3. Methoden

3.1. Flussdiagramm der verwendeten Methode RT-PCR

↓27

3.2. Flussdiagramm der verwendeten Methode Western Blot

↓28

3.3. Tierversuche: Tiere, Versuchsaufbau, Tierschutz

Wistar-Ratten im Alter von 6 Tagen, geliefert vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV, Berlin), wurden für die durchgeführten Versuche eingesetzt. Zusammen mit ihren Müttern wurden die 11–15g schweren Tiere in einen Käfig mit Wasser und Nahrung gesetzt. Für die Inkubation unter hyperoxischen Bedingungen wurden sie aus diesem Käfig mit dem Muttertier entnommen und bei Wasser und Nahrung in einem ehemaligen Transportinkubator (s. Abb.5) für neugeborene Kinder bei einer Sauerstoffkonzentration von 80% gehalten. Die Sauerstoffkonzentration wurde dabei ständig kontrolliert. Die Kontrolltiere wurden bei Raumluft gelassen.

Bei jedem Versuch wurden pro Zeiteinheit sechs Tiere eingesetzt und zusätzlich sechs Kontrolltiere. Die gewählten Zeiteinheiten, die die Tiere bei 80% Sauerstoffkonzentration verbrachten, lagen bei 2, 6, 12, 24, und 48std.

↓29

Die Tiere erlebten in ihren Käfigen einen Tag- und Nacht-Rhythmus von Licht und Dunkelheit.

Abbildung 5: Transportinkubator mit O2-Messgerät zur Überwachung der Sauerstoffkonzentration

3.4. Präparation von Hirngewebe

3.4.1. Präparation für molekularbiologische Untersuchungen

Die Tiere, die dem Sauerstoff ausgesetzt waren, sowie die Kontrolltiere wurden zunächst mit Ether narkotisiert und dann mit einer scharfen Schere dekapitiert. Die Kalotte wurde aufgeschnitten und das Gehirn entnommen. Folgende Hirnregionen der jeweils rechten und linken Hemisphäre wurden präpariert:

↓30

Die Gewebeproben wurden in 2,0ml-Reaktionsgefäßen sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert.

3.4.2. Perfusion und Präparation für histologische und immunhistochemische Untersuchungen

Tiere, die histologisch und immunhistochemisch untersucht werden sollten, wurden nach den bestimmten Zeiteinheiten (2, 6, 12, 24, 48std) in 80%iger Sauerstoffkonzentration mit einer Überdosis Chloralhydrat getötet. Anschließend wurde der Thorax geöffnet, und über eine in die Aorta vorgeschobene Kanüle erfolgte die intrakardiale Perfusion. Zunächst wurden die Ratten mit einer eiskalten Heparinlösung für 15min perfundiert, worauf eine weitere Perfusion für 30min mit eiskalter Fixierungslösung II folgte.

↓31

Nach der Perfusion wurde jeweils die Kalotte mittels vorsichtiger Schnitte entlang der Sagittalnaht geöffnet, das Gehirn mit einem Spatel entnommen, gewogen und in Fixierungslösung II für 4std bei 4°C nachfixiert. Anschließend erfolgten die DeOlmos Kupfersilberfärbung bzw. TUNEL-Färbung und die immunhistochemische Untersuchungen.

3.5. RT-PCR

3.5.1. Isolierung und Reinigung von RNA aus Hirngewebe

Die Isolation der RNA aus dem Gewebe erfolgte mittels einer sauren Guanidin-Isothiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode119 mit dem RNA-Clean TM -Reagenz.

Pro 100mg tiefgefrorenem Gewebe wurde 2,0ml RNA-CleanTM-Lösung zugefügt. Das Gewebe wurde zunächst gelöst und dann so lange gevortext, bis es vollständig homogenisiert war.

↓32

Im Anschluss daran folgte die Extraktion der RNA. Dafür wurden 1/10 Volumina Chloroform, bezogen auf das Volumen der eingesetzten RNA-CleanTM-Lösung, zugegeben. Nach dem Vortexen der Proben für 20s folgte für 5min eine Inkubation auf Eis. Anschließend wurden die Proben bei 4°C in einer Tischzentrifuge zentrifugiert (15min, 12.000xg). Danach wurde die obere wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 1 Volumen Isopropanol versetzt, 15min bei –20°C inkubiert und danach erneut bei 4°C zentrifugiert (15min, 12.000xg). Zur Reinigung der gefällten RNA wurde der Überstand abpipettiert, das RNA-Pellet mit 190 μl 70% Ethanol gewaschen und bei 4°C für 8min zentrifugiert (7.6000xg). Dieser Reinigungsschritt wurde wiederholt. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Pellet etwa 20min luftgetrocknet. Zur Entfernung von Restethanol wurden die Reaktionsgefäße anschließend offen für 5min bei 60°C inkubiert. Danach folgte die Resuspendierung der erhaltenen RNA mit 50μl PCR-H2O. Anschließend wurden die Proben nochmals bei 60°C für 5min inkubiert, gemischt, zentrifugiert und schließlich bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.

3.5.2. RNA-Konzentrationsbestimmung

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration120 und Reinheit der Präparation wurde die Absorption der jeweiligen RNA-Lösung bei 260 und 280nm im Spektralphotometer ermittelt. Die Konzentrationsbestimmung beruht auf dem Absorptionsmaximum der aromatischen Pyridin- und Pyrimidinringe der Nukleinsäurebasen bei 260nm. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine OD-Ratio von 1,0 einer RNA-Konzentration von 40μg/ml.

Proteine zeigen aufgrund ihrer aromatischen Aminosäurereste ein Absorptionsmaximum bei 280nm. Der Wert des Quotienten aus der Absorption bei 260nm und 280nm (ratio) sollte bei einer kontaminationsfreien RNA-Lösung zwischen 1,8 und 2,0 liegen.

3.5.3. DNase-Behandlung der präparierten RNA-Lösung mit anschließender Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Behandlung

↓33

RNA-Präparationen weisen oft eine Kontamination mit DNA auf. Da diese Verunreinigung mit DNA weitere Experimente beeinträchtigen und Ergebnisse verfälschen kann, mussten die erhaltenen RNA-Lösungen gereinigt werden. Dies erfolgte enzymatisch durch Behandlung mit einer RNase-freien DNase I und anschließender PCI-Fällung.

Ansatz:

↓34

Der Ansatz wurde 1std bei 37°C und anschließend 5min auf Eis inkubiert. Die Extraktion der RNA erfolgte mittels Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Behandlung (PCI-Behandlung). Zum Ansatz wurde 1 Volumen Roti-Phenol-Chloroform-Lösung gegeben und anschließend in einer Tischzentrifuge bei RT zentrifugiert (2min, 14.000xg). Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 1 Volumen Chloroform versetzt und analog zentrifugiert. Zur Fällung der RNA wurde die obere wässrige Phase erneut abgenommen, 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) sowie 0,5μg Glykogen (20μg/μl) zugegeben und gut gemischt. Dieser gesamte Ansatz wurde mit 3 Volumina 96% (v/v) Ethanol versetzt, sorgfältig gemischt und über Nacht bei –20°C gefällt.

Am folgenden Tag wurde der Ansatz in einer Tischzentrifuge 20min bei 14.000xg zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet zweimal mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Anschließend wurde das Pellet 15min an der Luft getrocknet und in 22μl PCR-H2O resuspendiert. Die RNA-Konzentration und Reinheit der Probe wurden photometrisch, wie unter Punkt 3.5.2 beschrieben überprüft.

3.5.4. RNA-Kontrollelektrophorese

Zur Überprüfung der Integrität und der Kontaminationsfreiheit wurde die RNA einer 1-%- Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.

↓35

1% Agarosegel:

Zur Kontrollelektrophorese wurden jeweils 500ng RNA aufgetragen.

↓36

Beispiel für Probenvorbereitung:

Zur Vermeidung von Sekundärstrukturen wurden die Proben vor dem Auftragen 10min bei 70°C erhitzt und dann kurz zuvor auf Eis gestellt. Als Laufpuffer der Elektrophorese wurde 1x T-Puffer, pH 7,7 verwendet. Die aufgetragenen Proben wurden zunächst 10min bei 50V laufen gelassen und anschließend für 30–40min bei 100V.

↓37

Die Färbung der Proben erfolgte für 40min in Ethidiumbromid. Ethidiumbromid interkaliert als organischer Fluoreszenzfarbstoff in Nukleinsäuren. Es wird durch UV-Licht angeregt und emittiert Licht im orangeroten Bereich.

Um weitere Sicherheit über die DNA-Freiheit der RNA zu erhalten, wurde eine Negativkontrolle der RT-PCR durchgeführt, wobei in der PCR nicht revers transkribierte RNA eingesetzt wurde.

3.5.5. Semiquantitative RT-PCR: Theoretische Aspekte

Es existieren zahlreiche molekularbiologische Methoden zur Analyse von RNA, u.a. Northern Blot, In-situ-Hybridisierung und der RNase-Protection-Assay. Diese sind jedoch sehr zeitintensive Methoden und bei schwachen Transkripten aufgrund ihrer geringen Sensitivität ungeeignet. Mit der Möglichkeit, das Prinzip der reversen Transkription zu nutzen, begann man auch RNA-Moleküle mit der PCR-Technologie zu amplifizieren, und es wurde die sensitive Methode der Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) entwickelt. Mit der RT-PCR kann also die Genexpression auf mRNA-Ebene analysiert werden.

↓38

Da die Taq-Polymerase einzelsträngige RNA nicht als Matrize erkennen kann, muss die RNA zunächst in cDNA umgeschrieben werden. Dies geschieht mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, der Reversen Transkriptase, die zur Ausgangs-RNA einen komplementären DNA-Strang (cDNA) bildet. Dieser cDNA-Einzelstrang wird durch die thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) bei 72°C zum Doppelstrang vervollständigt. Da die Taq-Polymerase leicht die Denaturierungstemperatur von 94°C übersteht, kann in einer Reaktion durch zyklische Veränderungen der Temperatur eine exponentielle Zunahme der DNA erreicht werden. Erst nach Verbrauch der Nukleotide oder der Primer wird eine Plateauphase erreicht. Die Spezifität dieses Verfahrens wird durch die Primer bedingt.

Um Mengenabschätzungen der Expression spezifischer mRNAs vorzunehmen, kann das Prinzip der internen endogenen Standardisierung genutzt werden. Dabei wird die mRNA eines so genannten Housekeeping-Gens zusätzlich zum zu untersuchenden Gen revers transkribiert und in der PCR coamplifiziert. Als „Housekeeping-Gene“ bezeichnet man Gene, die in jeder Zelle und zu jeder Zeit in gleichem Maße exprimiert werden. Das Signal nach der Amplifikation ist demnach konstant. Indem man das Signal des zu untersuchenden Gens ins Verhältnis zu dem des „Housekeeping-Gens“ setzt, können semiquantitative Abschätzungen vorgenommen werden. Wichtig bei der Auswahl eines internen Standards ist, dass das Transkriptionsniveau bei den verwendeten experimentellen Bedingungen nicht variiert.

Der verwendete Standard in der RT-PCR bei dieser Arbeit war β-Actin, da das β-Actin-Gen die oben genannten Bedingungen erfüllte.

↓39

Da die Amplifikation im Verlauf der PCR nicht linear sondern über eine exponentielle Phase und eine Plateauphase verläuft, ist eine Quantifizierung erschwert. Schon kleinste Schwankungen, z.B. unterschiedliche Inhibition von Proben, beeinflussen die Effizienz der Gesamtreaktion.

Die Analyse der Amplifikate erfolgte mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Die erhaltenen Gele konnten photographiert und densitometrisch mittels spezieller Software (semiquantitativ) ausgewertet werden. So konnten Unterschiede in der Expression bestimmter Gene im Verhältnis zum normalisierten β-Actin-mRNA-Gehalt einer jeden Probe bestimmt werden.

3.5.5.1. Reverse Transkription von mRNA in cDNA

Es wurden je 500ng RNA revers transkribiert. Diese wurden in einem ersten Ansatz mit 1μl Oligo(dT) Primer (50 μM) und PCR-H2O auf eine Gesamtmenge von 13,5μl aufgefüllt.

↓40

Zweiter Ansatz:

Der gesamte zweite Ansatz wurde dann in den ersten Ansatz überführt, sodass die Probe ein Gesamtvolumen von 25μl aufwies. Der Ansatz wurde anschließend 60min bei 42°C und dann 5min bei 95°C inkubiert.

3.5.5.2. Kontroll-PCR und Elektrophorese der cDNA

↓41

Die Reinheit der cDNA wurde mittels Kontroll-PCR und anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Für die Kontroll-PCR wurde folgender Ansatz vorbereitet:

Als erste Negativkontrolle wurde eine Probe vorbereitet, bei der 1μl PCR- H2O statt 1μl cDNA eingesetzt wurde.

↓42

Nach Ablauf des PCR-Programms erfolgte die Vorbereitung der Proben für das Auftragen auf ein 2%iges Agarosegel.

2% Agarosegel:

↓43

Ansatz:

Für die zweite Negativkontrolle wurde 1μl PCR-Produkt durch 1μl PCR- H2O ersetzt und dann 9μl DNA-Probenpuffer hinzugefügt. Das Auftragen auf das Agarosegel, die anschließende Elektrophorese und die Färbung mit Ethidiumbromid erfolgte wie unter Punkt 3.5.4. bei der RNA-Kontrollelektrophorese beschrieben.

↓44

Bei der Auswertung durfte nur die amplifizierte β-Actin-Bande bei einem Molekulargewicht von 433bp im UV-Licht zu sehen sein. Bei beiden Negativkontrollproben durfte hingegen kein Signal erscheinen.

3.5.5.3. Amplifizierung der cDNA mittels Polymerasekettenreaktion

In der Polymerasekettenreaktion (PCR) werden aus der mittels reverser Transkription gewonnenen cDNA und mit Hilfe spezifischer Primer verschiedene zu untersuchende Gene und der interne Standard β-Actin coamplifiziert.

Sowohl die Ansätze für die PCR als auch Zyklenanzahl und Annealingtemperatur des PCR-Programmes wurden für die einzelnen zu untersuchenden Gene optimiert.

↓45

Tabelle 1: PCR-Bedingungen für die untersuchten Gene

Gen (Faktor)

Ansatz (50μl)

Annealing-

temperatur

Zyklen-

anzahl

NT-3

-1μl cDNA

-4μl R-und F-Primer [10μM]

-1μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

60°C

32

NGF

-1μl cDNA

-4μl R-und F-Primer [10μM]

-1μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

60°C

32

BDNF

-1µl cDNA

-1,5µl R-und F-Primer[10μM]

-0,5μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

54°C

28

GDNF

-1μl cDNA

-1μl R-und F-Primer[10μM]

-0,75μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

54 °C

30

IL-10

-1μl cDNA

-1μl R-und F-Primer[10μM]

-0,5μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

58 °C

30

IL-1

-1µl cDNA

-2µl R-und F-Primer [10μM]

-0,5μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

58°C

30

IL-18

-2μl cDNA

-2μl R-und F-Primer[10μM]

-1μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

54°C

32

IL-18R

-2μl cDNA

-2μl R-und F-Primer [10μM]

-1μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

54°C

32

Fas

-1μl cDNA

-1μl R-und F-Primer [10μM]

-1μl R-und F-β-Actin-Primer [2μM]

54°C

28

Die Proben bestanden aus 5µl dNTPs, 5μl 10x PCR-Puffer, den Primerverdünnungen, der 0,3μl Taq-Polymerase, dem jeweiligen Volumen cDNA und wurden mit PCR-H2O auf ein Gesamtvolumen von 50μl verdünnt.

Bis auf die unterschiedlich angewandten Annealingtemperaturen und Zyklen war das PCR-Programm für die einzelnen Gene stets gleich.

↓46

Tabelle 2: Allgemeiner Ablauf des PCR-Cycler-Programmes

Schritt

Vorgang

Temperatur °C

Zeit

1

Denaturierung, hot start

94

30sec

2

Denaturierung

94

30sec

3

Annealing

primerspezifisch

(s. Tabelle 1)

1min

4

Extension

72

1min

5

x Zyklen d. Schritte 2 bis 4

6

terminale Extension

72

7min

7

Kühlung

4

Beide Amplifikate sollten gut sichtbare Banden vergleichbarer Intensität auf einem anschließenden Polyacrylamidgel ergeben. Zur Optimierung der erhaltenen Ergebnisse wurde daher, wie oben dokumentiert, das Volumen der eingesetzten Primer, die Zyklenzahl und die Annealingtemperatur für die einzelnen Gene variiert.

3.5.5.4. Gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente

Herstellung des 5% Polyacrylamidgels:

↓47

Die Gellösung wurde zwischen zwei mit einem Spacer abgedichtete Glasplatten gegossen.

Polyacrylamidgele zeichnen sich gegenüber Agarosegelen durch ein höheres Auflösungsvermögen bei der Auftrennung kleinerer Nukleinsäurefragmente aus.

Vorbereitung der Proben

Es wurden 9µl aus dem jeweiligen PCR-Produkt entnommen und mit1µl PAGE-Puffer gemischt. Die Proben wurden vor dem Probenauftrag 10min bei 70°C erhitzt und anschließend 5min auf Eis gestellt, um dann 5μl aufzutragen.

Polyacrylamidgel-Elektrophorese

↓48

Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese erfolgte in einem TGGE-Elektrophoresesystem. Für eine gleichmäßige Wärmeleitung wurden 5ml 0,1% Tritonlösung auf die Kühlplatte gegeben. In die Pufferreservoirs wurden gleiche Volumina (je ca. 500ml) Laufpuffer gegeben.

Laufpuffer:

Eine Präelektrophorese wurde für 10min bei 10W durchgeführt.

↓49

Nachdem das Gel equilibriert war, konnten die Proben in die Geltaschen aufgetragen werden. Zum Einlaufen der Proben in das Gel wurden die Bedingungen der Präelektrophorese übernommen. Die Hauptelektrophorese wurde bei 25W für 120min durchgeführt

3.5.5.5. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen

Die Silberfärbung ist eine sensitive Methode für die Färbung von Nukleinsäuren121. Ihre Nachweisgrenze liegt bei 0.03ng/mm². Die Färbung beruht auf der Veränderung des Redoxpotentials von Silber durch Nukleinsäuren, sodass sich elementares Silber abscheiden kann.

Das Gel wurde in den folgenden Lösungen für die Silberfärbung auf einem Taumel-Wipptisch in folgendem Algorithmus inkubiert:

↓50

3.5.5.6. Densitometrische Auswertung der Polyacrylamidgele

Die silbergefärbten Polyacrylamidgele wurden mit Hilfe des Programms Biometra eingescannt und mit der Biometra-Image-Analysis-Software ausgewertet. Entsprechend der Fläche und Intensität der silbergefärbten Bande wurde ein relativer Volumenanteil berechnet. Dieser Wert kann als ein semiquantitatives Maß genutzt werden.

Grundlage der Methode der semiquantitativen RT-PCR ist die These der gleichmäßigen Expression des internen Standards β-Actin in Zellen aller Entwicklungsstufen. Aufgrund der Sensitivität der PCR kann es zu Schwankungen in der Amplifikation kommen, die von Probe zu Probe verschieden stark sind (so genannte tube-to-tube variation). Daraus folgen nicht mehr einheitliche Standardbanden. Zum anderen existieren in biologischen Proben „natürliche“ Expressionsunterschiede von bis zu 15%. Um festzustellen, ob die Expression der Gene der einzelnen Faktoren in den verschiedenen Zeitintervallen nach der Hyperoxie signifikante Unterschiede aufweist, wurde daher eine Korrektur nach folgendem Algorithmus vorgenommen:

↓51

  1. den relativen Volumenanteil für eine (willkürlich gewählte) β-Actin-Bande 100 % setzen,
  2. für alle andern Standardbanden den prozentualen Anteil, bezogen auf die gewählte β-Actin-Bande, berechnen,
  3. der für jede Standardbande berechnete prozentuale Anteil gilt auch für die zugehörige Bande des jeweils zu untersuchenden Gens; der relative Volumenanteil dieser Bande wird auf 100% korrigiert.

Der interne Standard wurde demnach als Referenz verwendet, um das mRNA-Niveau des jeweiligen Gens zu normalisieren. Von diesen korrigierten Werten konnten der Mittelwert und die Standardabweichung der Stichprobe bestimmt werden, und eine graphische Aufzeichnung konnte erfolgen. Die mRNA-Gehalte des jeweiligen Gens konnten entweder als Verhältnis des relativen Volumenanteils von β-Actin zum relativen Volumenanteil des Gens angegeben werden. Eine andere Darstellungsweise war die prozentuale Angabe bezogen auf den Mittelwert des internen Standard der 100% entspricht. Änderungen in den Verhältnissen bzw. den prozentualen Anteilen bei verschiedenen Proben waren ein Indiz für die veränderte mRNA-Expression des zu untersuchenden Gens.

3.6. Western Blot

Während bei der RT-PCR nur die Genexpression der einzelnen Faktoren nachgewiesen wurde, diente die Methode des Western Blot zum direkten Nachweis der Proteine. Dabei wurden die Proteinfraktionen zunächst durch Elektrophorese in einem 8% Polyacrylamidgel getrennt. Im Anschluss daran folgte der Transfer auf eine Nitrocellulosemembran. Nach Beendigung des Transfers wurde die Membran mit dem ersten Antikörper inkubiert, sodass dieser spezifisch an das nachzuweisende Protein binden konnte. Um den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex anzufärben, wurde ein zweiter Antikörper verwendet, dessen Antigen wiederum der erste Antikörper darstellte (Anti-Antikörper). Ein an dieses zweite Immunglobulin gekoppeltes Enzym setzte ein farbloses Substrat in einer enzymatischen chemilumineszenten Reaktion in einen Farbstoff um. Auf einem anschließend aufgelegten Röntgenfilm erschien ein dunkler Strich, der selektiv die Lage der nachzuweisenden Proteine anzeigte.

3.6.1. Proteinextraktion

↓52

Die Gewebeproben wurden gewogen und der Extraktionspuffer vorbereitet (2ml pro Probe).

Extraktionspuffer (100ml):

↓53

Zur Homogenisierung, die bei 4°C durchgeführt wurde, wurde das gefrorene Gewebe mit 10x (w/v) Extraktionspuffer versetzt.

Anschließend wurden die Proben in einer Tischzentrifuge bei 4°C und 1050xg zentrifugiert. Der Überstand enthielt die Zytosol- und Mitochondrial-Proteinfraktion und wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und erneut 20min bei 4°C und 17000xg zentrifugiert. Der Überstand, die Zytosolfraktion, wurde wiederum in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt, das Pellet, die Mitochondrialfraktion, mit 200µl Extraktionspuffer resuspendiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben bei –80°C gelagert.

3.6.2. Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mittels eines BCA-Protein-Assays.

↓54

Dabei wurde BSA als Proteinstandard verwendet. Alle Proben wurden dreifach bestimmt. Die Konzentrationsreihe für BSA war: 2,0mg/ml; 1,0mg/ml; 0,5mg/ml; 0,2mg/ml und 0,02mg/ml. Zur Verdünnung wurde PBS verwendet. Auch die Proben wurden mit PBS verdünnt, die Zytosolfraktion 1:5 und die Mitochondrialfraktion 2:5. Für die Reagenzlösung wurden 50 Teile vom BCA-Reagenz A (Puffer mit Bicinchoninsäure) mit 1 Teil von BCA-Reagenz B (Lösung mit 4% Kupfersulfat) gemischt und zu den Proben gegeben. Ihre Absorption wurde bei 562nm in einem Mikroplattenreader bestimmt. Aus den erhaltenen Daten wurde eine Standardkurve erstellt, an der die Proteinkonzentrationen der Proben (µg/ml) kalkuliert werden konnten.

3.6.3. Gelelektrophorese

Das 8%ige Trenngel wurde zwischen die Glasscheiben bis 2cm unterhalb des Kammeinsatzes gegossen und mit Isopropanol überschichtet.

Trenngel (8%):

↓55

Nach 20min war das Gel auspolymerisiert, und das Isopropanol wurde abgegossen. Anschließend wurde das 4,4% Sammelgel gegossen und sofort der Probeauftragskamm eingesetzt.

Sammelgel (4,5%):

↓56

Je nach nachzuweisendem Protein wurden unterschiedliche Proteinkonzentrationen aufgetragen, für Fas: 50µg, für MAPK: 25µg und für Akt: 25μg. Zu 9µl Probevolumen wurden je 9µl Laemmli-Puffer hinzugegeben. Als Molekulargewichtsmarker wurde ein Rainbow-Marker verwendet. Dazu wurden 3µl Rainbow-Marker-Lösung mit 6µl PCR-H2O und 9µl Laemmli-Puffer gemischt. Proben und Marker wurden dann bei 95°C für 5min inkubiert und bis zum Probenauftrag 5min auf Eis gestellt.

Das Pufferreservoir der Elektrophoresekammer wurde mit 1x Elektrophoresepuffer befüllt.

↓57

1x Elektrophoresepuffer:

Nach dem Auspolymerisieren des Gels wurden Proben und Marker aufgetragen und die Elektrophorese gestartet. Zunächst für 30min bei 100V, bis das Bromphenolblau des Laemmli-Puffers das Trenngel erreichte, und dann für 90min bei 160V, bis die blaue Farbstofffront sich ca. 1–2cm oberhalb des Gelendes befand.

3.6.4. Transfer auf eine Nitrocellulosemembran (Tankblot-Verfahren)

↓58

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Trenngel vorsichtig in eine Pufferbox mit Transferpuffer für 20min überführt und unter leichtem Schütteln gewaschen.

Transferpuffer:

↓59

Der Aufbau des „Blottingsandwichs“ für ein Gel war folgender:

Die Blot-Apparatur wurde mit Transferpuffer gefüllt und das Blottingsandwich eingesetzt. Der Transfer wurde dann für 90min bei 150mA vollzogen.

↓60

Anschließend wurde die Membran kurz mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mit Ponceau-Rot für ein paar Minuten zur Kontrolle der Transferqualität gefärbt, bis die Proteinbanden sichtbar waren. Zum Entfärben wurde die Membran kurz mit destilliertem Wasser und danach für ca.5min mit TBS-Tween-20-Puffer (0,1%) gewaschen.

3.6.5. Blockierung

Um freie Bindungen auf der Membran zu blockieren, wurde diese für 2std mit 5%iger Magermilchlösung inkubiert. Danach wurde die Nitrocellulosemembran 4x für 10min in TBS-Tween-20-Puffer (0,1%) gewaschen.

1. Antikörper

Der Antikörper wurde 1:1000 verdünnt. Dazu wurden 2µl Antikörper mit 2ml TBS-Tween-20-Puffer (0,1%) und 20mg BSA vermengt. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte in einer speziellen Inkubationsbox. Diese wurde auf einem Schüttler fixiert und unter leichtem Schütteln bei 4°C über Nacht inkubiert.

↓61

Anschließend wurde die Membran 3x für 15min mit TBS-Tween-20-Puffer (0,1%) gewaschen.

2. Antikörper

Auch der zweite Antikörper wurde nach der oben beschriebenen Methode 1:1000 verdünnt. Die Inkubation erfolgte unter Schütteln in der Inkubationsbox für 1std bei RT. Nach Ablauf der Zeit wurde die Membran wiederum 3x für 15min mit TBS-Tween 20 Puffer (0,1%) gewaschen.

3.6.6. Röntgenfilmentwicklung

Zum enzymatischen Nachweis der erfolgten Antikörperreaktion wurde die ECL-Detektionslösung im Verhältnis 1:1 gemischt. 3ml ECL-Lösung I (Luminol, p-Coumarsäure, Tris-HCL pH 8,5) und 3ml ECL-Lösung II (Tris-HCL pH 8,5). Dazu wurde zunächst noch die ECL-Lösung II mit 1,8µl 30%iger Wasserstoffperoxidlösung versehen. Dieses ECL-Gemisch wurde dann für eine Minute im Dunkeln auf die Membran in einer Plastikinkubationsbox gegeben und für eine Minute geschwenkt. Dabei reagierte das Peroxidaseenzym mit dem Wasserstoffperoxid, wodurch es zu einer Änderung der Ringkonformation des Luminols und letztlich zur Lichtemission kam. Ein Hyperfilm-ECL-Röntgenfilm wurde auf die Membran gelegt und die Filmkassette verschlossen. Je nach nachzuweisendem Protein, Antikörper und Qualität des Western Blot wurde der Film 0,5–15min exponiert und dann in einer Filmentwicklungsmaschine entwickelt. Die entwickelten Filme wurden von einem Flachbrettscanner eingescannt und mit der TINA 2.09g-Software ausgewertet.

3.6.7. Entfernen gebundener Antikörper („Stripping“)

↓62

Um eine Membran nochmals zu verwenden, bestand die Möglichkeit, die gebundenen Antikörper abzuwaschen („zu strippen“) und mit neuem Antikörper zu hybridisieren. Dazu wurde die Membran zunächst 2x für 10min mit TBS-Tween-20-Puffer (0,1%) gewaschen und danach im Stripping-Puffer beiRT für 30min inkubiert. Anschließend wurde die Membran 3x für 10min in TBS-Tween-20-Puffer gewaschen und für 2std mit 5% Magermilchlösung bei RT blockiert. Nach dreimaligem Waschen für 10min in TBS-Tween 20 konnte nun die erneute Inkubation der Membran mit dem ersten Antikörper, wie unter Punkt 3.6.5. beschrieben, erfolgen.

3.7. Histologische Verfahren

3.7.1. DeOlmos Kupfersilberfärbung

In der DeOlmos Kupfersilberfärbung werden degenerierte Axone und Neurone dunkelbraun bis schwarz gefärbt und heben sich deutlich vom goldgelben Hintergrund ab122. Die Färbung beruht auf einer Reaktion des Axoplasmasvon degenerierten Neuronen mit dem Silbersalz, das durch die durchlässig gewordene Zellmembran der geschädigten Neurone in die Zellen eindringen kann. Die DeOlmos Kupfersilberfärbung sagt nichts über den Pathomechanismus aus, der zu der neuronalen Degeneration geführt hat, sie zeigt nur, dass Zellen zugrunde gegangen sind.

Für die Aufarbeitung der nachfixierten Gehirne mittels Rotationsvibratom, zum Bereitstellen der Schnitte für die DeOlmos Kupfersilberfärbung, wurden diese über Nacht bei 4°C in 1x PBS belassen und maximal 5 Tage bei 4°C in dieser Lösung, unter täglichem Lösungswechsel, gelagert. Anschließend wurden die Gehirne in 4% Agar eingebettet und am Rotationsvibratom koronar in 70μm dünne Scheiben geschnitten.

↓63

Zur folgenden Kupfersilberfärbung wurde jeder siebte Schnitt ausgewählt und nochmals in Fixierungslösung II für vier Tage nachfixiert. Danach wurden die Schnitte im Dunkeln 1std bei 40°C und anschließend 48 bis 72std bei RT in einer Kupfer-Silber-Lösung inkubiert. Nach der Reinigung mit reinem Aceton erfolgte die 35minütige Inkubation mit Silberdiaminlösung. Unter Agitation wurden die Schnitte exakt 1min in der Reduktionslösung belassen. Dann wurden sie einzeln mit 0,3%iger Kaliumferrizyanidlösung gebleicht. Zweimaliges Waschen mit Bidest-H2O war die Vorbereitung zur abschließenden Stabilisierung des Färbeergebnisses über eine Minute mit 0,1%iger Natriumthiosulfatlösung. Nach Dehydratation in einer aufsteigenden Alkoholreihe wurden die Präparate mit Hilfe von Permount auf Objektträger aufgebracht und mit Deckgläsern versehen.

3.7.2. Morphometrie

Das infantile Rattengehirn zeigt im Rahmen der physiologischen Entwicklung Apoptose, darum ist die genaue Quantifizierung des Ausmaßes der Apoptose der Hyperoxie exponierten und der in normaler Raumluft gehaltenen Tiere notwendig.

Für die Untersuchung wurde die stereologische Dissektionsmethode verwendet (unbiased stereological dissector method) 123. Darunter ist die Aufspaltung des großen, „unzählbaren“ Gewebeblockes in kleine, „zählbare“ Untereinheiten zu verstehen. Diese Fragmente werden nach zufälliger Auswahl mit Hilfe eines fixen Zählrahmens ausgezählt. Dieser Zählrahmen gibt die Ausdehnung in einer Ebene vor, und die dritte Dimension, die zur Beurteilung eines dreidimensionalen Objekts notwendig ist, wird durch die Dicke des Schnittes bestimmt. Das Ergebnis dieser ausgezählten Untereinheiten wird mit der Gesamtzahl aller Untereinheiten multipliziert. Als mögliche Fehlerquellen kommen in Betracht: extrem inhomogene Verteilung der zu zählenden Objekte und Schwellung oder Schrumpfung des Gesamtvolumens. In diesem Fall wurde ein 0,05 x 0,05mm großer Zählrahmen verwendet.

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Die Höhe des Schnittes betrug 0,07mm. Es wurden zufällig acht bis zehn Felder innerhalb einer Hirnregion ausgesucht und ausgezählt.

Die zugrunde liegenden Zahlen für normale Zelldichten wurden mit Hilfe von nach Nissen gefärbten Schnitten (Methylenblau, Azur B) ermittelt. Das Ausmaß der Apoptose wird als Verhältnis der Anzahl degenerierter Zellen zur Gesamtzahl dargestellt und durch einen Prozentwert ausgedrückt (Mittelwert +/- Standardfehler, SEM). Die Dichte an degenerierten Zellen wurde zum einen für die einzelnen Regionen ausgewiesen, und in einem zweiten Schritt wurden die einzelnen Zelldichtewerte zu einem Gesamtscore summiert. So konnten Tiere aus Kontroll- und Versuchsgruppe anhand eines einzelnen Wertes verglichen werden. Im Einzelnen wurden 12 Hirnregionenausgezählt:

3.7.3. Statistische Auswertung

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Die Auszählung der mit DeOlmos Kupfersilberfärbung gefärbten Präparate erfolgte blind und wurde durch erfahrene Untersucher kontrolliert. Das Endresultat wurde als numerische Neuronendichte angegeben: degenerierte Neurone pro Kubikmillimeter. Es wurden insgesamt 12 Hirnregionen ausgewertet. Die Ergebnisse jeder Region wurden gemittelt. Die Unterschiede zwischen Versuchsgruppen wurden mit Hilfe des Student’s t-Test auf ihre Signifikanz hin geprüft. Die Untersuchungen zur Zeitabhängigkeit der durch Hyperoxie bedingten Schäden wurden mit Hilfe der ermittelten Gesamtscores und der Varianzanalyse (ANOVA) überprüft.

3.7.4. 3.7.4 TUNEL-Färbung

Ein Kennzeichen der Apoptose ist die Aufspaltung der nukleären DNA durch Endonukleasen in Fragmente von ca. 180 Basenpaaren Länge. Die TUNEL-Färbung weist diese DNA-Fragmente nach124. Das Enzym Terminaldesoxynukleotidyltransferase reagiert nur mit 3’-OH-Enden von DNA und fügt an sie biotinylierte Polydesoxyuridylnukleotide an. Diese Biotinenden reagieren nun ihrerseits mit Avidin, das an eine Peroxidase gekoppelt ist. Diese Peroxidase katalysiert die Farbreaktion, die im histologischen Präparat sichtbar wird. Eine apoptotische Zelle ist mit der TUNEL-Methode für ca. 1–3std nachweisbar.

Nach definierten Zeiträumen in Hyperoxie wurden die sieben Tage alten Ratten, wie unter Punkt 3.4.2. beschrieben, getötet und perfundiert. Die Gehirne wurden am Vibratom in 70μm dünne Scheiben geschnitten. Die Färbung wurde mit Hilfe eines kommerziellen Kits (ApopTag® In Situ Apoptosis Detection Kit) durchgeführt, und die Gehirne wurden mit Methylgrün gegengefärbt. Das Resultat waren dunkelbraune Kerne von allen Zellen, die DNA-Fragmentierung zeigten. Das Zytoplasma intakter Zellen wurde mit Methylgrün angefärbt.

3.7.5. Immunhistochemischer Nachweis von Caspase-3

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Die Gehirne wurden in Paraffin eingelegt und koronar am Mikrotom in 5μm dicke Scheiben geschnitten. Danach wurden sie auf mit 3-Aminopropyltrietoxysilanbeschichtete Objektträger aufgebracht. Die Schnitte wurden anschließend in Zitratpuffer (pH = 6,0) bei 750 W in der Mikrowelle inkubiert125. Die endogene Peroxydaseaktivität wurde mit 0,6% (v/v) Hydrogenperoxid (15min) blockiert. Danach wurden die Schnitte zunächst 20min mit normalen Ziegenserum und anschließend über Nacht bei 4°C mit einem 1:100 verdünnten Caspase-3 Antikörper inkubiert. Die Negativkontrollen wurden mit Hilfe von Peptidimmunogen durchgeführt, einem Konkurrenten der Antikörperbindung. Die Schnitte wurden anschließend mit Ziegen-Antikaninchen-IgG versehen. Nach der Färbung mit einem ABC Kit konnten die positiven Zellen mit Hilfe von Diaminobenzidin (DAB) visualisiert und mit Mayers Hämalaun gegengefärbt werden.


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26.10.2005