II Ergebnisse

1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA

1.1. HBsAg-spezifische Primer und Sonde

↓32

Die Primer TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg, sowie die Sonde (Sonde HBsAg), sind ebenso wie die PCR-Bedingungen der Arbeit von Pas et al. (2000) entnommen. Sie befinden sich im PreS-Gen und es wird ein Bereich von 89 Basenpaaren amplifiziert. Durch Sequenzvergleiche wurde festgestellt, dass die Primer und die Sonde in den HBV-Subtypen adr und ayw binden und damit für die in der Arbeit verwendeten Konstrukte pSM2 und pSPT1.2HBV geeignet sind.

Die optimalen Konzentrationen der Primer wurden austitriert. Hierbei wurde auf einen möglichst hohen ΔRn-Wert (Änderung der Fluoreszenz) und einen möglichst geringen CT-Wert (Zykluszahl) geachtet. Dazu wurde die Konzentration der Sonde (250nM) und des Templates (ca. 1,8*106 Genomkopien) konstant gehalten. Es zeigte sich, dass die Endkonzentration von 900nM je Primer optimal für die TaqMan-PCR ist.

Im Anschluss wurde die Standardreihe, welche für die Quantifizierung der unbekannten Proben wichtig ist, optimiert. Dazu wurden verschiedene Präparationen des pSM2-Plasmides seriell verdünnt und mit optimierten Primerkonzentrationen eingesetzt. Hierbei fiel auf, dass die Abweichung bei geringer Kopienzahl sehr groß war (Abb. 12).

↓33

Abb. 12: Standardreihe von zwei verschiedenen pSM2-Präparationen und sechs verschiedenen Verdünnungsreihen
Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

Die Abbildung 13 zeigt eine typische Standardreihe mit dem Primerpaar TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg und der Sonde HBsAg. Auffällig ist die nur relativ geringe Änderung der Fluoreszenz ΔRn. ΔRn ist ein Maß für die Markierung der Sonde und damit für die Messgenauigkeit während der TaqMan-PCR entscheidend. Ändert sich die Fluoreszenz nur wenig, so sind nur sehr große Unterschiede in der DNA-Menge messbar (siehe Material und Methoden: 13.12. Quantitative PCR / TaqMan-PCR [S. 73]).

1.1.1. Verschiedene DNA-Isolierungsmethoden

↓34

Da die Detektion von Plasmid-DNA einfacher ist als die viraler DNA, wurden verschiedene Möglichkeiten getestet, um eine möglichst hohe Kopienanzahl im TaqMan-PCR-Ansatz nachweisen zu können. Der Zellkultur-Überstand von 2 Tagen von HepG2.2.15-Zellen wurde hierfür entweder durch Zentrifugation oder PEG8000-Fällung konzentriert oder ohne Anreicherung eingesetzt. Außerdem wurden unterschiedliche Arten der DNA-Isolierung aus Viren getestet. Ziel war es, eine gute Reproduzierbarkeit der Werte zu erreichen.

Die TaqMan-PCR zeigte für konzentrierte, nicht weiter behandelte (Abb. 14: 2) und nicht aufkonzentrierte (Abb. 14: 5) Zellkultur-Überstände keine bzw. geringe Kopien. Bei der Isolierung der DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) konnte dagegen viel DNA aus dem Zellkultur-Überstand gewonnen und nachgewiesen werden. Die Standardabweichung reichte von 45% bei Methode 1 über 30% bei Methode 4 und 5, bis zu 10% bei Methode 3 (Tabelle 2). Daher schien die Aufkonzentrierung über Zentrifugation und anschließende Isolierung der DNA die sinnvollste Methode, weil hier auch die Standardabweichung am geringsten war. Ein Teil der viralen DNA-Isolierung dieser Arbeit wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) durchgeführt.

Abb. 14: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen
1. Die DNA-Isolierung erfolgte mit Hilfe von Silica coarse nach
PEG8000-Fällung (Boom et al., 1990).
2. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-
konzentrator aufkonzentriert und die DNA nicht isoliert.
3. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-
konzentrator aufkonzentriert und die DNA mit dem QIAamp
Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert.
4. Der Zellkultur-Überstand wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit
(QIAGEN) isoliert.
5. DNA aus Zellkultur-Überstand
Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

↓35

Tabelle 2 : Darstellung des Vergleichs verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen

Methode

Kopien in 80µl ÜS

Standardabweichung

Kopien

Prozent

1

4

2

45

2

0

0

0

3

11.833

1.102

9

4

3.382

1.006

30

5

18

5

29

Später wurde ein weiterer Kit (High pure viral nucleic acid kit [Roche]) verwendet, so dass nochmals die Methoden miteinander verglichen wurden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Aufkonzentrierung nicht unbedingt notwendig ist (Abb. 15: Tag 3 3d unkonz.) und dass bei dem Kit von Roche die Standardabweichungen am geringsten waren. Die Freisetzung der viralen DNA durch NaOH mit anschließender Neutralisierung durch HCl erbrachte zwar eine relativ hohe Ausbeute an DNA aber die Standardabweichung war sehr hoch (Abb. 15 und Tabelle 3: Tag 3 3d NaOH/HCl). Für die Arbeit waren die absoluten Mengen an viraler DNA nicht relevant aber eine geringe Standardabweichung, um geringe Änderungen der Virussekretion detektieren zu können. Ein großer Teil der Arbeiten wurde mit dem High pure viral nucleic acid kit (Roche) durchgeführt, weil es von der Handhabbarkeit nicht nur am einfachsten, sondern auch am zuverlässigsten war.

Abb. 15: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen
Die konzentrierten (konz.) Proben wurden alle aus dem gleichen Zellkultur-Überstand entnommen. Der Zellkultur-Überstand wurde mit PEG8000 gefällt, die Viren durch Zentrifugation über ein 20% Sucrose-Kissen pelletiert. Die nicht aufkonzentrierten Proben (unkonz.) stammen aus einer anderen Charge. Aus den Viren des konzentrierten und nicht konzentrierten Zellkultur-Überstandes wurde durch High pure viral nucleic acid kit (Roche), QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) und Lyse mit NaOH die virale DNA isoliert.
Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

↓36

Tabelle 3 : Darstellung des Vergleich verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überstand (Abb. 15)

 

Roche

QIAGEN

NaOH/HCl

Tag 1 4d (Kopien)

8.344

16.136

293.319

Standardabweichung

13%

61%

41%

Tag 2 4d (Kopien)

16.142

11.749

209.794

Standardabweichung

29%

52%

20%

Tag 3 4d (Kopien)

11.654

12.422

462.090

Standardabweichung

26%

52%

47%

Tag 3 3d (Kopien)

1.102.891

2.924.893

94.289.638

Standardabweichung

7%

34%

74%

Die zur Isolierung der viralen DNA genutzten Zellkultur-Überstände von HepG2.2.15 Zellen (Abb. 14) sind zu einem anderen Zeitpunkt gewonnen worden, als jene, welche für Abbildung 15 genutzt wurden. Daher sind die Mengen an viraler DNA nicht direkt vergleichbar, sondern nur je nach Charge.

Abb. 16: 1:10 Verdünnungen der viralen DNA im Gegensatz zu unverdünnter DNA
Die 1:10 Verdünnungen sind auf die 10fache Menge umgerechnet. Die Zellkultur-Überstände sind mit einem Zentrifugalkonzentrator aufkonzentriert, die DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert.
Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

↓37

Zur Überprüfung der Annahme, ob eine Verdünnung der DNA eine bessere Reproduzierbarkeit der Werte zur Folge hat, wurde die virale DNA verdünnt und im Vergleich zur konzentrierten DNA bei der TaqMan-PCR eingesetzt. Bei der Verdünnung verringert sich zwar die Standardabweichung aber wenn man den Verdünnungsschritt wieder herausrechnet, detektiert man insgesamt weniger virale DNA (Abb. 16).

1.2. HBx-spezifische Primer und Sonde

Nach allen Optimierungsversuchen waren die Ergebnisse nicht zufriedenstellend. Die Standardabweichung war relativ hoch. Die Änderung des Fluoreszenzsignals der Sonde war auch nach Neubestellung relativ gering (ΔRn <1) (Abb. 13), so dass kleine Messunterschiede nicht eindeutig bestimmbar waren. Daher wurden weitere Primer (HBxfTM1, HBxrTM1) und eine Sonde (HBxSondeTM1) ausgewählt. Die Sequenzen sind der Arbeit von Loeb et al. (2000) entnommen und im überlappenden Bereich von x- und Polymerase-Gen lokalisiert. In diesem Bereich sind die Subtypen adr und ayw relativ homolog. Es wird ein 104 Basenpaare langes Amplifikat generiert.

Die optimierten Bedingungen der Primer TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg, sowie der dazugehörigen Sonde (Sonde HBsAg) wurden beibehalten. Die Primer HBxfTM1 und HBxrTM1 wurden mit einer Endkonzentration von 900nM und die Sonde HBxSondeTM1 mit 250nM eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Änderung des Fluoreszenzsignals wesentlich stärker (Abb. 17) als bei der HBsAg-Sonde war und daher auch geringere Unterschiede in der Menge der viralen DNA gemessen werden konnten.

↓38

Die DNA aus dem Zellkultur-Überstand wurde ohne vorherige Konzentrierung nur noch mit dem High pure viral nucleic acid kit (Roche) isoliert. Wenn die Experimente auf transient transfizierten Zellen basierten, wurde vor der DNA-Isolierung ein DNase-Verdau durchgeführt, um in der TaqMan-PCR nicht Signale durch Reste der transfizierten DNA zu erhalten. Die virale DNA ist im Virus vor der DNase geschützt.

2. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation

2.1. Synthetische Peptide

Das LHBs ist mit seiner zum Teil zytosolisch lokalisierten PreS-Region für die Verpackung der im Zytosol vorliegenden Kapside notwendig (Bruss & Vieluf, 1995). Als Bindungsdomänen wurden der C-terminale Bereich der PreS1-Region und die ersten fünf Aminosäuren der PreS2-Region beschrieben (Bruss & Thomssen, 1994; Bruss, 1997; Le Seyec et al., 1998).

2.1.1. Die Struktur der synthetischen Peptide

↓39

Dyson und Murray (1995) konnten mittels eines 8 Aminosäuren langen Peptids (ALLGRMKG) die Interaktion zwischen LHBs und HBcAg stören, es wurden 50% weniger Viren sezerniert. Böttcher et al. (1998) zeigten später mit hoch auflösender Elektronenkryomikroskopie, dass ein ähnliches Peptid (GSLLGRMKGA) an den spike tip eines HBcAg-Dimers bindet. Es wird aber davon ausgegangen, dass allein die Sequenz von LLGRMK ausreichend ist. Die synthetischen Peptide PS 734/RP und PS 735/RP leiten sich von dieser Sequenz ab und wurden an den flankierenden Bereichen erweitert. Sie wurden in den weiteren Experimenten als Positivkontrolle genutzt.

Abb. 18: Struktur der synthetischen Peptide

Zur genaueren Charakterisierung der HBcAg-Bindungsregion im LHBs wurden Peptide bestellt, die neben dem N-terminalem TLM der PreS2-Region aus überlappenden C-terminalen Bereichen der PreS1-Region bestehen (APO144 - 146) (Abb. 18). Durch das TLM werden die Peptide zellpermeabel. Damit sind nur die notwendigen strukturellen Regionen für die Internalisierung und die Interaktion in den Peptiden vorhanden.

2.1.2. Peptidmarkierung und -isolierung

↓40

Zur Untersuchung der Internalisierung und der Verteilung der synthetischen Peptide in der Zelle wurden diese mit Fluorescein markiert.

Die Abtrennung des nicht gekoppelten Fluoresceins erfolgte über eine Gelfiltrationssäule (Superdex Peptide-Säule). In Abbildung 19 ist in den Fraktionen B8, B11 und B12 das nicht gebundene Fluorescein zu finden. Die Fraktionen B2-B5 enthalten eine Verunreinigung die vom Fluorescein herrührt aber nicht fluoresziert.

↓41

Die Fraktionen A12 und A13 enthalten das markierte Peptid (Abb. 20). Die Fraktionen A7 und A8 enthalten kein Peptid, wie ein Vergleich mit einem Chromatogramm ergab, bei welchem nur das Peptid auf die Superdex Peptide-Säule gegeben wurde (nicht gezeigt).

Abb. 20: Chromatogramm des Fluorescein-Markierungsansatzes für APO145 mittels Superdex Peptide 200-Säule
Die Auftrennung erfolgte mit PBS bei einer Flussrate von 0,5ml/min.
Die Fraktionen A12 und A13 enthalten das markierte Peptid. Die blaue Linie markiert die Absorption bei 215nm (Peptidbindung), die rote Linie die Absorption bei 490nm (Fluorescein). Die violette Linie gibt die Absorption bei 280nm wider. Die braune Linie stellt die Leitfähigkeit dar.

2.1.3. Internalisierung der synthetischen Peptide

Um die Internalisierung der synthetischen Peptide untersuchen zu können, wurden die Fluorescein-markierten Peptide herangezogen. HepG2.2.15 als HBV-produzierende Zellen wurden 30min mit dem jeweiligen Peptid (2µM) inkubiert und anschließend mit Ethanol fixiert.

↓42

a) b)

Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die markierten Peptide fähig sind in die Zelle einzudringen. Sie akkumulieren im Kern (Abb. 21: b).

Als Folge der Internalisierung kommt es zu einer Umverteilung von HBsAg und HBcAg in HBV-produzierenden Zellen beobachten. Analog zum Internalisierungsexperiment wurden HepG2.2.15 mit den Peptiden behandelt. Das rekombinante PreS1S2-Protein diente als Positiv-Kontrolle und unbehandelte HepG2.2.15-Zellen als Negativ-Kontrolle.

↓43

Auffallend ist die Veränderung der Verteilung des HBcAg vom Zytosol in den Kern (Abb. 22: c). Diese Veränderung ist bei PreS1S2 nicht so ausgeprägt (Abb. 22: e).

Bei der Verteilung des HBsAg ist die in den unbehandelten Kontrollzellen vorhandene punktuelle Konzentrierung im Kern-nahen Bereich nach der Inkubation mit PS 735/RP aufgehoben und das HBsAg verteilt sich relativ gleichmäßig im Zytosol (Abb. 22: d). Ähnliches ist auch in der Positiv-Kontrolle zu beobachten (Abb. 22: f).

Die Veränderung der Verteilung der Oberflächenproteine (HBsAg) und der core-Protein (HBcAg) kann als Hinweis gewertet werden, dass sich auch das Sekretionsverhalten viraler Partikel und Antigene ändert. Hierauf wird im nächsten Abschnitt eingegangen.

↓44

HBcAg HBsAg

a) b)

c) d)

↓45

e) f)

2.2. Einfluss synthetisch hergestellter TLM-PreS1(n) Peptide

2.2.1. Sekretion von Virus-Partikeln

Zur Untersuchung des Einflusses der synthetisch hergestellten Peptide auf die Sekretion von Virus-Partikeln wurden HuH7-Zellen mit pSM2 transfiziert und anschließend mit verschiedenen Konzentrationen (0,1µM, 1,0µM, 10,0µM) der Peptide für 12 Stunden kultiviert. Die Viren im Zellkultur-Überstand wurden aufgeschlossen und die virale DNA isoliert. Die Menge an Virus-DNA wurde per TaqMan-PCR quantifiziert.

Abb. 23: Abhängigkeit der Virus-Sekretion transient transfizierter HuH7-Zellen von der Konzentration der synthetisch hergestellten TLM-PreS1(n)-Peptide
HuH7-Zellen wurden mittels DOTAP mit pSM2 (Sells et al., 1987) transfiziert. Die DNA der sekretierten Viren wurde per TaqMan-PCR quantifiziert. Als Positiv-Kontrollen dienten PS 734/RP, PS 735/RP und PreS1S2, als Negativ-Kontrolle dienten transient transfizierte HuH7 ohne Peptidinkubation.
Primer: HBxfTM1, HBxrTM1; Sonde: HBxSondeTM1

↓46

Als Positiv-Kontrollen wurden die PreS1S2-Region oder die von der Sequenz LLGRMK (Dyson und Murray, 1995) abgeleiteten Peptide PS 734/RP und PS 735/RP genutzt. Hierbei zeigte sich, dass die N- oder C-terminale Lokalisation des TLM bei den Peptiden PS 734/RP und PS 735/RP einen Einfluss auf die Sekretion der Virus-Partikel hat. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass alle eingesetzten Peptide einen reduzierenden Effekt auf die Virus-Sekretion haben, in Abhängigkeit von der Konzentration aber unterschiedlich stark (Abb. 23).

2.2.2. Sekretion von viralen Antigenen

Als weitere Parameter des Einflusses dieser Peptide auf die HBV-Replikation wurden die Sekretion von HBeAg und HBsAg untersucht. Hierfür wurden HBeAg- und HBsAg-spezifische ELISAs (Dade Behring) genutzt.

↓47

Die Sekretion von HBsAg ist im Vergleich zu unbehandelten Zellen leicht reduziert, wobei sich dieser Effekt nach erneuter Peptidzugabe weiter verstärkt (Abb. 24). Im Fall des HBeAg tritt eine Reduzierung der Sekretion erst nach anfänglich verstärkter Sekretion ein. Die unterschiedliche Lokalisation der TLM-Sequenz am N- bzw. C-Terminus der Peptide PS 734/PR und PS 735/PR hat einen Einfluss auf die Sekretion viraler und subviraler Partikel, sowie der Antigene.

Durch die Kompetition der HBcAg-Bindungsstelle mit den synthetischen Peptiden konnte eine Reduzierung der viralen und der Antigen-Sekretion erreicht werden. Hierbei scheint die Region von 101-115 einen starken Einfluss auf die Sekretion zu haben.

2.3. Herstellung rekombinanter PreS1(n)PreS2 Proteine

2.3.1. Konstruktion prokaryotischer Expressionsplasmide

Als technologische Alternative zu den synthetische Peptiden wurden Expressionsplasmide für Fusionsproteine aus den Abschnitten des C-Terminus der PreS1-Region (die den zuvor beschriebenen Peptiden entsprechen) und der PreS2-Region hergestellt.

↓48

Als Ausgangsplasmid wurde das Plasmid A40 genutzt, in welchem die PreS2-Domäne über die Schnittstellen BamHI/HindIII in den pQe8-Vektor subkloniert ist (Hildt et al., 1995). Das in der PreS2-Domäne lokalisierte TLM soll den Proteinen Zellpermeabilität verleihen. Außerdem verstärkt die PreS2-Region die Expression. Es wurde davon ausgegangen, dass die PreS2-Region keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht (Poisson et al., 1997; Tan, 2002; Hildt unpublished results). Zur Herstellung der prokaryotischen Expressionsplasmide (Abb. 25) wurde über entsprechende Überhangprimer (siehe Material und Methoden: 9.1 PCR-Primer [S. 68]) per PCR die PreS2-Sequenz 5´-terminal um die kodierenden Bereiche für die postulierte HBcAg-Bindungsstelle in der PreS1-Region verlängert und die Sequenz amplifiziert. Die BamHI/HindIII restringierten Amplifikate wurden in den eubakteriellen Expressionsvektor pQe8 inseriert. Der pQe8-Vektor kodiert für einem N-terminalen 6xHisTag an den Proteine. Durch diesen 6xHisTag wird die Reinigung über eine Affinitätschromatographiesäule (Ni-NTA-Superflow) ermöglicht.

2.3.2. Isolierung prokaryotisch produzierter Proteine

Die im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen prokaryotischen Expressionsplasmide wurden in E.coli transformiert. Unter denaturierenden Bedingungen (6M Harnstoff) wurden die erzeugten Proteine aus E.coli-Lysaten über Ni-NTA-Agarose-Säulen mit Hilfe des 6xHisTags gereinigt.

↓49

Abb. 26: Chromatogramm der Reinigung von E.coli-Lysaten (PreS1 110-119 PreS2) mittels Ni-NTA-Agarose-Säule
Die mit Pfeilen gekennzeichneten Fraktionen wurden zur Dialyse eingesetzt.
Die blaue Linie gibt die Absorption bei 280nm wieder. Die violett-gestrichelte Linie zeigt die Absorption bei 260nm, die nicht gestrichelte violette Linie die Absorption bei 215nm. Die gestrichelte grüne Linie stellt die Konzentration des Harnstoffes dar und die braune Linie die Leitfähigkeit.

Das Chromatogramm in Abbildung 27 zeigt ein typisches Elutionsprofil am Beispiel des Konstruktes von PreS1 110-119 PreS2. Die Elution des 6xHisTag-Proteins erfolgt im Bereich der Fraktionen A3 - A12, wie an der Änderung der Absorption bei 280nm ersichtlich. Die Fraktionen A5-A10 wurden vereinigt und durch Dialyse gegen Natriumacetat in 10%iger Sucroselösung renaturiert. Es konnten je Konstrukt aus einem Liter Induktionskultur bis zu 5mg in über 90%iger Reinheit gewonnen werden.

Der Nachweis der Proteine erfolgte zum einen mittels SDS-PAGE und anschließender Coomassie-Färbung und zum anderen per Immunoblot (Abb. 28). Das Gel zeigt die Proteine der erwarteten Größe von ca. 7kDa bzw. 19kDa (PreS1S2).

↓50

2.3.3. Konstruktion eukaryotischer Expressionsplasmide

Um auch im Rahmen von Transfektionsexperimenten den Einfluss der PreS1(n)PreS2-Proteine auf die Virusmorphogenese zu ermöglichen, sollten jeweils stabil transfizierte Zelllinien hergestellt werden. Zur Herstellung der entsprechenden Expressionsvektoren wurden die kodierenden Sequenzen mittels EcoRI/HindIII partiell verdaut und in einen ebenfalls EcoRI/HindIII geschnittenen pcDNA3.1(-)-Vektor (Invitrogen) subkloniert. Da kein zusätzliches Stopkodon in der PreS2-Sequenz ist wird ein im Vektor vorhandenes genutzt.

2.3.3.1. Stabil transfizierte HepG2-Zelllinien

Nach der Lipofektion von HepG2-Zellen mit den eukaryotischen Expressionsplasmiden wurden die Zellen zur Selektion mehrere Wochen in G418-haltigem (Neomycinderivat) Medium kultiviert, bis sich einzelne Kolonien gebildet hatten, die dann vereinzelt wurden.

↓51

Der Nachweis der Integration der DNA in das Zellgenom erfolgte nach Isolierung chromosomaler DNA mittels PCR durch ein spezifisches Fragment. Dazu wurde die aus den Klonen isolierte genomische DNA zunächst BamHI/HindIII restringiert.

Wie in Abbildung 26 zu sehen, konnte so für jedes Konstrukt mindestens ein positiver, insgesamt fünf positive, Klone identifiziert werden.

↓52

Zum Nachweis der produzierten Proteine wurde versucht, sie über Ni-NTA-Affinitätschromatografie aus dem Zelllysat anzureichern. Sie konnten leider mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden.

2.3.4. Antikörpergenerierung und -reinigung

Zur Gewinnung eines spezifischen anti-PreS2-Serums wurde ein Kaninchen dreimal mit rekombinant hergestelltem A40- (PreS2-) Protein immunisiert. Nach Entblutung des Tieres wurde das Serum gewonnen. Zur Überprüfung der Affinität wurde das Serum in Western Blot Analysen mit den verschiedenen rekombinant hergestellten PreS1S2-Proteinen eingesetzt.

Mit diesem Serum wird noch in einer Verdünnung von 1:10.000 das Antigen erkannt (Abb. 29).

↓53

Um unspezifische Antikörper zu entfernen, wurde eine Reinigung über eine Affinitätssäule vorgenommen. Das Ammoniumsulfat-gefällte, gegen PBS dialysierte Serum wurde bei 0,2ml/min mit PBS auf eine Säule aufgetragen, welche mit an NHS-aktivierte Sepharose (Amersham) gekoppeltem PreS1S2-Protein gefüllt war (freundlicher Weise von Dr. H. Huser zur Verfügung gestellt). Nach dem Waschen mit PBS erfolgte die Elution der spezifisch gebundenen Antikörper durch einen Glycinpuffer mit niedrigem pH-Wert. Die Antikörper-enthaltenden Fraktionen wurden sofort mit einem Tris-Puffer neutralisiert, um die Denaturierung der Antikörper durch den sauren pH-Wert zu verhindern.

↓54

Dass die gekennzeichneten Fraktionen (Abb. 30) wirklich Antikörper enthalten, wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Färbung nachgewiesen (Abb. 31).

Das so gereinigte Antiserum reagiert spezifisch mit PreS2, wie es bei der Mischung aus rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen mit HepG2-Zytosol gezeigt wurde (Abb. 32).

↓55

2.4. Charakterisierung rekombinanter PreS1(n)PreS2-Proteine

2.4.1. Zellpermeabilität der rekombinanten Proteine und Interaktion von HBcAg und PreS1(n)PreS2-Proteinen

Das in der PreS2-Domäne lokalisierte TLM soll den Fusionsproteinen Zellpermeabilität verleihen.

Um die Fähigkeit der Zellpermeabilität der rekombinanten Proteine zu untersuchen, wurden HepG2.2.15-Zellen in Gegenwart einer Konzentration von 2µM der verschiedenen Proteine inkubiert. Anschließend wurde das Zytosol aus den mit PreS1(n)PreS2-Proteinen behandelten HepG2.2.15-Zellen gewonnen. Durch Koimmunopräzipitation mit HBcAg-spezifischen Antikörpern gelang der Nachweis der internalisierten PreS1(n)PreS2-Proteine mit PreS2-spezifischen Antikörpern in der Western Blot-Analyse.

↓56

Der Western Blot (Abb. 33) zeigt, dass die Fusionsproteine PreS1(n)PreS2, nicht jedoch die PreS2-Region allein detektiert werden können. Dieses Ergebnis zeigt indirekt, dass die Fusionsproteine zellpermeabel sind, sie können mit verschiedenen PreS2-spezifischen Antikörpern im Zytosol nachgewiesen werden. Die PreS2-Region ist zellpermeabel (Saher & Hildt, 1999; Oess & Hildt, 2000). Der Nachweis der Zellpermeabilität der PreS2-Region kann mit diesem Western Blot nicht erbracht werden, da es sich um eine Immunopräzipitation von Zytosol mit einem HBcAg-spezifischen Antikörper handelt.

Bisher konnte in vivo nicht direkt nachgewiesen werden, dass die PreS1-Region mit HBcAg interagiert. Es wurden Deletionsanalysen durchgeführt, die auf eine Rolle der Aminosäuren 102-119 der PreS1-Region bei der HBcAg-Interaktion hindeuten (Bruss & Thomssen, 1994). Im zellfreien System konnte eine Interaktion dieser Region mit dem HBcAg bereits gezeigt werden (Poisson et al., 1997; Tan, 2002).

↓57

Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass durch die Nutzung der PreS2-Region als "carrier" für die PreS1-Region die Proteine direkt in die Zellen gelangen. Der in Abbildung 33 gezeigte Western Blot bestätigt die Annahme, dass die PreS1(n)PreS2-Proteine mit HBcAg auch in vivo interagieren können. Im Gegensatz dazu kann die PreS2-Region (A40) nicht mit HBcAg interagieren, wie die fehlende Bande bei ca. 7kDa in der A40 (PreS2)-Spur zeigt.

2.4.2. Sekretion von viralen Partikeln

Den Einfluss der HBcAg-Bindungsdomäne des LHBs auf die Virussekretion konnten Bruss (1997) und le Seyec et al. (1998) durch Deletionsanalysen im C-Terminus der PreS1-Region und im N-Terminus der PreS2-Region zeigen. Die Virusmorphogenese wird inhibiert, wenn die mit dem HBcAg interagierende Domäne deletiert wird. Auch die Verwendung von zellpermeablen Peptiden, welche von der Interaktionsdomäne abgeleitet sind, können die Virussekretion inhibieren (siehe Abschnitt 2.2.1).

Um zu untersuchen, welchen Einfluss die rekombinanten Fusionsproteine auf die Sekretion von Virus-Partikeln haben, wurden HepG2.2.15 mit den verschiedenen rekombinanten Fusionsproteinen (2µM) inkubiert. Es wurde jeweils nach 18h, 30h und 42h eine Probe aus dem Medium entnommen. Als Kontrolle dienten unbehandelte HepG2.2.15-Zellen. Anschließend wurden die Viren aus dem Zellkultur-Überstand aufgeschlossen und die virale DNA isoliert. Die Menge an Virus-DNA wurde per TaqMan-PCR quantifiziert.

↓58

Es zeigte sich bei den Versuchen, dass je länger die Zellen mit den rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen inkubiert wurden, die Anzahl der sekretierten Viren reduziert wurde. Dabei zeigten die Proteine PreS1 101-110 PreS2 und PreS1 105-115 PreS2 einen stärkeren Einfluss als PreS1 110-119 PreS2 (Abb. 34).

2.4.3. Sekretion von viralen Antigenen

HBeAg ist ein Replikationsmarker, der in das Zellkulturmedium sekretiert wird. Verringert sich die Menge an sezerniertem HBeAg, ist dies ein Zeichen für eine reduzierte Replikation.

↓59

Zur Untersuchung des Sekretionsverhaltens von HBeAg und HBsAg bei der Inkubation mit rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen wurden kommerziell angebotene ELISAs genutzt.

Die Sekretion von sowohl HBeAg als auch HBsAg wird durch die rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteine gehemmt. Am stärksten wird die HBeAg-Sekretion bei PreS1 105-115 gehemmt, während bei PreS1 101-110 die Reduzierung am geringsten war (Abb. 35).

↓60

Die rekombinanten Fusionsproteine sind ebenso wie die synthetischen Peptide zellpermeabel. Der inhibierende Einfluss auf die Virussekretion ist bei den rekombinanten Fusionsproteinen für die Region AS 101-110 und AS 105-115 am intensivsten. Die Sekretion von HBeAg als Replikationsmarker wird durch Inkubation mit den rekombinanten Fusionsproteinen PreS1 AS 105-115 am stärksten inhibiert.

Die im Abschnitt 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die Zellpermeabilität der synthetischen Peptide sowie der rekombinanten Fusionsproteine. Als wirkungsvollste Region für Inhibierung der Morphogenese und der Sekretion von viralen Partikeln und Antigenen wurde die PreS1-Region AS 105-115 identifiziert.

3. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation

3.1. Einfluss der HBV-Aktivatoren auf die HBV-Expression

Das Hepatitis B Virus besitzt zwei Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Voraussetzung für die Aktivatorfunktion von HBx ist die Funktionalität von Ras (Benn & Schneider, 1994). Dagegen aktiviert LHBs, unabhängig von Ras, über eine Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) die c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade (Hildt et al., 2002). Auch HBx kann die PKC aktivieren aber die Aktivatorfunktion wird durch eine Inhibierung der PKC nicht gestört (Lucito & Schneider, 1992; Murakami et al., 1994). Im Gegensatz dazu kommt es beim LHBs zu einer starken Reduktion der transkriptionellen Aktivität (Hildt et al., 2002).

↓61

Abb. 36: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.

Zur Untersuchung des Einflusses der HBx-abhängigen Aktivierung auf die HBV-Expression wurde ein HBV-Expressionsplasmid (pSPT1.2xHBV) mit einer transdominant negativen (tdn) Mutante von Ras (pRasN17) kotransfiziert. Zur Inhibierung der PKC im Falle der LHBs-induzierten Aktivierung wurde ein zellpermeables inhibierendes Peptid eingesetzt.

Die Zellkultur-Überstände der so transfizierten HepG2-Zellen zeigten keine signifikanten Änderungen in der Menge an Virus-DNA, weder bei der Koexpression mit pRasN17 noch bei der Inhibierung der PKC (Abb. 36). Dies ist übereinstimmend mit den Ergebnissen aus HBe- und HBsAg-spezifischen ELISAs, welche auch keine signifikante Änderung der Sekretion an Antigenen zeigten.

3.2. Einfluss der c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression

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LHBs und HBx aktivieren auf unterschiedliche Art die c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade (Andrisani & Barnabas, 1999; Benn & Schneider, 1994; Hildt et al., 1998, 2002).

Welchen Einfluss diese Signalkaskade auf die HBV-Expression hat, wurde durch die Koexpression von pSPT1.2xHBV mit einer tdn Mutante von c-Raf-1 in HepG2-Zellen untersucht. Um auszuschließen, dass mögliche Effekte durch unspezifische Reaktionen der tdn Mutante hervorgerufen werden, wurde weiterhin auch der MEK-spezifische Inhibitor PD 98059 eingesetzt. SB 202 474 ist chemisch ähnlich wie PD 98059, hat aber keine inhibierende Wirkung.

Abb. 37: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.

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Die Menge an detektierbarer viraler DNA im Zellkultur-Überstand wird bei Koexpression mit tdn c-Raf-1 stark reduziert. Dieser Effekt ist c-Raf-1-spezifisch; das wird durch die ähnlich starke Reduktion der DNA bei Einsatz des MEK-Inhibitors (Abb. 37) gezeigt.

Der inhibierende Effekt von tdn c-Raf-1 auf die Genexpression spiegelt sich auch in der stark verminderten HBsAg/HBeAg-Sekretion wider (Abb. 38).

Die Kotransfektion mit einer konstitutiv aktiven Form von c-Raf-1 (v-Raf) erbrachte keine signifikante Zunahme in der Sekretion an viralen und subviralen Partikeln.

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Abb. 38: Quantifizierung von HBsAg und HBcAg mittels ELISA im Zellkultur-Überstand von transient transfizierten HepG2-Zellen mit pSPT1,2HBV zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.

Basierend auf den vorhergehend beschriebenen Ergebnissen war zu untersuchen, ob die virale Sekretion auf eine reduzierte Synthese der Virusproteine zurückzuführen ist oder ob es zu einer Hemmung des Exports und somit zu einer Akkumulation der Virusproteine in der Zelle kommt. Hierzu wurden Immunofluoreszenzen von HepG2.2.15-Zellen durchgeführt, welche mit dem MEK-Inhibitor PD 98059 behandelt wurden.

Kontrolle PD 98059

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a) b)

c) d)

Die Immunofluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 39) zeigt deutlich, dass sowohl bei HBsAg als auch bei HBcAg die de novo Synthese der Virusproteine reduziert wird, wenn die Zellen mit einem MEK-Inhibitor behandelt werden. Es kommt zu keiner Anreichung der viralen Proteine in der Zelle.

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Dieser Befund wurde durch Western Blot Analysen von Zelllysaten transient transfizierter HepG2-Zellen bestätigt (Abb. 40). Die Zellen wurden entweder mit der tdn c-Raf-1-Mutante kotransfiziert oder mit verschiedenen Konzentrationen des MEK-Inhibitors inkubiert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Funktionalität der Raf/MEK-Signalkaskade essentiell für die Virusproduktion ist. Die aktivierende Funktion von HBx und LHBs auf die Virusproduktion wird durch Hemmung der Raf/MEK-Signalkaskade sehr stark reduziert.

3.3. Einfluss der Funktionalität der HBV-Aktivatoren auf die Virusproduktion

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Um zu untersuchen, ob HBx und / oder LHBs notwendig für die HBV-Generierung sind, wurden zwei Einzel- und eine Doppelmutante aus pSPT1.2xHBV hergestellt. Bei HBx wurde ein Stopkodon eingeführt. Zur Unterdrückung der PreS2-Aktivatorfunktion im LHBs wurde die Phosphorylierungsstelle im Bereich der Aminosäuren 27-31 der PreS2-Region mutiert. Das Vorhandensein dieser Phosphorylierungsstelle ist Voraussetzung für die PreS2-abhängige Aktivatorfunktion (Hildt et al., 2002).

Abb. 41: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.

Per TaqMan-PCR wurden die Zellkultur-Überstände der mit den verschiedenen Mutanten transfizierten HepG2-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Sekretion von HBV bei der Doppelmutante fast vollständig verhindert wurde, während sich bei den Einzelmutanten die Menge an Virus-DNA nicht stark veränderte (Abb. 41). Dies zeigt eine essentielle Rolle der Aktivatorfunktion für die Virusexpression.

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Die Aktivatoren wirken über die Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Genexpression. Eine Inhibierung dieser Signalkaskade hat eine verminderte Virussekretion zur Folge, welche auf eine reduzierte Synthese viraler Proteine zurückzuführen ist. Für die Aktivierung der Raf/MEK-Signalkaskade und damit die Aktivierung der Virusproduktion ist die Funktionalität mindestens eines HBV-Aktivators notwendig.


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24.10.2005