Märten, Angela: Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Generierung von dendritischen Zellen

In Anlehnung an das Romaniprotokoll ( Romani et al., 1994) konnte ein Vorgehen zur Generierung von dendritischen Zellen aus Patienten- oder Spenderblut etabliert werden. Die durch Dichtegradientenzentrifugation und Adhäsion an Zellkulturmaterialien gewonnenen. Monozyten/Makro-phagen zeigten nach Stimulation mit Interleukin-4 und GM-CSF nach wenigen Tagen morphologisch das typische Erscheinungsbild von dendritischen Zellen (siehe Abb. 3). Die Kultivierung der dendritischen Zellen konnte problemlos in autologem Serum durchgeführt werden. Aus 100 ml Blut wurden 5-10×107 adhärente Zellen gewonnen. Die Zellzahl nahm im Verlauf der Differenzierung um durchschnittlich 75% ab.

Abbildung 3: Dendritische Zellen an Tag +6 der Kultivierung (fotografiert bei 400facher Vergrößerung)

4.1.1. Durchflußzytometrische Untersuchung dendritischer Zellen

Die nach Zytokinstimulation gewonnenen DC wurden im Durchflußzytometer bezüglich ihrer Oberflächenmerkmale charakterisiert. Dendritische Zellen ließen sich durch das parallele Vorliegen unterschiedlicher Reifegrade in der durchflußzytometrischen Darstellung nur schwer als Population definieren (siehe Abb. 4), konnten aber sicher von CD14 + Monozyten abgegrenzt werden.

Abbildung 4: Durchflußzytometrische Darstellung dendritischer Zellen (Tag +5)

Um die Reifung der dendritischen Zellen zu verfolgen, wurden die Zellen nach unterschiedlicher Kultivierungsdauer mit den jeweiligen Antikörpern gefärbt und im Durchflußzytometer gemessen. Es wurden ungepulste, am Tag+1 mit 100ng Humanalbumin/ml gepulste DC , sowie gepulste und ungepulste dendritische Zellen nach Cokultur mit CIK-Zellen untersucht. Dendritische Zellen ließen


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sich aufgrund ihrer Größe und Granularität von cokultivierten CIK-Zellen sicher abgrenzen.

Tabelle 1: Expression von Oberflächenmarkern auf dendritischen Zellen

DC -Alter [d] (Cokultur ab Tag +7)

1

3

5

9

11

13

CD1a exprimierende DC

0,4 ± 0,2%

11,1 ± 1,7%

13,5 ± 1,2%

19,2 ± 3,8%

34,8 ± 1,3%

25,7 ± 1,6%

CD1a Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

30,0 ± 1,5%

49,4 ± 3,3%

38,8 ± 1,8%

CMRF-44 exprimierende DC

12,0 ± 1,5%

28,7 ± 3,3%

24,1 ± 3,2%

52,5 ± 2,0%

49,7 ± 4,1%

54,5 ± 3,0%

CMRF-44 Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

60,8 ± 1,8%

51,2 ± 4,5%

55,2 ± 1,8%

CD83 exprimierende DC

8,2 ± 1,0%

21,0 ± 1,9%

11,2 ± 1,1%

24,4 ± 0,9%

35,8 ± 5,8%

35,0 ± 7,0%

CD83 Expression auf stimulierten cokultivierten DC

 

37,1 ± 0,7%

37,9 ± 5,0%

42,5 ± 0,9%

CD80 exprimierende DC

10,7 ± 1,6%

20,5 ± 0,8%

15,6 ± 3,1%

28,3 ± 0,2%

50,3 ± 0,8%

47,2 ± 4,1%

CD80 Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

45,5 ± 0,7%

54,8 ± 3,1%

56,8 ± 1,3%

CD86 exprimierende DC


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TENT#

35,9 ± 2,3%

28,3 ± 2,1%

32,2 ± 2,8%

42,8 ± 7,9%

57,1 ± 4,3%

52,1 ± 4,0%

CD86 Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

60,8 ± 1,8%

65,8 ± 1,8%

65,3 ± 0,2%

HLA-ABC exprimierende DC

70,7 ± 5,5%

75,2 ± 0,2%

65,6 ± 10,3%

86,5 ± 1,8%

87,9 ± 1,8%

85,4 ± 2,9%

HLA-ABC Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

90,9 ± 0,9%

93,8 ± 0,6%

92,9 ± 0,2%

HLA-DR exprimierende DC

27,9 ± 0,3%

25,3 ± 0,4%

25,5 ± 1,0%

51,2 ± 3,1%

47,9 ± 1,5%

50,9 ± 2,9%

HLA-DR Expression auf stimulierten und cokultivierten DC

 

75,7 ± 5,4%

85,9 ± 6,1%

79,1 ± 0,5%

Der Anteil dendritischer Zellen, die die untersuchten Oberflächenantigene exprimierten, stieg im Verlauf der Kultivierung stetig an. Auffällig war eine verstärkte Antigenexpression bei dendritischen Zellen, die mit Humanalbumin stimuliert worden waren (Daten nicht gezeigt). Die Cokultivierung von DC mit Effektorzellen bewirkte eine weitere Hochregulation der Oberflächenmarker (Daten nicht gezeigt). Der prozentual größte Anteil antigenexprimierender Zellen konnte nach Stimulation mit Humanalbumin und Cokultivierung mit Effektorzellen detektiert werden. Es wurden drei von einander unabhängige Messungen durchgeführt, es sind die Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben.

4.2. Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen nach Cokultivierung mit gepulsten dendritischen Zellen

Für die Etablierung eines Systems, in dem bei CIK-Zellen durch eine Cokultivierung mit gepulsten dendritischen Zellen zytotoxische Wirkung gegen gastrointestinale Tumorzellen induziert wird, wurde in Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) der optimale Zeitpunkt für die Cokultur von autologen CIK-Zellen und DC ermittelt. Eine Cokultivierung sieben Tage nach der Isolierung der mononukleären Zellen aus dem Blut mit einem Stimulator zu Responder Verhältnis von 1:2 - 1:6 erwies sich hierbei als äquieffektiv. Die Differenzierung der dendritischen Zellen zeigte sich zu diesem Zeitpunkt unabhängig von einer fortführenden Stimulation mit Interleukin-4 und GM-CSF , so daß auf eine weitere Zytokinstimulation verzichtet werden konnte. Ab dem Zeitpunkt der Cokultur wurde eine Zytokinstimulation nur in Hinblick auf die CIK-Zellen mit Interleukin-2 durchgeführt.

4.2.1. Bestimmung der Tumorantigenexpression der Targetzellen

Es sollte untersucht werden, ob dendritische Zellen durch Pulsen mit Tumorantigen cokultivierten CIK-Zellen eine spezifische Zytotoxizität vermitteln können. Die verwendeten Zellinien wurden deshalb vorab hinsichtlich der Expression der Tumorantigene CA 19-9 und CEA durchflußzytometrisch untersucht.

Tabelle 2: Expression von Tumorantigenen

 

CA 19-9 Expression

CEA Expression

Colo 201

45,4%

77,3%

Colo 205

64,8%

80,1%

DAN-G

67,9%

4,3%

Aufgrund des Expressionsprofils der Zellinien wurden für Untersuchungen mit dem Tumorantigen CA 19-9 die Zellinien Colo 205 und DAN-G eingesetzt. Zytotoxizitätsuntersuchungen nach dem Pulsen mit CEA -Protein bzw. CAP-1 wurden mit Colo 201 und Colo 205 Zellen durchgeführt.

4.2.2. Zytotoxizitätsuntersuchungen zum Pulsen von dendritischen Zellen mit CA 19-9

In LDH -Freisetzungstests mit der CA 19-9 exprimierenden Kolonkarzinomzellinie Colo 205 als Target wurde die Zytotoxizität von nicht cokultivierten CIK-Zellen gegenüber mit dendritischen Zellen cokultivierten CIK-Zellen ermittelt. Des weiteren wurden unbehandelte DC und dendritische Zellen, die mit dem tumor-assoziierten Antigen CA 19-9 gepulst waren eingesetzt. Zum Pulsen wurde CA 19-9 bzw. Myoglobin aus Rinderherz als irrelevantes Protein in gleicher Proteinkonzentration verwendet. Ein Unit CA 19-9 entspricht einer Proteinmenge von 0,25-1ng.

In Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) konnte gezeigt werden, daß ein Pulsen von dendritischen Zellen mit Antigen an frühen Tagen (Tag +1, Tag +2) über drei bis vier Tage den später cokultivierten CIK-Zellen die höchste Zytotoxizität vermittelte.

Dendritische Zellen wurden an Tag +1 mit 100 U/ml CA 19-9 , bzw. 100 ng/ml Myoglobin über drei Tage gepulst. CIK-Zellen wurden ab Tag +7 cokultiviert. Der LDH -Freisetzungstest wurde an Tag +14 durchgeführt.


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Abbildung 5: Zytotoxische Aktivität von CIK-Lymphozyten gegen Pankreaskarzinomzellen (DAN-G) nach Cokultivierung mit CA 19-9 -Protein gepulsten dendritischen Zellen

CIK-Zellen , die nicht cokultiviert worden waren, zeigten gegenüber DAN-G Zellen nur eine sehr geringe Zytotoxizität. Bei einem Überschuß von vierzig CIK-Zellen auf eine Pankreaskarzinomzelle konnte nur eine 15%ige Targetlysierung bewirkt werden. Die Cokultivierung mit dendritischen Zellen steigerte die zytotoxische Wirkung auf 53,6%. Das unspezifische Pulsen der dendritischen Zellen mit dem irrelevanten Protein Myoglobin induzierte eine verstärkte Zytolyse der Targetzellen durch die CIK-Zellen von 70,8 %. Nach Cokultur der Effektorzellen mit DC , die mit CA 19-9 gepulst worden waren, wurden 86,2% der Targetzellen lysiert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.2.3. Titration von CA 19-9 Protein

Abbildung 6: Zytotoxische Aktivität von CIK-Lymphozyten gegen DAN-G Zellen nach Cokultivierung mit DC , die mit steigenden CA 19-9 Proteinkonzentrationen gepulst wurden

Eine Titration von CA 19-9 zum Pulsen dendritischer Zellen ergab für den Bereich 50-100 U/ml die höchste vermittelte Zytotoxizität. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.


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4.2.4. Pulsen von dendritischen Zellen mit CEA -Protein und CEA -Peptid (CAP-1)

Neben dem Tumorantigen CA 19-9 wurde auch das onkofetale Protein CEA , bzw. das Nonapeptid CAP-1 zum Pulsen dendritischer Zellen eingesetzt. CAP-1 ist als antigene Determinante von CEA beschrieben. In Vorversuchen wurde der optimale Stimulationsbereich von CEA -Protein und Peptid ermittelt (Daten nicht gezeigt), er lag bei 100-500ng CEA pro ml Medium, bzw. bei 0,1-5 µg Peptid. Höhere Konzentrationen erwiesen sich als toxisch bzw. bewirkten keine weitere Zytotoxizitätssteigerung.

Da CAP-1 nur an HLA-A2 positiven Zellen bindet, wurden DC und CIK-Zellen aus dem Blut eines HLA-A2+ Spenders isoliert. Dendritische Zellen wurden an Tag +1 mit 100 ng/ml CEA -Protein über drei Tage stimuliert. Beim Pulsen mit Peptid erwies sich ein späteres Pulsen als effektiver (Daten nicht gezeigt), so daß 1 µg/ml CAP-1 an Tag +7 für vier Stunden zugegeben wurde. CIK-Zellen wurden an Tag +7 cokultiviert. Der LDH -Freisetzungstest wurde nach 14 Tagen Kultivierung durchgeführt ( Abbildung 7 ). Der Einsatz von Colo 201 oder Colo 205 Zellen als Zielzellen erbrachte die gleichen Ergebnisse (Daten für Colo 205 Zellen nicht gezeigt). Um antigenunspezifische Effekte zu bestimmen, wurde auch die CEA negative Zellinie 293 im Zytotoxizitätstest als Target eingesetzt ( Abbildung 8 ).

Abbildung 7: Zytotoxizität von CIK-Zellen gegen Colo 201 Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten dendritischen Zellen

Die eingesetzten kolorektalen Karzinomzellen erwiesen sich als resistent gegenüber CIK-Zellen . Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 25:1 waren CIK-Zellen nicht in der Lage Colo 201 Zellen zu lysieren. Durch die Cokultivierung mit ungepulsten dendritischen Zellen konnten hingegen bis zu 46% der Targetzellen lysiert werden. Eine unspezifische Stimulation durch Zugabe von Myoglobin steigerte die Zytotoxizität auf 56,5%. Die Verwendung von Tumorantigen zum Pulsen der dendritischen Zellen steigerte die lytische Wirkung der cokultivierten CIK-Zellen . Mit CEA gepulste DC vermittelten eine Lyse von 69,2%, damit konnte durch das Pulsen mit Gesamtprotein die gleiche Zytotoxizität vermittelt werden, wie durch die Beladung der DC mit definiertem Peptid. Die Zugabe von CAP-1 an Tag +7 zu den DC bewirkte eine Tumorzellyse von 67,9% hervorgerufen durch die cokultivierten Effektorzellen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von fünf voneinander unabhängigen Experimenten.


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Abbildung 8: Zytotoxizität von CIK-Zellen gegen 293 Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten dendritischen Zellen

Die eingesetzte embryonale Nierenzellinie 293 konnte durch immunologische Effektorzellen lysiert werden. Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 konnten cokultivierte CIK-Zellen bereits 59,2% der Targetzellen lysieren. Eine unspezifische Stimulation durch Zugabe von Myoglobin steigerte die Zytotoxizität auf 88,7%. Die Verwendung von Tumorantigen zum Pulsen der dendritischen Zellen bewirkte keine weitere Zunahme der Zytotoxizität, sondern vermittelte sogar eine leicht geringere Zytotoxizität, als das Pulsen mit Myoglobin, bei einem 20fachen Effektorüberschuß lag sie bei 87,2%. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.2.5. Antikörperblockade von Tumorantigenen auf den Targetzellen

Um zu untersuchen, ob die beobachtete Targetzellyse spezifisch durch die Stimulation der dendritischen Zellen mit Tumorantigen vermittelt worden ist, wurden die Tumorantigene auf den Zielzellen mittels Antikörper der Zellerkennung entzogen. Monoklonaler Antikörper gegen CA 19-9 (3,13 µg/106 Zellen) wurde am Tag des Zytotoxizitätstests 15 min vor Zugabe der Effektorzellen zu DAN-G Zellen zugegeben. Ungebundener Antikörper wurde durch einen Waschschritt entfernt. Der LDH -Freisetzungstest wurde ansonsten unverändert durchgeführt.


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Abbildung 9: Blockade von CA 19-9 auf DAN-G Zellen zum Nachweis einer spezifischen Aktivierung mit gepulsten DC cokultivierter CIK-Zellen


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Die unspezifische CIK-Zellaktivierung, hervorgerufen durch die Cokultivierung mit ungepulstem dendritischen Zellen blieb durch die Antikörperzugabe unverändert (bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 lag sie ohne mAk -Zugabe bei 13,2%, nach mAk -Zugabe bei 16,3%. CIK -Zellen, die nach der Cokultur mit CA 19-9 gepulsten dendritischen Zellen eine Zytotoxizität von 49,1% aufwiesen, konnten bei Blockade des Tumorantigenes auf den Zielzellen nur noch 13,8% lysieren, der Wert lag somit in Höhe der unspezifisch vermittelten Zellyse. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.


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4.3. Einfluß tumormarkerhaltigen Serums von Karzinompatienten bei der Kultivierung dendritischer Zellen auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen

Es wurde untersucht, ob im Serum von Tumorpatienten antigene Substanzen enthalten sind, die zur Stimulation von dendritischen Zellen genutzt werden können. Dendritische Zellen wurden hierfür in DC-Medium mit 10% Patientenserum kultiviert. Das Serum wurde nicht, wie sonst in der Zellkultur üblich, hitzeinaktiviert. Die in den folgenden Versuchen verwendeten Seren stammten von Karzinompatienten, die entweder einen erhöhten CA 19-9 Spiegel oder CEA -Spiegel aufwiesen.

Es wurden Vorversuche durchgeführt, um auszuschließen, daß eine Antigenität der Seren durch ihren allogenen Charakter bedingt ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Verwendung allogener Seren von gesunden Spendern im Kultivierungsmedium keinerlei Einfluß auf die vermittelte Zytotoxizität zeigte (Daten nicht gezeigt). Dies war unabhängig davon, ob die Seren einer vorhergehenden Hitzeinaktivierung unterworfen worden waren, oder nicht.

4.3.1. Kultivierung dendritischer Zellen mit Seren von Patienten mit erhöhtem Tumormarkerspiegel

Dendritische Zellen wurden entweder in 10% allogenem unbehandelten Serum von Karzinompatienten, oder 10% allogenem unbehandelten Serum eines gesunden Spenders kultiviert. Der durchschnittliche CA 19-9 Spiegel im Kulturmedium lag bei 250 U/ml. Die DC wurden bis zur Cokultivierung an Tag +7 in dem Serum kultiviert. LDH -Freisetzungstests mit der Kolonkarzinomzellinie Colo 205 als Zielzellen wurden an Tag +14 durchgeführt.

Abbildung 10: Einfluß tumormarkerhaltigen Serums bei der Kultivierung von DC auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen Colo 205 Zellen

Die Kultivierung dendritischer Zellen in Medium mit 10% tumormarkerhaltigem Serum vermittelte cokultivierten CIK-Zellen eine höhere Zytotoxizität, als die Kultivierung im Serum gesunder Spender. Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 machte dies einen Unterschied in der Targetzellyse von 92,8% versus 63,2% aus. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von vier voneinander unabhängigen Experimenten.

Versuche mit CEA enthaltendem Serum erbrachten ähnliche Ergebnisse. Als Targetzellinien im Zytotoxizitätstest wurden bei Kultivierung in Serum mit erhöhtem CEA Spiegel die CEA positiven Zellinien Colo 201 und Colo 205 eingesetzt.


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4.3.2. Titration tumormarkerhaltigen Patientenserums

Es wurden LDH -Freisetzungstests durchgeführt, in denen untersucht wurde, ob die immunstimulierende Wirkung des Serums von Pankreaskarzinom-Patienten titrierbar ist. Unbehandeltes Serum wurde in den angegebenen Konzentrationen im Kultivierungsserum eingesetzt. Konzentrationen >50% erwiesen sich als nicht praktikabel. Der CA 19-9 Spiegel der verwendeten Seren lag zwischen 50-250 U/ml. Die dendritischen Zellen blieben bis zur Cokultivierung mit CIK-Zellen an Tag +7 in DC-Medium mit Patientenserumzusatz. Der Zytotoxizitätstest wurde an Tag +14 durchgeführt.

Abbildung 11: Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen DAN-G Zellen, nach Titration tumormarkerhaltigen Serums bei der Kultivierung dendritischer Zellen (Effektor zu Target Verhältnis 10:1)

Es ergab sich eine vermehrte Lyse von DAN-G Zellen in Abhängigkeit vom Serumanteil am Kultivierungsserum der dendritischen Zellen. Die Verwendung von 10% Serum bewirkte eine durch CIK-Zellen vermittelte Lyse von 49,5%, die Lyse stieg bei 20% Serum auf 61,7% und erreichte bei 50% Serumanteil im Medium ein Maximum vom 85,6%. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.3.3. Einfluß der Serumhitzeinaktivierung

Es wurde untersucht, ob eine Hitzeinaktivierung Auswirkung auf die immunstimulierende Wirkung tumormarkerhaltigen Serums hat. In Analogie zu der in der Zellkultur üblichen FCS -Hitzeinaktivierung, wurde das Patientenserum 30 min bei 56 °C erwärmt.

Es wurden mononukleäre Zellen aus dem Blut von Pankreaskarzinom-Patienten isoliert. Nach siebentägiger Kultur der dendritischen Zellen in 10% autologem Serum wurden die parallel generierten autologen CIK-Zellen cokultiviert. Der Zytotoxizitätstest wurde nach 14 Tagen Kultur mit DAN-G Zellen als Target durchgeführt.


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Abbildung 12: Einfluß einer Serumhitzeinaktivierung auf die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen von Patienten mit Pankreaskarzinom gegen DAN-G Zellen nach Kultivierung autologer dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigen Serum

Auch dendritische Zellen von Patienten mit Pankreaskarzinom erwiesen sich ebenfalls als potente Stimulatoren von autologer Effektorzellen. Durch die Cokultivierung von CIK-Zellen mit ungepulsten DC ließ sich bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 40:1 eine 35%ige Lyse von Pankreaskarzinomzellen vermitteln. Die Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen konnte durch die Verwendung von unbehandeltem tumormarkerhaltigen Serums bei der Kultivierung dendritischer Zellen stark gesteigert werden und lag bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 40:1 bei 77,7%. Der stimulierende Wirkstoff im Serum erwies sich somit als hitzelabil. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von fünf voneinander unabhängigen Experimenten.

4.3.4. Pulsen von dendritischen Zellen mit definierten Tumormarkerkonzentrationen, enthalten im Serum von Karzinompatienten

Zur Tumormarkerbestimmung wurde die ELECSYS©-Methode verwendet. Die hierbei verwendeten Antikörper detektieren auch denaturiertes Protein (persönliche Mitteilung der Firma), so daß der Gehalt an nativem Tumormarker nach erfolgter Hitzeinaktivierung nicht zuverlässig bestimmt werden konnte. Um die These zu untermauern, daß es sich bei dem hitzelabilen Stoff im Serum um CA 19-9 handelt, wurden zur Kultivierung DC-Medien verwendet, die durch Zugabe von Patientenserumproben eine Endkonzentration von 100 U/ml CA 19-9 aufwiesen. Es wurde Serum von drei verschiedenen Patienten eingesetzt. Der prozentuale Serumanteil am Kulturmedium lag zwischen 5 und 30%. Die Kultivierung der dendritischen Zellen mit Patientenserum erstreckte sich bis Tag+7, die Zytotoxizität wurde an Tag +14 bestimmt. Zum Vergleich wurden CIK-Zellen mit gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert, die in DC-Medium mit 10% tumormarkerfreiem Serum kultiviert worden waren. Die dendritischen Zellen wurden an Tag +1 mit 100 U/ml CA 19-9 über drei Tage gepulst.


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Tabelle 3: Tumormarkerhaltiges Serum in einer Endkonzentration von 100 U/ml CA 19-9 im Kultivierungsmedium von DC . Gemessen wurde die Zytotoxizität von cokultivierten CIK-Zellen gegen CA 19-9 positive Targetzellen. Angegeben ist die prozentuale Targetzellyse.

Effektor zu Target Verhältnis:

2,5:1

5:1

10:1

20:1

Serumgehalt im Kulturmedium

DC gepulst mit 100 U/ml CA 19-9 enthalten im Serum von Patient 1

6,8%

17,5%

42,2%

80,7%

5,3%

DC gepulst mit 100 U/ml CA 19-9 enthalten im Serum von Patient 2

11,3%

20,8%

46,9%

83,9%

18,9%

DC gepulst mit 100 U/ml CA 19-9 enthalten im Serum von Patient 3

6,5%

18,4%

37,2%

78,4%

29,6%

Mittelwert ± Standardabweichung

8,2 ±
2,2%

18,9 ± 1,4%

42,1 ± 3,9%

81,0 ± 2,3%

 

DC gepulst mit 100 U/ml CA 19-9
(Protein)

 

21,8%

58,3%

86,0%

10% tumormarkerfreies Serum

Bei der Stimulation dendritischer Zellen mit dem Serum von Patienten mit Pankreaskarzinom korrelierte die im LDH-Freisetzunngstest ermittelte Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen mit dem Serumgehalt an CA 19-9 . Das Pulsen der DC durch Kultivierung in Serum mit einer Endkonzentration von 100 U/ml CA 19-9 vermittelte in allen drei Fällen den cokultivierten CIK-Zellen die gleiche Zytotoxizität (p < 0,002). Der prozentuale Serumgehalt am Kultivierungsmedium hatte keinen Einfluß auf die vermittelte Zellyse. Effektorzellen, die mit dendritischen Zellen cokultiviert worden waren, die mit 100 U/ml exogenem CA 19-9 gepulst und in dem Serum gesunder Spender kultiviert worden waren, erwiesen sich als annähernd gleich lytisch.

4.3.5. Kultivierung in tumormarkerhaltigen Serum und zusätzliches Pulsen mit exogenem Protein

Um noch höhere Zytotoxizitäten zu induzieren, wurden dendritische Zellen mit exogenem Tumormarker gepulst und zusätzlich in autologem Serum von Tumorpatienten kultiviert. Dendritische Zellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom wurden entweder in hitzeinaktiviertem autologem Serum oder in unbehandeltem Serum kultiviert. Ein Teil der DC wurde an Tag +1 mit 200 ng/ml CEA -Protein bzw. 100 ng/ml Myoglobin über drei Tage gepulst. Die Cokultur der CIK-Zellen begann an Tag +7, die Zytotoxizität mit Colo 201 Zellen als Targetzellen wurde an Tag +14 bestimmt.


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Abbildung 13: Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen Colo 201 Zellen, nach zusätzlichem Pulsen der DC mit exogenem CEA und Kultivierung in Serum von Patienten mit CRC

Ein Pulsen der dendritischen Zellen mit exogenem Protein, zusätzlich zu der Kultivierung in Medium mit tumormarkerhaltigem Serum, konnte eine noch stärkere Zytotoxizität induzieren. Effektorzellen, die mit in hitzeinaktiviertem Serum und unspezifisch gepulsten DC , cokultiviert wurden, konnten lediglich 17,0% der Targetzellen lysieren (Effektor zu Target Verhältnis 20:1). Die Kultivierung in unbehandeltem Serum vermittelte, ohne zusätzliches Pulsen, eine Lyse von 58,7% und lag somit annähernd gleich hoch, wie nach dem Pulsen mit exogenem CEA -Protein (68,1%). Eine Zugabe von exogenem CEA -Protein bei der Kultivierung in tumormarkerhaltigem Serum ließ die Lyse auf 88,9% ansteigen.

Fünf weitere Experimente, in denen anstelle von CEA CA 19-9 und CA 19-9 -haltiges Serum eingesetzt wurde, erbrachten ähnliche Ergebnisse. Die Lyse von CA 19-9 positiven Zellen stieg bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1von 82,9% nach Kultivierung in unbehandeltem Serum auf 95,3% bei zusätzlichem Pulsen, an (Daten nicht gezeigt).


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4.4. Einsatz immunologischer Effektorzellen von Patienten mit kolorektalen Tumoren im Zytotoxizitätsassay gegen autologe Tumorzellen

Es war möglich, aus dem Blut von Patienten mit Pankreas oder kolorektalem Karzinom dendritische Zellen und CIK-Zellen zu generieren, die in LDH -Freisetzungstests gegen Zellinien Zellysen, vergleichbar denen der von Zellen gesunder Spender, bewirkten ( Abbildung 12 ).

Durch die Etablierung von Primärkulturen aus Tumormaterial von Patienten mit kolorektalen Tumoren, konnte auch komplett autologe Ansätze untersucht werden. Hierbei wurden dendritische Zellen in autologem unbehandeltem Serum kultiviert, autologe CIK-Zellen wurden cokultiviert und anschließend hinsichtlich ihrer lytischen Aktivität gegen autologe Tumorzellen untersucht.

Bei der Etablierung von Tumorzellinien aus frisch entnommenem Tumormaterial erwies sich das kolorektale Karzinom wegen der physiologischen Darmflora als problematisch. Die bakterielle Mischflora wurde mittels eines Breitbandantibiotikums abgetötet oder zumindest statisch gehalten. Bemühungen feste Zellinien aus dem Tumormaterial zu erstellen scheiterten meist an der Überwucherung der Kultur mit Fibroblasten, die ca. 4-6 Wochen nach der Einzelzellisolierung die Tumorzellen verdrängten. Die im Zytotoxizitätstest eingesetzten Tumorzellen hatten einen Fibroblastenanteil <15% und zeigten morphologisch das typische Aussehen kolorektaler Tumorzellen. Durchschnittlich 40% der entnommenen Tumore ließen sich unter Kulturbedingungen zum Wachstum bringen. Pankreastumore wurden wegen ihrer geringen Verfügbarkeit nicht untersucht.

4.4.1. Immunologische Zellen von Patienten mit erhöhtem CA 19-9 Spiegel

CIK-Zellen von zwei Patienten mit Rektumkarzinom wurden mit autologen dendritischen Zellen cokultiviert und im LDH -Freisetzungstest gegen autologe Tumorzellen untersucht. Die dendritischen Zellen wurden in 10% autologem Serum kultiviert und an Tag +1 mit exogenem CA 19-9 über drei Tage gepulst. Der Serumspiegel der Patienten an CA 19-9 lag bei 156 U/ml bzw. 346 U/ml.

Abbildung 14: Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CA 19-9 gepulsten autologen dendritischen Zellen gegen autologe Tumorzellen von Patienten mit Rektumkarzinom

Die vorab erhobenen Ergebnisse bezüglich der Zytotoxizitätssteigerung von CIK-Zellen durch Cokultivierung mit dendritischen Zellen, sowie die weitere Steigerung durch Pulsen mit CA 19-9 und durch Kultivierung in tumormarkerhaltigem Serum konnten auch im komplett autologem System reproduziert werden.

Nicht cokultivierte CIK-Zellen waren nicht in der Lage autologe Tumorzellen zu lysieren. Die Cokul


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tivierung mit dendritischen Zellen vermittelte den Effektorzellen eine Zytotoxizität von 21,2% bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 80:1. Das Pulsen mit CA 19-9 steigerte die Zellyse auf 40,6%, nach Kultivierung der DC in unbehandeltem tumormarkerhaltigem Serum auf sogar 98,3%. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.4.2. Immunologische Zellen von Patienten mit erhöhtem CEA Spiegel

CIK-Zellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom wurden mit autologen dendritischen Zellen cokultiviert und im LDH -Freisetzungstest gegen autologe Tumorzellen untersucht. Die dendritischen Zellen wurden in 10% autologem Serum kultiviert und an Tag +1 mit exogenem CEA -Protein über drei Tage gepulst. Der Serumspiegel der Patienten an CEA lag bei 18,4 bzw. 35 ng/ml Serum.

Abbildung 15: Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CEA gepulsten autologen dendritischen Zellen gegen autologe Tumorzellen von Patienten mit CRC

Die hinsichtlich CA 19-9 positiver Tumoren gemachten Beobachtungen konnten auch für CEA exprimierende Tumoren bestätigt werden. Nicht cokultivierte CIK-Zellen waren nicht in der Lage autologe Tumorzellen zu lysieren. Bei der verwendeten niedrigen Effektor zu Target Verhältnis waren auch mit ungepulsten DC cokultivierte CIK-Zellen nicht in der Lage den autologen Tumor zu lysieren (Daten nicht gezeigt). Die


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Kultivierung in unbehandeltem CEA enthaltendem Serum vermittelte eine Zellyse von 11,0%, durch Pulsen mit CEA Protein stieg die Zytotoxizität auf 31,1% bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 16:1. Die Kultivierung in autologem Serum kombiniert mit einem Pulsen mit CEA an Tag +1 steigerte die Zellyse auf 50,0%. Das Pulsen mit CA 19-9 brachte bei diesem Ansatz keine verbesserte Lyse (Daten nicht gezeigt). Der Serumspiegel der Patienten an CA 19-9 lag im Normalbereich. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.5. Phänotypische und funktionelle Veränderungen von CIK-Zellen durch die Cokultivierung mit dendritischen Zellen

Es wurde untersucht, ob der gesteigerten Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen meßbare Veränderungen der Effektorzellen zugrunde liegen. Während der Cokultivierung mit dendritischen Zellen konnte eine gesteigerte Proliferation beobachtet werden. Während bei nicht cokultivierten CIK-Zellen zwischen Tag +7 und Tag +14 nur eine geringe Proliferation verzeichnet wurde, verdoppelten sich cokultivierte Effektorzellen im gleichen Zeitraum.

4.5.1. Expression von T-Zellmarkern auf CIK-Zellen

Durchflußzytometrisch wurde bestimmt, ob es durch die Cokultivierung von CIK-Zellen mit dendritischen Zellen zu einer Veränderung des Anteiles von Helfer- und zytotoxischen Zellen an den CD3+ Zellen kommt.

CIK-Zellen wurden nativ bzw. nach Cokultur mit dendritischen Zellen untersucht. Dendritische Zellen wurden an Tag +1 mit 100ng Myoglobin unspezifisch über drei Tage gepulst. Die Cokultivierung von CIK-Zellen mit autologen dendritischen Zellen erfolgte an Tag +7.

Abbildung 16:Einfluß einer Cokultivierung mit DC auf den Quotienten CD8+CD3+/CD4+CD3+ bei CIK-Zellen

Während der Kultivierung von CIK-Zellen kam es zu einem Anstieg des prozentualen Anteiles zytotoxischer Zellen. Die Cokultivierung von CIK-Zellen mit dendritischen Zellen bewirkte eine weitere Verschiebung der Population in Richtung zytotoxische Zellen. Der Quotient CD8+CD3+/CD4+CD3+ bei CIK-Zellen stieg durch die Cokultur mit dendritischen Zellen hoch signifikant an (p = 0,00008). So stieg der Quotient an Tag +10 von 0,92 bei nativen CIK-Zellen auf 1,36 bei cokultivierten Effektorzellen und erreichte mit einem Wert von 1,77 an Tag +12 sein Maximum. Die Daten zeigen die Mittelwerte von drei voneinander unabhängigen Messungen.

4.5.2. Blockade von MHC -Molekülen auf dendritischen Zellen

Um die Bedeutung der T-Zellpopulationen für die induzierte Zytotoxizität zu ermitteln, wurden die MHC -Expression auf den dendritischen Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch Zugabe von monoklonalen Antikörper gegen HLA -ABC bzw. HLA -DR blockiert. Im Zytotoxizitätsassay wurde untersucht, welche Auswirkungen die Blockade von MHC Klasse I und MHC Klasse II-Molekülen


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auf dendritischen Zellen auf die cokultivierten CIK-Zellen hat. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils 20 µl Antikörper zugegeben. Um etwaige antigene Wirkungen der Antikörper, bzw. zytopathische Effekte durch die Fluoreszenzmarkierung der Antikörper zu kompensieren, wurde monoklonaler Antikörper gegen ein irrelevantes Antigen (anti-Maus IgG1- FITC ) an Tag +6 zugegeben. Die dendritischen Zellen wurden an Tag +1 mit 100 ng/ml Myoglobin über drei Tage stimuliert, die Cokultivierung der CIK-Zellen begann an Tag +7, der LDH -Freisetzungstest wurde an Tag +14 durchgeführt.

Abbildung 17: Blockade der MHC -Expression auf DC durch Antikörperzugabe an verschiedenen Tagen. Cokultivierte CIK-Zellen wurden im Zytotoxizitätstest in einem 20fachen Überschuß gegen Colo 205 Zellen eingesetzt

CIK-Zellen zeigen nach Cokultur mit unspezifisch gepulsten dendritischen Zellen eine zytotoxische Wirkung gegen Colo 205 Zellen. Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 wurden 35,7% der Zielzellen lysiert. Die Zugabe von Antikörper gegen MHC Klasse I-Moleküle zu den dendritischen Zellen bewirkte eine verminderte Zytotoxizität der Effektorzellen CIK , wobei sich dieser Effekt bei späterer Zugabe des Antikörpers stärker ausprägte. Eine Blockade der MHC Klasse I-Moleküle an Tag +6 verminderte die lytische Wirkung von 35,7% auf 14,2%, nach Zugabe des mAK an Tag +9 lysierten cokultivierte CIK-Zellen nur noch 5,7% der Targetzellen.

Bei der Blockade der MHC Klasse II-Moleküle ließ sich ebenfalls eine Bedeutung des Zeitpunktes der Antikörperzugabe aufzeigen, allerdings bewirkte hier eine Blockade an frühen Tage eine stärkere Verminderung der Zytotoxizität, wohingegen die Zugabe von mAK an späten Tagen keine reprimierende Wirkung zeigte. Die Zugabe des Antikörpers an Tag +6 senkte die lytische Wirkung von 35,7% auf 20,7%. DC , deren MHC Klasse II-Moleküle an Tag + 10 blockiert wurden, konnten bei cokultivierten CIK-Zellen eine zytotoxische Wirkung von 34,0% induzieren, dieser Wert liegt im Bereich der Kontrollgruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.5.3. Durchflußzytometrische Daten zur T-Zellrezeptorspezifität cokultivierter CIK-Zellen

Der Einsatz von Dimeren in der Analytik ermöglicht es, den Anteil an antigenspezifischen T-Zellen einer Population zu bestimmen. Ein Dimer bestehend aus einem Immunglobulin-G1 und dem C-Terminus eines HLA -A2 Moleküls wird mit dem zu untersuchenden Antigen inkubiert. Unter der Voraussetzung, daß das Peptid HLA -A2 bindend ist, kommt es zur Ausbildung eines Komplexes, der spezifisch an den T-Zellrezeptor von antigenerkennenden T-Zellen bindet. Der Immunglobulinanteil des Dimers kann dann mittels eines markierten Antikörpers detektiert werden. Die T-Zellen


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können durch den Einsatz weiterer Antikörper genauer charakterisiert werden.

Hier wurde die Fragestellung behandelt, ob bei CIK-Zellen die mit spezifisch gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert worden sind, ein vermehrtes Auftreten von antigenspezifischen T-Zellen zu beobachten ist.

Um unspezifische Bindungen zu erkennen, wurde Dimer mit einem irrelevanten Peptid beladen. Als irrelevantes Peptid wurde das HLA -A2 bindende Peptid Pep CD 19 gewählt, für das keine spezifischen T-Zellrezeptoren zu erwarten sind ( CD 19 ist ein B-Zellmarker).

Abbildung 18: Durchflußzytometrische Bestimmung der T-Zellrezeptorspezifität mit gepulsten dendritischen Zellen cokultivierter CIK-Zellen . Zytotoxische T-Zellen, mit dem Phänotyp CD8+ wurden durch FITC -Färbung ermittelt. Es wurde die in ‚A‘ isolierte Lymphozytenpopulation untersucht. Das rechte Bild in der ersten Zeile entspricht dem Nullwert und zeigt CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CAP-1 gepulsten dendritischen Zellen. Bestimmt wurde die Expression des T-Zellrezeptors für ein irrelevantes Peptid (hier Pep CD 19). Im linken Bild der zweiten Zeile werden CIK-Zellen nach Cokultur mit CEA -Protein gepulsten DC gezeigt, bestimmt wurde der Anteil spezifischer CAP-1 T-Zellrezeptoren. Das rechte Bild in der zweiten Zeile zeigt CAP-1 spezifische T-Zellrezeptoren auf CIK-Zellen nach Cokultur mit CEA -Peptid (CAP-1) gepulsten dendritischen Zellen.

In der graphischen Darstellung der Lichtstreuung des Vorwärts und des Seitwärtslaser ließ sich die Lymphozytenpopulation gut abgrenzen (1. Bild links oben, Gate A). Diese wurde bezüglich ihrer CD8 Expression und der Expression des spezifischen T-Zellrezeptors untersucht. In der Lymphozytenpopulation waren die zytotoxischen Zellen gut als eigenständige Population zu erkennen (B2 und B4). Zellen auf denen gebundenes Dimer detektiert wurde lagen in den Bereichen B1 und B2. Doppelt positive Zellen liegen im Quadranten B2 und sind rot hervorgehoben. Auch hier ließen sich die Populationen abgrenzen.


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Tabelle 4: Anteil der CIK-Zellen mit peptidspezifischen T-Zellrezeptor an der Lymphozytensubpopulation nach Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen. Die in Klammern angegebenen Zahlen entsprechen der Expression nach Subtraktion der Kontrollmessung. Die Daten zeigen die Mittelwerte von zwei voneinander unabhängigen Messungen.

Dimer beladen mit

DC gepulst mit

Peptidspezifischer T-Zellrezeptor+ und CD8+

Peptidspezifischer T-Zellrezeptor+

Anteil doppeltpositiver Zellen von CD8+ Zellen

PepCD19

CAP-1

    0,29%

0,55%

0,90%

CAP-1

CEA-Protein

1,15% (0,86%)

1,45% (0,90%)

2,76% (1,86%)

CAP-1

CAP-1

1,62% (1,33%)

2,00% (1,45%)

3,72% (2,82%)

In der Kontrollmessung wurde mit irrelevantem Peptid beladenes Dimer zu CIK-Zellen gegeben, die mit CAP-1 gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert worden waren. Es konnte ein Anteil von 0,29% Zellen detektiert werden, die doppeltpositiv waren, d.h. sowohl das Differenzierungscluster CD8 wie auch den T-Zellrezeptor für das Peptid, hier Pep CD 19, exprimierten. Es kann davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen 0,29% um unspezifische Bindungen handelt, da physiologischerweise keine T-Zellrezeptoren gegen das CD 19-Peptid ausgebildet werden und das Pulsen der dendritischen Zellen mit CAP-1 auch keine T-Zellantwort gegen CD 19 induziert. Die Messungen in denen mit irrelevantem Peptid beladenes Dimer eingesetzt worden ist, wurden deswegen als Artefakte interpretiert.

Nach Cokultur mit CEA -Protein gepulsten DC exprimierten 1,15% der CIK-Zellen sowohl den CAP-1 spezifischen T-Zellrezeptor, als auch CD 8. Dies entspricht einem Anstieg um 0,86 Punkte im Vergleich zur Kontrollmessung. Wurden die DC mit CAP-1 gepulst, konnte sogar eine Zunahme der doppeltpositiven Zellen um 1,33 Punkte auf 1,62% beobachtet werden.

Da nicht nur zytotoxische T-Zellen über Rezeptoren zur Antigenerkennung an MHC -Komplexen verfügen, wurde auch der Anteil der rezeptorspezifischen Lymphozyten unabhängig von ihrem CD8 Status untersucht. Hier bot sich ein ähnliches Bild. Die Kontrollgruppe exprimierte zu 0,55% den Rezeptor. Bei mit CEA Protein gepulsten DC cokultivierten CIK-Zellen stieg der Anteil auf 1,45% und lag nach dem Pulsen mit CAP-1 bei 2,0%. Nach Proteinzugabe konnten demnach 0,9% rezeptorspezifische Zellen und nach Pulsen mit Peptid ein Anteil von 1,45% Zellen mit dem Merkmal ermittelt werden.

Von Interesse ist der prozentuale Anteil an antigenspezifischen zytotoxischen Zellen an der CD8 + Population. Bei der Untersuchung der doppeltpositiven Zellen als Subpopulation der zytotoxischen Zellen ergab sich wiederum ein um den Faktor 1,5 höherer Anteil spezifischer CD8 + Zellen nach Cokultur mit Peptid gepulsten DC im Vergleich zu CIK-Zellen , die mit Protein gepulsten DC cokultiviert worden waren. Abzüglich des Kontrollwertes exprimierten 1,86% der CD8 + Zellen einen T-Zellrezeptor, der CAP-1 erkennt, nachdem sie mit dendritischen Zellen cokultiviert worden sind, die mit Protein gepulst worden sind. Durch Beladen der dendritischen Zellen mit Peptid, anstelle des Pulsens mit Protein konnte der Anteil auf 2,82% erhöht werden. Native CIK-Zellen exprimierten zu <0,1% den untersuchten T-Zellrezeptor.

4.5.4. Nachweis IFN-gamma produzierender CIK-Zellen mittels der ELISpot-Technik

In ELISpot Versuchen wurde die Interferon-gamma Produktion von CIK-Zellen als Parameter ihrer Aktivierung bestimmt. CIK-Zellen wurden in Zellzahlen zwischen 104 und 5×104 48 Stunden auf Antikörper beschichteten Nitrozellulose-Platten inkubiert. Es wurden native CIK-Zellen , CIK-Zellen die mit ungepulsten und gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert worden waren und cokultivierte CIK-Zellen , die zusätzlich mit Tumorzellen cokultiviert worden waren, eingesetzt. Tumorzellen wurden 24 Stunden vor dem Ansetzen des ELISpots in einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 zu den cokultivierten CIK-Zellen gegeben. Nach 24 Stunden waren mikroskopisch keine Colo 205 Zellen mehr zu entdecken.


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Tabelle 5: Nachweis IFN-gamma produzierender CIK-Zellen im ELISpot

 

Spot-Anzahl/104 Zellen

CIK-Zellen

3 ± 0,2%

CIK-Zellen cokultiviert mit DC

45 ± 12%

CIK-Zellen cokultiviert mit Myoglobin gepulsten DC

47 ± 10%

CIK-Zellen cokultiviert mit CEA gepulsten DC

57 ± 10%

CIK-Zellen cokultiviert mit DC und Colo 205-Zellen

128 ± 12%

CIK-Zellen cokultiviert mit Myoglobin gepulsten DC und Colo 205-Zellen

96 ± 34%

CIK-Zellen cokultiviert mit CEA gepulsten DC und Colo 205-Zellen

99 ± 31%


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Abbildung 19: Nitrozellulosemembran mit IFN-gamma Spots

Bei nativen CIK-Zellen konnten, trotz einer Stimulation mit Phytohämagglutinin, nur wenige IFN-gamma produzierende Zellen nachgewiesen werden (3 von 104 Zellen). Eine Cokultivierung mit dendritischen Zellen steigerte die Anzahl zytokinproduzierender CIK-Zellen stark, wobei ein Pulsen der DC nur geringfügige weitere Steigerungen nach sich zog. Eine Zunahme der Spot-Anzahl um mehr als den Faktor zwei konnte durch die zusätzliche Cokultur mit Tumorzellen erreicht werden. Bei diesen zweifach cokultivierten CIK-Zellen konnte die stärkste Zytokinproduktion nach Cokultur mit ungepulsten DC beobachtet werden (128 Spots/104 Zellen). CIK-Zellen , die mit Myoglobin oder CEA gepulsten DC und Colo 205-Zellen cokultiviert worden waren, bildeten gleich viele Spots (96 versus 99 Spots/104 Zellen). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.6. Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen

Ein spezifisches Pulsen von dendritischen Zellen mit definierten Tumorantigenen scheitert oftmals daran, daß nur für wenige Tumore tumor-assoziierte Antigene beschrieben sind. Um zytotoxische Zellen zu rekrutieren, die in vivo durch ein fehlendes Signal seitens der antigenpräsentierenden Zellen anerg sind, wurden Möglichkeiten der unspezifischen Stimulation mit modifizierten APC untersucht. Es wurde versucht durch eine Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen eine Hochregulierung von MHC Klasse II-Molekülen zu bewirken. Durch eine verstärkte Stimulation von T-Helferzellen sollte eine Erhöhung der Zytotoxizität mit DC cokultivierter CIK-Zellen erreicht werden. Die Bedeutung der T-Helferzellen konnte unter 4.5.2 aufgezeigt werden.

4.6.1. Integrinexpression auf dendritischen Zellen

Der adenovirale Gentransfer wird initiiert durch die Anbindung des Viruses mit seinem Fiberprotein am Coxsackievirusrezeptor (CA-Rezeptor). Der eigentliche Viruseintritt in die Zellen wird über die Bindung viraler Pentonbasisproteinen an die zellulären Integrine alphavbeta3 und alphavbeta5 vermittelt.

Durchflußzytometrisch wurde die Expression von CAR und Integrinen auf dendritischen Zellen in Abhängigkeit von ihrer Reife bestimmt.

Abbildung 20: Expression von Integrin und CAR auf dendritischen Zellen in Abhängigkeit vom Alter der DC

Dendritische Zellen exprimieren die für den adenoviralen Gentransfer erforderliche Oberflächenmerkmale. Die Expression von CAR AR und alphavbeta5 nimmt mit zunehmendem Alter der Zellen zu. Am ersten Tag der Kultivierung liegt die Expression von CAR bei 12,5% und bei 17,9% für alphavbeta5. An Tag +6 exprimieren 40,6% der DC den CA-Rezeptor und 32,6% das Integrin alphavbeta5. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Messungen.

4.6.2. Effizienz der Transfektion dendritischer Zellen mit Poly-L-Lysin (AdV-PLL) gekoppeltem Adenovirus

Nachdem gezeigt werden konnte, daß dendritische Zellen über die notwendigen Rezeptoren für einen adenoviralen Gentransfer verfügen, wurde untersucht, ob sich dendritische Zellen mit AdV-PLL transfizieren lassen. Als Reportergen wurde lacZ verwendet, so daß transfizierte Zellen sich nach Zugabe von X-gal aufgrund ihrer blauen Anfärbung gut bestimmen ließen. Um abzuklären, ob die Transfektionseffizienz abhängig vom Alter der dendritischen Zellen ist, wurden die Zellen von Tag +1 bis Tag +6 transfiziert. Ein Gentransfer zu einem späterem Zeitpunkt wäre im gewählten Modell


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nicht optimal da das Virus zwei Tage auf den DC verbleibt und die Cokultur der CIK-Zellen an Tag +7 stattfindet. Eine Transfektion zu einem späterem Zeitpunkt würde also auch die CIK-Zellen in Kontakt mit dem AdV-PLL bringen.

Abbildung 21: Effizienz der adenoviralen Transfektion dendritischer Zellen. Mit dem lacZ-Gen transfizierte Zellen wurden durch Blaufärbung nach X-gal Zugabe detektiert

Die Transfektion dendritischer Zellen mittels AdV-PLL konnte in Abhängigkeit vom Alter der Zellen erfolgreich durchgeführt werden. Die Effizienz stieg von 2% an Tag +1 auf nahezu 100 % an Tag +5. Es wurden keine zytopathischen Effekte beobachtet. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

Abbildung 22: Fünf Tage alte dendritische Zellen nach Transfektion mit dem lacZ-Gen und Anfärbung positiver Zellen durch Zugabe von X-gal (fotografiert bei 100 × Vergrößerung)

4.6.3. Nachweis von CIITA- RNA mittels RT-PCR

Nachdem gezeigt werden konnte, daß dendritische Zellen mit AdV-PLL transfiziert werden können, wurden DC mit dem CIITA-Gen transfiziert. Eine Kontrollgruppe wurde mit dem lacZ-Gen ‚mock’ transfiziert. Anschließend wurde aus den transfizierten DC die RNA isoliert. Isolierte RNA wurde mittels RT-PCR mit spezifischen Primern für CIITA in cDNA umgeschrieben. Die amplifizierte DNA wurde gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Kontrolle der PCR -Bedingungen wurde eine Wasserprobe mitgeführt, und das ubiquitär vorkommende beta-Aktin Gen nachgewiesen.


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Abbildung 23: Agarosegel nach RT-PCR zum Nachweis von CIITA- RNA in CIITA-transfizierten DC (Transfektion an Tag +5)

Aus transfizierten dendritischen Zellen konnte erfolgreich RNA isoliert werden. Nach Umschreibung der RNA in cDNA und Amplifikation mittels PCR -Technik, konnte in der gel-elektrophoretischen Auftrennung eine Bande in Höhe der erwarteten 1079 Basenpaare sichtbar gemacht werden. In dendritischen Zellen, die mit einem irrelevanten Gen transfiziert wurden, konnte keine CIITA- RNA nachgewiesen werden. Bei sehr jung transfizierten DC (le 2 Tage) konnte keine CIITA- RNA nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

4.6.4. Expression von MHC -Molekülen auf dendritischen Zellen nach Transfektion mit dem CIITA-Gen

Dendritische Zellen wurden an Tag +3 mittels AdV-PLL mit dem Gen für CIITA transfiziert. Durchflußzytometrisch wurde die Expression von MHC Klasse I und MHC Klasse II-Molekülen bestimmt. Zur Kontrolle wurden dendritische Zellen mit einem mock-Gen (dem lacZ-Gen) ebenfalls mit AdV-PLL transfiziert.


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Tabelle 6: Expressionsmuster von MHC -Molekülen auf CIITA transfizierten dendritischen Zellen

Tag der Kultivierung

Expression von HLA -ABC nach mock Transfektion

Expression von HLA -ABC nach Transfektion mit dem CIITA Gen

Expression von HLA -DR nach mock Transfektion

Expression von HLA -DR nach Transfektion mit dem CIITA Gen

+3

+4

+5

+7

+9

+12

75,0 ± 10,3%

66,0 ± 0,2%

57,1 ± 1,8%

74,5 ± 2,9%

84,5 ± 3,5%

87,9 ± 1,9%

73,6 ± 13,4%

57,7 ± 9,5%

76,9 ± 7,3%

73,4 ± 2,2%

95,9 ± 1,3%

82,5 ± 12,9%

25,1 ± 0,4%

25,8 ± 1,0%

26,9 ± 3,1%

49,5 ± 2,9%

55,4 ± 3,1%

65,8 ± 2,1%

50,3 ± 17,5%

41,0 ± 7,6%

74,8 ± 4,4%

46,6 ± 0,9%

82,6 ± 1,8%

70,5 ± 10,1%

Das Expressionsmuster von HLA -ABC Molekülen auf dendritischen Zellen nach Transfektion mit dem CIITA Gen bot kein einheitliches Muster. Die Expression änderte sich jedoch nicht wesentlich und wurde durch die Transfektion meistenteils leicht erhöht. An Tag +4 kam es zu einer auffällig verminderten Expression, an Tag +5 konnten wesentlich mehr HLA -ABC positive Zellen detektiert werden.

Die Expression des Oberflächenantigens HLA -DR stieg bei dendritischen Zellen im Verlauf der Kultivierung stetig an. Nach der Transfektion mit dem CIITA Gen kam es zusätzlich zu einem statistisch signifikanten (p = 0,046) Anstieg der HLA -DR Expression, der lediglich an Tag +7 sogar leicht unter den prozentualen Anteil der MHC Klasse II-Molekülexpression bei mock transfizierten Zellen fiel. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen Experimenten.

4.6.5. Zytotoxizität von CIK-Zellen nach Cokultivierung mit CIITA-transfizierten dendritischen Zellen

Hintergrund für den adenoviralen Gentransfer des CIITA-Genes in dendritische Zellen war die Vermutung, durch eine verstärkte Expression von MHC Klasse II-Molekülen eine Aktivierung von T-Helferzellen zu bewirken, die wiederum eine gesteigerte Zytotoxizität der CD8 + Zellen induzieren sollten. Untersucht wurde dies im LDH -Freisetzungstest mit der CA 19-9 exprimierenden Zellinie DAN-G als Target. Dendritische Zellen wurden ungepulst, bzw. mit 50 U/ml CA 19-9 ab Tag +1 über zwei Tage gepulst, eingesetzt. Die Transfektion des CIITA-Genes, bzw. des mock-Genes (hier das lacZ-Gen) in die dendritischen Zellen wurde am Tag +3 vorgenommen.


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Abbildung 24: Zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen gegen Pankreaskarzinomzellen nach Cokultur mit CA 19-9 gepulsten und mit dem CIITA-Gen transfizierten dendritischen Zellen

Effektorzellen, die mit dendritischen Zellen cokultiviert worden sind, zeigten eine zytotoxische Wirkung gegen Pankreaskarzinomzellen. Dieser Effekt konnte durch das Pulsen mit CA 19-9 bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 20:1 von 15,3 ± 8,9% auf 48,5 ± 8,8% gesteigert werden. Eine Transfektion der gepulsten dendritischen Zellen mit dem CIITA-Gen bewirkte keine weitere signifikante Steigerung. Hingegen ist beim Vergleich ungepulster dendritischer Zellen mit ungepulsten, transfizierten Zellen, eine stark zytotoxizitätssteigernde Wirkung der Transfektion zu verzeichnen (15,3% versus 56,8%). Bei der Gegenüberstellung des Effektes ungepulster, transfizierter Zellen mit dem gepulster, transfizierter DC , läßt sich wegen der großen Standardabweichung keine eindeutige Aussage treffen (56,8 ± 19,3% vs. 49,6 ± 37,9%). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von vier voneinander unabhängigen Experimenten.


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