1. Einleitung

• 1.1. Hyperoxie

  • 1.1.1. Physiologische Veränderungen während der Geburt

  • 1.1.2. Hyperoxie und ihre Auswirkungen

  • 1.1.3. Direkte Toxizität von Sauerstoff

  • 1.1.4. Maladaptive physiologische Antwort auf Sauerstoff

  • 1.1.5. Auswirkungen von Hyperoxie auf das sich entwickelnde Gehirn

• 1.2. Zytokine

  • 1.2.1. Zytokine und Neurodegeneration im neonatalen Gehirn

  • 1.2.2. Hyperoxie und Zytokinproduktion

  • 1.2.3. Wirkungsmechanismen von Zytokinen

    • 1.2.3.1. IL-1β und IL-18

    • 1.2.3.2. IL-10

• 1.3. Wachstumsfaktoren

  • 1.3.1. Die Bedeutung der Neurotrophine im sich entwickelnden Gehirn

  • 1.3.2. Wirkungswege der Neurotrophine

  • 1.3.3. Neurotrophine und Hyperoxie

• 1.4. Die Periode des rapiden Hirnwachstums („Brain growth spurt period“)

• 1.5. Apoptose

  • 1.5.1. Morphologische Kennzeichen der Apoptose

  • 1.5.2. Die genetische Regulation der Apoptose

• 1.6. Formulierung der zentralen Fragestellung

2. Material

• 2.1. Geräte und Hilfsmittel

• 2.2. Chemikalien

• 2.3. Häufig verwendete Lösungen

• 2.4. Kits

• 2.5. Enzyme

• 2.6. Antikörper

• 2.7. Oligonukleotide

  • 2.7.1. Oligonukleotide für die reverse Transkription

  • 2.7.2. Oligonukleotide für die semiquantitative PCR

• 2.8. Molekulargewichtsmarker

• 2.9. Tiere

• 2.10. Software und Datenbanken

3. Methoden

• 3.1. Flussdiagramm der verwendeten Methode RT-PCR

• 3.2. Flussdiagramm der verwendeten Methode Western Blot

• 3.3. Tierversuche: Tiere, Versuchsaufbau, Tierschutz

• 3.4. Präparation von Hirngewebe

  • 3.4.1. Präparation für molekularbiologische Untersuchungen

  • 3.4.2. Perfusion und Präparation für histologische und immunhistochemische Untersuchungen

• 3.5. RT-PCR

  • 3.5.1. Isolierung und Reinigung von RNA aus Hirngewebe

  • 3.5.2. RNA-Konzentrationsbestimmung

  • 3.5.3. DNase-Behandlung der präparierten RNA-Lösung mit anschließender Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Behandlung

  • 3.5.4. RNA-Kontrollelektrophorese

  • 3.5.5. Semiquantitative RT-PCR: Theoretische Aspekte

    • 3.5.5.1. Reverse Transkription von mRNA in cDNA

    • 3.5.5.2. Kontroll-PCR und Elektrophorese der cDNA

    • 3.5.5.3. Amplifizierung der cDNA mittels Polymerasekettenreaktion

    • 3.5.5.4. Gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente

    • 3.5.5.5. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen

    • 3.5.5.6. Densitometrische Auswertung der Polyacrylamidgele

• 3.6. Western Blot

  • 3.6.1. Proteinextraktion

  • 3.6.2. Bestimmung der Proteinkonzentration

  • 3.6.3. Gelelektrophorese

  • 3.6.4. Transfer auf eine Nitrocellulosemembran (Tankblot-Verfahren)

  • 3.6.5. Blockierung

  • 3.6.6. Röntgenfilmentwicklung

  • 3.6.7. Entfernen gebundener Antikörper („Stripping“)

• 3.7. Histologische Verfahren

  • 3.7.1. DeOlmos Kupfersilberfärbung

  • 3.7.2. Morphometrie

  • 3.7.3. Statistische Auswertung

  • 3.7.4. 3.7.4 TUNEL-Färbung

  • 3.7.5. Immunhistochemischer Nachweis von Caspase-3

4. Ergebnisse

• 4.1. Physiologische Parameter

• 4.2. Histologischer Nachweis der Apoptose

• 4.3. Der Einfluss von Hyperoxie auf die Expression der Wachstumsfaktoren

• 4.4. Regulation der Fas- und Zytokinexpression und der Caspase-3-Aktivität unter Hyperoxie

  • 4.4.1. Hochregulierung des Todesrezeptors Fas durch Hyperoxie

  • 4.4.2. Sauerstoffexposition triggert die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen

  • 4.4.3. Sauerstoffexposition triggert die Transkription des IL-18-Rezeptors (IL-18R)

  • 4.4.4. Transkription des antiinflammatorischen IL-10 nach Hyperoxie

  • 4.4.5. Gesteigerte Aktivität von Caspase-3 nach Hyperoxie

5. Diskussion

• 5.1. Allgemeine Betrachtung

• 5.2. Hyperoxie führt zu Apoptose

  • 5.2.1. Apoptotische Neurodegeneration als Folge von Hyperoxie im sich entwickelnden Rattengehirn

  • 5.2.2. Einfluss von O₂ auf Fas und Caspase-3

  • 5.2.3. Gesteigerte Vulnerabilität des sich entwickelnden Gehirns für Hyperoxie

• 5.3. Hyperoxie führt zur Herabregulierung der Wachstumsfaktoren

• 5.4. Hyperoxie führt zur gesteigerten Expression von Caspase-1-abhängigen inflammatorischen Zytokinen

• 5.5. Hochregulierung von IL-10 als möglicher endogener Kompensationsmechanismus

6. Zusammenfassung

ERKLÄRUNG AN EIDES STATT

Danksagungen

7 Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Tabelle 1: PCR-Bedingungen für die untersuchten Gene

Tabelle 2: Allgemeiner Ablauf des PCR-Cycler-Programmes

Abbildung 1: Signaltransduktion von IL-18 und IL-1β

Abbildung 2: Signalwege des neuronalen Überlebens, induziert durch die Bindung von NGF an den TrkA-Rezeptor

Abbildung 3: Die Periode des rapiden Hirnwachstums („brain growth spurt period“)

Abbildung 4: Die apoptotische Kaskade

Abbildung 5: Transportinkubator mit O₂-Messgerät zur Überwachung der Sauerstoffkonzentration

Abbildung 6: Darstellung morphologischer Veränderungen bei Hyperoxie-induzierter Neurodegeneration.

Abbildung 7: Zeitverlauf des Hyperoxie-induzierten Zelltodes im Gehirn von 7 Tage alten Ratten. Die Dichte der degenerierten Zellen (nach DeOlmos gefärbt) wurde mit der stereologischen optischen Dissektionsmethode in 12 Hirnregionen bestimmt. Diese Zelldichtewerte wurden zu einem Gesamtwert für jedes Gehirn addiert (Score).

Abbildung 8a: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von BDNF

Abbildung 8b: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von GDNF

Abbildung 8c: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von NGF

Abbildung 8d: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von NT-3

Abbildung 9: Die Western Blots zeigen eine Herabregulation von p-MAPK und p-AKT nach Hyperoxie im rechten Thalamus von 7 Tage alten Ratten. Das MAPK-, p-MAPK-, Akt- und p-Akt-Protein wurde im rechten Thalamus von Kontrolltieren (C) und den der Hyperoxie ausgesetzten Tieren untersucht (n = 6 pro Zeiteinheit). Die Proteinexpression wurde berechnet in bezug auf das jeweilige Protein in den Kontrolltieren. Die Ratten wurden 6, 12, 24 oder 48std einer Hyperoxie (80% O₂) ausgesetzt. Nach 12std Hyperoxie zeigte sich eine maximale Runterregulierung der untersuchten Proteinexpression von p-Akt und p-MAPK, während es bei den unaktivierten, unphosphorylierten Isoformen von MAPK und Akt zu keinen Veränderungen der Proteinexpressionen kam.

Abbildung 10a-c: Das Polyacrylamidgel (A) der RT-PCR zeigt eine Hochregulierung von Fas auf mRNA-Ebene mit einem Maximum nach 12std in Hyperoxie (80% O₂) im rechten Thalamus. Das Dichteverhältnis wurde in Relation zum internen Standard β-Actin ermittelt (C) und im Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialen Kortex (RSC) bei Kontrolltieren (C) und bei Ratten, die für 6, 12, 24 oder 48std (n = 6 pro Zeiteinheit) einer Hyperoxie ausgesetzt waren, bestimmt. Der Western Blot (B) zeigt, dass es auf Proteinebene zu einer Hochregulierung des Fas-Rezeptors mit einem Maximum bei 24std in Hyperoxie kam. Das Fas-Protein wurde im rechten Thalamus der Kontrolltiere und der Tiere in Hyperoxie (n = 6 pro Zeiteinheit) bestimmt. Dabei wurde die Proteinexpression nach Hyperoxie in Relation zu den Kontrolltieren gemessen.

Abbildung 11: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-1β

Abbildung 12: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-18.

Abbildung 13: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression des IL-18-Rezeptors (IL-18R). A) Das Polyacrylamidgel zeigt eine Hochregulation auf mRNA-Ebene des Interleukin-18- Rezeptors im rechten Thalamus 7 Tage alter Ratten. B) Es wurde die mRNA-Expression des IL-18-Rezeptors (IL-18R) in Thalamus (THA), Striatum (STR) und retrosplenialem Kortex (RSC) der rechten Hirnhemisphären von Kontrolltieren (C) und von 7 Tage alten Ratten nach 2, 6, 12 und 24std Hyperoxie (80% O₂) mit Hilfe der RT-PCR analysiert. Das Dichteverhältnis wurde in Relation zum internen Standard ß-Actin gesetzt (n = 6 pro Kontrolle und Zeiteinheit).Sauerstoffexposition triggert eine verstärkte Transkription des IL-18-Rezeptors mit einem Maximum nach 6std und einem Abfall auf die Ausgangswerte nach 24std Hyperoxie.

Abbildung 14: Einfluss von Hyperoxie auf die Expression von IL-10. A) Das Polyacrylamidgel zeigt die gesteigerte mRNA-Expression von IL-10 im rechten Thalamus 7 Tage alter Ratten nach Hyperoxie. B) Untersucht wurde die mRNA-Expression bei Kontrollratten (C) und bei Ratten nach 2, 6, 12 und 24std (n = 6 pro Zeiteinheit und Kontrolle) Hyperoxie (80%ige Sauerstoffkonzentration).Eine vermehrte IL-10-Transkription konnte in allen drei untersuchten Hirnregionen Thalamus (THA), Striatum (STR) und Kortex (RSC) der rechten Hirnhemisphären festgestellt werden, mit einem signifikanten Anstieg nach 2std und einer maximalen Steigerung nach 6std O₂-Exposition.

Abbildung 15: Aktivierte Caspase-3 nach 12std Sauerstoffexposition (80%). A) In der immunhistochemischen Färbung fanden sich viele Caspase-3-positive Zellen. Hier wurden drei Zellen beispielhaft mit Pfeilen gekennzeichnet. B) Der vergrößerter Ausschnitt zeigt immunopositive Zellen für aktivierte Caspase 3 mit apoptotischen Veränderungen der Nuclei. Die Abbildungen zeigen eine gesteigerte Immunbindung von Caspase-3 im laterodorsalen Thalamus, in Abb. A mit 120facher, in Abb. B mit 200facher Vergrößerung.