4. Ergebnisse

4.1. Physiologische Parameter

↓66

Es gab keine Beeinträchtigungen oder Unterschiede in Körpergewicht und Atmung der Tiere in 80%igem Sauerstoff verglichen mit den Kontrolltieren. Bei allen Tieren wurden keine klinischen Beeinträchtigungen festgestellt, und es gab keine Mortalität.

4.2. Histologischer Nachweis der Apoptose

Um festzustellen, ob Sauerstoffkonzentrationen zu Schädigungen im sich entwickelnden Gehirn führen, wurden 6 Tage alte Ratten mit ihren Müttern einer 80%igen Sauerstoffkonzentration ausgesetzt, sofort getötet und transkardial perfundiert. Die histologische Auswertung mit Hilfe der DeOlmos Kupfersilberfärbung oder TUNEL-Färbung zeigt eine vermehrte Dichte der degenerierten Zellen in verschiedenen Hirnregionen im Vergleich zu den nicht exponierten Tieren.
Abbildung 6: Darstellung morphologischer Veränderungen bei Hyperoxie-induzierter Neurodegeneration.

A–D) Nach DeOlmos gefärbte histologische Schnitte vom Thalamus (A und B), Subiculum (C) und Corpus callosum (D), von Hyperoxie-exponierten Ratten (A, C und D) und Kontrolltieren (B). Degenerierte Zellen finden sich reichlich in den hyperoxischen Gehirnen (A, C und D) und nur vereinzelt in den Gehirnen der Ratten in normaler Umgebungsluft (B). E) Detailaufnahme eines mit TUNEL gefärbten mikroskopischen Schnitts des Kortex (RSC) eines 7 Tage alten Rattengehirns mit Darstellung apoptotischer Zellen. F) Eine schematische Darstellung der Verteilung des Hyperoxie-induzierten Zelltodes im 7 Tage altem Rattengehirn nach 12std Hyperoxie mit 80% O2.Vergrößerungen: A und B x25; C x40; D und E x120.

↓67

Um die Dauer der O2-Exposition zu bestimmen, die notwendig ist, um Apoptose im sich entwickelnden Gehirn auszulösen, wurden die 7 Tage alte Ratten für 2, 6, 12, 24, 48 oder 72std 80%igem Sauerstoff ausgesetzt. Die Analyse der Silberfärbungen der Rattengehirne ergab, dass es nach 6std Hyperoxieexposition zu einem leichten und nach 12std zu einem signifikanten Anstieg des apoptotischen Zelltodes kam. Ein maximales Vorkommen von apoptotischer Neurodegeneration konnte nach 24std Hyperoxie beobachtet werden. Nach längerer Expositionsdauer (48 und 72std) wurde keine weitere Steigerung mehr beobachtet (s. Abb.7).

Abbildung 7: Zeitverlauf des Hyperoxie-induzierten Zelltodes im Gehirn von 7 Tage alten Ratten. Die Dichte der degenerierten Zellen (nach DeOlmos gefärbt) wurde mit der stereologischen optischen Dissektionsmethode in 12 Hirnregionen bestimmt. Diese Zelldichtewerte wurden zu einem Gesamtwert für jedes Gehirn addiert (Score).

4.3. Der Einfluss von Hyperoxie auf die Expression der Wachstumsfaktoren

Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die in die Pathogenese der apoptotischenNeurodegeneration im sich entwickelnden Gehirn, ausgelöst durch Hyperoxie, involviert sind, wurde getestet, ob und wie Hyperoxie die Expression von BDNF (brain-derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), NT-3 (neurotrophin 3) und GDNF (glia-derived neurotrophic factor) imretrosplenialen Kortex, Striatum und Thalamus beeinflusst. Aus diesem Grund wurden 7 Tage alte Ratten 80% O2 für 2, 6, 12 oder 24std (n = 6 proGruppe) ausgesetzt und sofort nach dem Ende der Exposition getötet. Hyperoxie triggert eine verminderte Expression aller vier Wachstumsfaktoren in den untersuchten Hirnregionen Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialer Kortex (RSC) auf mRNA-Ebene, mit einem Maximum der Herabregulation zwischen 2–6std. (s. Abb.8a–8d).

↓68

Mittels Western-Blot-Verfahren konnte festgestellt werden, dass die Herabregulation von BDNF, NGF, NT-3 und GDNF auf mRNA-Ebene assoziiert ist mit einer Runterregulierung der aktivierten, phosphorylierten Isoformen der Serin-Threonin-Kinase Akt (p-Akt, Proteinkinase B) und ERK1/2 (p-ERK 1/2) (extracellular signal-regulated protein kinase), einem Mitglied der MAPK-Familie, Mediatoren der intrazellulären Signale, die der Aktivierung der Tyrosinrezeptorkinase (Trk) durch Wachstumsfaktoren folgen. Es zeigte sich, dass es nach 12std zu einem maximalen Abfall der Proteinexpression in den untersuchten Gehirnen der 7 Tage alten Ratten kam (s. Abb.9).

Abbildung 8a: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von BDNF

Abbildung 8b: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von GDNF

↓69

Abbildung 8c: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von NGF

Abbildung 8d: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von NT-3

Abbildung 8a-d: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von Neurotrophinen. A) Die Polyacrylamidgele zeigen eine Herabregulation der mRNA-Expressionen der Wachstumsfaktoren nach Hyperoxie im Gehirn von 7 Tage alten Ratten. Hier dargestellt ist jeweils der rechte Thalamus. B) Es wurden die mRNA-Expressionen der Wachstumsfaktoren a) BDNF (brain-derived neurotrophic factor), b) GDNF (glia-derived neurotrophic factor), c) NGF (nerve growth factor) und d) NT-3 (neurotrophin 3) im retrosplenialen Kortex (RSC), Thalamus (THA) und Striatum (STR) in den rechten Hirnhemisphären von Kontrolltieren (C) und von Ratten nach 2, 6, 12 und 24std Hyperoxie (80% O2) mit Hilfe der RT-PCR bestimmt. Das Dichteverhältnis dieser Wachstumsfaktoren wurde in Relation zum internen Standard β-Actin bestimmt (n = 6 pro Kontrolle und Zeiteinheit). Bei BDNF kam es nach 6std, bei NGF und GDNF nach 2std in Hyperoxie zu einem maximalen Abfall der mRNA-ExpressionenDer maximale Abfall der NT-3-mRNA-Expression lag zwischen 6 und 12std. Bei allen in dieser Arbeit untersuchten Wachstumsfaktoren kam es nach 24std O2-Exposition zu einem Anstieg der mRNA-Level auf die Ausgangswerte.

Abbildung 9: Die Western Blots zeigen eine Herabregulation von p-MAPK und p-AKT nach Hyperoxie im rechten Thalamus von 7 Tage alten Ratten. Das MAPK-, p-MAPK-, Akt- und p-Akt-Protein wurde im rechten Thalamus von Kontrolltieren (C) und den der Hyperoxie ausgesetzten Tieren untersucht (n = 6 pro Zeiteinheit). Die Proteinexpression wurde berechnet in bezug auf das jeweilige Protein in den Kontrolltieren. Die Ratten wurden 6, 12, 24 oder 48std einer Hyperoxie (80% O2) ausgesetzt. Nach 12std Hyperoxie zeigte sich eine maximale Runterregulierung der untersuchten Proteinexpression von p-Akt und p-MAPK, während es bei den unaktivierten, unphosphorylierten Isoformen von MAPK und Akt zu keinen Veränderungen der Proteinexpressionen kam.

4.4. Regulation der Fas- und Zytokinexpression und der Caspase-3-Aktivität unter Hyperoxie

4.4.1. Hochregulierung des Todesrezeptors Fas durch Hyperoxie

↓70

Um herauszufinden, ob es durch Hyperoxie zu einer Aktivierung des extrinsischen Weges der Apoptose über Fas kommt, wurde der Zusammenhang zwischen Hyperoxie und Fas-Expression im Gehirn 7 Tage alter Ratten mit Hilfe von RT-PCR und Western-Blot-Verfahren untersucht.

Dafür wurden 6 Tage alte Ratten für 6, 12, 24 und 48std (n = 6 pro Zeiteinheit) einer Hyperoxie (80% O2) ausgesetzt und nach dem Ende der Sauerstoffexposition sofort getötet. Im Vergleich dazu wurden Kontrolltiere (n = 4) in normaler Raumluft gelassen. Mit Hilfe der densitometrischen Analyse wurden die Polyacrylamidgele ausgewertet und das Dichteverhältnis (Fas in Bezug auf β-Actin) statistisch bestimmt. Sauerstoffexposition triggert eine vermehrte mRNA-Expression von Fas in Kortex, Thalamus und Striatum mit einem signifikanten Anstieg nach 6std und einem Maximum nach 12std Hyperoxie (s. Abb.10A/B).

Die Proteinexpression von Fas wurde mittels Western-Blot-Verfahren in Thalamus, Striatum und Kortex bestimmt. Die sechs Tage alten Ratten wurden nach 6, 12, 24 und 48std (n = 6 pro Zeiteinheit) Sauerstoffexposition getötet. Erhöhte Proteinlevel von Fas wurden im ipsilateralen Thalamus nach 6std Hyperoxie gefunden, mit dem größten Anstieg nach 12 und 24std O2-Exposition (s. Abb.10B). Ähnliche Ergebnisse konnten in Proteinanalysen mit Proben aus Striatum und Thalamus festgestellt werden.

↓71

Abbildung 10a-c: Das Polyacrylamidgel (A) der RT-PCR zeigt eine Hochregulierung von Fas auf mRNA-Ebene mit einem Maximum nach 12std in Hyperoxie (80% O2) im rechten Thalamus. Das Dichteverhältnis wurde in Relation zum internen Standard β-Actin ermittelt (C) und im Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialen Kortex (RSC) bei Kontrolltieren (C) und bei Ratten, die für 6, 12, 24 oder 48std (n = 6 pro Zeiteinheit) einer Hyperoxie ausgesetzt waren, bestimmt. Der Western Blot (B) zeigt, dass es auf Proteinebene zu einer Hochregulierung des Fas-Rezeptors mit einem Maximum bei 24std in Hyperoxie kam. Das Fas-Protein wurde im rechten Thalamus der Kontrolltiere und der Tiere in Hyperoxie (n = 6 pro Zeiteinheit) bestimmt. Dabei wurde die Proteinexpression nach Hyperoxie in Relation zu den Kontrolltieren gemessen.

4.4.2. Sauerstoffexposition triggert die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen

Um zu untersuchen, welchen Einfluss Hyperoxie auf die Expression von inflammatorischen Zytokinen im sich entwickelnden Gehirn hat, wurden 6 Tage alte Ratten 2, 6, 12, und 24std (n = 6 pro Zeiteinheit) 80%iger Sauerstoffkonzentration ausgesetzt. Mit Hilfe der RT-PCR wurde dann die mRNA-Expression von IL-1β und IL-18 im rechten Thalamus, Striatum und retrosplenialem Kortex bestimmt.

Sauerstoff triggert einen Anstieg der mRNA von IL-1β und IL-18 in den untersuchten Geweben des sich entwickelnden Rattengehirns. Dieser Effekt wurde nach 2std Hyperoxie offensichtlich. Nach 6std wurde ein Maximum der mRNA-Level erreicht, und nach 12–24std kam es zu einem Abfall auf die Basalwerte (s. Abb.11 und 12).

↓72

Abbildung 11: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-1β

Abbildung 12: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-18.

Abbildung 11-12: A) Die Polyacrylamidgele zeigen die Hochregulation der mRNA der Zytokine IL-1β und IL-18 im rechten Thalamus 7 Tage alter Ratten nach Hyperoxie. B) Es wurde die m-RNA Expression dieser inflammatorischen Interleukine in Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialem Kortex (RSC) der rechten Hirnhemisphären von Kontrolltieren (C) und 7 Tage alten Ratten nach 2, 6, 12 und 24std Hyperoxie (80% O2) mit Hilfe der RT-PCR bestimmt. Das Dichteverhältnis wurde in Relation zum internen Standard β-Actin bestimmt. Zu einem maximalen Anstieg der mRNA-Expression von IL-1β und IL-18 kam es nach 6std Sauerstoffexposition.

4.4.3. Sauerstoffexposition triggert die Transkription des IL-18-Rezeptors (IL-18R)

Um die Transkription des IL-18-Rezeptors unter den pathologischen Konditionen einer Hyperoxie (80%ige Sauerstoffkonzentration) zu untersuchen, wurden die mRNA-Level in Thalamus, Striatum und retrosplenialem Kortex von Ratten nach Sauerstoffexposition und Kontrollratten analysiert. Die Zeiteinheiten der Hyperoxie (n = 6 pro Zeiteinheit und Kontrolle) waren wie bei IL-18 2, 6, 12 und 24std.

↓73

Es gab einen signifikanten Anstieg der IL-18R-mRNA in allen drei untersuchten Hirnregionen nach 2std O2-Exposition. Das Maximum der Hochregulation lag bei 6std und nach 24std kam es zu einem Abfall der mRNA-Expression auf die Ausgangswerte.

Abbildung 13: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression des IL-18-Rezeptors (IL-18R). A) Das Polyacrylamidgel zeigt eine Hochregulation auf mRNA-Ebene des Interleukin-18- Rezeptors im rechten Thalamus 7 Tage alter Ratten. B) Es wurde die mRNA-Expression des IL-18-Rezeptors (IL-18R) in Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialem Kortex (RSC) der rechten Hirnhemisphären von Kontrolltieren (C) und von 7 Tage alten Ratten nach 2, 6, 12 und 24std Hyperoxie (80% O2) mit Hilfe der RT-PCR analysiert. Das Dichteverhältnis wurde in Relation zum internen Standard ß-Actin gesetzt (n = 6 pro Kontrolle und Zeiteinheit).Sauerstoffexposition triggert eine verstärkte Transkription des IL-18-Rezeptors mit einem Maximum nach 6std und einem Abfall auf die Ausgangswerte nach 24std Hyperoxie.

4.4.4. Transkription des antiinflammatorischen IL-10 nach Hyperoxie

Die Untersuchung der mRNA-Expression von IL-10, einem Interleukin mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zeigt einen klaren Anstieg nach 2std mit einem Maximum nach 6std Hyperoxie. Wie bei den zuvor beschriebenen inflammatorischen Interleukinen IL-1β und IL-18 (s. Kapitel 4.4.2.) kam es auch hier nach 24std Sauerstoffexposition zu einem Erreichen der Ausgangswerte.

↓74

Abbildung 14: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-10. A) Das Polyacrylamidgel zeigt die gesteigerte mRNA-Expression von IL-10 im rechten Thalamus 7 Tage alter Ratten nach Hyperoxie. B) Untersucht wurde die mRNA-Expression bei Kontrollratten (C) und bei Ratten nach 2, 6, 12 und 24std (n = 6 pro Zeiteinheit und Kontrolle) Hyperoxie (80%ige Sauerstoffkonzentration).Eine vermehrte IL-10-Transkription konnte in allen drei untersuchten Hirnregionen Thalamus (THA), Striatum (STR) und Kortex (RSC) der rechten Hirnhemisphären festgestellt werden, mit einem signifikanten Anstieg nach 2std und einer maximalen Steigerung nach 6std O2-Exposition.

4.4.5. Gesteigerte Aktivität von Caspase-3 nach Hyperoxie

Die Immunoreaktivität wurde mit einem spezifischen Antikörper gegen die aktive P20-Untereinheit von Caspase-3 in in Paraffin gelagerten Hirnschnitten von 7 Tage alten Ratten nach 6 (n = 4), 12 (n = 4) und 24 (n = 4) Stunden Hyperoxie analysiert. In den gefärbten Präparaten konnte immunhistochemisch eine starke Steigerung der Caspase-3-Aktivität festgestellt werden. 12std Sauerstoffexposition war die optimale Zeit zur Visualisierung der weit verbreiteten Verteilung der Caspase-3-Aktivität in vielen Hirnregionen. Die Caspase-3-Immunbindung stieg vor allem in den kortikalen Neuronen und im Thalamus. Ebenso gab es Caspase-3-positive Zellen im Striatum und in der periventrikulären weißen Substanz.

Abbildung 15: Aktivierte Caspase-3 nach 12std Sauerstoffexposition (80%). A) In der immunhistochemischen Färbung fanden sich viele Caspase-3-positive Zellen. Hier wurden drei Zellen beispielhaft mit Pfeilen gekennzeichnet. B) Der vergrößerter Ausschnitt zeigt immunopositive Zellen für aktivierte Caspase 3 mit apoptotischen Veränderungen der Nuclei. Die Abbildungen zeigen eine gesteigerte Immunbindung von Caspase-3 im laterodorsalen Thalamus, in Abb. A mit 120facher, in Abb. B mit 200facher Vergrößerung.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
26.10.2005