrointestinalen Karzinomen die schlechteste Prognose. Therapeutisch werden Resektion mit eventuell postoperativer adjuvanter Chemotherapie durchgeführt, bzw. beim Vorliegen von Fernmetastasen wird eine palliative, d.h. eine nicht auf Heilung zielende, sondern an Beschwerdenlinderung und Lebensqualitätsverbesserung orientierte, Chemotherapie durchgeführt. Die Fünfjahresüberlebensrate für alle Stadien beträgt <1% mit einer medianen Überlebenszeit von 4-6 Monaten ( Schmoll et al., 1997).

Adjuvante postoperative Chemotherapie bedeutet, daß eine Therapie mit Zytostatika eingeleitet wird, obwohl Metastasen nicht nachweisbar sind, denn auch nach kurativ intentionierter Operation erleidet ein Teil der Patienten mit einem Kolonkarzinom einen Rückfall der Erkrankung (Lokalrezidiv oder Fernmetastasen). Bei allen Patienten mit einem Tumorrezidiv besteht demnach eine residuale Tumorerkrankung, die für das Rezidiv verantwortlich ist. Als Strategie böten sich immunologische Therapieformen an. Patienten mit minimaler Tumorerkrankung nach einer Operation eines Kolonkarzinoms sollten von immunologischen Therapieformen besonders profitieren, da diese Therapieformen ihre höchste Effektivität bei geringer Tumorlast haben ( Van Pel and Boon, 1982).

Zum Einsatz in der Chemotherapie des kolorektalen Karzinoms und des Pankreaskarzinoms kommen Antimetabolite, die durch Bindung an Enzymen die DNA -Synthese hemmen und somit die Zellteilung unterbinden. Dosiseinschränkend bei der Chemotherapie sind die teilweise sehr schwe


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ren Nebenwirkungen, die dadurch hervorgerufen werden, daß die Substanzen alle sich teilende Zellen angreifen. Besonders stark betroffen sind dabei die sich häufig teilenden Zellen des Immunsystems, des blutbildenden Systems und der Schleimhäute.

1.4. Tumor-assoziierte Antigene

Transformierte Zellen exprimieren qualitativ und quantitativ andere Antigene als Gewebe unter physiologischen Bedingungen. Der Nachweis solcher tumor-assoziierter Antigene in Patientenserum kann eine Möglichkeit zur Diagnostik, Verlaufsbeurteilung und Prognostik darstellen ( Seleznick , 1992). Die meisten Tumormarker sind Glykoproteine, die eine Funktion bei der Zelladhäsion, der Zell-Zell-Erkennung, bei der Zellaktivierung und bei der Signaltransduktion haben. Im folgenden wird auf die tumor-assoziierten Antigene CEA und CA 19-9 ausführlicher eingegangen.

Carcinoembryonic antigen ( CEA ) ist ein onkofetales Protein, das während der Embryonal- und Fetalzeit gebildet wird und ist der bekannteste und am besten beschriebene Tumormarker ( Gold and Freeman, 1965). CEA kommt hauptsächlich im fetalen Gastrointestinaltrakt und im fetalen Serum vor. Die Bildung von CEA wird nach der Geburt reprimiert. CEA ist nicht organspezifisch, und erhöhte Serumwerte finden sich bei vielen Tumorentitäten, speziell bei gastrointestinalen Tumoren. 95% aller kolorektalen Karzinome exprimieren CEA , und die Serumwerte korrelieren mit der Tumorausdehnung. Beim Pankreaskarzinom sind ungewöhnlich hohe CEA -Werte nachweisbar. Einschränkend für die Diagnostik wirkt sich die überaus geringe Sensitivität bei Patienten mit minimal residualer Erkrankung und der Einfluß des Rauchens und gutartiger gastrointestinaler Erkrankungen auf die Spezifität aus.

CEA kommt in zwei Formen vor, mit einem Molekulargewicht von 160.000 Dalton bzw. 180.000 Dalton. Die CEA Genfamilie gehört zur Immunglobulinsuperfamilie und umfaßt eine große Anzahl von Genen, sie gliedert sich in zwei Untergruppen, die CEA - und die schwangerschaftsspezifische Glykoprotein-Untergruppe. Die Mehrzahl der CEA -Untergruppenproteine sind stark glykosiliert und kommen entweder transmembran oder über einen Glykosylphosphatidylinositolanker mit der Plasmamembran verbunden vor ( Öbrink , 1997). Das Vorhandensein eines CEA exprimierenden Tumors muß nicht unbedingt im Serum nachweisbar sein, da eine Sekretion ins Serum nicht zwangsläufig ist. Die Sekretion von CEA kann in vitro durch die bakterielle glykosylphosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C bewirkt werden, die Vorgänge in vivo sind noch ungeklärt ( Yeatman et al., 1995; Low and Prasad, 1988). Schlom konnte 1995 die Peptidsequenzen der Epitope des CEA identifizieren, die von den MHC Klasse I-Molekülen der zytotoxischen T-Zellen erkannt werden. Eine Peptidsequenz die restriktiv von HLA -A2+ zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt wird, wurde CAP-1 benannt ( Schlom , 1995).

Cancer associated antigen ( CA 19-9 ) ist ein Glykolipid mit einem Molekulargewicht um 10.000 Dalton, das einem Hapten der Lewis-a-Blutgruppendeterminante entspricht. 3-7% der Bevölkerung haben die Blutgruppenkonstellation Lewis a-negativ/b-negativ, und können somit kein CA 19-9 exprimieren. CA 19-9 kommt im fetalen Epithel von Magen, Darm und Pankreas vor. Mit einer Sensitivität von 70-87% helfen CA 19-9 Testwerte bei der Differentialdiagnose und Verlaufskontrolle von Pankreaskarzinom-Patienten ( Haglund et al., 1986). Es besteht keine Korrelation der CA 19-9 Serumwerte mit der Tumormasse. CA 19-9 ist auch bei anderen gastrointestinalen Tumoren nachweisbar, erhöhte Werte finden sich auch bei einer Reihe benigner, inklusive entzündlicher Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, sowie bei der Mukoviszidose.


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1.5. Gentransfer in dendritische Zellen

Zum Einbringen fremder genetischer Information in eukaryotische Zellen stehen mittlerweile diverse Techniken zur Verfügung. Die Entscheidung für eine bestimmte Gentransfermethode ist abhängig von den Zielzellen, von den Sicherheitsrisiken und wird bestimmt von der Frage nach einer transienten oder langfristigen Genübertragung. Grob kann zwischen physikalischen und viralen Methoden unterschieden werden. Die Effizienz des Gentransfers kann mittels Markergenen, wie dem LacZ-Gen oder dem green fluorescent protein (GFP)-Gen bestimmt werden. Zu den physikalischen Methoden zählen die Elektroporation, der magneto-ballistische Gentransfer, die Liposomentechnik, sowie der ligandenvermittelte Transfer. Da die physikalischen Systeme nur eine recht geringe Effizienz haben, wurden virale Vektoren wie Adeno-, Retro, Herpes- und adenoassoziierte Viren etabliert.

Dendritische Zellen aus Monozyten lassen sich nur schlecht auf physikalischem Wege transfizieren ( Jill et al., 1997). DC und Langerhans-Zellen, die aus CD34 + Vorläuferzellen generiert werden, können mittels Elektroporation mit einer Effizienz von bis zu 16% transfiziert werden ( Tendeloo et al., 1998). Beim retroviralen Gentranfer konnten bei ‚jungen’ DC aus peripheren mononukleären Blutzellen (1-2 Tage alt) Effizienzen zwischen 28 und 67% erreicht werden, ohne die Zellen zu schädigen ( Westermann et al., 1998; Aicher et al., 1997). Die Transduktionsrate bei DC , die aus Knochenmark oder Nabelschnurblut gewonnen werden, liegt zwischen 15 - 21% ( Szabolcs et al., 1997).

Als kompetentester Vektor für die Infektion von dendritischen Zellen haben sich Adenoviren erwiesen. Unabhängig vom Ursprung der dendritischen Zellen werden Effizienzen zwischen 80 und 100% beschrieben ( Dietz and Vuk-Pavlovic, 1998; Di Nicola et al., Diao et al., 1999; Gong et al., 1997). Wegen bestehender Sicherheitsbedenken und um eine potentielle Immunogenität der Adenoviren zu umgehen, können Adenoviren durch UV-Bestrahlung inaktiviert werden ( Cristiano et al., 1993). An das Virus können dann kovalent Poly-L-Lysin oder Polyethylenimim gekoppelt werden, Plasmid-DNA bindet über diese Konjugate an das Adenovirus, das die Plasmid-DNA über die adenoviralen Infektionswege in die Zelle schleust, ohne sein eigenes zerstörtes Genom einbringen zu können ( Diebold et al., 1999; Mulders et al., 1998).

Für den adenoviralen Gentransfer werden meist Adenoviren des Serotyp 5 verwendet. Adenoviren haben einen Durchmesser von 60-90 nm, Fibern und einen ikosaedrischen Aufbau. Das Genom besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA von ungefähr 36 Kilobasen Länge, jedes Ende des viralen Genoms verfügt über das inverted terminal repeat (ITR), das linke Ende enthält das Verpackungssignal, beide Elemente werde für die virale Replikation und Verpackung benötigt. Man unterscheidet Bereiche der frühen und der späten Genexpression. Die E1-Region (early 1) enthält Gene, die für Proteine, die für Regulation und Transkription des viralen Genoms verantwortlich sind. Adenovirale Vektoren sind E1-deletiert, so daß die Viren ohne eine Wirtszellinie (üblicherweise die Zellinie 293), die die E1-Region in trans zur Verfügung stellt, replikationsdefizient sind. Die Infektion einer humanen Zelle durch ein Adenovirus basiert auf dem Zusammenspiel von zwei zellulären Rezeptoren mit dem Virus. Zuerst bindet das Virus mit seinem Fiberprotein an einem 46Kilodalton großen transmembranen Rezeptor, der als Coxsackievirusrezeptor (CAR) bekannt ist. Der Viruseintritt in die Zellen geschieht durch Internalisierung in clathrinbedeckte Vesikeln und wird über die Bindung viraler Pentonbasisproteine an die zellulären Integrine alphavbeta3 und alphavbeta5 vermittelt ( Bergelson et al., 1997; Wickham et al., 1993).

Die Verwendung adenoviraler Vektoren bietet mehrere Vorteile: Adenoviren sind gut beschrieben und untersucht; sie integrieren nicht in das Wirtsgenom, sondern liegen episomal vor; sie können im Gegensatz zu Retroviren auch Zellen infizieren, die sich nicht teilen; sie verfügen über eine hohe Kapazität für Fremdgene (bis zu 32 Kilobasen) und sie können in hohen Virustitern gewonnen werden ( Zhang , 1999).


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1.6. CIITA

Die präzise Regulation der MHC Klasse II-Gene spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle einer Immunantwort. MHC Klasse II-Moleküle, die den CD4 + T-Zellen Peptide präsentieren, binden Peptide von Proteinen, die in angesäuerten Vesikeln abgebaut wurden. Die Präsentation von antigenen Peptiden durch den MHC Klasse II-Komplex erfordert die Coexpression der invarianten Kette, welche zum einen in der antigenbindenden Furche bindet, um Peptidbindung im endoplasmatischen Retikulum zu verhindern, zum anderen die MHC Klasse II-Komplexe in spezielle zelluläre Kompartimente führt, wo die Fremdpeptidbeladung stattfindet. Des weiteren wird das enzymatische HLA -DM Protein benötigt, welches die Proteine der invarianten Kette beseitigt und die Fremdantigenbindung somit ermöglicht ( Denzin and Creswell, 1995; Fremont et al., 1996; Sherman et al., 1995).

Genetische und biochemische Analysen haben verschiedene DNA -bindende und nicht DNA -bindende Proteine identifiziert, die die Funktion von MHC Klasse II-Genen regulieren ( Boss , 1997). Die Gene für die invariante Kette, HLA -DM und für die MHC Klasse II-Komplexe stehen unter der Kontrolle des MHC II-Transaktivators CIITA ( Chang et al., 1996). CIITA ist ein 125 kDa großer, nicht DNA -bindender Transkriptionsaktivator, dessen Domänen mit Transkriptionsfaktoren assoziiert sind ( Chin et al., 1997). Das Gen für CIITA konnte 1993 kloniert werden ( Steimle et al., 1993). CIITA ist auch an der IFN-gamma( induzierten Expression von MHC Klasse II-Komplexen beteiligt und kann ebenfalls die Expression von MHC Klasse I-Komplexen bewirken, indem es den Promotor des MHC Klasse I-schwere Ketten-Genes induziert ( Martin et al., 1997). Die zentrale Bedeutung des Transaktivators zeigt sich im Tierversuch. Mäuse ohne CIITA zeigen eine Behinderung der MHC Klasse II-Expression ( Chang et al., 1996). Beim Menschen führt das Fehlen von CIITA zu einer schweren Immundefizienz, dem bare lymphocyte syndrome (Nackte-Lymphozyten-Syndrom).


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Thu Jun 15 9:43:05 2000