Märten, Angela: Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Material

Es wurden Einwegmaterialien der Firma Falcon® (Becton Dickinson, Heidelberg) verwendet.

3.1.1. Chemikalien und Reagenzien

Biochrom KG
(Berlin)

Collagenase III; Collagenase IV; Gentamycin; Penicillin/Streptomycin; MEM Vitamine 100×; Trypanblau 0,5%; L-Glutamin; L-15 Medium

BioRad
(München)

BCIP/NBT Substrat

B.Braun
(Melsungen)

Glukose 20%

Gibco BRL
(Karlsruhe)

2-Mercaptoethanol, HBSS Puffer, HEPES , humanes rekombinantes Transferrin, Lymphoprep, RPMI 1640 mit Glutamax; RPMI 1640 farblos; Taq-Polymerase; Natriumhydrogencarbonat

Hoechst
(Bad Soden a. Ts)

    Humanes Alt-Insulin

Hölzel Diagnostics
(Köln)

    Humanes IFN-gamma ELISpot Kit

Invitrogen
(Groningen, Niederlande)

    beta-gal-staining kit

PAA
(Cölbe)

BSA ; FCS (Lot A01428-291); PBS w/o Ca2+/Mg2+

Qiagen
(Hilden)

Plasmidpräparation-Mega-Endotoxin free-Kit; QiaShredder-Kit; RNA-Präparations Kit

Roche Diagnostics
(Mannheim)

DNA -Marker III; DNase I; Cytotoxicity Detection Kit

Sigma
(Deisenhofen)

Ammoniumchlorid; Ampicillin; Agarose; Bacto Agar; Borsäure; Bromphenolblau/Xylencyanol; D-Glukose; DMSO 99%, EDTA ; Ethidiumbromid; Glyzerol; Hefeextrakt; Hyaluronidase; IGEPAL; Isopropanol; Kaliumhydrogencarbonat; di-Kaliumhydrogenphosphat; Kaliumdihydrogenphosphat; Kalziumchlorid; Kanamycin; Magnesiumchlorid; Natriumazid; Myoglobin (aus Rinderherz); Natriumchlorid; Natriumzitrat; Pepton; Poly-L-Lysin mit einem Molekulargewicht von 160-200.000Da; Salzsäure; Schwefelsäure; Tris Base; Zitronensäure

3.1.2. Zytokine und Stimulanzien

Boehringer Ingelheim
(Ingelheim)

Imukin (humanes rekombinantes Interferon-gamma )

Calbiochem
(Schwalbach)

Cancer Associated Antigen;
Carcinoembryonic Antigen


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Chiron
(Ratingen)

Proleukin (humanes rekombinantes Interleukin-2 )

Essex Pharma
(München)

Leucomax 300 ( GM-CSF );
humanes rekombinantes Interleukin-4

Eurogentec
(Hamburg)

CAP-1 mit der Aminosäuresequenz: YLSGANLNL;
PepCD19 mit der Aminosäuresequenz: IFAAAQEL

Roche Diagnostics
(Mannheim)

humanes rekombinantes Interleukin-1beta

Sigma
(Deisenhofen)

Phytohämagglutinin

3.1.3. Antikörper

Beckman-Coulter
(Krefeld)

Isotypkontrolle anti-Maus IgG1-PE/FITC;
Isotypkontrolle anti-Maus IgM -FITC,
anti CD3 (HIT3a)-FITC (IgG2a); anti CD3 (UCHT1)-FITC;
anti CD4 (13B8.2)-PE; anti CD8 (B9.11)-PE;
anti CD14 (RMO52)-PE; anti CD80 (MAB104)-FITC;
anti CD83 (HB15A)-FITC; anti CD86 (HA5.2B7)-FITC;
anti CA 19-9 (121-SLE)-IOPath

Chemicon
(Tenecula, CA, USA)

anti alphavbeta5 (MAB 1961)

DAKO Diagnostics
(Hamburg)

anti CD66a/b/c/d/e (Kat4c)-FITC (anti CEA)

Janssen-Cilag
(Neuss)

Orthoclone OKT3 (Muromonab = anti CD3)

Medac
(Wedel)

Ziege anti Maus IgG1-PE

Pharmingen
(Hamburg)

anti CD1a (HI149)-PE; anti HLA-ABC (MaP.DM1)-FITC;
anti HLA-DR (TÜ36)-FITC

Sigma (Deisenhofen)

anti CD8 (UCHT-4)-FITC (IgG2)

 

    HLA-A2/IgG1-Komplex (Dimer) war eine freundliche Gabe von T. Greten, Medizinische Hochschule Hannover

 

    anti CA-Rezeptor war eine freundliche Gabe von T. Heinicke, Medizinische Einrichtungen Bonn

 

anti CMRF-44 (IgM) war eine freundliche Gabe von D.N.J. Hart, Christchurch Hospital, Neuseeland

Soweit nicht anders vermerkt handelt es sich um monoklonale IgG1-Antikörper von der Maus, die gegen menschliche Epitope gerichtet sind.


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3.1.4. Zellinien

DSMZ
(Braunschweig)

DAN-G (humane Pankreaskarzinomzellinie)
293 (embryonale Nierenzellen)

ECACC
(Salisbury, Wiltshire, UK)

Colo 201;
Colo 205 (humane Kolonkarzinom-Zellinien)

3.1.5. Bakterien, Plasmide, Primer

Invitrogen
(de Schelp, Niederlande)

pcDNA3.1/HisB/LacZ

Mologen (Berlin)

    pcR2.1-TOPO-HSCIITA (das Insert mit einer Größe von 3,5kb beinhaltet das CIITA-Gen, das unter CMV-Promotor Kontrolle steht)

Stratagene (Amsterdam, Niederlande)

XL1-Blue MRF’ strain (Epicurian Coli);
b-Aktin-Primer (ergeben ein Fragment von 661 Basenpaaren Länge)

TIB Molbiol
(Berlin)

CIITA-Primer (forward: GAG GCT TAT GCC AAT ATC GCG)
(reward: CTA GGA TGA GCA GAA CGC GGT);
Die Primer binden an den Stellen +277 (forward) und +1356 (reward)

 

UV-inaktivierter Adenovirus, Typ 5, kovalent an Poly-L-Lysin gekoppelt ( AdV-PLL ) mit einem Titer von 8-10×1010 plaque forming units/ml (pfu/ml) wurde von Nancy Weigel, BCM Texas Medical Center, Houston, TX, USA bezogen

Abbildung 2: Vektorkarte des pCR2.1-TOPO-HSCIITA


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3.1.6. Lösungen und Puffer

ACD

Natriumzitrat 16 g/L; Zitronensäure 4,7 g/L; D-Glukose 25 g/L

in Aqua bidest, bei 121 °C autoklaviert

Blocking solution

BSA 4%

in PBS, durch 0,2 µm-Filter sterilfiltriert

Erythrozytenlyse-Puffer

Ammoniumchlorid 8,29 g/L ; Kaliumhydrogencarbonat 1,0 g/L; EDTA 0,0371 g/L

in Aqua bidest, durch 0,2 µm-Filter sterilfiltriert

HBS-Puffer

Natriumchlorid 150 mM; HEPES 20 mM

pH 7,3; in Aqua bidest; bei 121 °C autoklaviert

Isolationslösung

DNase I 108 U/L; Collagenase III 240 mg/L; Collagenase IV 560 mg/L; Hyaluronidase 200 mg/L; H-Alt-Insulin 80 U/L

in HBSS-Puffer, durch 0,2 µm-Filter sterilfiltriert

Ladepuffer 6×

EDTA 0,2 M; Glycerol 25%; Bromphenolblau/Xylencyanol 0,4%

in 1× TBE-Puffer

PBS++

Magnesiumchlorid 0,1 g/L; autologes Serum 2%

in PBS

TBE 10×

Tris Base 108 g/L; Borsäure 55 g/L; EDTA 20 mM

pH 8,0 in Aqua bidest

3.1.7. Kulturmedien


RPMI-Medium

Fetales Kälberserum 10% (30 min bei 56 °C hitzeinaktiviert); Penicillin 105 U/L; 105 µg/L Streptomycin

in RPMI 1640 mit Glutamax


Hepes-Medium

Fetales Kälberserum 10% (30 min bei 56 °C hitzeinaktiviert); Penicillin 105 U/L; 105 µg/L Streptomycin; HEPES 25 mM

in RPMI 1640 mit Glutamax


DC-Medium

Autologes Serum 10%; Penicillin 105 U/L; 105 µg/L Streptomycin; HEPES 25 mM

in RPMI 1640 mit Glutamax


Zytotox-Medium

Fetales Kälberserum 2% (30 min bei 56 °C hitzeinaktiviert); Penicillin 105 U/L; 105 µg/L Streptomycin; L-Glutamin 1 mM; HEPES 25 mM

in RPMI 1640 farblos


Leibovitz-Medium

L-Glutamin 1 mM; Glukose 20% 2,5ml/L; MEM-Vitamine 1×; hTransferrin 2,5 g/L; Natriumhydrogencarbonat 1 g/L; Gentamycin 10 mg/L; H-Alt-Insulin 80 U/L; Amphotericin B 2,5 mg/L

in L-15 Medium


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Einfriermix

    DMSO 20%; FCS 40% Zellkulturmedium 20%


LB-Medium
(LB-Agar)

Pepton 10 g/L; Natriumchlorid 10 g/L; Hefeextrakt 5 g/L; Ampicillin 200 mg/L; Kanamycin 10 mg/L, (Agar 15 g/L)

    in Aqua bidest; bei 121 °C autoklavieren; Zugabe von Antibiotika bei 40 °C

3.2. Methoden

3.2.1. Zellkultur

Alle Zellen wurden bei 37 °C , 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert (Cytoperm 2, Heraeus, Hanau). Zur Zellernte und für Medienwechsel wurden adhärente Zellen mechanisch mittels eines cell-scrapers bzw. eines Gummiwischers gelöst. Die so gewonnenen Zellen wurden in einem sterilem Röhrchen bei 400×g über zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Varifuge 3.0, Heraeus Sepatech, Hanau). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in frischem Medium resuspendiert. Die permanenten Zellinien wurden in RPMI-Medium kultiviert und alle drei Tage 1:3 gesplittet.

Die Zellzahlbestimmung erfolgte durch Färbung mit Trypanblau. 20 µl Zellsuspension wurden mit 180 µl Trypanblau 0,5% 1:10 verdünnt. Ein Aliquot wurde unter ein Deckglas auf eine Neubauer-Zählkammer gegeben, lichtmikroskopisch erfolgte dann die Auszählung von vier Quadranten. Ein Quadrant enthält 0,1 µl Zellsuspension.

Zum Einfrieren der Zellen wurden 5×106 Zellen in einem Cryoröhrchen in 1 ml Medium aufgenommen und tropfenweise 1 ml Einfriermix zugegeben. Die Cryoröhrchen wurden umgehend für 24 Stunden in einen -80 °C-Tiefkühlschrank gestellt und am nächsten Tag in Flüssigstickstoff gelagert. Alle Schritte erfolgten auf Eis.

Zum Auftauen wurden die Zellen aus dem Flüssigstickstoff in einem 37 °C-Wasserbad aufgetaut, dann erfolgte eine tropfenweise Zugabe von vorgewärmten Medium. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Zellen gezählt und in einer Zellkulturflasche ausplattiert.

Alle Arbeiten erfolgten unter einer sterilen Werkbank (Herasafe 12, Heraeus, Hanau).

3.2.1.1. Gewinnung peripherer mononukleärer Zellen

Die Zellisolierung erfolgte über Dichtegradientenzentrifugation. Zur Unterdrückung der Gerinnung wurden 100 ml humanes peripheres Blut sofort nach der Entnahme mit 20 ml ACD gemischt. Das Blut wurde 1:1 mit PBS/1% BSA verdünnt. In einem Röhrchen wurde ein Teil Lymphoprep® (9,6% Metrizamid®; 5,6% Ficoll®) vorgelegt und vorsichtig mit zwei Teilen Blut überschichtet. Die Röhrchen wurden 30 min bei 800×g ohne Bremse zentrifugiert ( Bøyum , 1964). Serum wurde aus dem Überstand entnommen und bei 4 °C aufbewahrt. Die Interphase mit den mononukleären Zellen wurde abpipettiert, mit PBS/1% BSA auf 50 ml aufgefüllt und 10 min bei 400×g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 ml PBS/1% BSA aufgenommen und erneut zentrifugiert. Es wurden insgesamt drei Waschschritte durchgeführt, im Anschluß erfolgte eine Zellzahlbestimmung.

3.2.1.2. Herstellung von CIK-Zellen

Nach der Isolierung mononukleärer Zellen wurden die Zellen in Hepes-Medium aufgenommen und die Zellzahl auf 5×106/ml eingestellt. Die Zellen wurden à 4 ml pro well in 6-Loch-Platten ausgesät und eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Der Überstand mit den nicht adhärierten Zellen wurde durch Spülen gelöst und in Zellkulturflaschen überführt. Die Zelldichte wurde auf 3×106/ml einge


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stellt, die Lymphozyten wurden durch Zugabe von 1000 U/ml IFN-gamma stimuliert. Am Tag +1 wurden 300 U/ml IL-2, 5 ng/ml anti-CD3 und 100 U/ml IL-1b zugegeben. Jeden dritten Tag erfolgte eine weitere Zugabe von 300 U/ml IL-2. Die Zelldichte wurde durch Mediumzugabe während der Kultivierung konstant gehalten, Zentrifugationsschritte wurden vermieden ( Schmidt-Wolf et al., 1991).

3.2.1.3. Generierung und Pulsen von dendritischen Zellen

Die unter 3.2.1.1 gewonnenen und in 6-Loch-Platten adhärierten Zellen wurden mit 2 ml DC-Medium pro well unter Zugabe von 500 U/ml GM-CSF und 500 U/ml IL-4 kultiviert ( Romani et al., 1994). Um eine Stimulation durch im fetalen Kälberserum enthaltene Fremdantigene zu vermeiden, wurden die DC in autologem Serum kultiviert. Die dendritischen Zellen wurden am Tag +1 durch Zugabe von Protein gepulst, bei der Verwendung von Peptiden erfolgte die Zugabe am Tag +5. Am vierten Tag der Kultivierung wurde der Überstand zentrifugiert und in frischem DC-Medium mit Zytokinen (500 U/ml GM-CSF , 500 U/ml IL- 4) aufgenommen.

3.2.1.4. Cokultivierung von CIK-Zellen mit dendritischen Zellen

Am Tag +7 wurden dendritische Zellen mit autologen CIK-Zellen cokultiviert. Die DC eines wells wurden mit einem Gummiwischer gelöst, nach einem Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in 2 ml DC-Medium resuspendiert und gezählt. Die CIK-Zellen wurden mit 1 ml Hepes-Medium pro well ausgesät, so daß sich ein Stimulator zu Responder Verhältnis von 1:2-1:6 ergab. Die cokultivierten Zellen wurden ab dem Zeitpunkt der Cokultivierung nur noch mit IL-2 stimuliert. An Tag +14 wurden die CIK-Zellen analysiert.

3.2.1.5. Einzelzellisolierung von Tumorzellen

Die Einzelzellisolierung aus Gewebe erfolgte enzymatisch. Der Tumor wurde mit einem Skalpell in einer Petrischale kleingeschnitten und in 2 mm³ große Stücke zerkleinert. Die so gewonnenen Stücke wurden mit einer sterilen Pinzette in ein 50 ml Röhrchen überführt und 15 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln (200 spm) mit 15 ml Isolationslösung inkubiert. Der Überstand wurde entnommen und in ein Röhrchen überführt, mit 50 ml PBS aufgefüllt und zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Das Pellet wurde mit zehn Teilen Erythrozytenlyse-Puffer versetzt und inkubierte 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die verbliebenen Tumorstücke wurden erneut mit 15 ml Isolationslösung versetzt und geschüttelt. Es wurden insgesamt drei Isolations- und Erythrozytenlysierungsgänge durchgeführt ( Kemmner et al., 1987).

Nach der Erythrozytenlyse wurden die Zellen zentrifugiert. Die Pellets und das nicht isolierte Tumormaterial wurden nacheinander durch ein 100 µm, 70 µm und ein 40 µm Nylonsieb gedrückt. Dafür wurde das jeweilige Nylonsieb auf ein 50 ml Röhrchen gesetzt und mit dem Kolben einer 5 ml Spritze wurde das Material durchgerieben. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 107 Zellen/ml in Leibovitz-Medium aufgenommen und ausgesät. Bei Konfluenz wurden die Zellen 1:2 gesplittet.

3.2.2. Molekularbiologische Techniken

3.2.2.1. Herstellung kompetenter Bakterien

Eine Vorkultur von XL1-Blue MRF’ strain wurde über Nacht angelegt. Die Vorkultur wurde 100fach in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37 °C bis zu einer definierten Zelldichte kultiviert. Die Zelldichte wurde durch Messung der Absorption bei 600 nm mit 1 mm-Küvetten bestimmt und lag bei einer O.D. von 0,6 - 0,9. Die Zellen wurden nach Erreichen der Zelldichte für 5 min auf Eis inkubiert, anschließend durch Zentrifugation bei 2500×g über 5 min bei 4 °C (Sorvall RC-5B, Krefeld) geerntet, und das Zellsediment in 20 ml eiskalter 50 mM Kalziumchlorid-Lösung resuspendiert.


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Nach einer Inkubation auf Eis für 30 min wurden die Zellen erneut zentrifugiert (2500×g, 5 min, 4 °C), anschließend in 5 ml eiskalter 50 mM Kalziumchlorid-Lösung und 1 ml 100% Glyzerol resuspendiert und für mindestens 3 Stunden auf Eis inkubiert. Die nun kompetenten Bakterienzellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.2.2. Transformation von Bakterien

Nach Auftauen der kompetenten Zellen (100 µl) auf Eis wurde 1 µg DNA zu der Zellsuspension gegeben und für 45 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte für 90 sec. ein Hitzeschock bei 42 °C und eine erneute Inkubation für 5 min auf Eis. Nach Zugabe von 1 ml LB-Medium wurden die Bakterien für 45 min bei 37 °C inkubiert. 50 µl der Suspension wurden direkt auf LB-Ampicillin-Kanamycin-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde ein Einzelklon gepickt und in 10 ml LB-Medium über 3 Stunden kultiviert, diese Vorkultur wurde in 500 ml LB-Medium mit Ampicillin und Kanamycin überführt und über Nacht bei 37 °C vermehrt.

3.2.2.3. Gentransfer in dendritische Zellen

Der Gentransfer erfolgte mittels UV-inaktiviertem Adenovirus, an das kovalent Poly-L-Lysin gebunden ist ( AdV-PLL ). Das Adenovirus wurde mit einer multiplicity of infection (MOI) von 80-100 eingesetzt, d.h. 80-100 ‚infektiöse’ Partikel pro Zelle. Ein Transfektionscocktail bestehend aus 29,4 µl HBS; 1 µl Plasmid-DNA (Konzentration 100 µg/ml); und 4,5 µl AdV-PLL wurde lichtgeschützt und in Polystyrol-Röhrchen angesetzt. Der Ansatz inkubierte 30 min bei Raumtemperatur und wurde zwischendurch mehrmals sanft geschüttelt. Zur weiteren Komplexbildung wurden 15,1 µl Poly-L-Lysin zugegeben und weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Die dendritischen Zellen (5×105 Zellen/well) wurden in 1 ml PBS++ aufgenommen, dazu wurde der Transfektionscocktail zugegeben. Die Platte wurde über zwei Minuten bei 200×g zentrifugiert und im Anschluß für zwei Stunden im Brutschrank inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von DC-Medium mit Zytokinen (500 U/ml GM-CSF , 500 U/ml IL- 4). Nach zwei Tagen wurde das Medium gewechselt ( Cristiano et al., 1993). Gentechnische Abfälle wurden gemäß des Gentechnikrechtes entsorgt.

3.2.2.4. Plasmidherstellung

Die präparative Reinigung von Plasmid-DNA wurde nach dem Protokoll des EndoFree Plasmid Mega Kit (QIAGEN, Hilden) durchgeführt. Dieses basiert auf einer modifizierten alkalischen Lyse ( Birnboim and Doly, 1979) und nutzt die selektive Bindung von Nukleinsäuren an das Qiagen-Anionenaustauscherharz. Die Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt ([dsDNA mg/ml] = 50 × Verdünnung × O.D.260 nm), die Reinheit wurde durch den Quotienten der Extinktionen bei 260 nm und 280 nm errechnet.

3.2.2.5. RNA-Isolierung

Die präparative Isolierung von RNA wurde nach dem Protokoll des RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden) durchgeführt. Dieses nutzt die selektive Bindung von RNA an einer Kieselgelmembran. Die Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt (RNA [mg/ml] = 40 × Verdünnung × O.D.260 nm), die Reinheit durch den Quotienten der Extinktionen bei 260 nm und 280 nm errechnet. Es kam RNA mit einem Quotienten zwischen 1,8 und 2,1 zur Verwendung.


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3.2.2.6. RT-PCR

Die Umschreibung der isolierten RNA in cDNA, sowie deren Vermehrung mittels PCR-Technik wurde mittels des SuperScript™ One-Step™ RT-PCR System (Gibco BRL, Karlsruhe) durchgeführt. Das Programm umfaßte die Schritte: Umschreibung der RNA in cDNA (45 °C, 45 min), Prä-Denaturierung der cDNA (94 °C, 3 min) und daran anschließend 34 Zyklen bestehend aus: Denaturierung (95 °C, 3 min), Annealing (64 °C, 45 sec) und Extension (68 °C, 1min). Abschließend fand eine weitere Extension über 5 min bei 68 °C statt. Die Konzentration an cDNA wurde photometrisch bestimmt ( Chomczynski and Sacchi, 1987)

3.2.2.7. Gel-Elektrophorese

Zur horizontalen Gel-Elektrophorese wurde ein 1% Agarosegel mit 2 µg/µl Ethidiumbromid verwendet. 2 µg DNA wurden mit 1/6 Volumen 6× Ladepuffer versetzt und mit Laufpuffer ad 24µl aufgefüllt. Die Proben wurden in die Geltaschen pipettiert, die Auftrennung erfolgte bei 60 V Gleichspannung bei einer Laufzeit von 1,5 Stunden. Zur Größenbestimmung wurde ein Größenmarker mitgeführt. Die Auftrennung wurde unter UV-Licht kontrolliert und fotografisch dokumentiert.

3.2.3. Analytik

3.2.3.1. Zytotoxizitätsnachweis

Es wurde als nicht radioaktive Alternative zum 51Cr release assay das Cytotoxicity Detection Kit (Roche, Mannheim) verwendet. Es mißt mittels einer enzymatischen Reaktion, bei der ein Tetrazoliumsalz in ein Formazanprodukt umgewandelt wird, die quantitative Freisetzung des Enzyms Laktatdehydrogenase (LDH), welches bei der Zellyse freigesetzt wird ( Cook and Mitchell, 1987).

Targetzellen, deren Lyse durch Effektorzellen induziert werden soll, wurden mit 10.000 Zellen pro well in einer 96-Loch-MTP à 100 µl ausgesät. Um einen Hintergrund durch in FCS enthaltenes LDH und als pH-Indikator beigefügtes Phenolrot zu vermeiden, wurde RPMI 160 farblos mit einem Serumgehalt von 2% (Zytotox-Medium) verwendet. CIK-Zellen wurden in 100 µl/well so zugegeben, daß sich Effektor zu Target Verhältnisse im Bereich von 80:1 bis 2,5:1 ergaben. Parallel dazu wurde eine Platte mit Effektorzellen ohne Targetzellen pipettiert, um die Spontanfreisetzung der Effektorzellen zu bestimmen. Die wells wurden mit Zytotox-Medium ad 200 µl/well aufgefüllt. Es wurden jeweils drei gleiche wells pipettiert. In sechs wells wurden Targetzellen ohne Effektorzellen pipettiert, um die Spontanfreisetzung der Targetzellen zu bestimmen. Ebenfalls als Sechsfachbestimmung wurde die Maximalfreisetzung der Targetzellen induziert, indem ein anionisches Detergenz (IGEPAL) 1% zu den Targetzellen gegeben wurde.

Nach einer fünfstündigen Inkubation im Brutschrank wurden die Platten zentrifugiert (200×g, 7 min). 50 µl Überstand wurden geerntet und in eine neue 96-well-Platte überführt. Zu den Proben wurden 50 µl Substrat zugegeben, die Farbreaktion wurde nach ca. 20 min durch 50 µl einer 1 M Salzsäure/well abgestoppt. Die Extinktion wurde photometrisch bei 492 nm bestimmt. Die Extinktion von Zytotox-Medium wurde als Blank gemessen und von den gemessenen Extinktionen abgezogen. Zytotox-Medium mit 1% IGEPAL wurde als Blank für die maximal lysierten Targetzellen verwendet. Die prozentuale Zytotoxizität berechnet sich nach der Formel:


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3.2.3.2. Durchflußzytometrie

In der Durchflußzytometrie können Einzelzellen gemäß ihrer Größe und Granularität dargestellt werden. Durch Zugabe spezifischer fluoreszenzmarkierter Antikörper können Oberflächenmarker auf den Zellen detektiert werden.

Für jede Färbung wurden 105 Zellen geerntet, zentrifugiert und in 100 µl PBS/1% BSA resuspendiert, von Fluorisothiocyanat ( FITC ) markierten Antikörpern wurden 10 µl, von Phycoerythroin ( PE ) markierten Antikörpern 5 µl zugegeben, die Zellen inkubierten 15 min auf Eis im Dunkeln. Daran schloß sich ein Waschschritt an, die Zellen wurden dann in 1 ml PBS/1% BSA aufgenommen und innerhalb von 24 Stunden gemessen. Bei der Verwendung unkonjugierter Antikörper (15 µl pro Ansatz) wurde nach dem Waschen ein sekundärer, markierter Antikörper zugegeben, der gegen den Idiotyp des ersten Antikörpers gerichtet ist. Die zweite Inkubation dauerte ebenfalls 15 min, woran sich ein Waschschritt anschloß. Die Messungen wurden am EPICS XL der Firma Coulter-Beckmann, Krefeld durchgeführt. Es wurden jeweils mindestens 30.000 Zellen gemessen.

3.2.3.3. Dimeruntersuchungen

Mittels der Dimertechnik können T-Zellen, die einen spezifischen Rezeptor exprimieren, durchflußzytometrisch erkannt werden. Die Aminosäuresequenz des Epitops und der HLA-Typ müssen hierfür bekannt sein. Durch Zweitfärbungen können die rezeptorspezifischen Zellen hinsichtlich des Anteiles der zytotoxischen Zellen weiter eingeengt werden ( Greten et al., 1998).

Ein chimeres Protein, bestehend aus einem Immunglobulinanteil und einem HLA-A2-Rezeptoranteil wurde mit HLA-A2 spezifischen Peptid beladen. 10 µl Dimer wurden hierfür mit 3,2 µg Peptid über 14 Tage bei 4 °C beladen. Das Peptid wurde in PBS/0,01% Natriumazid gelöst.
Die Färbung nach zytotoxischen T-Zellen und nach Zellen mit dem entsprechenden T-Zellrezeptor erfolgte leicht modifiziert zum oben beschriebenen Durchflußzytometrieprotokoll. 106 CIK-Zellen wurden 40 min mit 10 µl peptidbeladenem Dimer auf Eis inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde 10 µl anti-Maus IgG1-PE zugegeben und 20 min auf Eis inkubiert, um den Immunglobulinanteil des Dimers zu detektieren. Nach einem Waschschritt wurden 10 µl anti CD8-FITC (IgG2), der direkt an den Zellen bindet, zupipettiert und weitere 20 min bei 4 °C inkubiert. Das Pellet wurde nach dem Waschen in 500 µl PBS/1% BSA aufgenommen. Es wurden mindestens 100.000 Zellen gemessen. Als Kontrollansatz diente ein Dimer, das mit irrelevantem Protein beladen wurde. Die Einstellungen am Durchflußzytometer wurden so gewählt, daß die Messung mit Dimer, das mit dem irrelevanten Peptid beladen war, dem Nullwert entsprach.

3.2.3.4. ELISpot-Analytik

Die ELISpot-Technik erlaubt es, die Zytokinproduktion einzelner Zellen zu detektieren ( Versteegen et al., 1998). Es wurde ein humanes IFN-gamma ELISpot Kit (Hölzel, Köln) verwendet. Hierbei werden Zellen auf einer mit monoklonalem Antikörper beschichteten 96-well HATF-Membran-Platte (Millipore, Bedford, MA, USA) ausgesät. Die Zellen werden mit Phytohämagglutinin in einer Konzentration von 20 µg/ml aktiviert. Während einer zweitägigen Inkubation bindet von den Zellen produziertes IFN-gamma an den Antikörper und kann nach Entfernen der Zellen durch einen sekundären, biotinylierten Antikörper markiert werden. Streptavidin-alkalische Phosphatase bindet an das Biotin und wird mittels BCIP/NBT Substrat nachgewiesen. Auf der Nylonmembran befinden sich nun blaue Spots, die unter einem Binokular-Mikroskop ausgezählt werden können. Es wurden Zellzahlen zwischen 106 und 105/ml eingesetzt.


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3.2.3.5. Nachweis transfizierter Zellen

Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz wurde ein b-gal-staining kit (Invitrogen, De Schelp, Niederlande) verwendet. Das Kit erlaubt den Nachweis von Zellen, die mit einem Plasmid, das lacZ exprimiert, transfiziert worden sind. LacZ ist ein bakterielles Gen, das bei eukaryotischen Transfektionen als Reportergen verwendet wird, da das Produkt b-Galaktosidase, proteolytisch nicht abgebaut wird. Transfizierte Zellen können das Substrat X-gal in einen blauen Farbstoff umwandeln. Der Prozentsatz blau gefärbter Zellen wurde lichtmikroskopisch bestimmt.


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3.2.3.6. Tumormarkerbestimmung

Die Bestimmung von Tumormarker im Serum wurde freundlicherweise vom Tumormarkerlabor der klinischen Biochemie der Medizinischen Einrichtungen der Universität Bonn durchgeführt. Hierzu wurde die ELECSYS-Methode der Firma Roche Diagnostics (Mannheim) verwendet. Angewendet wird das Sandwich-Prinzip. Die Probe bildet mit einem biotinylierten monoklonalen Antikörper und einem mit Ruthenium-Komplex markierten zweiten monoklonalen Antikörper einen Sandwich-Komplex. In der Meßzelle werden die Mikropartikel magnetisch auf der Oberfläche einer Elektrode fixiert, durch Anlegen elektrischer Spannung wird die Chemolumineszenz Emission induziert, die mittels Photomultiplier gemessen wird.


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