Charakterisierung funktioneller und struktureller Voraussetzungen der Hepatitis-B-Virus-Replikation

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

( Dr. rer. nat.)

im Fach Virologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biochem. Beate Malkowski


geboren am 9. Dezember 1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Detlev Krüger
2. PD Dr. Helmut Hengel

Eingereicht: 25.06.2003

Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2004

Widmung:

Meinen Eltern

Zusammenfassung

Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Sich überlappende synthetische Peptide aus dem Bereich der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und dem TLM, sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region interagieren mit dem Nukleokapsid, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf.

Rekombinante Proteine ähnlich den synthetischen Peptiden aber mit der vollständigen PreS2-Region, sind nach Internalisierung im Zytosol nachweisbar. Die Sekretion viraler Partikel wurde partiell inhibiert.

Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Durch simultane Inhibierung der Signalkaskade so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen.

Schlagworte: HBV, Interaktion, Nukleokapsid, Aktivator, Signalkaskade, Virussekretion

Abstract

Assembly of HBV particles and subsequent secretion of mature virus requires the interaction of the nucleocapsid with defined domains of the surface proteins. Overlapping synthetic peptides covering the C-terminal part of the PreS1 domain and the cell permeable domain of PreS2 (TLM) were shown to localize most of all in the nucleus. Based on these peptides aa 101-115 of PreS1 were found to be essential for the interaction with the nucleocapsid, while the PreS2 domain does not interact with the nucleus. Presence of the peptides that compete the nucleocapsid surface protein interaction a block of HBV and antigen secretion was achieved. HBcAg as natural interaction partner of the surface proteins then arises increased in the nucleus.

Recombinant proteins similar to the synthetic peptides but with the whole PreS2 domain localize in the cytoplasm and block HBV and antigen secretion.

The genome of HBV encodes two transcriptional activators: the HBx protein and the PreS2 activator LHBs. Both trigger activation of c-Raf-1/MEK kinase cascade. To evaluate the importance of both activators for viral replication selective inhibitions of signal transduction cascades were performed and do not result in a decrease of viral replication. Simultaneous inhibition of both activators abolished viral secretion. It is due to a reduced de novo synthesis and not to an accumulation of viral proteins in cells. The relevance of activator function was tested by mutated HBV genome defective for HBx and / or PreS2 activator function. After transfection single mutants show no significant reduced HBV expression whereas at the double mutated HBV genome a strong reduced virus expression could be observed. The HBx protein and the PreS2 activator LHBs are important for viral replication but they can replace each other.

Keywords: HBV, interaction, nucleocapsid, activator, kinase cascade, viral secretion

Inhaltsverzeichnis

• I Einführung
  • 1. Das Hepatitis-B-Virus
  • 2. Verlauf einer HBV-Infektion
  • 3. Aufbau des Virus und der sekretierten Antigene
  • 4. Das HBV-Genom
  • 5. HBV-Replikation
  • 6. HBV-Transkription
  • 7. Die viralen Proteine
    • 7.1. Die HBV-Polymerase
    • 7.2. Das HBSP
    • 7.3. Das HBx-Protein
    • 7.4. Das Nukleokapsidprotein und HBeAg
    • 7.5. Die Oberflächenproteine
      • 7.5.1. Das kleine Oberflächenprotein SHBs
      • 7.5.2. Das mittlere Oberflächenprotein MHBs
      • 7.5.3. Das große Oberflächenprotein LHBs
      • 7.5.4. Das LHBs als transkriptioneller Aktivator
      • 7.5.5. Die Rolle der Oberflächenproteine bei der Virusmorphogenese
  • 8. Zellpermeable Peptide und Proteine
    • 8.1. Das Translokationsmotiv
  • 9. Ansätze und Ziele dieser Arbeit
• II Ergebnisse
  • 1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA
    • 1.1. HBsAg-spezifische Primer und Sonde
      • 1.1.1. Verschiedene DNA-Isolierungsmethoden
    • 1.2. HBx-spezifische Primer und Sonde
  • 2. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation
    • 2.1. Synthetische Peptide
      • 2.1.1. Die Struktur der synthetischen Peptide
      • 2.1.2. Peptidmarkierung und -isolierung
      • 2.1.3. Internalisierung der synthetischen Peptide
    • 2.2. Einfluss synthetisch hergestellter TLM-PreS1(n) Peptide
      • 2.2.1. Sekretion von Virus-Partikeln
      • 2.2.2. Sekretion von viralen Antigenen
    • 2.3. Herstellung rekombinanter PreS1(n)PreS2 Proteine
      • 2.3.1. Konstruktion prokaryotischer Expressionsplasmide
      • 2.3.2. Isolierung prokaryotisch produzierter Proteine
      • 2.3.3. Konstruktion eukaryotischer Expressionsplasmide
        • 2.3.3.1. Stabil transfizierte HepG2-Zelllinien
      • 2.3.4. Antikörpergenerierung und -reinigung
    • 2.4. Charakterisierung rekombinanter PreS1(n)PreS2-Proteine
      • 2.4.1. Zellpermeabilität der rekombinanten Proteine und Interaktion von HBcAg und PreS1(n)PreS2-Proteinen
      • 2.4.2. Sekretion von viralen Partikeln
      • 2.4.3. Sekretion von viralen Antigenen
  • 3. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation
    • 3.1. Einfluss der HBV-Aktivatoren auf die HBV-Expression
    • 3.2. Einfluss der c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression
    • 3.3. Einfluss der Funktionalität der HBV-Aktivatoren auf die Virusproduktion
• III Diskussion
  • 1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA
  • 2. Antikörpergenerierung und -reinigung
  • 3. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation
    • 3.1. Einfluss von synthetischen Peptiden auf HBV-produzierende Zellen
    • 3.2. Einfluss von rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen auf HBV-produzierende Zellen
  • 4. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation
• IV Zusammenfassung
• V Material und Methoden
  • 1. Puffer und Lösungen
  • 2. Chemikalien und Verbrauchsmittel
  • 3. Enzyme
  • 4. Antikörper
    • 4.1. Primäre Antikörper
    • 4.2. Sekundäre Antikörper
  • 5. Materialien für die Zellkultur
  • 6. Längenstandards
  • 7. Verwendete Kits
  • 8. Plasmide
    • 8.1. HBV-Plasmide
    • 8.2. kommerziell erhältliche Plasmide
  • 9. Synthetische Oligonukleotide
    • 9.1. PCR-Primer:
    • 9.2. Primer für die Sequenzanalyse:
    • 9.3. Primer und Sonden für TaqMan-PCR
  • 10. Synthetische Peptide
  • 11. Geräte
    • 11.1. Elektrophorese- und Blotsysteme
    • 11.2. Zentrifugen / Rotoren
    • 11.3. Chromatographiegeräte / Säulen
    • 11.4. Mikroskope
    • 11.5. Sonstige Geräte
  • 12. Zelllinien und Bakterienstämme
    • 12.1. Eukaryontische Zelllinien
    • 12.2. Bakterienstämme
  • 13. Molekularbiologische Methoden
    • 13.1. Agarose-Gelelektrophorese
    • 13.2. Restriktionsverdau von DNA
    • 13.3. DNA-Fragmentisolierung aus präparativen Agarosegelen
    • 13.4. Dephosphorylierung von DNA
    • 13.5. Reinigung von DNA
    • 13.6. Entfernen von Nukleotidmonomeren über Gelfiltrationschromatographie
    • 13.7. Fällung von Nukleinsäuren
    • 13.8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
    • 13.9. DNA-Ligation
    • 13.10. Sequenzierung von DNA
    • 13.11. Polymerase Kettenreaktion (PCR)
    • 13.12. PCR / TaqMan-PCR
    • 13.13. Herstellung kompetenter E. coli
    • 13.14. Transformation von kompetenten E. coli
    • 13.15. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli
    • 13.16. Isolierung viraler DNA
      • 13.16.1. kommerziell angebotene Kits
      • 13.16.2. nach Boom et al. (1990)
      • 13.16.3. nach Kaneko et al. (1989, 1990)
  • 14. Zellbiologische Methoden
    • 14.1. Kultivierung und Passagieren von eukaryotischen Zellen
    • 14.2. Einfrieren und Auftauen von immortalisierten Zellen
    • 14.3. Transfektion von Säugerzellen
      • 14.3.1. Calciumphosphat-Methode
      • 14.3.2. Lipofektion
    • 14.4. Herstellung einer stabil transfizierten Zelllinie
    • 14.5. Inkubation eukaryotischer Zellen mit synthetischen Peptiden / rekombinanten Proteinen
    • 14.6. Zelllysatpräparation aus eukaryotischen Zellen
      • 14.6.1. mit Triton X-100 haltigem Puffer
      • 14.6.2. mit Dignam A
    • 14.7. Immunopräzipitation
    • 14.8. Kultivierung von E. coli
    • 14.9. Lyse von E. coli durch Ultraschall
  • 15. Proteinchemische Methoden
    • 15.1. Induktionskultur von E. coli
    • 15.2. Proteinkonzentrationsbestimmung
      • 15.2.1. nach Bradford
      • 15.2.2. durch Absorptionsmessung bei 280nm
    • 15.3. Säulenchromatographische Methoden
      • 15.3.1. Affinitätschromatographie
      • 15.3.2. Gelfiltrationschromatographie
      • 15.3.3. Reversed-Phase-Chromatographie
    • 15.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 15.5. Färben von Proteingelen
      • 15.5.1. Coomassie-Färbung
      • 15.5.2. Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick
    • 15.6. "Western Blotting", Immunoblot
    • 15.7. Generierung von Antiserum
    • 15.8. Aufreinigung des PreS2-Antiserums
    • 15.9. Fluoreszenzmarkierung synthetischer Peptide
      • 15.9.1. Fluorescein-Markierung
      • 15.9.2. Cy3™-Markierung
  • 16. Virologische Methoden
    • 16.1. ELISA
    • 16.2. Sedimentation von Virus-Partikeln durch Sucrose-Kissen
  • 17. Indirekte Immunfluoreszenz von eukaryotischen Zellen
• Literatur
• Anhang
• Abkürzungsverzeichnis
• Eigene Veröffentlichung
• Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 2 : Darstellung des Vergleichs verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen
• Tabelle 3 : Darstellung des Vergleich verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überstand (Abb. 15)

Bilder

• Abb. 1: Schema einer Hepatitis-B-Infektion mit Darstellung der Antigene und Antikörper, die im Rahmen einer akuten Hepatitis B im Serum nachgewiesen werden können. Quelle: Thomas (Hrsg.): Labor und Diagnose, Die Med. Verlagsgesellschaft, Marburg 1992
• Abb. 2: Schematische Darstellung der drei verschiedenen Partikel, die im Blut von HBV-infizierten Personen zu finden sind. LHBs, MHBs, SHBs: Large (großes), Middle (mittleres), Small (kleines) Hepatitis-B surface-Protein; HBc: Hepatitis-B core-Protein; hsc70: Heat shock cognate 70; Pk: Proteinkinase; Pri: Primer-Protein; RT: reverse Transkriptase; PreS1, PreS2: PreS1-, PreS2-Domäne; S: S-Domäne (Hüllproteine) (nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert)
• Abb. 3: Genomstruktur des Hepatitis-B-Virus mit Darstellung der vier konservierten ORFs des HBV-Genoms am Beispiel des Genotyps A (HBsAg Subtyp adw2).  Pol: DNA-Polymerase; Pr: Primer-Protein; E1, E2: Enhancer 1 und 2; GRE: glucocorticoid responsive elements; PREα, PREβ: posttranscriptional regulatory elements; DR1, DR2: direct repeat 1 und 2; (+):Plusstrang-DNA; (-): Minusstrang-DNA; ε: Epsilon-RNA Verpackungssignal (nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert)
• Abb. 4: Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus (aus Fabrizi et al., 2002)
• Abb. 6: Die MAPK- (Mitogen-activated protein kinase) und die JAK/STAT- (Janus kinases/signal transducer and activators of transcription) Signalkaskaden werden durch HBx aktiviert. (aus Arbuthnot et al., 2000)
• Abb. 7: hypothetische Beeinflussung des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels und der HBV-Replikation durch HBx.  Der Haupteffekt auf die HBV-Replikation geschieht eher auf der Ebene der HBV-DNA als auf RNA-Ebene (Bouchard et al., 2001) (dicke Pfeile). CAM: Calmodulin; CAMK: Ca²⁺-Calmodulin-abhängige Kinase; CN: Calcineurin; Cyt c: Cytochrom c; DAG: Diacylglycerol; Ins(1,4,5)P3: Inositol-1,4,5-trisphosphat; NOS: Stickstoffmonoxid-Synthase; PKA: (cAMP-abhängige) Proteinkinase A; PKC: (Ca²⁺-abhängige) Proteinkinase C; PLCγ: Phospholipase Cγ; PTP: permeable Übergangspore (nach Bouchard et al., 2002)
• Abb. 12: Standardreihe von zwei verschiedenen pSM2-Präparationen und sechs verschiedenen Verdünnungsreihen Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg
• Abb. 14: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen 1. Die DNA-Isolierung erfolgte mit Hilfe von Silica coarse nach  PEG8000-Fällung (Boom et al., 1990). 2. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-  konzentrator aufkonzentriert und die DNA nicht isoliert. 3. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-   konzentrator aufkonzentriert und die DNA mit dem QIAamp   Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert. 4. Der Zellkultur-Überstand wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit   (QIAGEN) isoliert. 5. DNA aus Zellkultur-Überstand Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg
• Abb. 15: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen Die konzentrierten (konz.) Proben wurden alle aus dem gleichen Zellkultur-Überstand entnommen. Der Zellkultur-Überstand wurde mit PEG8000 gefällt, die Viren durch Zentrifugation über ein 20% Sucrose-Kissen pelletiert. Die nicht aufkonzentrierten Proben (unkonz.) stammen aus einer anderen Charge. Aus den Viren des konzentrierten und nicht konzentrierten Zellkultur-Überstandes wurde durch High pure viral nucleic acid kit (Roche), QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) und Lyse mit NaOH die virale DNA isoliert. Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg
• Abb. 16: 1:10 Verdünnungen der viralen DNA im Gegensatz zu unverdünnter DNA Die 1:10 Verdünnungen sind auf die 10fache Menge umgerechnet. Die Zellkultur-Überstände sind mit einem Zentrifugalkonzentrator aufkonzentriert, die DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert. Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg
• Abb. 18: Struktur der synthetischen Peptide
• Abb. 20: Chromatogramm des Fluorescein-Markierungsansatzes für APO145 mittels Superdex Peptide 200-Säule Die Auftrennung erfolgte mit PBS bei einer Flussrate von 0,5ml/min. Die Fraktionen A12 und A13 enthalten das markierte Peptid. Die blaue Linie markiert die Absorption bei 215nm (Peptidbindung), die rote Linie die Absorption bei 490nm (Fluorescein). Die violette Linie gibt die Absorption bei 280nm wider. Die braune Linie stellt die Leitfähigkeit dar.
• Abb. 23: Abhängigkeit der Virus-Sekretion transient transfizierter HuH7-Zellen von der Konzentration der synthetisch hergestellten TLM-PreS1(n)-Peptide HuH7-Zellen wurden mittels DOTAP mit pSM2 (Sells et al., 1987) transfiziert. Die DNA der sekretierten Viren wurde per TaqMan-PCR quantifiziert. Als Positiv-Kontrollen dienten PS 734/RP, PS 735/RP und PreS1S2, als Negativ-Kontrolle dienten transient transfizierte HuH7 ohne Peptidinkubation. Primer: HBxfTM1, HBxrTM1; Sonde: HBxSondeTM1
• Abb. 26: Chromatogramm der Reinigung von E.coli-Lysaten (PreS1 110-119 PreS2) mittels Ni-NTA-Agarose-Säule  Die mit Pfeilen gekennzeichneten Fraktionen wurden zur Dialyse eingesetzt.  Die blaue Linie gibt die Absorption bei 280nm wieder. Die violett-gestrichelte Linie zeigt die Absorption bei 260nm, die nicht gestrichelte violette Linie die Absorption bei 215nm. Die gestrichelte grüne Linie stellt die Konzentration des Harnstoffes dar und die braune Linie die Leitfähigkeit.
• Abb. 36: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.
• Abb. 37: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.
• Abb. 38: Quantifizierung von HBsAg und HBcAg mittels ELISA im Zellkultur-Überstand von transient transfizierten HepG2-Zellen mit pSPT1,2HBV zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.
• Abb. 41: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.