Märten, Angela: Tumorantigen gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen bei Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

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Kapitel 5. Diskussion

Die hohe Rezidivrate bei Patienten mit gastroenteropankreatischen Tumoren reflektiert den Nutzen von neuen therapeutischen Strategien. Als solche Strategien böten sich immunologische Therapieformen an. Patienten mit minimaler Tumorerkrankung würden von immunologischen Therapieformen besonders profitieren, da diese Therapieformen wahrscheinlich ihre höchste Effektivität bei geringer Tumorlast haben. Untersuchungen, in denen immunologische Effektorzellen, wie TILs ( Rosenberg et al., 1986), LAK-Zellen ( Grimm et al., 1982) oder CIK-Zellen ( Schmidt-Wolf et al., 1994), eingesetzt wurden, zeigten eine relative Resistenz von soliden Tumoren gegen immuntherapeutische Ansätze ( Bean and Mazumder, 1992). Um zytotoxische tumorspezifische T-Zellen zu rekrutieren, ist die Präsentation von tumorspezifischen Antigenen in Verbindung mit MHC -Molekülen auf dendritischen Zellen notwendig. Tumore können durch die Sekretion von Interleukin-10 oder vascular endothelial growth factor die Funktion und die Reifung von dendritischen Zellen hemmen ( Schuler and Steinman, 1997; Gabrilovich et al., 1998). Mittlerweile ist es möglich, dendritische Zellen in größeren Mengen ex vivo zu generieren ( Inaba et al., 1992; Romani et al., 1994; Caux et al. 1996), sie mit Tumorantigen zu beladen und sie dann als Vakzine bei Tumorpatienten zu verwenden.

5.1. Etablierung des Modells

Es sollte ein System etabliert werden, in dem bei CIK-Zellen durch eine Cokultivierung mit gepulsten dendritischen Zellen zytotoxische Wirkung gegen gastroenteropankreatische Tumorzellen induziert wird. 1 - 3×106 dendritische Zellen mit der typischen Morphologie (Abbildung 3).konnten erfolgreich aus 100 ml peripherem Blut durch Zugabe von Interleukin-4 und GM-CSF generiert werden. Diese Ausbeute liegt in der von Romani beschriebenen Größenordnung ( Romani et al., 1994). Die Zellen konnten, um eine Stimulation durch in fetalem Kälberserum enthaltene Antigene zu vermeiden, problemfrei in autologem Serum kultiviert werden. Aus der nicht adhärenten Phase isolierter mononukleärer Zellen konnten erfolgreich durch Zytokinstimulation CIK-Zellen gewonnen werden, die am siebenten Tag der Kultivierung mit autologen dendritischen Zellen über weitere sieben Tage cokultiviert wurden. Der Zeitpunkt erwies sich als günstig, da dendritische Zellen am Tag +7 der Kultivierung bereits hohe Spiegel an T-zellstimulierenden Oberflächenmarkern exprimieren und keiner weiteren Zytokinstimulation bedürfen. CIK-Zellen sind nach 10-14tägiger Kultur hinsichtlich ihrer zytotoxischen Eigenschaft ausgereift. Die gewählte Cokultivierungsdauer liegt in dem in der Literatur beschriebenen Bereich. Boczkowski et al. cokultivieren zytotoxische T-Zellen fünf Tage mit DC ( Boczkowski et al., 1996), Diao et al. lassen die T-Zellen sieben Tage in Cokultur ( Diao et al., 1999) und Philip et al. belassen die Zellen zehn bis zwölf Tage zusammen ( Philip et al., 1997). Bei der Cokultur wurde ein Stimulator zu Responder Verhältnisse von 1:2 bis 1:6 erreicht. Dendritische Zellen sind in der Lage, weit mehr T-Zellen zu aktivieren. Ein Stimulator zu Responder Verhältnis von 1:100-3.000 ist beschrieben ( Bancherau and Steinman, 1998), doch war das gewählte autologe System aufgrund der verfügbaren Zellzahlen limitiert.

Die DC wurden durchflußzytometrisch untersucht ( Tabelle 1 ). Dendritische Zellen ließen sich durch das parallele Vorliegen unterschiedlicher Reifegrade in der durchflußzytometrischen Darstellung nur schwer als eigenständige Population definieren, konnten aber sicher von CD14 + Monozyten getrennt werden. In der Literatur sind, allein schon bedingt durch die unterschiedlichen Generierungsmethoden, verschiedene Expressionsmuster der untersuchten Oberflächenmarker beschrieben. Grundsätzlich werden aber mäßig bis sehr hohe Expressionen von CD1a , CD80 , CD83 , CD86 , CMRF-44 und MHC-Molekülen beschrieben. Die beobachteten Expressionsprofile konvergieren mit diesen Literaturdaten ( Hart , 1997; Bancherau and Steinman, 1998; Romani et al., 1994; Steinman , 1991). Allerdings exprimierten lediglich 54,5 ± 3,0% der generierten DC den als typisch für dendritische Zellen beschriebenen Marker CMRF-44. Da aber alle untersuchten Zellen eine für dendritische Zellen typische Morphologie aufwiesen, ist die mäßige Expression möglicherweise durch Probleme bei der Färbung mittels Zweitantikörpers bedingt (gebundener mAK CMRF-44 mußte durch einen sekundären Antikörper gegen IgM detektiert werden). Die im Verlauf der Kultivierung beobachtete Zunahme der Expression obengenannter Marker erklärt sich durch die Rei


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fung zu maturen dendritischen Zellen. Es wurden durchflußzytometrische Daten von stimulierten und mit CIK-Zellen cokultivierten DC gewonnen. Interessanterweise bewirkte ein Pulsen der dendritischen Zellen mit Antigen (Myoglobin aus Rinderherz) eine Zunahme der Expression an untersuchten Markern. Dies spiegelt möglicherweise die Vorgänge bei der Aktivierung von dendritischen Zellen nach Antigenkontakt in vivo wider. Eine weitere Zunahme der Oberflächenantigene durch die Cokultivierung von CIK-Zellen zeigt, daß die Interaktion von DC mit T-Zellen sich nicht nur auf die T-Zellen, sondern auch auf die dendritischen Zellen auswirkt. Ridge et al. schlägt ein dynamisches Modell vor, in dem T-Helferzellen APC s derart stimulieren, daß sie in der Lage sind, zytotoxische T-Zellen zu aktivieren ( Ridge et al., 1998).

5.2. Gepulste dendritische Zellen zur Steigerung der Zytotoxizität immunologischer Effektorzellen

In LDH-Freisetzungstests erwiesen sich CIK-Zellen als nur sehr schwach lytisch gegen die eingesetzten pankreatischen und kolorektalen Zellinien. Die Cokultivierung der Effektorzellen mit dendritischen Zellen bewirkte eine starke Zunahme der Zytotoxizität ( 10 ). Es ist zu vermuten, daß costimulatorische Moleküle, wie der Kontakt von CD28 auf den T-Zellen mit den von dendritischen Zellen exprimierten CD80 und CD86 Molekülen die T-Zellaktivierung bewirkten. Des weiteren sezernieren dendritische Zellen Interleukin-12 , welches die Zytotoxizität von CIK-Zellen erhöht ( Zoll et al., 1998). Wurden die dendritischen Zellen mit Antigen gepulst, das von den Targetzellen nicht exprimiert wird, wurden sie also unspezifisch z.B. mit Myoglobin gepulst, induzierten sie eine noch stärkere Lyse. Wie unter 15 diskutiert, exprimieren dendritische Zellen nach Antigenstimulation in höherem Maße Oberflächenmarker, die für eine T-Zellaktivierung notwendig sind. Vor diesem Hintergrund ließen sich die verstärkte Zellyse durch eine erhöhte unspezifische T-Zellaktivierung erklären.

5.2.1. Pulsen dendritischer Zellen mit CA 19-9

Ziel war es, cokultivierte CIK-Zellen spezifisch zu aktivieren. Hierzu wurden dendritische Zellen mit CA 19-9 gepulst. Es erwiesen sich sehr niedrige Antigenkonzentrationen als effektiv, dies korreliert mit Angaben, die pico- nanomolare Konzentrationen an Antigen als ausreichend für eine Stimulation beschreiben ( Sallusto and Lanzavecchia, 1994b). Höhere Konzentrationen an CA 19-9 verminderten die Lyse. Möglicherweise war dem Antigen als antimikrobielles Agenz zugegebenes Natriumazid verantwortlich dafür. Eine durch überhöhte Antigenexposition induzierte Anergie ist allerdings nicht auszuschließen. Entscheidend für ein erfolgreiches Pulsen war der Zeitpunkt der Antigenzugabe. Bei der Verwendung von Proteinen zum Pulsen erwies sich eine frühe Zugabe (Tag +1) als optimal ( Inaba et al., 1990). Dies erscheint plausibel, da immature DC über Rezeptoren für die Antigenaufnahme verfügen, die während des Reifeprozesses herunterreguliert werden. Dendritische Zellen sind im Vergleich zu Makrophagen nur schwach endozytotisch aktiv, aber präsentieren in hohem Maße Antigene. Dies läßt vermuten, daß Makrophagen Antigene endozytotisch degradieren und abbauen, der endozytotische Apparat der DC hingegen für eine Antigenpräsentation ausgebildet ist ( Steinman and Cohn, 1972). Das Pulsen dendritischer Zellen mit CA 19-9 vermittelte cokultivierten CIK-Zellen eine zytotoxische Wirkung gegen CA 19-9 exprimierende Zellinien, die deutlich über der zytotoxische Wirkung lag, die allein durch unspezifische Aktivierung vermittelt wurde. Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 40:1 konnten 86,2% der eingesetzten DAN-G Zellen lysiert werden ( Abbildung 5 ). Peiper et al. verwendeten zum Pulsen dendritischer Zellen ein Peptid von der transmembranen Region des Protoonkogen HER2/neu als tumor-assoziiertes Antigen beim Pankreaskarzinom ( Peiper et al., 1997). Sie erreichten damit aber bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 40:1 lediglich eine Lyse von 35-40%. In Blockadeexperimenten konnte gezeigt werden, daß es durch die Cokultur von CIK-Zellen mit CA 19-9 gepulsten dendritischen Zellen zu einer spezifischen Targetzellyse kommt. Wurde auf den Targetzellen das Tumorantigen CA 19-9 durch die Zugabe monoklonalen Antikörpers der Zellerkennung entzogen, waren die Effektorzellen nur noch in der Lage, die unspezifisch vermittelte Zytotoxizität zu bewirken ( Abbildung 9 ).


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5.2.2. Pulsen von dendritischen Zellen mit CEA -Protein und CAP-1

Versuche mit CEA -Peptid gepulsten dendritischen Zellen sind von mehreren Arbeitsgruppen durchgeführt worden. Alters et al. pulsten mit Interleukin-7 stimulierte DC nach der Entfernung gebundener Peptide auf den MHC -Molekülen der dendritischen Zellen mit dem CEA -Peptid CAP-1 in einer Konzentration von 40 mg/ml. Sie erreichen damit im Zytotoxizitätstest gegen kolorektale Zellinien eine Lyse von ca. 15% bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 25:1 ( Alters et al., 1997; Alters et al., 1998). Wong et al. beschreiben einen Ansatz mit CAP-1 gepulsten und mit Antisense-Oligonukleotiden gegen das Transporters associated with Antigen Processing-2 Gen ( TAP -2 Gen) behandelten dendritischen Zellen ( Wong et al., 1997). Als Targetzellen wurden Zellen mit defektem TAP -Gen verwendet, durch die Funktionsstörung bedingt können bei diesen Zellen keine endogen gebundenen Peptide an MHC Klasse I-Moleküle präsentiert werden. Die auf der Zelloberfläche exprimierten leeren MHC Klasse I-Moleküle wurden, wie bei den eingesetzten DC , mit CAP-1 beladen. Nach einem Pulsen mit 25-50 µg/ml Peptid konnte im Zytotoxizitätstest bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 25:1 eine Lyse von ca. 38% beobachtet werden.

In dem hier untersuchten Ansatz wurden dendritische Zellen mit 1 µg/ml CAP-1 an Tag +7 beladen, die cokultivierten CIK-Zellen riefen im LDH -Freisetzungstest gegen CEA -exprimierende Kolonkarzinomzellen, bei ebenfalls 25fachem Effektorüberschuß, eine Zellyse von 67,9% hervor ( Abbildung 7 ). Die starken Unterschiede in der vermittelten Zytotoxizität können durch die eingesetzten zytotoxischen Zellen erklärt werden. Alters et al. verwenden T-Zellen, Wong et al. setzen CD8 + angereicherte, Interleukin-2 stimulierte T-Zellen ein. Neben einer generell höheren zytolytischen Fähigkeit von CIK-Zellen , könnte die geringere Zytotoxizität bei Wong et al. auch durch das Fehlen von CD4 + T-Helferzellen nach einer CD8 + Anreicherung erklärt werden.

Analog zum Vorgehen bei der Verwendung von CA 19-9 wurde auch CEA -Protein eingesetzt. Das Pulsen an Tag +1 mit 100 ng/ml Protein bewirkte eine identische Zellyse, wie das Beladen mit CAP-1 an Tag +7 ( Abbildung 7 ). Das Pulsen dendritischer Zellen mit Peptid wurde an späten Kulturtagen durchgeführt, da Peptide nicht über die früh exprimierten Antigenrezeptoren aufgenommen werden muß, sondern extrazellulär an MHC Klasse I-Moleküle bindet. Um zu untersuchen, ob das Pulsen mit CEA eine spezifische Zytotoxizität vermittelt, wurde im LDH -Freisetzungstest die CEA -negative Nierenzellinie 293 eingesetzt. Die Zellinie erwies sich als sensibel gegen cokultivierte CIK-Zellen , ein Pulsen mit Tumorantigen brachte aber keine Steigerung der Zellyse ( Abbildung 8 ). Auch hier konnte wieder eine starke Aktivierung der Effektorzellen durch eine Cokultivierung mit unspezifisch gepulsten dendritischen Zellen beobachtet werden.

5.2.3. Kultivierung dendritischer Zellen mit tumormarkerhaltigem Serum von Patienten mit Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

Um sich von den wenigen beschriebenen Tumorantigenen unabhängig zu machen, wurde untersucht, ob im Serum von Tumorpatienten antigene Substanzen enthalten sind, die zur Stimulation dendritischer Zellen genutzt werden können. Auch wurden bei der Verwendung exogenen Tumormarkers bei höheren Konzentrationen zytopathische Effekte beobachtet, die möglicherweise durch Konservierungsstoffe hervorgerufen wurden.

Die Kultivierung dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigen Serum ( CA 19-9 und CEA ) bewirkte eine erhöhte Zytotoxizität cokultivierter CIK-Zellen gegen tumormarkerexprimierende Targetzellen ( 35 ). Dieser Effekt zeigte sich unabhängig davon, ob allogene oder autologe Seren eingesetzt wurden. Eine antigene Wirkung allogener Seren konnte nicht gezeigt werden. Die induzierte Zytotoxizitätssteigerung konnte durch Steigerung des prozentualen Anteils an tumormarkerhaltigen Serum im Kultivierungsmedium erhöht werden ( Abbildung 11 ). Um die Hypothese zu festigen, daß die beobachteten Effekte durch den Gehalt an Tumormarker im Serum bewirkt wurden, wurden Seren von Karzinompatienten in einer Endkonzentration von 100 U/ml CA 19-9 im Kultivierungsmedium eingesetzt. Zum Vergleich wurden dendritische Zellen mit dem Serum eines gesunden Spender kultiviert und mit 100 U/ml exogenem CA 19-9 gepulst. Die im LDH -Freisetzungstest ermittelten Zellysen ergaben gleich hohe Zytolysen bei allen untersuchten Ansätzen, unabhängig davon, ob exogenes Protein oder im Serum unterschiedlicher Patienten enthaltenes CA 19-9 zum Pulsen eingesetzt worden war ( Tabelle 3 ). Da der Serumspiegel der drei untersuchten Patienten unterschiedlich hoch war, ergaben sich unterschiedlich hohe prozentuale Serumanteile, dies wirkte sich jedoch nicht aus.

Es ist in der Zellkultur üblich, Serum zur Komplementinaktivierung einer Hitzeinaktivierung zu un


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terwerfen. Die Hitzeinaktivierung tumormarkerhaltiger Seren brachte die zuvor beobachtete Steigerung der zytotoxischen Fähigkeit cokultivierter CIK-Zellen zum Verschwinden ( 37 ). Dies spricht dafür, daß die Steigerung durch einen hitzelabilen Stoff, wie einem Protein, hervorgerufen wurde. Bedauerlicherweise konnte sich eine Denaturierung von Tumormarker im Serum durch eine Hitzeinaktivierung nicht belegen, da die verwendete Detektionsmethode keinen Unterschied zwischen nativem und denaturierten Protein macht ( 28 ).

Da die Verwendung exogenen Proteins dosislimitiert ist und tumormarkerhaltiges Serum maximal 50% des Kulturmediums ausmachen kann, da sonst der Anteil an Nährstoffen zu gering wird, wurde untersucht, ob beide Formen des Pulsens miteinander kombiniert werden können. Dendritische Zellen, die in tumormarkerhaltigen Serum kultiviert und zusätzlich mit exogenem Tumormarker gepulst wurden, vermittelten den cokultivierten Effektorzellen eine weit höhere zytotoxische Wirkung, als nur einfach gepulste DC ( 39 ).

Die gemachten Beobachtungen legen die Vermutung nahe, daß Tumormarker im Serum von Karzinompatienten ex vivo generierte dendritische Zellen spezifisch aktiviert.

5.2.4. Immunologische Zellen von Patienten mit gastrointestinalen Tumoren

Es konnte gezeigt werden, daß die diskutierten Phänomene sich nicht nur mit Zellen von gesunden Probanden erreichen ließen, sondern auch mit immunologischen Zellen von Tumorpatienten ( 37 ). Die induzierten Zytotoxizitäten im Patientenmodell lagen nicht wesentlich unter den Werten, die Zellen gesunder Spender bewirkten. Dies ist in Anbetracht der bösartigen Grunderkrankung um so erstaunlicher.

Von großem Interesse war die Frage, ob CIK-Zellen in der Lage sind autologe Tumorzellen zu lysieren. Die Etablierung von Primärkulturen aus Tumormaterial erwies sich als durchführbar. Eine genauere Charakterisierung der Zellen bezüglich Tumormarkerexpression oder Färbung auf Zytokeratin war wegen der geringen Zellzahlen leider nicht möglich. Ausgehend von der Morphologie ist aber davon auszugehen, daß es sich bei den eingesetzten Zellen überwiegend um kolorektale Tumorzellen gehandelt hat.

Sowohl für Patienten mit CA 19-9 exprimierenden Tumoren, wie auch für Patienten mit erhöhtem CEA -Spiegel ließen sich autologe Modelle entwickeln. In beiden Ansätzen kam es nach Kultivierung der dendritischen Zellen in autologem unbehandeltem Serum zu einer zytotoxischen Wirkung cokultivierter CIK-Zellen . Das Pulsen der dendritischen Zellen mit exogenem Tumorantigen, bei Kultivierung in autologem hitzeinaktiviertem Serum vermittelte noch höhere Zytolysen. Dies ist in Anbetracht der niedrigen Tumormarkerspiegel der untersuchten Patienten nicht verwunderlich, beim Pulsen mit tuomrmarkerhaltigem Serum wurden deswegen suboptimale Dosierungen verwendet. Der stärkste Effekt konnte durch Kultivierung in unbehandeltem Serum und zusätzlichem Pulsen mit exogenem Tumormarker erreicht werden. Ein Pulsen mit CA 19-9 erbrachte bei den Zellen von Patienten, die keinen erhöhten CA 19-9 Serumspiegel aufwiesen, keine zytotoxizitätssteigernde Wirkung. Die gemessenen Zytotoxizitäten lagen mit 98,3% bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 80:1 für die Zellen von Patienten mit erhöhten CA 19-9 Serumspiegel ( Abbildung 14 ), und mit 50% bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 16:1 für die Gruppe der CEA exprimierenden Tumore ( Abbildung 15 ), erfreulich hoch und im Bereich der Zytolysen, die bei Verwendung von Zellinien hervorgerufen wurden.

5.2.5. Zusammenfassung: Pulsen dendritischer Zellen

In der Literatur sind viele Möglichkeiten zum Pulsen von dendritischen Zellen beschrieben ( 1 ). Grundsätzlich kann zwischen dem Pulsen mit definiertem Tumorantigen und dem Pulsen mit unfraktioniertem Tumorantigen unterschieden werden. Der Einsatz definierten Tumorantigens mündet in einer genau formulierten Vakzine, bei der die Induktion einer Autoimmunantort nicht zu befürchten ist. Allerdings schränkt die Verwendung definierten Antigens immuntherapeutische Ansätze auf die Tumorentitäten ein, für die tumor-assoziierte Antigene beschrieben sind. Unfraktionierte Tumorantigene, wie Tumorlysat, Tumor- RNA oder - DNA reduzieren das Risiko, das der Tumor sich durch Mutation dem einzigen definierten Epitop entzieht, das zum Pulsen verwendet wurde. Stark einschränkend wirken sich allerdings die Probleme bei der Gewinnung ausreichend großer Tumormengen aus, zumal bei der Patientengruppe, die von einer immunologisch gerichteten Thera


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pie wahrscheinlich am meisten profitieren würde, nämlich der Patientengruppe mit einer nicht nachweisbaren oder nur minimal residualen Erkrankung.

Bei den hier untersuchten Tumorentitäten sind die tumor-assoziierten Antigene CA 19-9 und CEA beschrieben. Diese wurden in dieser Arbeit zum Pulsen dendritischer Zellen verwendet. Die Effekte bei Verwendung des kompletten Proteins bzw. eines definierten Epitops waren gleich stark ausgeprägt. Dem Pulsen mit Protein ist der Vorzug zu geben, da Gesamtprotein unabhängig vom HLA -Typ eingesetzt werden kann, leichter erhältlich ist und keine Voruntersuchungen zur Bestimmung der antigenen Determinante erfordert. Auch können sich definierte Epitope leichter dem immunologischen Angriff durch Mutation entziehen.

Erstmals beschrieben wurde hier der Einsatz von Serum von Tumorpatienten im Sinne eines Pulsens mit unfraktionierten Tumorantigenen. Die Verwendung autologer oder allogener unbehandelter Seren von Karzinompatienten zum Pulsen dendritischer Zellen ist in der Literatur noch nicht beschrieben worden. Es konnte gezeigt werden, daß eine Kultivierung in tumormarkerhaltigem Serum eine Stimulation dendritischer Zellen bewirkt. Es ist zu hoffen, daß dieser Effekt auch für Seren von Patienten mit anderen Tumorformen gilt, für die noch keine Tumormarker beschrieben sind.

Für eine nahezu 100%ige Zellyse mußten im Zytotoxizitätstest Effektorzellen in einem Überschuß zwischen 20:1 - 80:1 eingesetzt werden, wobei sich Colo 205 Zellen dem immunologischen Angriff gegenüber sensibler zeigten als die Pankreaskarzinomzellinie DAN-G. Dieser benötigte Überschuß an Effektorzellen betont die Limitierung von derartigen immuntherapeutischen Strategien auf Patienten mit kleiner Tumormasse.

5.3. Veränderungen der Oberflächenmerkmale von CIK-Zellen durch die Cokultivierung mit dendritischen Zellen

CIK-Zellen zeigten nach Cokultur mit dendritischen Zellen ein verändertes Verhalten gegenüber gastrointestinalen Tumorzellen. Ferner ließ sich cokultivierten CIK-Zellen eine verstärkte Proliferation beobachten. Es konnte gezeigt werden, daß neben funktionellen Veränderungen auch phänotypisch Modifikationen zu beobachten waren.

5.3.1. Expression von T-Zellmarkern auf CIK-Zellen

Bei Untersuchungen der Oberflächenmerkmale cokultivierter CIK-Zellen wurde die Verteilung von T-Helferzellen und zytotoxischen T-Zellen ermittelt. Der Quotient von zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen steigt bei nativen CIK-Zellen während der Kultivierung an und erreichte mit 1,24 an Tag +12 sein Maximum. Cokultivierte CIK-Zellen wiesen schon einen Tag nach Beginn der Cokultur 28% mehr zytotoxische T-Zellen als T-Helferzellen auf. Diese Verschiebung in Richtung CD8 + Zellen blieb an den folgenden Kultivierungstagen erhalten und lag ab Tag +9 im Mittel bei 50%, so daß an Tag +12 das Verhältnis von CD8 + CD3 + zu CD4 + CD3 + bei 1,8:1 lag( Abbildung 16 ). Während der siebentägigen Cokultur kam es zu einer starken Proliferation der Effektorzellen. Es ist anzunehmen, daß es durch die Präsentation von Antigenen auf MHC Klasse I-Molekülen auf den dendritischen Zellen, verbunden mit dem Vorliegen costimulatorischer Signale, zu einer klonalen Expansion von zytotoxischen T-Zellen kommt, deren Wirkung in den durchgeführten LDH -Freisetzungstests nachgewiesen werden konnte.

5.3.2. Bedeutung der T-Helferzellen bei der Cokultivierung von CIK-Zellen

Die Interaktion naiver T-Zellen mit antigenpräsentierenden Zellen ist oftmals nicht ausreichend, um zytotoxische T-Zellen zu stimulieren. Die deswegen lange Zeit diskutierte Notwendigkeit, der gleichzeitigen Bindung antigenspezifischer T-Helferzellen und zytotoxischer T-Zellen an die APC wurde kürzlich in dieser Stringenz verworfen ( Lanzavecchia , 1998). Das von P. Matzinger vorgeschlagene Modell läßt dendritische Zellen durch den Kontakt mit T-Helferzellen konditionieren, die dann dahingehend differenzieren, daß sie in der Lage sind, zytotoxische T-Zellen direkt zu stimulieren ( Ridge et al., 1998). Der Kontakt zwischen DC und T-Helferzellen findet über CD40 / CD40L -Interaktionen statt. Neben dem Kontakt mit T-Helferzellen können auch andere Stimuli wie Viren,


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Lipopolysaccharide und TNF-? die Konditionierung der dendritischen Zellen bewirken. Damit lassen sich auch Beobachtungen, daß dendritische Zellen zytotoxische T-Zellen unmittelbar stimulieren können ( Inaba et al., 1987), erklären.

Die Bedeutung von T-Helferzellen in dem hier untersuchten Modell konnte durch eine Blockade von MHC Klasse II-Molekülen auf den dendritischen Zellen gezeigt werden ( 43 ). Eine Blockade zu frühen Zeitpunkten verminderte die induzierte Zellyse, die Zugabe von Antikörper an späten Tagen bewirkte keine Veränderung. Zusammen mit der Beobachtung, daß eine Blockade der MHC Klasse I-Moleküle sich an späten Tagen schwerwiegender als wie eine Blockade an frühen Tagen auswirkte, ergibt sich ein Bild, das sich mit dem Modell von P. Matzinger vereinbaren läßt. T-Helferzellen binden zu Beginn der Cokultur an dendritische Zellen, dieser Stimulation der dendritischen Zellen folgt dann eine Interaktionen zwischen den MHC Klasse I-Moleküle auf den DC und den zytotoxischen Zellen. Wird der Kontakt von T-Helferzelle und dendritischer Zelle verhindert, werden zytotoxische Zellen weniger stark aktiviert. Die in 42 beobachtete Verschiebung cokultivierter CIK-Zellen in Richtung CD8 + T-Zellen bei zunehmender Cokultivierungsdauer läßt sich mit der Bedeutung von T-Helferzellen an frühen Tagen gut vereinbaren.

5.3.3. Spezifität von T-Zellrezeptoren

Zur Abklärung der Frage, inwieweit die Zunahme an zytotoxischen T-Zellen durch die Cokultivierung auch einen erhöhten Anteil antigenspezifischer T-Zellen bedeutet, wurden T-Zellrezeptoruntersuchungen durchgeführt. Alters et al. konnten nach einer Cokultivierung von T-Zellen mit CAP-1 beladenen DC eine oligoklonale Expansion beobachten ( Alters et al., 1998). Sie untersuchten dabei die Expressionsmuster des Genes für den variablen Teil der beta-Kette des T-Zellrezeptors. Die Tetramertechnik erlaubt es, gezielt spezifische T-Zellrezeptoren nachzuweisen, sie basiert auf dem gleichen Prinzip, wie die in dieser Arbeit verwendete Dimertechnik. Bei der Tetramertechnik wird ein biotinylierter HLA-A2/beta2-Mikroglobulin/Peptidkomplex mit Avidin- PE gekoppelt (Altman et al., 1996). Lee et al. untersuchten Blut von Melanompatienten mit Tetrameren auf die Expression von T-Zellrezeptoren für Melanom-assoziierte Antigene (MART, gp100 und Tyrosinase) und fanden, daß bis zu 2% der zytotoxischen Zellen spezifisch eines der Antigene erkennen ( Lee et al., 1999). Diese T-Zellen waren aber anerg.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden T-Zellrezeptoren, die spezifisch CAP-1 erkennen mittels der Dimertechnik detektiert ( 44 ). Eine Cokultivierung der CIK-Zellen mit spezifisch gepulsten dendritischen Zellen bewirkte eine starke Zunahme der CAP-1 spezifischen zytotoxischen T-Zellen. 2,8% der CD8 + Zellen erkannten das Antigen, nachdem sie mit CAP-1 gepulsten DC cokultiviert worden waren. Für CIK-Zellen , die mit Gesamtprotein gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert worden waren, lag der Anteil bei 1,86%. Es ist davon auszugehen, daß dendritische Zellen, die mit Protein gepulst werden, eine Vielzahl von Epitopen präsentieren. Daher ist eine weniger starke Zunahme CAP-1 rezeptorspezifischer CD8 + Zellen durch die Cokultivierung mit Protein gepulster dendritischer Zellen, nicht verwunderlich. Es ist zu vermuten, daß der Anteil antigenspezifischer T-Zellen in beiden Fällen gleich hoch ist, jedoch nach dem Pulsen mit Peptid sich monoklonal darstellt, nach dem Pulsen mit Protein sich jedoch ein zumindest oligoklonales T-Zellrezeptorrepertoire ausbildet.

Irritierend ist der Umstand, daß bei der Detektion rezeptorspezifischer Zellen unabhängig von ihrem CD8 Status, keine relevante Zunahme im Vergleich zu den CD8 + rezeptorspezifischen Zellen beobachtet werden konnte. Der Anteil CD8 - rezeptorspezifischer Zellen lag lediglich um 5-9% über dem der CD8 + rezeptorspezifischer Zellen. Es scheinen sich also zumindest an Tag +14 der Cokultivierung nur noch wenige CD4 + Zellen, die das untersuchte Antigen erkennen können, in der Kultur zu befinden. Dies läßt sich nur teilweise durch die in 5.3.1 diskutierte prozentuale Abnahme von CD4 + Zellen im Vergleich zur CD8 + Population erklären.

Die im Rahmen dieser Arbeit detektierten 2,8% peptidspezifischer zytotoxischer Zellen nach Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen liegen nicht wesentlich über den von Lee et al. im Blut von Melanompatienten erhobenen Befunde. Der wesentliche Unterschied besteht jedoch darin, daß die untersuchten CIK-Zellen zytotoxisch wirksam waren.


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5.3.4. Interferon-gamma Produktion cokultivierter CIK-Zellen

Es wurde die Interferon-gamma Produktion von CIK-Zellen als Parameter ihre Stimulation bestimmt ( 45 ). CIK-Zellen sezernierten auch nach Stimulation mit polyklonalem Mitogen in nur geringem Maße IFN-gamma . Eine Cokultivierung mit dendritischen Zellen bewirkte eine starke Stimulation der CIK-Zellen , wobei ein Pulsen der dendritischen Zellen nur eine geringfügig höhere IFN-gamma Produktion bewirkte. Eine zweite Cokultivierung mit allogenen Tumorzellen stellte einen weiteren Stimulus für die CIK-Zellen dar. Nicht erklärbar ist der Umstand, daß die Cokultur mit ungepulsten DC und Tumorzellen einen stärkeren Reiz darstellte, als die Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen und Tumorzellen. Allerdings gab es bei diesen beiden Untersuchungen auch die statistisch größte Streuung der Einzeldaten.

5.3.5. Zusammenfassung: Veränderungen cokultivierter CIK-Zellen

Bei der Cokultivierung dendritischer Zellen mit CIK-Zellen kam es, bedingt durch die Zell-Interaktionen zu Veränderungen beider Zellpopulationen. Dendritische Zellen exprimierten nach Kontakt mit CIK-Zellen in verstärktem Maße antigenpräsentierende und costimulatorische Moleküle ( Tabelle 1 ).

Bei den CIK-Zellen bewirkte die Cokultivierung mit dendritischen Zellen mehrere Veränderungen, die die erhöhte Zytotoxizität erklärbar machen. Die Proliferationsrate stieg an, der prozentuale Anteil zytotoxischer T-Zellen nahm zu, ein starker Anstieg IFN-gamma sezernierender, d.h. aktivierter T-Zellen war zu verzeichnen und die Untersuchungen bezüglich CAP-1 spezifischen T-Zellrezeptors zeigten eine Zunahme antigenspezifischer zytotoxischer T-Zellen ( 13 ). Erklärbar sind die beobachteten Effekte durch ein Modell, daß dendritische Zellen durch einen Kontakt mit T-Helferzellen konditionieren läßt ( 57 ). Die derart konditionierten dendritischen Zellen bewirken dann eine klonale Expansion antigenspezifischer, zytotoxischer T-Zellen.

5.4. Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen

Vor dem Hintergrund der in 43 gemachten Beobachtungen zur Bedeutung der MHC Klasse II-Moleküle auf dendritischen Zellen, erschien eine Transfektion mit dem CIITA-Gen zur Stimulation von T-Helferzellen sinnvoll.

5.4.1. Transfektion dendritischer Zellen

Mulders et al. beschreiben eine hohe Transfektionseffizienz bei dendritischen Zellen unter Verwendung eines AdV-PLL -Vektors ( Mulders et al., 1998). Diese Ergebnisse konnten reproduziert werden, wobei eine etwas höhere MOI verwendet wurde. Die Verwendung der relativ geringen MOI von 80-100 und das Belassen des Viruses für 48 Stunden auf den Zellen bewirkte keine zytopathischen Effekte. Die Bestimmung der Expression der für den adenoviralen Gentransfer benötigten Oberflächenstrukturen auf den dendritischen Zellen, ergab eine Zunahme des CA-Rezeptors und des alphavbeta5-Integrins im Verlauf der Kultivierung ( Abbildung 20 ). Korrespondierend dazu fiel die Transfektionseffizienz mit zunehmendem Alter der Zellen höher aus ( Abbildung 21 ). Fünf Tage dendritische Zellen konnten fast zu 100% transfiziert werden. Die Transfektion bewirkte keine morphologischen Veränderungen ( Abbildung 22 ).

In Abhängigkeit von dem Alter der dendritischen Zellen am Tag der Transfektion konnte die m RNA des CIITA-Genes nachgewiesen werden (Abbildung 23) . Wie zu erwarten, konnte bei sehr jung transfizierten DC (le 2 Tage) keine CIITA- RNA nachgewiesen werden.


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5.4.2. Eigenschaften CIITA transfizierter dendritischer Zellen

Im Gegensatz zu den von Martin et al. publizierten Ergebnissen ( Martin et al., 1997), konnte keine wesentliche Veränderung der MHC Klasse I-Expression nach Transfektion mit dem CIITA-Gen beobachtet werden. Bei der MHC Klasse II-Expression konnte nach der CIITA Transfektion eine Zunahme der Expression um durchschnittlich 64,6% beobachtet werden ( Tabelle 6 ). Das viral eingeschleuste CIITA-Gen war somit funktionell aktiv.

Nachdem dargestellt werden konnte, daß dendritische Zellen sich mittels AdV-PLL mit dem CIITA-Gen transfizieren lassen, daß das Gen in m RNA umgeschrieben wird, und daß dies letztendlich zu einer verstärkten Expression von MHC Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche dendritischer Zellen führt, wurden die Auswirkungen dieser Transfektion auf die zytotoxizitätssteigernde Wirkung dendritischer Zellen auf cokultivierte CIK-Zellen untersucht ( 50 ). Im Zytotoxizitätstest ergab sich keine Steigerung der vermittelten Zellyse der CIK-Zellen bei Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen. Gravierend fiel jedoch der Unterschied zwischen CIK-Zellen , die mit ungepulsten mock-transfizierten DC cokultiviert worden waren, und solchen, die mit ungepulsten CIITA-transfizierten cokultiviert wurden. Es wurden Zellysen erreicht, die die Größenordnung der CIK-Zellen erreichten, die mit Tumorantigen gepulsten dendritischen Zellen cokultiviert worden waren, wobei starke Unterschiede zwischen den verschiedenen Spendern auffielen. Die starke unspezifische Aktivierung nach Cokultur mit CIITA-transfizierten dendritischen Zellen läßt sich möglicherweise mit dem eingangs erwähnten Modell zur T-Zellaktivierung diskutieren. Gepulste dendritische Zellen sind durch den Antigenkontakt ausreichend konditioniert für eine Aktivierung zytotoxischer T-Zellen, wohingegen ungepulste DC erst durch einen Kontakt mit T-Helferzellen zu stimulationsfähigen APC ausdifferenzieren. Eine Erhöhung der MHC Klasse II-Expression, z.B. nach Transfektion mit dem CIITA-Gen fördert den Kontakt mit T-Helferzellen.

5.4.3. Zusammenfassung: Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen

Dendritische Zellen ließen sich erfolgreich mittels AdV-PLL transfizieren. Beim Vergleich ungepulster dendritischer Zellen mit CIITA transfizierten ungepulsten dendritischen Zellen, konnte im Zytotoxizitätstest eine starke Zunahme der lytischen Eigenschaft cokultivierter CIK-Zellen bei vorausgegangener Transfektion der dendritischen Zellen beobachtet werden. Wurden gepulste dendritische Zellen transfiziert, konnte keine relevante Zunahme beobachtet werden. Eine Transfektion dendritischer Zellen mit dem CIITA-Gen stellt somit eine Möglichkeit zur Zytotoxizitätssteigerung cokultivierter Effektorzellen dar, wenn kein Antigen zum Pulsen dendritischer Zellen zur Verfügung steht.


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5.5. Ausblick

Weltweit wurden in den vergangenen Jahren klinische Studien initiiert, in deren Mittelpunkt eine Immuntherape mit dendritischen Zellen steht. Zum Einsatz kommen dabei dendritische Zellen, die abhängig von der Erkrankung, spezifisch gepulst werden. So werden z.B. bei Patienten mit B-Zell Lymphomen mit Idiotyp-Protein gepulste DC verwendet ( Hsu et al., 1996), Hölt et al. setzen autologes Tumorlysat bei Patienten mit Nierenzellkarzinom zum Pulsen ein ( Höltl et al., 1998), für den klinischen Einsatz bei Patienten mit Prostatakarzinom ist ein Beladen der dendritischen Zellen mit Peptiden des Prostata-spezifischen-Membran-Antigens beschrieben ( Murphy et al., 1996), weitere Studien beschäftigen sich mit dem Ovarialkarzinom ( Brossart et al., 1999), dem malignem Melanom ( Nestle et al., 1998) oder dem multiplen Myelom ( Reichhardt et al., 1999). Insgesamt konnte aufgezeigt werden, daß ein klinischer Einsatz dendritischer Zellen durchführbar ist, mit sehr geringen Nebenwirkungen verbunden ist und keine Autoimmunität bewirkt. Ein Ansprechen auf die Behandlung wird von den meisten Arbeitsgruppen beschrieben und reicht von Stabilisierung über partielle Remission bis hin zur Remission. Begleitanalysen, wie ELISpot-Untersuchungen, delayed-type hypersensitivity reaction (DTH-Reaktion), Messungen der Zytokinproduktion und Zytotoxizitätstests mit peripheren Blutlymphozyten demonstrieren das Vorliegen einer Immunantwort.

Die hier vorliegende Arbeit zeigt einen immuntherapeutischen Ansatz für die Behandlung gastrointestinaler Tumore auf. Autologe dendritische Zellen oder cokultivierte Effektorzellen können als Tumorvakzine eingesetzt werden. Dendritische Zellen können hierfür mit CA 19-9 , CEA oder mit


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dem Serum von Tumorpatienten gepulst werden. Eine unspezifische Aktivierung der dendritischen Zellen durch Transfektion mit dem CIITA-Gen könnte bei Patienten mit Tumoren, für die keine Tumorantigene beschrieben sind, erfolgversprechend sein. Eine klinische Studie zum Einsatz mit Tumorlysat gepulster autologer dendritischer Zellen beim Nierenzellkarzinom, die von unserer Arbeitsgruppe momentan durchgeführt wird, wurde von der vorliegenden Arbeit beeinflußt.
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